CN113646631A

CN113646631A - 动脉硬化及动脉硬化相关疾病标志物

Info

Publication number: CN113646631A
Application number: CN201980094777.XA
Authority: CN
Inventors: 南野直人; 八木宽阳; 锦织充広; 植田初江; 松田均; 村上裕辅
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd; National Cerebral and Cardiovascular Center
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd; National Cerebral and Cardiovascular Center
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2021-11-12
Also published as: US20220196681A1; JP7399431B2; EP3951387A4; EP3951387A1; WO2020202241A1; JPWO2020202241A1

Abstract

本发明的目的是提供用于检测动脉硬化相关疾病或用于评价动脉硬化进展程度的新型生物标志物。具体地，本发明涉及一种用于检测动脉硬化相关疾病或用于评价动脉硬化进展程度的标志物，其包含NPC2(Niemann‑Pick disease type C2，尼曼‑匹克病C2型)蛋白和/或IGFBP7(Insulin‑like growth factor‑binding protein7，胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

Description

动脉硬化及动脉硬化相关疾病标志物

技术领域

本发明涉及辅助动脉硬化相关疾病和动脉硬化诊断的临床检查剂的技术领域。详细地，涉及动脉硬化相关疾病的生物标志物、反映动脉硬化状态(下面也称为“进展程度”)的生物标志物、使用这些生物标志物的测定试剂、试剂盒、动脉硬化相关疾病的检测方法和动脉硬化的进展程度的评价方法。

背景技术

动脉硬化是各种物质沉积在动脉的内部，使动脉内壁肥厚、硬化而失去弹性、内腔变窄的状态的总称。虽然分为动脉粥样硬化(下面称为粥样动脉硬化)、中膜钙化、细动脉硬化这3个，但一般在多数情况下动脉硬化则是指粥样动脉硬化。粥样动脉硬化是在主动脉、脑动脉、冠状动脉等比较粗的动脉中引起的动脉硬化，在动脉的内膜中积存由胆固醇等脂肪构成的粥状物质而形成动脉粥样斑块(粥样硬化病灶)，通过逐渐变厚使动脉的内腔变窄。此外，所形成的不稳定的粥肿剥落而形成血栓，成为各种梗塞的病因，这样，已知动脉硬化会引起心肌梗塞、外周动脉疾病、主动脉瘤、主动脉夹层、脑卒中(动脉粥样硬化性脑梗塞、短暂性脑缺血发作等)、肾动脉狭窄、颈内动脉狭窄、心绞痛等疾病，随着人口的高龄化、生活习惯的变化而近年来增加。动脉硬化以无症状发展，如果达到心肌梗塞、脑梗塞、主动脉瘤等发病时，则是会有生命危险的严重疾病。但是，由于通过进行适当的治疗能够避免发病，因此早期检测动脉硬化、动脉硬化性疾病、管理动脉硬化的进展程度是非常重要的。

例如，因动脉硬化等病因而发病的胸主动脉瘤基本是在体检等进行胸部X光检查时偶然被发现的，腹主动脉瘤多是在叩击以触诊腹部来诊断胃溃疡或胆石症等胃肠道疾病时被发现，或者在胃肠道和肾脏、前列腺等腹部超声(超音波)的检查中或在胸腹部的MRI检查中偶然被发现。

作为动脉硬化和动脉硬化相关疾病的标志物，已知有用作风险评价的LDL胆固醇、氧化LDL等脂质标志物；CRP、Pentraxin3等炎症标志物(非专利文献1)。但是，就灵敏度、特异性和疾病特异性方面而言，它们均不足够。

另外，作为非侵入性地掌握动脉硬化的状态的方法，已知有基于利用颈动脉超声检查的血管内膜-中膜复合体厚度(Intima-Media Thickness)(下面称为IMT)测定、手与足的动脉波的速度差(上臂-脚踝间脉搏波传导速度：brachial-ankle Pulse WaveVelocity)(下面称为baPWV)的测定等(非专利文献2)。这些检查可在很多医院中进行，因为它们需要时间在十几分钟内，且是非侵入、简便地调查检查动脉硬化的进展程度，但是如果不在设备整齐的医院进行则无法接受检查的方面、为了从大规模人群筛选动脉硬化风险高的组而用于筛选检查时的处理量方面，与血液检查等相比明显是不适合的。

现有技术文献

专利文献

非专利文献1：平山哲等人，Vascular Medicine，10(1)，10-15，2014

非专利文献2：循環器病の診断と治療に関するガイドライン(2011-2012年度合同研究班報告)血管機能の非侵襲的評価法に関するガイドライン，2013(心血管疾病的诊断与治疗指南(2011-2012年度联合研究组报告)血管功能的非侵入评价法指南，2013)

发明内容

发明所要解决的问题

迄今为止，在体检等中作为筛查性的动脉硬化的危险因素而使用的血压和LDL胆固醇、HDL胆固醇等血液检查是检查时间点时的数值，并不反映在各种危险因素或压力不同强度、不同时间段的暴露下，血管壁的组织和细胞的状态。基于上述实际情况，如果开发出与颈动脉超声、baPWV检查的动脉硬化的评价法表现出密切相关的可用于筛查的生物标志物，则可预想到对动脉硬化的预防、动脉硬化相关疾病的发病诊断、进展程度评价、治疗药物的开发等带来新的局面。

