CN113637596A - 酿酒酵母zb421及其应用 - Google Patents

酿酒酵母zb421及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株酿酒酵母ZB421及其应用。酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)ZB421，其已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：61681，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。本发明的有益效果包括：本发明提供的酵母菌株为酿酒酵母菌ZB421，该菌株能直接用于酱油或者酱的发酵，产生的乙酸乙酯和乙醇含量更高，所得酱油或者酱香气味更好。本发明的酿酒酵母菌ZB421可以采用流加发酵的方式快速得到大量菌体，将其流加发酵的产物接种至酱醪中，发酵效果更好，所得酱油或者酱风味更佳。

Description

酿酒酵母ZB421及其应用
技术领域
本发明涉及微生物培养及应用领域，具体为一株来源于酱油的酿酒酵母菌，使用高密度发酵技术培养后，所得酿酒酵母菌的高密度培养物在酱油或者酱酿造中的应用。
背景技术
酿酒酵母是目前发酵工业中使用非常广泛的一种酵母，主要用于馒头、面包以及其他食品酿造工业领域。酿酒酵母生长周期短，发酵能力强，容易进行大规模培养，含有多种蛋白质、氨基酸等生物活性物质，这些特点使得酵母在食品酿造领域的应用中一直是研究的主要对象。
目前，酱油或者酱中酿酒酵母的主要来源还是通过开放式环境带入，造成酱油或者酱中酿酒酵母的含量低，发酵效果不明显，对酱油或者酱发酵的香气风味提升较小。并且，传统应用在酱油或者酱酿造过程中的酿酒酵母中，大部分酿酒酵母容易老化，酵母活性较差，这主要是在高糖和高营养盐的环境下，酿酒酵母表现出耐受、生长停滞造成的，最终严重影响到了下游的酱油或者酱油的发酵过程，造成最终发酵酱油或者酱的香气较差。
为了解决酱油或酱中酵母含量偏低的问题，以取得品质较好的香气风味酱油或酱类产品，已有厂家采用自培方式向酱醅中添加酵母菌，取得了一定的使用效果，其中，自培方式几乎全部采用鲁氏酵母和球拟酵母，并且使用常规发酵扩培方式，即采用一次加料发酵，总体上存在酵母菌添加量偏低，产品性能良莠不齐，导致香气欠缺以及香气品质提高有限等缺点。目前酿酒酵母经高密度培养后用于酱油或者酱的制备还没有相关报道。因此，寻找新的酿酒酵母发酵菌株并进行高密度培养提高接种密度，以提升酱油的风味品质是十分有必要。
发明内容
鉴于以上背景技术，本发明的目的之一在于提供一株酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)ZB421，该菌株是发明人在前期工作中从佛山海天调味食品有限公司的酱醪中筛选得到，该菌株用于酱油或者酱发酵的过程中，乙酸乙酯和乙醇产量高，所得酱油或者酱风味佳。本发明的另一目的是通过酵母高密度扩培技术，即采取流加发酵这一扩培方式，提高酿酒酵母的生物量，实现大量扩培菌种，提高单位发酵体积的菌体浓度，以此获得的扩培产物接入酱醪中进行发酵，提升酱油或者酱风味。
本发明上述目的可以采用以下技术方案来实现：
一株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421，其已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61681，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种酱油或者酱的制备方法，所述制备方法包括将酿酒酵母菌接种于酱醪进行酱油发酵或者酱发酵的步骤；所述酿酒酵母菌为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421。
在其中一个实施例中，所述酿酒酵母菌的扩培方式采用流加发酵。
在其中一个实施例中，流加发酵的步骤包括：
提供混合物Ⅰ和混合物Ⅱ，所述混合物Ⅰ的组分包含硫酸镁、硫酸锌、酵母膏以及水，所述混合物Ⅱ的组分包含蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵、食盐、酵母膏以及水；
将所述酿酒酵母菌接种于所述混合物Ⅰ进行培养并于培养过程中流加所述混合物Ⅱ。
在其中一个实施例中，所述混合物Ⅰ中的所述组分的质量百分比为：硫酸镁0.8‰-1.2‰，硫酸锌0.3‰-0.5‰，酵母膏1.5‰-2.5‰，pH值为4.6-5.0。
在其中一个实施例中，所述混合物Ⅱ中的所述组分的质量百分比为：蛋白胨1.8％-2.2％，葡萄糖1.8％-2.2％，硫酸铵0.8％-1.2％，食盐2.8％-3.2％，酵母膏0.8％-1.2％，pH值为4.6-5.0。
在其中一个实施例中，流加发酵采用的条件包括：温度为28℃-32℃，时长为18h-22h，通气量为6L/min-10L/min。
在其中一个实施例中，酱油发酵的方式采用高盐稀态发酵。
