CN113640263A - 葡萄糖醛酸功能化金纳米簇lb膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜及其制备方法和应用。所述的葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜是由葡萄糖醛酸对人血清白蛋白保护的金纳米簇进行功能化所得的葡萄糖醛酸功能化金纳米簇再经LB技术得到的薄膜。申请人在实验中发现，将该LB膜用于人血清中纳摩尔水平游离胆红素含量的荧光检测时，不仅可以重复使用，而且抗干扰能力强、灵敏度高，在1.00nM～5.00μM的浓度范围内，猝灭效率与游离胆红素浓度的对数呈良好的线性关系，检测限为(2.70±0.14)×10‑1nM(S/N＝3)。
Description
技术领域
本发明涉及一种葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜及其制备方法和应用，属于生物检测技术领域。
背景技术
胆红素(BR)作为血红素分解代谢的最终产物，大部分(70～90％)来自血红蛋白的降解，少量来自其他血红蛋白，如细胞色素P450同工酶、肌红蛋白等。胆红素以未结合和结合胆红素形式存在于血清中。未结合的胆红素包括游离胆红素(fBR)和与血清白蛋白结合的胆红素。游离胆红素具有亲脂性，可自由穿透细胞膜，损伤细胞、组织和器官。由于胆红素在水中溶解性差，它通过与血清白蛋白形成复合物在血液中循环。fBR进入肝细胞后，胆红素从胆红素-白蛋白复合物中分离，与葡萄糖醛酸结合，随胆汁排出。血清胆红素是肝脏和血液疾病的重要诊断指标。作为一种内源性抗氧化剂，它也与冠心病、动脉粥样硬化、肺癌等疾病有关。
目前血清胆红素的测定方法主要有重氮试剂光度法、氧化酶法、化学氧化法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。这些方法或多或少存在容易受到溶血和血脂的干扰、设备昂贵或技术要求高等缺点。如，在氧化酶法测试中，工具酶的催化活性容易受到环境因素的影响。近年来，人们已经认识到胆红素水平与心血管疾病和癌症的风险呈负相关。预防医学中要求检测纳摩尔水平的fBR以评估健康状况，因为血液中的fBR浓度通常低于100纳摩尔。
fBR的超灵敏测定仍然是一项具有挑战性的工作。目前关于纳摩尔水平胆红素检测的报道很少。Franko等人开发了一种亚纳摩尔水平的BR测定的高效液相色谱方法，该方法配备了热透镜检测器或二极管阵列检测器(M.Martelanc,L.
S.Passamontiand，M.Franko,Anal.Chim.Acta,2014,809,174.M.Martelanc,L.
S.Passamonti andM.Franko,Talanta,2016,154,92.)。有研究将人弹性蛋白样多肽与UnaG蛋白融合，得到一种新的工程蛋白。融合蛋白可以作为一种传感平台，在纳米尺度上监测细胞胆红素的释放。K.Shanmugaraj等人报道了基于共振能量转移的蓝光二氧化MoS2量子点测定胆红素，检测限(LOD)为2.1nM(K.Shanmugaraj and S.A.John,Spectrochim.Acta.A,2019,215,290.)。W.Zhao等人采用量子点聚集计数的方法，可以实现低至0.6nMfBR的超灵敏测定(W.Zhao,C.Zong,T.Lei,W.Tian,M.Sun,X.Liu,Q.Zhang and H.Gai,Sensor.Actuat.B.Chem.,2018,275,95.)，具体方法是用人血清白蛋白(HSA)修饰量子点识别fBR，均相的HSA-QDs-fBR配合物在聚乙烯亚胺加入后被诱导聚集，利用单分子光谱成像显微镜测定了量子点的聚集比。另一种超灵敏的胆红素传感方法是基于表面增强拉曼光谱，其基质为Ag@Fe2O3杂化材料和3D MoS2纳米花(D.Xu,L.Duan,W.Jia,G.Yang and Y.Gu,Microchem.J.,2021,161,105799.S.S.Singha,S.Mondal,T.S.Bhattacharya,L.Das,K.Sen,B.Satpati,K.Das andA.Singha,Biosens.Bioelectron.,2018,119,10.)。