本发明所要解决的问题是提供一种新型生物标志物，其能够反映动脉硬化的状态，并且可以简便、高灵敏度地进行动脉硬化相关疾病的检测和动脉硬化的进展程度的评价。

解决问题的技术方案

为了实现提供反映动脉硬化状态的优异动脉硬化性疾病标志物的目的，本发明人实施了使用动脉硬化性胸主动脉瘤组织作为以动脉硬化为病因而发病的疾病的蛋白质组分析。动脉硬化性胸主动脉瘤由于以动脉硬化为病因而发病，而且明确地区分疾病部位，因此非常适合于使用组织的动脉硬化性疾病的分析。能够从获得的蛋白质谱中，按照疾病的进展程度分类组织，这些分类可以很好地说明已知的结构蛋白质的变化、蛋白酶等的变化。健康主动脉组织的蛋白质组分析也通过相同的方法进行。从获得的数据中，比较健康主动脉组织与动脉硬化性胸主动脉瘤患者组织的蛋白质组数据，以确定与疾病发作相关的因素。此外，为了确定与疾病进展相关的因素，对动脉硬化性胸主动脉瘤患者的各分类间组织蛋白质组数据进行了比较。两种比较中共同变动的因素被推测与疾病的发生和进展有关。在共同变动的因素中，寻找也在血液中波动的因素，发现了高精度地反映动脉硬化的发病和进展、即动脉硬化相关疾病的发病和动脉硬化的进展程度的新标记物，从而完成了本发明。

即，本发明包括以下内容的构成：

(1)一种用于检测动脉硬化相关疾病的方法，该方法包括：在从受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

(2)一种用于检测或筛查动脉硬化相关疾病复发的方法，该方法包括：在从具有动脉硬化相关疾病复发风险的受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

(3)一种用于检测或筛查将来有动脉硬化相关疾病发病风险的受试者的方法，该方法包括：在从受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

(4)一种评价动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物效果的方法，该方法包括：在给予动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物前，在从需要预防或治疗动脉硬化相关疾病或动脉硬化的受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤；在给予动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物后，在从所述受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤；或者，该方法包括：在给予动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物后，从需要预防或治疗动脉硬化相关疾病或动脉硬化受试者在按时间顺序两个以上的时间点得到的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，所述动脉硬化相关疾病选自由下列组成的组：心肌梗塞、外周动脉疾病、主动脉瘤、主动脉夹层、动脉粥样硬化性脑梗塞、短暂性脑缺血发作、肾动脉狭窄、颈内动脉狭窄、心绞痛。

(6)一种用于评价动脉硬化进展程度的方法，该方法包括：在从受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，试样选自由下列组成的组：血清、血浆、血液、尿和唾液。

(8)根据(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，所述受试者是需要预防或治疗动脉硬化相关疾病或动脉硬化的动物，所述方法以所述NPC2蛋白和/或IGFBP7蛋白作为指标，来评价或判定动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物的效果。

(9)根据(1)～(8)中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。

(10)根据(1)～(9)中任一项所述的方法，其中，测定方法是免疫测定法或质谱法。

(11)一种用于检测动脉硬化相关疾病的标志物，其包括以下的1)和/或2)：

1)NPC2蛋白；

2)IGFBP7蛋白。

(12)根据(11)所述的检测标志物，其中，所述动脉硬化相关疾病选自由下列组成的组：心肌梗塞、外周动脉疾病、主动脉瘤、主动脉夹层、动脉粥样硬化性脑梗塞、短暂性脑缺血发作、肾动脉狭窄、颈内动脉狭窄、心绞痛。

(13)一种用于评价动脉硬化进展程度的标志物，其包括以下的1)和/或2)：

1)NPC2蛋白；

2)IGFBP7蛋白。

(14)一种用于检测动脉硬化相关疾病或用于评价动脉硬化进展程度的测定试剂，其包含用于测定(11)～(13)中任一项所述的标志物的抗体或适体。

(15)根据(14)所述的测定试剂，其中，所述抗体是单克隆抗体和/或多克隆抗体。

(16)一种用于检测动脉硬化相关疾病或用于评价动脉硬化进展程度的试剂盒，其包含(14)或(15)所述的测定试剂。

(17)根据(11)～(16)中任一项所述的标志物、测定试剂或试剂盒，其中，在用于检测动脉硬化相关疾病中或在用于评价动脉硬化进展程度中使用的试样选自由下列组成的组：血清、血浆、血液、尿和唾液。

(18)根据(11)～(13)中任一项所述的标志物用于筛查动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物的用途。

(19)根据(11)～(13)中任一项所述的标志物用于体外检测或筛查动脉硬化相关疾病复发的用途。

(20)根据(11)～(13)中任一项所述的标志物用于体外检测或筛查将来有动脉硬化相关疾病发病风险的受试者的用途。

发明效果

通过将本发明发现的NPC2或IGFBP7用作动脉硬化相关疾病的标志物(即用于检测动脉硬化相关疾病的标志物)或动脉硬化标志物(即用于评价动脉硬化进展程度的标志物)，能够高灵敏度地检测动脉硬化相关疾病的发病和动脉硬化。而且，NPC2和IGFBP7如实施例所示，被认为是分别捕捉动脉硬化的不同侧面的标志物，通过使用这些组合来获得更详细的动脉硬化的进展程度的信息成为可能。

另外，使用本发明的用于检测动脉硬化相关疾病的标志物或用于评价动脉硬化进展程度的标志物的测定试剂和测定试剂盒可用于动脉硬化相关疾病发病和动脉硬化的早期诊断、动脉硬化进展状态的掌握(监测)，通过这些疾病的早期检测，能够有助于避免疾病的恶化。

本发明的用于检测动脉硬化相关疾病的标志物或用于评价动脉硬化进展程度的标志物也可以用于这些疾病的预防药物和治疗药物的开发、评价。而且，也可以检测或筛查动脉硬化相关疾病复发，以及检测或筛查将来有动脉硬化相关疾病发病风险的受试者。

附图说明

图1-1是表示实施例1中的动脉硬化相关疾病(下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中NPC2值与maxIMT值的相关分析结果图。