作为本发明的又一方面，本发明提供一种酱油或者酱的制备方法，所述制备方法包括将酿酒酵母菌接种于酱醪进行酱油发酵或者酱发酵的步骤；所述酿酒酵母菌的扩培方式采用流加发酵。
其中一个实施例中，流加发酵的步骤包括：
提供混合物Ⅰ和混合物Ⅱ，所述混合物Ⅰ的组分包含硫酸镁、硫酸锌、酵母膏以及水，所述混合物Ⅱ的组分包含蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵、食盐、酵母膏以及水；
将所述酿酒酵母菌接种于所述混合物Ⅰ进行培养并于培养过程中流加所述混合物Ⅱ。
其中一个实施例中，所述混合物Ⅰ中的所述组分的质量百分比为：硫酸镁0.8‰-1.2‰，硫酸锌0.3‰-0.5‰，酵母膏1.5‰-2.5‰，pH值为4.6-5.0。
其中一个实施例中，所述混合物Ⅱ中的所述组分的质量百分比为：蛋白胨1.8％-2.2％，葡萄糖1.8％-2.2％，硫酸铵0.8％-1.2％，食盐2.8％-3.2％，酵母膏0.8％-1.2％，pH值为4.6-5.0。
其中一个实施例中，流加发酵采用的条件包括：温度为28℃-32℃，时长为18h-22h，通气量为6L/min-10L/min。
其中一个实施例中，酱油发酵的方式采用高盐稀态发酵。
作为本发明的又一方面，本发明提供如上所述的制备方法获得的酱油。
本发明的有益效果包括：
1.本发明提供的酵母菌株为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421，该菌株能直接用于酱油或者酱的发酵，产生的乙酸乙酯和乙醇含量更高，所得酱油或者酱香气味更好。
2.本发明的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421可以采用流加发酵的方式快速得到大量菌体，将其流加发酵的产物接种至酱醪中，发酵效果更好，所得酱油或者酱风味更佳。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421在YPD固体培养基平板上的菌落形态图；
图2为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421在显微镜下的细胞形态。
本发明提供的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421，已于2021年5月26日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61681；该菌株于2021年5月26日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年5月27日检测为存活菌株。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。一株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421，保藏编号为GDMCC NO：61681，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421菌株的形态学特征描述包括：
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421采用划线法接种在YPD固体培养基平板上，30℃条件下培养24h，菌落呈乳白色，菌体平滑，不反光，边缘整齐，菌落呈圆形，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421在YPD固体培养基平板上的菌落形态见图1。
在YPD液体培养基中，30℃条件下培养24h，菌体浑浊，无菌璞，不产膜，有香气，有发酵酒精气味。菌体在显微镜下观察，酵母细胞为球形或卵圆形，参见图2。
以上说明的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421是从佛山市海天(高明)调味食品有限公司酱醪中，经过大量的筛选、纯化获得的，主要包括如下步骤：
(1)纯化：取佛山市海天(高明)调味食品有限公司酱油发酵酱醪，梯度稀释；分别取各梯度稀释液，接种于含盐的YPD固体培养基培养，挑选单菌落分离纯化；
(2)初筛：将步骤(1)所得菌株接种于含酱油的筛选培养基培养，挑选增殖快并且发酵液具有令人愉悦的酱香气和醇香气的菌株；
(3)复筛：取步骤(3)所得菌株，接种于YPD液体培养基，制备种子培养液；将所述种子培养液接种于酱醪进行酱油发酵，检测香气成分并选择香气成分含量高的菌株。
由于酱油发酵过程中需要添加较多的盐分，盐分对酿酒酵母菌的生长影响有抑制作用，盐分主要是通过渗透压对酵母的生长产生较为严重的负面影响。本发明通过筛选酱油中已有的酿酒酵母菌，通过使用添加盐分的培养基以及添加酱油的筛选培养基，最终得到符合发酵要求的大量扩增酿酒酵母发酵物。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种酱油或者酱的制备方法，所述制备方法包括将酿酒酵母菌接种于酱醪进行酱油发酵或者酱发酵的步骤；所述酿酒酵母菌为上述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421。