蛋白质保护的金纳米簇(AuNCs)具有合成条件温和、光稳定性好、生物相容性好、易于功能化等优点，在离子传感、生物分子识别和细胞成像等领域有着广泛的应用。在传感应用中，AuNCs通常分散在溶液中作为荧光探针，这种均相荧光探针在存储过程中可能由于聚集而导致荧光减弱。与均相溶液相比，基于AuNCs的薄膜传感器具有可重复使用、发光稳定、存储时间较长和易于集成到设备中等优势。用传统方法获得的AuNCs荧光膜已有报道。如AuNCs可以通过旋转涂膜、表面修饰或包埋在聚苯乙烯、聚多巴胺和聚乙烯醇等聚合物基体中制备固体薄膜(D.Qu,J.Zhang,G.Chu,H.Jiang,C.Wu and Y.Xu,J.Mater.Chem.C,2016,4,1764.R.H.Wu,S.H.Yau and T.Goodson III,ACS Nano,2016,10,562.Z.Li,W.Xiao,R.Huang,Y.Shi,C.Fang and Z.Chen,Sensors,2019,19 1726.)。Lin等利用牛血清白蛋白(BSA)在其等电点下的成膜特性制备了用于Cu2+传感的AuNCs膜(Z.Lin,F.Luo,T.Dong,L.Zheng,Y.Wang,Y.Chi and G.Chen,Analyst,2012,137,2394.)。由于薄膜厚度为微米级级别，这些传统方法获得的膜具有较低的传质速率和较长的响应时间。通过层层静电组装获得的超薄膜具有响应速度快、灵敏度高的特点。但是金纳米团簇在薄膜中的空间分布是无序的，导致传感器的灵敏度有限。目前尚未见有利用葡萄糖醛酸功能化金纳米簇并进一步制成LB膜用于血清中纳摩尔水平游离胆红素含量检测的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可重复用于血清中纳摩尔水平游离胆红素含量检测，且抗干扰能力强、灵敏度高的葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜及其制备方法，以及在检测胆红素含量中的应用。
本发明所述的葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜，它是由葡萄糖醛酸对人血清白蛋白保护的金纳米簇进行功能化所得的葡萄糖醛酸功能化金纳米簇再经LB(Langmuir-Blodgett)技术得到的薄膜。
本发明所述葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜的制备方法，包括以下步骤：
1)制备人血清白蛋白保护的金纳米簇(在本申请中也简称为HSA-AuNCs)；
2)用葡萄糖醛酸对人血清白蛋白保护的金纳米簇进行功能化，得到葡萄糖醛酸功能化金纳米簇(在本申请中也简称为GluA@AuNCs)；其中，功能化反应在pH＝7.0～7.6的PBS缓冲液中进行；
3)所得葡萄糖醛酸功能化金纳米簇采用LB技术成膜，即得到葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜(在本申请中也简称为GluA@AuNCs LB膜或LB膜)。
上述制备方法的步骤1)中，采用现有常规方法或参考现有文献(J.Xie,Y.Zhengand J.Y.Ying,J.Am.Chem.Soc.,2009,131,888.)制备人血清白蛋白保护的金纳米簇。