图1-2是表示实施例1中的主动脉瘤(包括胸主动脉瘤、腹主动脉瘤和胸腹部复合发病的主动脉瘤)患者血清样本中NPC2值与maxIMT值的趋势分析的结果图。“NS”表示“notsignificant(无显著差异)”。

图1-3是表示实施例1中的动脉硬化相关疾病(主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中NPC2值与有无颈动脉斑块的比较分析的结果图。

图2-1是表示实施例2中的动脉硬化相关疾病(主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中NPC2值与baPWV值(临界值1400(cm/s))的比较分析的结果图。

图2-2是表示实施例2中的动脉硬化相关疾病(主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中NPC2值与baPWV值(临界值1700(cm/s))的比较分析的结果图。

图3-1是表示实施例3中的动脉硬化相关疾病(下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中IGFBP7值与maxIMT值的相关分析结果图。

图3-2是表示实施例3中的主动脉瘤(包括胸主动脉瘤、腹主动脉瘤和胸腹部复合发病的主动脉瘤)患者血清样本中IGFBP7值与maxIMT值的趋势分析的结果图。

图3-3是表示实施例3中的动脉硬化相关疾病(主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中IGFBP7值与有无颈动脉斑块的比较分析的结果图。“NS”表示“not significant(无显著差异)”。

图4-1是表示比较例1中的动脉硬化相关疾病(下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中CRP值与maxIMT值的相关分析结果图。

图4-2是表示比较例1中的主动脉瘤(包括胸主动脉瘤、腹主动脉瘤和胸腹部复合发病的主动脉瘤)患者血清样本中CRP值与maxIMT值的趋势分析的结果图。“NS”表示“notsignificant(无显著差异)”。

图4-3是表示比较例1中的动脉硬化相关疾病(主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中CRP值与有无颈动脉斑块的比较分析的结果图。“NS”表示“not significant(无显著差异)”。

图5-1是表示比较例2中的动脉硬化相关疾病(主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中CRP值与baPWV值(临界值1400(cm/s))的比较分析的结果图。

图5-2是表示比较例2中的动脉硬化相关疾病(主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症、心肌梗塞)患者血清样本中CRP值与baPWV值(临界值1700(cm/s))的比较分析的结果图。“NS”表示“not significant(无显著差异)”。

图6-1是表示实施例4中的健康者、非动脉硬化性胸主动脉瘤患者和动脉硬化性胸主动脉瘤患者的血清样本中NPC2值的测定结果图。“HC”表示healthy control(健康者)；“TAA-NAS”表示“Thoracic aortic aneurysm-non atherosclerotic(非动脉硬化性胸主动脉瘤)”；“TAA-AS”表示“Thoracic aortic aneurysm-atherosclerotic(动脉硬化性胸主动脉瘤)”；“NS”表示“not significant(无显著差异)”。

图6-2是表示实施例4中的健康者、非动脉硬化性胸主动脉瘤患者和动脉硬化性胸主动脉瘤患者的血清样本中IGFBP7值的测定结果图。“HC”表示“healthy control(健康者)”；“TAA-NAS”表示“Thoracic aortic aneurysm-non atherosclerotic(非动脉硬化性胸主动脉瘤)”；“TAA-AS”表示“Thoracic aortic aneurysm-atherosclerotic(动脉硬化性胸主动脉瘤)”。

具体实施方式

为了鉴定反映动脉硬化状态的标志物，本发明人等使用从健康者主动脉组织14例、动脉硬化性胸主动脉瘤患者组织29例采集的主动脉中膜平滑肌层组织，如下进行蛋白质组分析。

■组织破碎和胰蛋白酶消化

采集后，冷冻组织用微珠破碎机进行破碎，添加Lys-C(Lysyl Endopeptidase，赖氨酰内肽酶)、胰蛋白酶(Trypsin)，在37℃过夜温育进行消化。将得到的消化肽用C18(十八烷基甲硅烷基)柱进行脱盐，并用作分析样品。

■分析

分析样品在用Nano LC(日立Nano Frontier，日立高新技术公司)分离后，通过连接的TripleTOF 5600(SCIEX社)进行MS/MS分析。利用Mascot数据库搜索(Matrix science公司)从测定数据中鉴定蛋白，使用集成LC-MS数据并使用比较定量蛋白质组分析软件2DICAL(2Dimensional Image Converted Analysis of Liquid chromatography massspectrometry(液相色谱质谱二维图像转换分析)，三井信息株式会社)进行定量，进行动脉硬化性胸主动脉瘤组的分类与分类内的比较，在正常主动脉组与动脉硬化性胸主动脉瘤组间进行比较，探求存在差异的蛋白。其结果是，作为在动脉硬化性胸主动脉瘤组的分类间和在正常主动脉组与动脉硬化性胸主动脉瘤组间共同显示出显著性增加的蛋白，鉴定出NPC2、IGFBP7，从而完成了本发明。

予以说明，本发明中，不仅是健康者与动脉硬化性胸主动脉瘤的比较，而且还参考非动脉硬化性胸主动脉瘤与动脉硬化性胸主动脉瘤的比较数据来选择候选因子，从而发现了本发明的标志物。

如上所述，NPC2和IGFBP7在以动脉硬化为病因而发病的来自动脉硬化性胸主动脉瘤患者的主动脉中膜组织中，与健康者的主动脉中膜组织相比，均确认到表达显著增加。通过分别单独使用NPC2、IGFBP7作为标志物，可以检测动脉硬化相关疾病和动脉硬化，但如后述的实施例中所示，由于两标志物与不同的动脉硬化指标关系更密切(如后述的实施例1～2中所示，NPC2是与有无颈动脉斑块和baPWV值关系更密切的标志物；如实施例3所示，IGFBP7是与颈动脉球部的IMT最大值(下面，称为maxIMT值)关系更密切的标志物)，因此通过组合NPC2和IGFBP7，能够发挥更准确地反映动脉硬化的状态(进展程度)的优异的检测效果。