在其中一个示例中，所述酿酒酵母菌的扩培方式采用流加发酵。可以理解的是，本发明所述的流加发酵为菌体高密度培养方法。本发明所述的高密度培养方法如下：
提供混合物Ⅰ和混合物Ⅱ，所述混合物Ⅰ的组分包含硫酸镁、硫酸锌、酵母膏以及水，所述混合物Ⅱ的组分包含蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵、食盐、酵母膏以及水；
将所述酿酒酵母菌接种于所述混合物Ⅰ进行培养并于培养过程中流加所述混合物Ⅱ。
本发明所述的扩培，即菌种扩大培养，是对保藏菌种进行活化和逐级繁殖培养，从而为发酵生产提供相当数量代谢旺盛并满足一定生理要求的微生物细胞(种子)的方法。
在其中一个示例中，所述混合物Ⅰ中的所述组分的质量百分比为：硫酸镁0.8‰-1.2‰，硫酸锌0.3‰-0.5‰，酵母膏1.5‰-2.5‰，pH值为4.6-5.0。例如所述混合物Ⅰ包含硫酸镁1‰、硫酸锌0.4‰、酵母膏2‰，pH值为4.8。在其中一个示例中，所述混合物Ⅱ中的所述组分的质量百分比为：蛋白胨1.8％-2.2％，葡萄糖1.8％-2.2％，硫酸铵0.8％-1.2％，食盐2.8％-3.2％，酵母膏0.8％-1.2％，pH值为4.6-5.0。例如所述混合物Ⅱ中的所述组分的质量百分比为：蛋白胨2％，葡萄糖2％，硫酸铵2％，食盐3％，酵母膏1％，pH值为4.8。
在其中一个示例中，流加发酵采用的条件包括：温度为28℃-32℃(例如28℃、30℃、32℃)，时长为18h-22h(例如18h、20h、22h)，通气量为6L/min-10L/min(例如6L/min、8L/min、10L/min)。本发明采用通气流加补料发酵方式，能快速的增加发酵液的湿重，提高发酵液的菌体密度。
可以理解的是，将所述酿酒酵母菌接种于所述混合物Ⅰ的过程中，所述酿酒酵母菌是以菌液的形式接入混合物Ⅰ，所述菌液的制备包括活化的步骤以及摇瓶培养的步骤；活化的步骤是将所述酿酒酵母菌的菌种接种于YPD固体培养基培养斜面上培养，摇瓶培养的步骤是将活化后的酿酒酵母菌接种于摇瓶种子培养基中培养。其中：YPD固体培养基包含1％酵母膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂粉以及水，pH值为4.2-4.5；摇瓶种子培养基包含1％酵母膏、2％蛋白胨、4％葡萄糖、硫酸铵1％、硫酸镁0.5％、硫酸锌0.5％、食盐3％-5％以及水，pH值为4.8；摇瓶培养的条件可以为30℃、220rpm条件下20h。本发明摇瓶种子培养基使用盐分3％-5％(例如3％)，通过食盐的添加防止杂菌的污染，同时使目标菌体逐步适应酱油发酵环境，便于后续的酱油发酵过程。
优选地，本发明所述的含盐的YPD固体培养基培养、含酱油的筛选培养基培养、混合物Ⅱ流加至混合物Ⅰ的混合体系中盐浓度可以控制3％，通过食盐的添加防止杂菌的污染，同时使目标菌体逐步适应酱油发酵环境，便于后续的酱油发酵或者酱发酵过程。
本发明上述流加发酵所得产物接种到酱醪中，发酵获得酱油或者酱具有浓郁的鲜香香气风味，能够显著提升酱油或者酱中乙酸乙酯含量并提升发酵产品的香气风味，该菌株遗传稳定，生长旺盛，适合工业化生产。可以理解的是，本发明对流加发酵所得产物接种到酱醪的浓度不做特别限定，适于酱油或者酱发酵即可，例如可以是5％(v/v)。
在其中一个示例中，酱油发酵的方式采用高盐稀态发酵。例如：将原料大豆和小麦粉通过圆盘制曲获得成曲，然后将曲料加入盐水进行发酵，当发酵体系中氨基酸态氮≥0.7g/100mL接种流加发酵所得产物，接种量为5％(v/v)，发酵10d，发酵管理按照常规方法进行。
流加发酵尽管已在酿酒酵母发酵中应用，但是，传统的流加发酵主要应用于发酵生产阶段，例如CN101429537A。然而，在大规模的发酵生产阶段引入流加发酵实现酿酒酵母高密度培养，设备要求高，技术难度大，生产工艺趋于复杂化，成本高。如何基于常规发酵生长实现酿酒酵母生物量的提升是目前亟待解决的技术问题。为此，本发明提供一种酱油的制备方法，该制备方法采用流加发酵对酿酒酵母菌酵母进行扩陪，然而接种至酱醪进行酱油发酵，该制备方法的酱油发酵采用常规发酵工艺即可。
作为本发明的又一方面，本发明提供一种酱油或者酱的制备方法，所述制备方法包括将酿酒酵母菌接种于酱醪进行酱油发酵或者酱发酵的步骤；所述酿酒酵母菌的扩培方式采用流加发酵。
其中一个示例中，流加发酵的步骤包括：
提供混合物Ⅰ和混合物Ⅱ，所述混合物Ⅰ的组分包含硫酸镁、硫酸锌、酵母膏以及水，所述混合物Ⅱ的组分包含蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵、食盐、酵母膏以及水；
将所述酿酒酵母菌接种于所述混合物Ⅰ进行培养并于培养过程中流加所述混合物Ⅱ。