上述制备方法的步骤2)中，所述功能化反应按现有常规操作进行，具体的，可以将葡萄糖醛酸和人血清白蛋白保护的金纳米簇分别溶于PBS缓冲液中再混合在一起进行功能化反应，也可以将葡萄糖醛酸或人血清白蛋白保护的金纳米簇先溶于PBS缓冲液中再加入人血清白蛋白保护的金纳米簇或葡萄糖醛酸，搅拌溶解后再进行功能化反应。功能化反应在黑暗条件下进行，温度优选为15～25℃，时间优选为10～12h。
上述制备方法的步骤2)中，所述功能化反应优选是在pH＝7.4的PBS缓冲液中进行，进一步优选PBS缓冲液的浓度≤100mmol/L，更优选PBS缓冲液的浓度为20～80mmol/L。所述PBS缓冲液的用量为满足在功能化反应时，人血清白蛋白保护金纳米簇能被充分溶解所需的量，具体的，可以按2mg人血清白蛋白保护的金纳米簇用2～5mLPBS缓冲液的比例计算。所述葡萄糖醛酸和人血清白蛋白保护的金纳米簇的摩尔比为100～1200：1，进一步优选为100～350：1，更优选为350：1。为了提高的偶联效率，通常在功能化反应时添加1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
上述制备方法的步骤3)中，所述LB技术成膜操作与现有技术相同，优选的，在采用LB技术成膜时，控制亚相的离子强度≤1mmol/L，以避免金簇团聚而不利于膜的铺展，在本申请中，进一步优选亚相的离子强度为0.2～1.0mmol/L。对于表面压力(即π值)和提拉速度等参数，可结合π-A等温线进行确定，在本申请中，优选表面压力为15～20mN/m，提拉速度为1～5mm/min，单层沉积温度为20±0.2℃；在一个具体的实施例中，选择表面压力为15mN/m，提拉速度为3mm/min。本申请中，所得的LB膜为Y型膜。
上述制备方法的步骤3)中，所述亚相为乙酸/乙酸钠缓冲液，由于HSA的等电点为4.7，因此，更具体的是pH＝4.7的乙酸/乙酸钠缓冲液。在等电点由于分子是中性的，溶解度较差，蛋白质可以较好地铺展在亚相表面，因此，界面上的物质可以更多地转移到基片上，使薄膜具有更高TR(转移比)和荧光强度。当pH低于或高于等电点时，蛋白质携带的净电荷会增加其在亚相中的溶解度，减少了界面吸附GluA@AuNCs的数量。因此，当亚相pH值偏离等电点时，薄膜的TR较差，荧光强度较低，不利于用于胆红素的荧光检测。
申请人将上述葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜用于血清中胆红素含量的荧光检测时，发现其不仅可以重复使用，而且抗干扰能力强、灵敏度高，因此，本发明还包括葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜在检测人血清中胆红素含量中的应用，更具体的是在荧光检测人血清中纳摩尔水平游离胆红素含量中的应用。在进行测定时，葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜与胆红素溶液或人血清的作用时间优选为150～200s。在沉积到基片上时，优选沉积的层数为≥4层，这样更容易获得强烈的荧光，满足胆红素测定的要求。
与现有技术相比，本发明提供了一种葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜及其制备方法，通过将葡萄糖醛酸基团引入AuNCs的HSA壳层中，增加BR的结合位点，从而提高所得LB膜的灵敏度。申请人在实验中发现，将该LB膜用于人血清中纳摩尔水平游离胆红素含量的荧光检测时，不仅可以重复使用，而且抗干扰能力强、灵敏度高，在1.00nM～5.00μM的浓度范围内，猝灭效率与游离胆红素浓度的对数呈良好的线性关系，检测限为(2.70±0.14)×10- 1nM(S/N＝3)。