本发明的特征在于采用将NPC2和/或IGFBP7用于检测动脉硬化相关疾病的标志物或用于评价动脉硬化进展程度的标志物。

本发明中，“标志物”或“生物标志物”是指用作从受试者获得的试样的测定用靶标的分子。

本发明的标志物包含NPC2和/或IGFBP7。人NPC2(即，Niemann-Pick disease typeC2 protein，尼曼-匹克病C2型蛋白)是UniProt登录号P61916所表示的分泌性蛋白(http://www.uniprot.org/uniprot/P61916)。人NPC2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，第1位～第19位的氨基酸序列是信号肽，第20位～第151位的氨基酸序列是成熟型蛋白。NPC2在人中是由132个氨基酸组成的糖蛋白，在附睾中含量很高，但也存在于许多其他组织中。NPC2具有胆固醇结合能力，被认为与NPC1一起参与胆固醇从脂质体排出。NPC2功能缺陷会导致尼曼病C型，其表现为胆固醇在脂质体中异常沉积(Marie T.Vanier,Gilles Millat.Structure and functionof the NPC2protein.Biochimica et Biophysica Acta2004；1685:14-21)。

本发明中，NPC2蛋白中包括由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第20位～第151位的氨基酸序列具有70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、更优选为95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、最优选为100％的序列同一性的氨基酸序列组成，且具有胆固醇结合活性和/或胆固醇从脂质体排出的活性的蛋白或者功能缺陷突变体等不具有该活性的蛋白，还包括这样蛋白的多聚体(二聚体及以上)。

另一方面，人IGFBP7(即，Insulin-like growth factor-binding protein7，胰岛素样生长因子结合蛋白7)是UniProt登录号Q16270所表示的分泌性蛋白(http://www.uniprot.org/uniprot/Q16270)。人IGFBP7的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列中，第1位～第26位的氨基酸序列是信号肽，第27位～第282位的氨基酸序列是成熟型蛋白。IGFBP7在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠等很多组织表达。已知不同于其他IGFBP蛋白与胰岛素样生长因子(IGF)的结合性较弱，IGFBP7与胰岛素结合性强。据报告IGFBP7与细胞增殖控制、凋亡、细胞老化和血管新生相关(Shuzhen Zhu,Fangying Xu,Jing Zhang,Wenjing Ruan,Maode Lai.Insulin-like growthfactor binding protein-related protein1andcancer.Clinica Chimica Acta 2014；431:23-32)。

本发明中，IGFBP7蛋白中包括由与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中的第27位～第282位的氨基酸序列具有70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、更优选为95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、最优选为100％的序列同一性的氨基酸序列组成，且具有胰岛素结合活性或不具有该活性的蛋白，还包括这样蛋白的多聚体(二聚体及以上)。

予以说明，也可以将本发明的标志物与LDL胆固醇、HDL胆固醇、氧化LDL等变性LDL、sdLDL(小而密(small dense)LDL)、C反应性蛋白(CRP)、正五聚蛋白3、IL-6等已知的报告了与动脉硬化性疾病相关的标志物组合使用。

本发明中，“动脉硬化相关疾病”是指以动脉硬化为病因而发病的疾病。通过本发明的动脉硬化相关疾病标志物可以检测的疾病只要是由动脉硬化引起发病的疾病，就没有特别限定。作为具体例，可举出：心肌梗塞、外周动脉疾病、主动脉瘤、主动脉夹层、脑卒中(动脉粥样硬化性脑梗塞、短暂性脑缺血发作等)、肾动脉狭窄、颈内动脉狭窄、心绞痛等。本说明书中，有时将动脉硬化及其相关疾病统称为“动脉硬化性疾病”。此外，上述的各种动脉硬化相关疾病可以称为动脉硬化相关疾病，其可通过本发明的标志物进行诊断、检查、评价或判定。

本发明中，检测动脉硬化相关疾病标志物的方法和测定动脉硬化标志物的方法(即用于评价动脉硬化进展程度的标志物的测定方法)包括测定NPC2蛋白和/或IGFBP7蛋白的步骤。在测定试样中的NPC2蛋白和/或IGFBP7蛋白时，可以测定作为糖蛋白的NPC2和/或IGFBP7，此外，还可以通过预处理除去糖链、磷酸等翻译后的修饰，然后测定NPC2和/或IGFBP7的氨基酸序列部分。

检测动脉硬化相关疾病的方法可以通过在从受试者获得的试样中测定本发明的标志物来检测该受试者的动脉硬化相关疾病。因此，可以将检测动脉硬化相关疾病的方法称为动脉硬化相关疾病的诊断、检查、评价或判定方法，或者用于检测动脉硬化相关疾病的体外数据收集方法等。

如后述的实施例1～3所示，确认到本发明的标志物与作为动脉硬化指标的颈动脉超声和baPWV检查等的相关性密切，评价动脉硬化的进展程度的方法、即评价动脉硬化的进展程度的方法仅通过在从受试者获得的试样中测试本发明的标志物，就能够掌握与通过颈动脉超声和baPWV检查等获得的血管的动脉硬化进展程度相同程度的信息。因此，评价动脉硬化的进展程度的方法可以称为动脉硬化的诊断、检查、评价或判定方法或用于检测动脉硬化的体外的数据收集方法等。