其中一个示例中，所述混合物Ⅰ中的所述组分的质量百分比为：硫酸镁0.8‰-1.2‰，硫酸锌0.3‰-0.5‰，酵母膏1.5‰-2.5‰，pH值为4.6-5.0。
其中一个示例中，所述混合物Ⅱ中的所述组分的质量百分比为：蛋白胨1.8％-2.2％，葡萄糖1.8％-2.2％，硫酸铵0.8％-1.2％，食盐2.8％-3.2％，酵母膏0.8％-1.2％，pH值为4.6-5.0。
其中一个示例中，流加发酵采用的条件包括：温度为28℃-32℃，时长为18h-22h，通气量为6L/min-10L/min。
其中一个示例中，酱油发酵的方式采用高盐稀态发酵。
作为本发明的又一方面，本发明提供如上所述的制备方法获得的酱油或者酱。
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例中，所述盐、盐分等如无特别说明，均为食盐。
实施例1、筛选菌株
1、分离纯化
取佛山市海天(高明)调味食品有限公司酱油发酵酱醪，以质量比1:9加入无菌水制成悬浊液，然后用无菌生理盐水梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍后，分别取0.1mL上述稀释液涂布至含盐量3％的YPD固体培养基上，30℃培养24h，根据特定的微生物菌落形态挑选单菌落，并进行进一步划线分离纯化3次后，纯化后的菌株接种在斜面YPD琼脂培养基上进行保种。
YPD液体培养基：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖和水。YPD固体或斜面培养基中则另外添加2％琼脂。
2、菌株初筛
将上述经分离纯化、培养后的菌株接种至含酱油的筛选培养基中，于30℃、220rpm震荡培养24h，通过测定湿重值和香气感官鉴评，挑选在含盐培养基能够快速增殖且对发酵所得培养液经感官鉴评后风味优良、酯香更加浓郁的菌种为初筛合格菌株。其中：
含酱油的筛选培养基的制备包括如下步骤：酱油稀释10倍后，添加2％的葡萄糖、2％的酵母膏和1％酵母粉，调节pH为4.2，调节盐浓度至3％，温度30℃，220rpm，发酵20h。
湿重测定方法如下：
准确吸取发酵醪各10.0ml于两个预先已称好重量的离心管中，于离心机以4000r/min离心5分钟，倾去上清液，甩干，在分析天平上称重。
发酵醪湿重按下式计算：
Figure BDA0003227482550000111
式中：
X-------试样湿重，g/L；
W1-------空离心管加离心后试样的总质量，g；
W2-------空离心管的质量，g；
2×10-----吸取发酵醪的体积，ml。
表1、菌株的湿重测定结果
菌株编号 菌株湿重/g/L
ZB113 42.3
ZB224 45.3
ZB325 50.2
ZB467 38.2
ZB421 56.3
ZB654 38.6
ZB778 41.3
ZB885 50.3
香气鉴评方法：召集20名有丰富经验的酱油鉴评人员进行感官鉴评，对上述不同菌株的发酵培养液样品进行盲评，主要评价香气可接受度、鉴别酯香气和醇香气。
表2、发酵培养液的香气鉴评结果
菌株编号 是否有醇香 是否有酯香 香气是否愉悦
ZB113 是 是 否
ZB224 是 否 否
ZB325 是 是 是
ZB467 否 是 否
ZB421 是 是 是
ZB654 是 是 是
ZB778 是 否 是
ZB885 否 是 否
挑选具有较高发酵湿重值，并且发酵培养液香气浓郁，具有令人愉悦的酱香气和醇香气的菌株备用。
3、菌株复筛
将上述菌株ZB325、ZB421、ZB654共3株菌株的单菌落分别接种于YPD液体培养基中，30℃、220rpm震荡培养24h，得到上述菌株的种子培养液。
将种子培养液按5％(v/v)的添加量分别接种至酱醪发酵液体培养基中进行发酵，30℃、220rpm振荡发酵培养7d，发酵结束后，过滤取澄清酱油原液进行指标检测。
酱醪发酵液体培养基的制备包括如下步骤：取发酵酱油酱醪，其中氨基酸态氮≥0.7g/100mL，总酸≥1.6g/100mL，盐度15％，过滤，取上清液即为酱醪发酵液体培养基。
采用SPME-GC-MS检测上述酱油原液中的香气物质，检测参数如下：
SPME条件：CAR/PDMS萃取头；萃取温度：35℃；取样量：5g；平衡时间：10min；萃取时间：30min；脱附时间：20min；GC条件：进样口温度：250℃，不分流进样；色谱柱：VF-WAX 60m×0.25mm×50μm；升温程序如表3：
表3、SPME-GC-MS检测参数
Figure BDA0003227482550000121
Figure BDA0003227482550000131
检测器：MS，离子源温度：250℃；四级杆温度：150℃。
表4、香气成分结果(半定量检测，以空白组香气物质峰面积为100％计)
项目 乙醇/g/100mL
CAS Number 64-17-5
空白组 0.5
ZB325 1.04
ZB421 1.57
ZB654 1.36
备注：以不接种任何种子培养液的发酵组作为空白组。
从上表4的结果可以看出，优选产乙醇含量最高的菌株ZB421进行后续试验。