附图说明
图1为HSA、HSA-AuNCs和GluA@AuNCs的表征图谱；其中，(a)为HSA-AuNCs(3.5mg/mL)和GluA@AuNCs(0.33mg/mL)的荧光激发和发射光谱，(b)为HSA、HSA-AuNCs和GluA@AuNCs的红外光谱，(c)和(d)分别为HSA、HSA-AuNCs和GluA@AuNCs在Δλ＝15nm和Δλ＝60nm处的同步荧光光谱。
图2为GluA@AuNCs LB膜的表征图；其中，(a)为HSA、HSA-AuNCs和GluA@AuNCs的π-A等温线，(b)为GluA@AuNCs溶液和LB膜的发射光谱，(c)为亚相pH值对膜转移比和荧光强度的影响柱状图，(d)为表面压力对薄膜荧光强度的影响柱状图，(e)为薄膜荧光强度和吸光度与层数的关系曲线，(f)为2层LB膜的原子力显微镜图像。
图3为GluA@AuNCs LB膜对fBR的荧光传感；其中，(a)为传感器的响应平衡时间，(b)和(c)分别为pH和温度对传感器的荧光猝灭的影响曲线，(d)为薄膜在fBR浓度逐渐增大时的荧光发射光谱，(e)为荧光猝灭比F0/F与fBR浓度的关系，(f)为fBR标准曲线。
图4为传感器的抗干扰性和可重复利用性结果，其中，(a)为干扰实验(CBR＝2μM)，(b)为薄膜传感器对fBR检测的重复使用性(CBR＝0.6μM)。
图5为HSA-AuNCs的葡萄糖醛酸功能化示意图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
实施例1
1.实验部分
1.1仪器和试剂
氯金酸、HSA、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)由国药化学试剂有限公司(中国上海)供应。胆红素和D-葡萄糖醛酸来源于中国上海麦克林生化科技有限公司。所有其他化学品均为分析级试剂，使用时未进行纯化。整个实验使用超纯水(18.2MΩ)。
使用KSV NIMALB分析仪(KSV NIMA 2002)测定π-A(表面压力-平均分子面积)等温线并将单层膜沉积在基底上。运用JEOL 2100透射电镜下，在200kV加速电压下对HSA-AuNCs进行形态学表征。红外光谱由Thermo Nicolet 6700 FT-IR光谱仪采用KBr压片法记录。所有荧光测量都在日立F-4600荧光光谱仪(日立，日本)上进行。激发和发射的狭缝宽度为5nm。吸光度在日立UH5300紫外可见分光光度计上(日立，日本)测定。用Bruker DimensionIcon原子力显微镜(AFM)对LB膜进行表征。
1.2人血清白蛋白保护的金纳米簇(HSA-AuNCs)的制备
在37℃的磁力搅拌水浴锅的环境下，取5mL HSA(50mg/mL)和5mL氯金酸溶液(10mmol/L)混合，连续搅拌2min后，逐滴加入0.6mL的氢氧化钠溶液(1mol/L)，使混合溶液的pH＝12，在37℃的磁力搅拌水浴锅中继续搅拌反应8h，反应溶液由淡黄色变为深棕色，在365nm的紫外光灯下可明显的观察到红色的荧光。由此可知，已形成金纳米簇。
采用共沉淀法对纳米团簇进行纯化。将合成的深棕色溶液与10mM的氯化锌溶液按1：1的体积比混合，于16000rpm下离心15min，收集红褐色沉淀，然后将沉淀重新分散于PBS溶液(pH＝7.4,50mM)中，在纯水中透析(分子量截留35kDa)24h，以分离未反应物质，收集透析液，将透析液冷冻干燥，得到HSA-AuNCs，粉末保存于-20℃，以备后续使用。
1.3葡萄糖醛酸功能化金纳米团簇(GluA@AuNCs)的制备
用2mL PBS缓冲液(pH＝7.4,50mM)溶解上述制备的HSA-AuNCs(2mg)，得到HSA-AuNCs溶液，待用。