作为能够成为检测动脉硬化相关疾病的方法和评价动脉硬化的进展程度的方法的受试对象的动物，例如可举出：人、猴、牛、猪、马、狗、猫、绵羊、山羊、兔、仓鼠、豚鼠、小鼠、大鼠等哺乳类，优选为人。

另外，作为在检测动脉硬化相关疾病的方法和评价动脉硬化的进展程度的方法中使用的试样，例如可举出：血清、血浆、血液、尿、唾液等。

本发明中，例如在从怀疑是动脉硬化的患者采集的试样中，可以通过在体外测定NPC2蛋白水平和/或IGFBP7蛋白水平来判断、检测或筛查目前动脉硬化相关疾病或动脉硬化正在进展的可能性、将来动脉硬化相关疾病发病的风险(可能性)或动脉硬化相关疾病的复发。将患者样本中的NPC2蛋白水平和/或IGFBP7蛋白水平与健康者的水平相比较，当患者样本中的NPC2蛋白水平和/或IGFBP7蛋白水平高于健康者的水平时，能够判断为目前动脉硬化相关疾病或动脉硬化正在进展的可能性、将来动脉硬化相关疾病发病的风险(可能性)或动脉硬化相关疾病正在复发的可能性很高。

具体地，根据检测动脉硬化相关疾病的方法和评价动脉硬化的进展程度的方法，本发明还包括以下方法：

通过在从具有动脉硬化相关疾病复发风险的受试者获得的试样中，测试本发明的标志物来检测或筛查动脉硬化相关疾病复发的方法；

通过在从受试者获得的试样中，测试本发明的标志物，来检测或筛查将来有动脉硬化相关疾病发病风险的受试者的方法。

另外，作为用于判断为动脉硬化相关疾病发病的可能性或目前动脉硬化正在进展的可能性很高的各标志物的临界值，没有限定，可举例有如下。下述的临界值是根据由实施例所示的数据绘制的ROC曲线而计算的。

(i)基于实施例1(有无颈动脉斑块的比较分析)的NPC2的临界值：2.8ng/mL(灵敏度68.0％，特异度22.2％)；

基于实施例2(baPWV的临界值1400cm/s)的NPC2的临界值：2.3ng/mL(灵敏度75.0％，特异度29.0％)；

基于实施例2(baPWV的临界值1700cm/s)的NPC2的临界值：3.4ng/mL(灵敏度65.0％，特异度35.0％)。

(ii)基于实施例3(有无颈动脉斑块的比较分析)的IGFBP7的临界值：178.0ng/mL(灵敏度53.3％，特异度22.2％)。

基于这些临界值，当患者样本中的NPC2蛋白水平和/或IGFBP7蛋白水平高于临界值时，能够判断为动脉硬化相关疾病发病的可能性或动脉硬化正在进展的可能性很高。

本发明的标志物还可以用于筛选动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物、用于评价和判定动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物的效果。例如，在进行评价和判定动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物的效果时，可以按照以下方法进行：在向需要预防或治疗动脉硬化相关疾病或动脉硬化的受试对象动物给予相对应的预防药物或治疗药物之前与之后，从受试对象动物采集试样，或者在给予该预防药物或治疗药物之后，按时间顺序在两个以上的时间点从受试对象动物采集试样，研究试样中的NPC2蛋白水平和/或IGFBP7蛋白水平随时间的变化。通过给予相对应的预防药物或治疗药物，在动脉硬化病变的形成、进展受到抑制时，从受试对象动物采集的试样中的NPC2蛋白水平和/或IGFBP7蛋白水平随时间的增加显示有被抑制或稳定的趋势。另一方面，通过给予相对应的预防药物或治疗药物，在动脉硬化病变的形成、发展得到改善时，从受试对象动物采集的试样中的NPC2蛋白水平和/或IGFBP7蛋白水平显示有随时间减少的趋势。

作为测定本发明的标志物蛋白的方法，例如只要是特异性地测定NPC2蛋白、IGFBP7蛋白的方法，则可以使用免疫测定法、质谱法等已知的任何方法。在测定本发明的标志物蛋白时所使用的试剂中，作为检测剂可以使用抗体和适体等。

作为免疫测定法，没有特别限定，可以举出各种的酶免疫测定法、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、双单克隆抗体夹心免疫测定、单克隆多克隆抗体夹心免疫测定、免疫染色法、免疫荧光法、蛋白质印迹法、生物素-亲和素法、免疫沉淀法、胶体金凝集法、免疫色谱法、胶乳凝集法(LA)、免疫比浊法(TIA)等。

作为在免疫测定法中使用的试剂，可以使用已在销售的抗NPC2抗体、抗IGFBP7抗体作为检测剂，也可以基于公知的NPC2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和IGFBP7的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)通过常规方法制备抗体。可以是特异性地识别NPC2、IGFBP7各自的氨基酸序列结构的抗体，也可以是特异性地识别包括各自糖链和二硫键、磷酸化等翻译后修饰的整个结构的抗体。

只要是可以检测NPC2蛋白、IGFBP7蛋白的抗体，则所来源的动物物种和克隆没有特别限定。可以举出来源于兔、山羊、小鼠、大鼠、豚鼠、马、绵羊、骆驼、鸡等的抗体，单克隆抗体和多克隆抗体均可以。此外，可以使用适于特异性结合于NPC2蛋白、IGFBP7蛋白的所有亚类的抗体。当然也可以使用重组抗体、Fab、Fab'或F(ab')2片段这样的片段。

作为本发明的动脉硬化相关疾病的检测剂或动脉硬化的评价剂，还可以使用与NPC2蛋白、IGFBP7蛋白具有结合性的适体。在适体的制造时，通过已知的方法从公知的NPC2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和IGFBP7的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)对可结合的DNA或者RNA或它们的诱导体即核酸适体和由氨基酸构成的肽适体进行合成并使用即可。在测定时，可以通过发光法和荧光法、表面等离子体共振法检测适体的结合。