3、菌株鉴定
本发明提供的酿酒酵母菌ZB421具有以下形态特征：
酿酒酵母ZB421在YPD固体培养基平板上，在30℃条件下培养24h，菌落呈乳白色，表面平滑，不透明，不反光，边缘整齐，圆形，菌落直径1mm-2mm。见图1。
在YPD液体培养基中，30℃条件下培养24h，菌体浑浊，无菌璞，不产膜，有酯香，无不良气味。菌体在显微镜下观察，酵母细胞为球形或卵圆形。见图2。
本发明提供的酿酒酵母ZB421菌株的生理生化实验结果如表5所示。
表5、生理生化试验结果
Figure BDA0003227482550000132
提取上述所筛选酿酒酵母ZB421菌株的基因组，利用18S ITSrDNA测序等实验数据综合分析，该菌株被鉴定为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，菌株ZB421的18SITSrDNA序列如下SEQ ID No.1所示：
GCAATTTATACAGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTCCTTTACTACATGGTATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTTAAAATCTCGACCCTTTGGAAGAGATGTATTTATTAGATAAAAAATCAATGTCTTCGGACTCTTTGATGATTCATAATAACTTTTCGAATCGCATGGCCTTGTGCTGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTAATTCAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACGATACAGGGCCCATTCGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATGTAAATACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTTGGGCCCGGTTGGCCGGTCCGATTTTTTCGTGTACTGGATTTCCAACGGGGCCTTTCCTTCTGGCTAACCTTGAGTCCTTGTGGCTCTTGGCGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCGTATTGCTCGAATATATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCATCGTAATGATTAATAGGGACGGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGTGGTGTTTTTTTAATGACCCACTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTACTAAATAGTGGTGCTAGCATTTGCTGGTTATCCACTTCTTAGAGGGACTATCGGTTTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGACGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTCTAACCTTGGCCGAGAGGTCTTGGTAATCTTGTGAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGTAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTAGTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCAGGATCTGCTTAGAGAAGGGGGCAACTCCATCTCAGAGCGGAGAATTGGACAAAC
该序列分析证明筛选得到的菌株是酿酒酵母。
4、菌株培养
(1)低温保藏的酿酒酵母ZB421菌株接种在斜面活化培养基(YPD固体培养基)上，生化培养箱培养，培养温度30℃，培养时长24h，得到活化的酿酒酵母菌体；
酵母活化使用的YPD固体培养基，配方：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，加入2％琼脂粉，加水配料，调节发酵液pH值为4.2-4.5；
酵母活化使用的YPD固体培养基，配制方法包括如下步骤：
a、溶解10g酵母膏，20g蛋白胨于900mL水中，升温，加入20g琼脂粉，调节pH值4.2-4.5；
b、高压115℃、15min；
c、加入100mL葡萄糖溶液，含20g葡萄糖(即葡萄糖溶液灭菌后加入)。
注：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。葡萄糖可以过滤除菌，也可以115℃15min灭菌。
(2)摇瓶培养方式：