用2mL PBS缓冲液(pH＝7.4,50mM)溶解葡萄糖醛酸(2mg)，然后加入2mg EDC和3mgNHS，在37℃黑暗中搅拌15min，之后加入上述配制的HSA-AuNCs液(葡萄糖醛酸：HSA-AuNCs摩尔比350：1)，在25℃搅拌下反应过夜。所得溶液透析(MWCO 35kDa)，透析液冻干，得到GluA@AuNCs，-20℃保存。
1.4葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜(GluA@AuNCs LB膜)的制备
采用无荧光石英玻璃作为LB薄膜沉积基底。用丙酮、乙醇和水依次对底物进行超声波清洗30min。清洗后，石英在食人鱼(Piranha)溶液中回流，温度为90℃，持续10h。冲洗和干燥后，石英基片在5％(v/v)的全氟辛基三甲氧基硅烷溶液中室温浸泡12h。基片进一步在120℃下干燥1h，获得疏水表面。
以水为溶剂，加入适量的戊醇(戊醇在形成的GluA@AuNCs溶液中所占的体积比为0.03～0.1％，在本例中为0.05％)，制备浓度为0.1mmol/L的GluA@AuNCs溶液。通过添加戊醇促进GluA@AuNCs在空气/亚相界面上的铺展。铺膜亚相为乙酸/乙酸钠缓冲液(pH＝4.7)。亚相的离子强度保持在1mmol/L以下(优选为0.2～1.0mmol/L)。采用汉密尔顿微量注射器进行铺膜。单层膜材料在亚相表面扩展15min后，以1～5mm/min的提拉速度通过两个平行的滑障对单层进行压缩。本例中，以3mm/min的提拉速度将单层转移到疏水基体上，π值(表面压力)保持在15～20mN/m(本例中为15mN/m)。膜在空气中干燥15min后再进行下一次镀膜。单层膜沉积的温度为(20±0.2)℃。
1.5荧光法测定游离胆红素
制备胆红素储备液(171.0μM)：将0.1M氢氧化钠溶液加入到1mg胆红素粉末中使其溶解，然后用50mM pH＝7.4的PBS缓冲液稀释至10mL。
LB膜被安装在一个薄膜支架上，与激发光束呈45°角进行荧光测量。胆红素测定时，将不同浓度的胆红素溶液(50μL)滴加到GluA@AuNCs LB膜表面，相互作用150s。过量的液体用吸水纸吸去。在490nm激发时，记录LB薄膜在610nm处的荧光发射强度。
2.结果与讨论
2.1 HSA、HSA-AuNCs和GluA@AuNCs的表征
制备的HSA-AuNCs团簇为近球形，直径约为1.0nm。为了引入更多的游离胆红素结合位点，葡萄糖醛酸通过EDC/NHS偶联反应与HSA-AuNCs结合(如图5所示)。
图1a为HSA-AuNCs被葡萄糖醛酸功能化前后的荧光特性。HSA-AuNCs的两个激发峰分别出现在370nm和499nm处，两个发射峰分别出现在464nm和638nm，激发波长为370nm。在638nm处的强峰是Au25纳米团簇的典型发射峰。氧化蛋白在464nmnm处可能产生弱荧光发射。经过功能化处理后，HSA-AuNCs仍具有良好的荧光特性，其发射峰未发生变化，因此可作为胆红素测定的荧光探针。
采用红外光谱技术对葡萄糖醛酸功能化过程中蛋白质结构的变化进行了表征。游离HSA、HSA-AuNCs结合物和GluA@AuNCs的FTIR光谱相似(图1b)。3400cm-1附近的峰是蛋白质中酰胺A带的吸收。与游离HSA相比，HSA-AuNCs结合物和GluA@AuNCs的吸收峰分别蓝移至3300cm-1和3288cm-1。其酰胺I带(1652cm-1)和酰胺II带(1541cm-1)差异不大，说明葡萄糖醛酸功能化不会干扰HSA的二级结构。