作为质谱法，没有特别限定，可以利用将使用电喷雾电离法(ESI)、基质辅助激光解吸电离法(MALDI)、表面增强激光解吸电离法(SELDI)等的离子源与飞行时间型分析仪(TOF)、离子阱型分析仪(IT)、傅立叶变换型分析仪(FT)等进行组合的质谱仪。可以使用将质谱仪与高速液相色谱(HPLC)或毛细管电泳(CE)等分离装置连接而成的LC-MS和CE-MS等。此外，作为质谱数据的获得方法，可举出：数据非依赖性分析(DIA)、数据依赖性分析(DDA)、多反应监测方法(MRM)等。质谱中还包括对试样进行iTRAQ试剂(SCIEX公司)等的稳定同位素标记的情况。

在进行本发明的动脉硬化相关疾病检测或动脉硬化的进展程度的评价时所需要的各种试剂，可以预先包装在试剂盒中。例如，作为试剂盒提供如下：(i)作为捕获抗体对本发明的标志物蛋白有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体；(ii)作为检测抗体对本发明的标志物蛋白有特异性的酶标记单克隆抗体或多克隆抗体；(iii)底物溶液等必要的试剂。

实施例

下面，示出本发明的实施例，本发明并不限于这些实施例。

〔实施例1〕

血清NPC2值与maxIMT值、有无斑块的关系

将主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症和心肌梗塞患者作为受试者，进行与利用ELISA法测定NPC2的血清浓度、利用超声检查的颈动脉球部的maxIMT值和利用颈动脉超声检查的斑块发现(有无斑块)的比较。NPC2是使用NPC2 ELISA试剂盒(AvivaSystems Biology公司)并按照试剂盒附带的操作方案进行测定的。maxIMT值是利用佳能医疗系统株式会社制造的Aplio系列测定包括颈动脉球部斑块在内的最大壁厚。在超声检查中，将确认到存在斑块的组作为有斑块(Plaque)组、将未确认到明显的斑块的组作为无斑块组，由此作为有无斑块的判定。

详细地，利用ELISA法的NPC2浓度测定是在抗NPC2抗体的固相板添加稀释的血清样本并温育。然后，除去样本液，添加生物素标记的抗NPC2抗体并温育。在温育后进行洗涤操作，添加HRP(Horseradish peroxidase，辣根过氧化物酶)标记的亲和素并温育。接着，进行洗涤操作，添加TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液进行显色反应，然后添加终止液，使用酶标仪(SpectraMax M2e，Molecular Devices公司)在主波长450nm、副波长540nm下进行测定。从由同时测定的各标准液的测定数据制作的校准曲线计算针对该数据的浓度，并测定NPC2浓度。

血清NPC2值与maxIMT值的相关分析是将动脉硬化相关疾病23例(下肢动脉硬化性闭塞症14例、心肌梗塞9例)作为受试者来进行的。其结果：血清NPC2值与maxIMT值的相关系数为0.151(p＝0.491)(图1-1：横轴的B_maxIMT表示分叉部(Bifurcation)(颈动脉球部)maxIMT)。

血清NPC2值与maxIMT值的趋势分析如下进行：对于主动脉瘤(包括胸主动脉瘤、腹主动脉瘤和胸腹部复合发病的主动脉瘤。在以下全部的实施例中也相同)48例，从maxIMT低值侧起依次分为低值组(low group)12例、中等值1组(middle1 group)12例、中等值2组(middle2 group)12例、高值组(high group)12例的4组，考察各组的血清NPC2值。使用Jonckheere-Terpstra检验进行趋势性的差异显著性检验。如图1-2所示，确认到maxIMT值越高，则血清NPC2值越趋于高值。

血清NPC2值与有无颈动脉斑块的比较分析如下进行：对于合计84例(主动脉瘤52例、主动脉夹层10例、下肢动脉硬化性闭塞症14例、心肌梗塞8例)，分成无斑块、有斑块的2组，考察各组的血清NPC2值。统计处理中使用了Mann-Whitney的U检验。如图1-3所示，在颈动脉有斑块组中，血清NPC2值为显著性高值(p＝0.013)。

〔实施例2〕

血清NPC2值与baPWV值的关系

将主动脉瘤、主动脉夹层、下肢动脉硬化性闭塞症和心肌梗塞患者作为受试者，利用ELISA法测定NPC2的血清浓度，进行与baPWV值的比较。NPC2的血清浓度是按照与实施例1中记载的方法进行测定的。baPWV值是利用日本COLIN株式会社制造的BP-203RPEII(Exceed)进行测定的。

血清NPC2值与baPWV值的比较分析如下进行：对于合计85例(主动脉瘤49例、主动脉夹层11例、下肢动脉硬化性闭塞症8例、心肌梗塞17例)，将baPWV的临界值作为1400(cm/s)或1700(cm/s)分为2组，考察各组的血清NPC2值。统计处理中使用了Mann-Whitney的U检验。如图2-1和2-2所示，在baPWV高值的组中，血清NPC2值为显著性高值(临界值1400(cm/s)时：p＝0.014，临界值1700(cm/s)时，p＝0.031)。

由于存在颈动脉斑块、在baPWV高值组中为显著性高值化(实施例1和2)，因此表明血清NPC2值可能成为动脉硬化发展和动脉硬化相关疾病的标志物。

〔实施例3〕

血清IGFBP7值与maxIMT值、有无斑块的关系

将与实施例1相同的患者作为受试者，利用ELISA法测定IGFBP7的血清浓度，进行与利用超声检查的颈动脉球部的maxIMT值和利用颈动脉超声检查的斑块发现(有无斑块)的比较。IGFBP7使用用于胰岛素样生长因子结合蛋白7的ELISA试剂盒(cloud-clone公司)，并按照试剂盒附带的操作方案进行了测定。maxIMT值测定、有无斑块的判定按照实施例1中记载的方法进行。