摇瓶培养所采用的发酵培养基组成包括：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，硫酸铵1％，硫酸镁0.5％，硫酸锌0.5％，食盐3％，配水完成，调节发酵液pH值为4.8。
摇瓶培养所采用的条件包括：控制发酵温度为30℃，220rpm条件下摇瓶发酵，发酵时间按照20h进行。
实施例2、流加补料发酵方式
酿酒酵母ZB421菌株的扩大培养，采用以下方式：
1、流加补料发酵培养
将上述鉴定的Saccharomyces cerevisiae菌株ZB421进行发酵培养，培养条件如下：
将筛选出的酿酒酵母活化后，使用摇瓶培养方式培养；
摇瓶培养所采用的发酵培养基的制备步骤包括：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，硫酸铵1％，硫酸镁0.5％，硫酸锌0.5％，食盐3％，一次性配料，然后配水完成，调节pH值为4.8；
摇瓶培养所采用的条件包括：控制发酵温度为30℃，220rpm条件下摇瓶发酵，发酵时间按照20h进行。
然后，分别采用一次补料发酵和流加补料发酵方式对酵母乳进行扩大培养，作为对比研究两种发酵方式的差异：
(1)一次补料发酵：
商品发酵培养基组成包括：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，硫酸铵1％，硫酸镁0.5％，硫酸锌0.5％，食盐3％，发酵罐总体积为15L，加入底水后，然后上述物料一次性投入，然后配水完成，调节发酵液pH值为4.8；将种子发酵液接入到上述发酵培养基中，接种量按照5％操作，然后在30℃，通气量按照10L/min条件下发酵，发酵时间按照20h进行。
(2)流加补料发酵：
实验组a：商品发酵罐体积为15L，使用物料和上述一次补料发酵使用物料种类一致，首先发酵罐配置底水7L，加入硫酸镁1‰、硫酸锌0.4‰和酵母膏2‰，然后按照酵母接种量为5％接入摇瓶培养所得种子发酵液，调节底水pH值为4.8，剩余酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵和食盐配成溶液，该溶液所含物料质量百分如下：蛋白胨2％，葡萄糖2％，硫酸铵1％，食盐3％，酵母膏1％，都采取匀速流加补料方式添加，控制温度为30℃，pH值4.8，通气量按照6L/min-10L/min通气(通气量随酵母增殖而增加)，发酵时间按照20h进行。
实验组b：商品发酵罐体积为15L，使用物料和上述一次补料发酵使用物料种类一致，首先发酵罐配置底水7L，加入硫酸镁1.2‰、硫酸锌0.5‰和酵母膏2.5‰，然后按照酵母接种量为5％接入摇瓶培养所得种子发酵液，调节底水pH值为5.0，剩余酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵和食盐配成溶液，该溶液所含物料质量百分比如下：蛋白胨2％，葡萄糖2％，硫酸铵1％，食盐3％，酵母膏1％，都采取匀速流加补料方式添加，控制温度为31℃，pH值5.0，通气量按照6L/min-10L/min通气(通气量随酵母增殖而增加)，发酵时间按照20h进行。
实验组c：商品发酵罐体积为15L，使用物料和上述一次补料发酵使用物料种类一致，首先发酵罐配置底水7L，加入硫酸镁1.5‰、硫酸锌1‰和酵母膏2‰，然后按照酵母接种量为5％接入摇瓶培养所得种子发酵液，调节底水pH值为5.5，剩余酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵和食盐配成溶液，该溶液所含物料质量百分比如下：蛋白胨2％，葡萄糖2％，硫酸铵1％，食盐3％，酵母膏1％，都采取匀速流加补料方式添加，控制温度为35℃，pH值5.5，通气量按照6L/min-10L/min通气(通气量随酵母增殖而增加)，发酵时间按照20h进行。
总体来看，采用通气流加补料发酵方式，快速的增加了发酵液的湿重，提高了发酵液的菌体密度。
发酵体积直接放料测定体积数量；湿重测定方法同上筛选方法一致；活细胞率测定采用GB/T 20886食品加工用酵母中的检测方法；糖转化率为单位纯糖转化得到的酵母干重数据。
表6、不同发酵方式所得发酵液对比表
Figure BDA0003227482550000181
备注：流加补料发酵效果和一次补料发酵对比，主要对比方面包括发酵湿重和单批发酵产量。对照为一次加料发酵，对照指标为100％。
从上表6的结果可以看出，采用流加补料发酵方式得到的发酵液，如所有实验组发酵结果来看，发酵湿重相对于对照组更高，菌株的单批次产量更高，主要是糖转化率更高，相同体积的发酵液，菌体生物量更高。但是也可以看出，改变发酵条件后，如实验组b，酵母发酵的物料浓度变化不大时，最终发酵液的指标差异不大。但是如果增加部分盐分，然后进行发酵实验组c，发酵过程中增加部分盐分如硫酸镁和硫酸锌，提升温度和pH值，最终得到的产品的效果降低比较大，对发酵的影响很大。
对采用流加补料发酵和一次补料发酵的酵母乳进行了分离，洗涤，然后收集，分析2种不同发酵方式后最终得到的酵母的理化指标，得到如下数据。