采用同步荧光光谱法观察蛋白质的构象变化。同步荧光对芳香族氨基酸残基周围的微环境变化敏感。对于人血清白蛋白，荧光残基是酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)。在同步测量中，同时扫描激发和发射，同时保持两个波长之间的波长差恒定。Tyr的波长间隔为15nm,Trp的波长间隔为60nm。图1c和1d分别显示了在Δλ＝15nm和Δλ＝60nm处HSA、HSA-AuNCs和GluA@AuNCs的同步荧光光谱。HSA的典型发射峰出现在280nm左右。在Δλ＝15nm时，HSA在与AuNCs配位后的发射峰出现了轻微的蓝移，而在葡萄糖醛酸功能化后则出现了红移，这表明Tyr周围的微环境发生了变化。在Δλ＝60nm处，与自由的HSA相比，HSA-AuNCs发射峰由279nm红移至287nm。与葡萄糖醛酸结合使人血清白蛋白的发射峰又蓝移回到原位。峰位移说明色氨酸周围的微环境在功能化过程中受到了干扰。与HSA相比，在15nm和60nm的波长差下，HSA-AuNCs分别在378和332nm处出现了新的弱发射峰。对于GluA@AuNCs，在两个波长差扫描时都出现了两个同步荧光峰，当Δλ＝15nm时荧光峰的中心波长为339,406nm，Δλ＝60nm时其峰的中心波长为324,376nm。同步荧光实验结果证实了葡萄糖醛酸与AuNCs的成功结合。
2.2 GluA@AuNCs LB膜的制备与表征
Langmuir-Blodgett(LB)技术是通过控制Langmuir单层膜沉积到固体衬底上获得多层结构的有效途径。在传感器构建领域，LB膜也引起了研究人员的兴趣。人血白蛋白显示两亲性，因为它的表面含有大量的亲脂和亲水基团。两亲性使HSA能够在空气/水界面上吸附。获得GluA@AuNCs的荧光多层膜主要依赖于其蛋白保护层。图2a描绘了自由HSA、HSA-AuNCS结合物和GluA@AuNCs单分子膜在滑障压缩过程中的π-A等温线。等温结果表明，上述三种物质均能在亚相表面形成稳定致密的单分子层。
用LB法制备以石英玻璃为衬底的功能化AuNCs膜，首先要在亚相表面上铺展GluA@AuNCs，然后将单层转移到疏水基片上。如图2b所示，GluA@AuNCs LB膜具有以610nm为中心的尖锐发射峰，激发波长为490nm。与溶液中的GluA@AuNCs 638nm的荧光发射峰相比，LB薄膜的发射峰蓝移至610nm。发射峰蓝移的原因可能是，当蛋白质保护的金纳米簇被排列成高度有序和致密的薄膜时，分子振动受到限制。与均匀溶液相比，相邻团簇之间的相互作用增强，可能会改变能级从而荧光发射峰蓝移。
我们的目标是获得稳定的具有优异荧光性能的LB膜。通过优化亚相pH值和表面压力等实验条件，提高了薄膜的转移比和荧光性能。在不同的亚相pH下制备了六层LB膜，平均单层转移比(TR)和荧光强度如图2c所示。在pH＝4.7的亚相条件下获得的薄膜具有优良的转移比和强烈的荧光。HSA的等电点为4.7。在等电点，由于分子是中性的，溶解度较差，蛋白质可以聚集在亚相表面。因此，界面上的物质可以更多地转移到基片上，使薄膜具有更高TR和荧光强度。当pH低于或高于等电点时，蛋白质携带的净电荷会增加其在亚相中的溶解度，减少了界面吸附GluA@AuNCs的数量。因此，当亚相pH值偏离等电点时，薄膜的TR较差，荧光强度较低。
π-A等温线表明，蛋白质分子在压缩过程中经历了从气体到液体到固体的相变。表面压力直接影响分子的排列和膜的紧致性，因此在膜的转移过程中需要考虑表面压力。在10、15、18、20mN/m的表面压力下，将GluA@AuNCs单分子膜转移到硅烷化玻璃上制备了Langmuir-Blodgett薄膜。如图2d所示，膜的发射强度随着表面压的增加而线性增加。在较高的表面压力下压缩，单分子膜变得更加有序和致密。因此，在沉积过程中，更多的荧光分子转移到衬底上，导致更高的荧光发射。然而，由于仪器规格的限制，每次要铺展的材料量是一定的，过多的表面压力沉积不利于多层膜的制备。在接下来的实验中，我们在15mN/m的转移表面压力下制备LB膜。