详细地，在利用ELISA法的IGFBP7浓度测定是在抗IGFBP7抗体的固相板添加稀释的血清样本并温育。然后，除去样本液，添检测试剂A液并温育。在温育后进行洗涤操作，添加检测试剂B液并温育。接着，进行洗涤操作，添加TMB溶液进行显色反应，然后添加终止液，使用酶标仪(SpectraMax M2e、Molecular Devices公司)在主波长450nm、副波长540nm下进行测定。从由同时测定的各标准液的测定数据制作的校准曲线计算针对该数据的浓度，并测定IGFBP7浓度。

血清IGFBP7值与maxIMT值的相关分析结果、血清IGFBP7值与maxIMT值与相关系数R＝0.503显著性(p＝0.015)相关(图3-1：横轴的B_maxIMT表示分叉部(颈动脉球部)maxIMT)。此外，血清IGFBP7值与maxIMT值的趋势分析的结果如图3-2所示，表示maxIMT值越高，则血清IGFBP7值越趋于显著性高值(p<0.05)。而且，血清IGFBP7值与有无颈动脉斑块的比较分析的结果如图3-3所示，确认到在颈动脉有斑块的组中血清IGFBP7趋于高值。

如上所述，血清IGFBP7值与颈动脉球部maxIMT值显著相关，由于颈动脉球部maxIMT值越高，血清IGFBP7值越为显著性高值，因此表明可能成为动脉硬化发展和动脉硬化相关疾病的标志物。此外，由实施例1～3的数据中，显示出NPC2、IGFBP7分别与不同的动脉硬化进展的指标具有更强的关联性。即，通过组合这些NPC2、IGFBP7来进行检查，有望获得更详细的动脉硬化的进展程度信息。

〔比较例1〕

血清CRP值与maxIMT值、有无斑块的关系

将与实施例1相同的患者作为受试者，利用ELISA法测定CRP的血清浓度，进行与利用超声检查的颈动脉球部的maxIMT值和利用颈动脉超声检查的斑块发现(有无斑块)的比较。CRP的测定试剂中使用了C反应性蛋白试剂盒CRP-latex X2“生研”NX(Denka生研株式会社)，测定装置中使用了LABOSPECT 008日立自动分析装置和7180型日立自动分析装置(日立高新技术公司)。maxIMT值测定和有无斑块的判定按照实施例1中记载的方法进行。

血清CRP值与maxIMT值的相关分析结果、血清CRP值与maxIMT值的相关系数为-0.274(p＝0.207)(图4-1：横轴的B_maxIMT表示分叉部(颈动脉球部)maxIMT)。此外，血清CRP值与maxIMT值的趋势分析的结果如图4-2所示，在血清CRP值与maxIMT值之间未确认到趋势性。而且，血清CRP值与有无颈动脉斑块的比较分析的结果如图4-3所示，未确认到在血清CRP值与有无颈动脉斑块间存在相关性。

〔比较例2〕

血清CRP值与baPWV值的关系

将与实施例2相同的患者作为受试者，利用ELISA法测定CRP的血清浓度，进行与baPWV值的比较。CRP的血清浓度测定按照比较例1中记载的方法进行，baPWV值测定按照实施例2中记载的方法进行。

如图5-1和5-2所示，在临界值1400(cm/s)时，血清CRP值在baPWV高值组中为显著性高值(p＝0.024)，但在临界值1700(cm/s)时，未确认到相关性。

根据以上的实施例1～3、比较例1、2，表明NPC2、IGFBP7均作为动脉硬化发展和动脉硬化相关疾病标志物，是比CRP相比有用的标志物。

〔实施例4〕

非动脉硬化性胸主动脉瘤患者和动脉硬化性胸主动脉瘤患者中的血清样本中的NPC2、IGFBP7的比较(ELISA法)

为了确认作为NPC2、IGFBP7的动脉硬化相关疾病标志物的有用性，进行了非动脉硬化性胸主动脉瘤(遗传性结缔组织疾病)患者和动脉硬化性胸主动脉瘤患者的血清中的NPC2值、IGFBP7值的测定。NPC2按照实施例1中记载的方法进行测定，IGFBP7按照实施例3中记载的方法进行测定。统计处理中使用了StatFlex ver6.0(Artec公司)，差异显著性检验中使用了Mann-Whitney U检验。

如图6-1所示，NPC2在健康者(44例)、非动脉硬化性胸主动脉瘤患者(20例)和动脉硬化性胸主动脉瘤患者(29例)中分别为2.91±2.01ng/mL、3.02±3.21ng/mL、9.03±4.37ng/mL，与非动脉硬化性胸主动脉瘤患者相比，在动脉硬化性胸主动脉瘤患者中也为高值。因此，表明NPC2是动脉硬化相关疾病的有用标志物。

如图6-2所示，IGFBP7在健康者(44例)、非动脉硬化性胸主动脉瘤患者(20例)和动脉硬化性胸主动脉瘤患者(29例)分别为139.20±28.47ng/mL、187.25±58.97ng/mL、291.96±316.83ng/mL，与非动脉硬化性胸主动脉瘤患者相比，在动脉硬化性胸主动脉瘤患者中也为高值。因此，表明IGFBP7也是动脉硬化相关疾病的有用标志物。