蛋白质检测采用凯氏定氮法；核酸检测采用紫外吸收法测定；发酵力测定采用GB/T 20886食品加工用酵母中的检测方法。
表7、不同发酵方式中酵母的理化指标对比表
项目 对照组(一次加料发酵) 实验组a(流加分批发酵)
蛋白质 100％ 116.6％
核酸 100％ 128.5％
发酵力 100％ 113.4％
备注：流加补料发酵效果和一次补料发酵对比，对照指标为100％，指标均折干。
从上表7可以发现，采用流加补料发酵方式得到的酵母，蛋白质、核酸和发酵力均相比对照组有明显的提升，由于蛋白质和核酸继续水解会产生鲜味成分，极少量时仍然会对最终产品的口感产生较为明显的影响，且发酵力的提升会明显提升最终发酵液的风味物质成分。
2、不同发酵方式所得发酵液对比
将上述一次补料发酵和流加补料发酵方式得到的发酵液进行香气成分测定试验，并以一次补料发酵方式作为对照组，流加发酵方式为实验组。
按照一次补料发酵和流加补料发酵后，过滤，取发酵清液，采用SPME-GC-MS分析测定其发酵液中乙醇和乙酸乙酯的含量，结果如表8所示。
表8、发酵液香气成分测试结果
组别 乙醇 乙酸乙酯
对照组(一次加料发酵) 100％ 100％
实验组a(流加分批发酵) 60％ 195.2％
备注：对照组各项待测物质浓度为100％，试验组指标换算成相应比值。
上述结果表明，酿酒酵母菌ZB421发酵过程中，采用流加补料发酵，对比一次补料发酵，流加补料发酵可显著提高发酵液中的乙酸乙酯含量。
流加补料发酵的发酵液中乙醇含量低于一次加料发酵，主要原因是一次加料发酵由于糖浓度抑制呼吸作用，产生乙醇数量更高所致。
发酵条件优化，优化发酵温度，pH值和通气量，最终可以发现在温度为30℃，pH值在4.8时，通气量按照发酵时间逐渐增加时，发酵效果最好，最终菌体湿重能够达到220g/L，活细胞率为99.0％，糖转化率大于90％。
研究了发酵时间对发酵的影响，发酵时间增加，菌体湿重增加，但是后期增加较慢，且细胞死亡率增加，最终发酵时间按照20h进行。
发酵结束后，得到的发酵液待用，不需要分离，直接冷藏即可，冷藏温度为1℃-4℃，在此冷藏条件下，菌株的活细胞率几乎无变化，冷藏7天无任何质量问题。
实施例3、酿酒酵母ZB421在酱油发酵中的应用
采用流加补料发酵方式培养酿酒酵母ZB421，整个过程中控制风量，温度，所有的营养源采取流加方式补入，按照设定的发酵程序进行发酵，最终得到菌体活性高、菌体密度大的种子培养液，具体可参见实施例2实验组a。
将原料大豆和小麦粉(质量比为3：2)通过圆盘制曲获得成曲，然后将曲料加入盐水(浓度为20g/100mL)进行发酵，当发酵体系中氨基酸态氮≥0.7g/100mL接种种子培养液，接种量为5％(v/v)，发酵10d，发酵管理按照包启安所著《酱油科学与酿造技术》中的高盐稀态酱油酿造方式进行，发酵时间为10d。
按照现有常规的高盐稀态大罐发酵工艺进行发酵制取酱油，对照组包括不添加酿酒酵母组和一次补料发酵工艺组，对照组1为常规酱油工艺，不添加酿酒酵母，对照组2为使用酿酒酵母，采用一次补料发酵工艺，实验组为使用酿酒酵母，发酵方式为流加补料发酵工艺。菌株均采用酿酒酵母菌ZB421。
发酵完成后，检测酱油常规理化指标，采用SPME-GC-MS分析测定其发酵酱油中乙醇和乙酸乙酯的含量，并对酱油的风味进行鉴评，结果如表9和表12所示。
表9、发酵酱油理化指标测试结果
Figure BDA0003227482550000211
备注：对照组发酵酱油(常规工艺)各项待测物质浓度为100％，试验组发酵酱油指标换算成相应比值。
考虑到高盐和高温对酵母的生长不利，后续的研究如下：
高盐稀态大罐发酵10d后，对发酵酱油产品进行微生物测定，采用PDA固体培养基平板来测定后续的微生物情况，并同起始的微生物菌落数做对比；检测方法包括如下步骤：
取发酵的酱醪1g，然后加入10mL的无菌生理盐水，混合均匀后，参照GB4789.2菌落总数的测定的方法来测定菌落总数，培养基采用PDA培养基，培养基中加入抗生素，避免细菌的干扰。
表10、酵母培养模拟培养指标测试结果
Figure BDA0003227482550000221
由上表10可以发现，发酵10d后，酵母的数量很低，最低稀释度情况下，酵母的数量低于10，证明在发酵结束时均有明显自溶失活现象。
发酵模拟实验如下：
YPD液体培养基(补充盐分10～15％)，加入对照组和实验组的酵母乳液，然后31℃下发酵培养10d后，采用分离去掉酵母菌体，液体培养基的最终数据如下表11所示。
总氮和氨氮检测方法采用GB/T 23530中的方法测定；活细胞率测定采用GB/T20886食品加工用酵母中的检测方法；
表11、酵母培养模拟培养指标测试结果
Figure BDA0003227482550000222
备注：对照组各项待测物质为100％，实验组换算成相应比值。
因此可以解释，通过高密度培养，酵母发酵结束后，自身自溶失活产生的部分蛋白类成分会进入发酵体系，最终有助于产品的氨氮和总氮的提高，最终有利于提升酱油产品的口感和风味。