为了检验多层膜在基底上的沉积是否均匀，我们测量了不同层数的LB膜的荧光强度(F,610nm)和吸光度(A,280nm)。显然，薄膜的荧光强度和吸光度都与层数有良好的线性关系(图2e)。图2f为pH 4.7，温度为20℃，表面压力为15mN/m时制备的沉积有两层GluA@AuNCs LB膜的AFM图像。虽然有一些聚集的区域，薄膜的表面是相对均匀的。该薄膜的相对均方根粗糙度为1.86±0.16nm。
2.3基于GluA@AuNCs LB膜的fBR荧光传感
建立了一种基于胆红素对GluA@AuNCs LB薄膜荧光猝灭的fBR分析方法。对平衡时间、温度、pH值等实验因素进行了优化，以改善薄膜对胆红素的响应。为确定LB膜对胆红素的平衡响应时间，将50μL的2nM和600nM BR溶液依次滴到LB膜上后，立即进行时间扫描，记录荧光强度随时间的变化。图3a清楚地表明，随着fBR反应时间的延长，薄膜的发射强度逐渐减小，150s后荧光强度趋于稳定。当薄膜与600nM fBR相互作用时，150s后荧光响应也达到平衡，荧光猝灭程度更大。根据实验结果，LB薄膜传感器对fBR的响应平衡时间150s。
为了获得了较高的fBR响应灵敏度，对溶液介质的pH值进行了优化。不同pH值的胆红素溶液与6层LB膜反应150s后记录荧光强度。介质pH对荧光猝灭效率F0/F的影响如图3b所示(F0和F分别为fBR加入前后的薄膜荧光强度)。在pH值为6.5～7.4时，荧光猝灭效率随pH值的增加而增加，在pH值为7.4时达到最高。在碱性介质中，AuNCs的蛋白保护层可能发生构型转变，不利于fBR的结合，导致灵敏度降低。pH值为7.4时的最佳响应灵敏度表明该传感膜适用于血清中fBR的检测。
在薄膜传感实验中应考虑温度效应。研究了温度对LB膜对fBR的荧光猝灭的影响，结果如图3c所示。可以看出，荧光猝灭效率F0/F随着温度从25℃升高到35℃略有增强，然后在35～37℃处达到稳定状态，当温度高于37℃时则下降。温度高于37℃不利于LB传感膜与fBR的结合。为了获得更高的响应，fBR的传感温度保持在37℃。
在上述条件下，研究了GluA@AuNCs LB薄膜对fBR传感的性能。图3d显示，纳摩尔浓度的胆红素可以导致LB膜显著的荧光猝灭。随着胆红素浓度的升高，薄膜的发射强度随之降低。荧光猝灭效率与fBR浓度呈s型关系(图3e)。当胆红素浓度低于60nM时，F0/F比值随胆红素浓度的增加呈直线上升。当胆红素浓度大于60nM时，随着胆红素浓度的增加，F0/F比值的增大趋于平缓，最终趋于饱和。在1.00nM～5.00μM的浓度范围内，F0/F值与fBR浓度的对数具有良好的线性关系。检出限为(2.70±0.14)×10-1nM(S/N＝3)。
GluA@AuNCs LB膜对BR的传感机理可以通过BR与金纳米簇HSA保护层的作用来解释。蛋白质与BR的结合可能减弱了金纳米团簇与HSA的相互作用，导致膜的荧光猝灭。为了提高膜对fBR的传感灵敏度，我们将葡萄糖醛酸基团引入AuNCs的HSA壳层中，增加BR的结合位点。BR与HSA的络合反应可以用以下反应描述:
HSA+n(BR)→[HSA-BR]n
用Scatchard公式估计HSA-BR复合物的结合位点数(n)，公式为:
log10(F0/F-1)＝log10K+n log10[BR]
式中K表示复合物的结合常数。
采用荧光滴定法测定了BR，以log10(F0/F-1)对log10[BR]作图，进行曲线拟合。结合位点n根据线性曲线的斜率计算。HSA-AuNCs和GluA@AuNCs的n值分别为1.08和1.61。结合位点数量的增加表明，在葡萄糖醛酸功能化后，GluA@AuNCs可以提供比HSA-AuNCs更多的fBR结合位点。本发明所述的LB传感膜可以检测到纳摩尔浓度水平的fBR。这种较高的灵敏度部分归因于传感膜中结合位点的增加。