工业上的可利用性

通过使用作为本发明的动脉硬化相关疾病和动脉硬化进展新型标志物的NPC2和/或IGFBP7，能够高灵敏度地检测动脉硬化的进展和动脉硬化相关疾病的发病。因此，使用本发明的动脉硬化相关疾病标志物或动脉硬化进展标志物的测定试剂和试剂盒可以用于动脉硬化相关疾病或动脉硬化发病的筛查和早期诊断、动脉硬化进展程度的监测、动脉硬化相关疾病复发风险评价、将来发病风险的评价、预防药物和治疗药物的开发、评价等，此外，本发明可以在制造该测定试剂和试剂盒的工业中得到利用。

本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文并入本说明书中。

序列表

<110> 荣研化学株式会社

国立研究开发法人国立循环器病研究中心

<120> 动脉硬化及动脉硬化相关疾病标志物

<130> PH-7840-PCT

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 151

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Arg Phe Leu Ala Ala Thr Phe Leu Leu Leu Ala Leu Ser Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ala Glu Pro Val Gln Phe Lys Asp Cys Gly Ser Val Asp Gly

20 25 30

Val Ile Lys Glu Val Asn Val Ser Pro Cys Pro Thr Gln Pro Cys Gln

35 40 45

Leu Ser Lys Gly Gln Ser Tyr Ser Val Asn Val Thr Phe Thr Ser Asn

50 55 60

Ile Gln Ser Lys Ser Ser Lys Ala Val Val His Gly Ile Leu Met Gly

65 70 75 80

Val Pro Val Pro Phe Pro Ile Pro Glu Pro Asp Gly Cys Lys Ser Gly

85 90 95

Ile Asn Cys Pro Ile Gln Lys Asp Lys Thr Tyr Ser Tyr Leu Asn Lys

100 105 110

Leu Pro Val Lys Ser Glu Tyr Pro Ser Ile Lys Leu Val Val Glu Trp

115 120 125

Gln Leu Gln Asp Asp Lys Asn Gln Ser Leu Phe Cys Trp Glu Ile Pro

130 135 140

Val Gln Ile Val Ser His Leu

145 150

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Thr Cys

20 25 30

Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys

35 40 45

Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala

50 55 60

Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly

85 90 95

Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val

100 105 110

Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro

115 120 125

Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly

130 135 140

Glu Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro

145 150 155 160

Ser Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln

165 170 175

Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile

180 185 190

Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu

195 200 205

Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro

210 215 220

Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys

225 230 235 240

Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln

245 250 255

Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile

260 265 270

Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu

275 280

Claims

1.一种用于检测动脉硬化相关疾病的方法，该方法包括：在从受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

2.一种用于检测或筛查动脉硬化相关疾病复发的方法，该方法包括：在从具有动脉硬化相关疾病复发风险的受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

3.一种用于检测或筛查将来有动脉硬化相关疾病发病风险的受试者的方法，该方法包括：在从受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

4.一种评价动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物效果的方法，该方法包括：

在给予动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物前，在从需要预防或治疗动脉硬化相关疾病或动脉硬化的受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤；

在给予动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物后，在从所述受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤；

或者，该方法包括：在给予动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物后，从需要预防或治疗动脉硬化相关疾病或动脉硬化受试者在按时间顺序两个以上的时间点得到的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述动脉硬化相关疾病选自由下列组成的组：心肌梗塞、外周动脉疾病、主动脉瘤、主动脉夹层、动脉粥样硬化性脑梗塞、短暂性脑缺血发作、肾动脉狭窄、颈内动脉狭窄、心绞痛。

6.一种用于评价动脉硬化进展程度的方法，该方法包括：在从受试者获得的试样中，测定以下1)和/或2)的步骤：

1)NPC2(尼曼-匹克病C2型)蛋白；

2)IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)蛋白。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，试样选自由下列组成的组：血清、血浆、血液、尿和唾液。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述受试者是需要预防或治疗动脉硬化相关疾病或动脉硬化的动物，所述方法以所述NPC2蛋白和/或IGFBP7蛋白作为指标，来评价或判定动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物的效果。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，测定方法是免疫测定法或质谱法。

11.一种用于检测动脉硬化相关疾病的标志物，其包括以下的1)和/或2)：

1)NPC2蛋白；

2)IGFBP7蛋白。

12.根据权利要求11所述的标志物，其中，所述动脉硬化相关疾病选自由下列组成的组：心肌梗塞、外周动脉疾病、主动脉瘤、主动脉夹层、动脉粥样硬化性脑梗塞、短暂性脑缺血发作、肾动脉狭窄、颈内动脉狭窄、心绞痛。

13.一种用于评价动脉硬化进展程度的标志物，其包括以下的1)和/或2)：

1)NPC2蛋白；

2)IGFBP7蛋白。

14.一种用于检测动脉硬化相关疾病或用于评价动脉硬化进展程度的测定试剂，其包含用于测定权利要求11～13中任一项所述的标志物的抗体或适体。

15.根据权利要求14所述的测定试剂，其中，所述抗体是单克隆抗体和/或多克隆抗体。

16.一种用于检测动脉硬化相关疾病或用于评价动脉硬化进展程度的试剂盒，其包含权利要求14或15所述的测定试剂。

17.根据权利要求11～16中任一项所述的标志物、测定试剂或试剂盒，其中，在用于检测动脉硬化相关疾病中或在用于评价动脉硬化进展程度中使用的试样选自由下列组成的组：血清、血浆、血液、尿和唾液。

18.根据权利要求11～13中任一项所述的标志物用于筛查动脉硬化相关疾病或动脉硬化的预防药物或治疗药物的用途。

19.根据权利要求11～13中任一项所述的标志物用于体外检测或筛查动脉硬化相关疾病复发的用途。

20.根据权利要求11～13中任一项所述的标志物用于体外检测或筛查将来有动脉硬化相关疾病发病风险的受试者的用途。