本申请选择HSA保护的AuNCs作为荧光薄膜材料，利用LB技术获得超薄荧光膜。目前还未见有蛋白质包覆金纳米团簇LB膜制备的相关报道。为了提高HSA-AuNCs对fBR的结合能力，在制备膜前先用葡萄糖醛酸功能化HSA-AuNCs。表面压力可以直接控制单层分子的排列和取向。当纳米团簇被组装成2D/3D结构时时，相邻团簇的距离变得很近。偶极-偶极相互作用使二维/三维组合具有不同于孤立团簇的集体性质。这可能是LB膜对fBR具有更高灵敏度的原因。
2.4 LB膜的抗干扰性和可重复使用性
采用干扰试验研究了人血清中常见成分对胆红素检测的影响。果糖、葡萄糖、半乳糖、多巴胺、谷胱甘肽、血红素等物质(浓度均为100μM)在与浓度为2μM胆红素共存时，按上述程序检测。从图4a可以看出，这些共存物质对胆红素的测定没有干扰作用。
与均匀荧光探针相比，薄膜传感器的一个重要优点是可重用性。将50μL fBR溶液(0.6μM)滴在薄膜表面，反应2.5min，记录荧光强度后，用2mM的NaOH溶液轻轻洗涤薄膜，然后用纯水洗涤完成再生。从图4b可以看出，LB膜具有良好的重复使用性。
实验例1：人血清中fBR的测定
为进一步证实本发明所述LB膜用于胆红素定量测定的可行性，在优化的实验条件下对血清样本进行fBR测定。血清样本由中国广西桂林市当地医院提供。所有样品在测量前用PBS溶液(pH＝7.4,50mM)稀释5倍。将已知浓度的胆红素溶液加入到血清样品中，并按照上述步骤进行检测。表1列出了样品检测结果。良好的回收率说明本发明所述的LB膜可以直接测定人血清中的fBR。
表1：
Claims (9)
1.葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜，其特征是，它是由葡萄糖醛酸对人血清白蛋白保护的金纳米簇进行功能化所得的葡萄糖醛酸功能化金纳米簇再经LB技术得到的薄膜。
2.权利要求1所述的葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜的制备方法，包括以下步骤：
1)制备人血清白蛋白保护的金纳米簇；
2)用葡萄糖醛酸对人血清白蛋白保护的金纳米簇进行功能化，得到葡萄糖醛酸功能化金纳米簇；其中，功能化反应在pH＝7.0～7.6的PBS缓冲液中进行；
3)所得葡萄糖醛酸功能化金纳米簇采用LB技术成膜，即得到葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤2)中，所述功能化反应在pH＝7.4的PBS缓冲液中进行。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是，步骤2)中，所述PBS缓冲液的浓度≤100mmol/L。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是，步骤2)中，所述PBS缓冲液的浓度为20～80mmol/L。
6.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是，步骤2)中，所述葡萄糖醛酸和人血清白蛋白保护的金纳米簇的摩尔比为100～1200：1。
7.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征是，步骤3)中，在采用LB技术成膜时，控制亚相的离子强度≤1mmol/L，表面压力为15～20mN/m，提拉速度为1～5mm/min。
8.权利要求1所述葡萄糖醛酸功能化金纳米簇LB膜在检测人血清中胆红素含量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，在荧光检测人血清中纳摩尔水平游离胆红素含量中的应用。
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