本实施例还召集7名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括香气、综合香气、浓厚口感和综合感官，分值为0-5分打分，分数越高，该项指标越好，满分5分。感官鉴评结果见表12。
表12、发酵酱油感官鉴评测试结果
Figure BDA0003227482550000223
Figure BDA0003227482550000231
上述结果表明，采用高密度流加补料发酵技术培养酿酒酵母菌ZB421，最终应用于酱油发酵时，相对于对照常规酱油工艺和一次补料发酵工艺情况，可显著提高乙醇和乙酸乙酯含量。通过感官鉴评结果可知，流加补料发酵工艺得到的酿酒酵母菌ZB421，相同比例接种发酵获得的酱油，香气丰富浓郁，口感浓厚，综合感官显著提升。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 广东海天创新技术有限公司
佛山市海天（高明）调味食品有限公司
佛山市海天调味食品股份有限公司
<120> 酿酒酵母ZB421及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1664
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
gcaatttata cagtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatcgttt atttgatagt 60
tcctttacta catggtataa ctgtggtaat tctagagcta atacatgctt aaaatctcga 120
ccctttggaa gagatgtatt tattagataa aaaatcaatg tcttcggact ctttgatgat 180
tcataataac ttttcgaatc gcatggcctt gtgctggcga tggttcattc aaatttctgc 240
cctatcaact ttcgatggta ggatagtggc ctaccatggt ttcaacgggt aacggggaat 300
aagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatccaag gaaggcagca 360
ggcgcgcaaa ttacccaatc ctaattcagg gaggtagtga caataaataa cgatacaggg 420
cccattcggg tcttgtaatt ggaatgagta caatgtaaat accttaacga ggaacaattg 480
gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt atattaaagt 540
tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaact ttgggcccgg ttggccggtc cgattttttc 600
gtgtactgga tttccaacgg ggcctttcct tctggctaac cttgagtcct tgtggctctt 660
ggcgaaccag gacttttact ttgaaaaaat tagagtgttc aaagcaggcg tattgctcga 720
atatattagc atggaataat agaataggac gtttggttct attttgttgg tttctaggac 780
catcgtaatg attaataggg acggtcgggg gcatcagtat tcaattgtca gaggtgaaat 840
tcttggattt attgaagact aactactgcg aaagcatttg ccaaggacgt tttcattaat 900
caagaacgaa agttagggga tcgaagatga tcagataccg tcgtagtctt aaccataaac 960
tatgccgact agggatcggg tggtgttttt ttaatgaccc actcggcacc ttacgagaaa 1020
tcaaagtctt tgggttctgg ggggagtatg gtcgcaaggc tgaaacttaa aggaattgac 1080
ggaagggcac caccaggagt ggagcctgcg gcttaatttg actcaacacg gggaaactca 1140
ccaggtccag acacaataag gattgacaga ttgagagctc tttcttgatt ttgtgggtgg 1200
tggtgcatgg ccgttcttag ttggtggagt gatttgtctg cttaattgcg ataacgaacg 1260
agaccttaac ctactaaata gtggtgctag catttgctgg ttatccactt cttagaggga 1320
ctatcggttt caagccgatg gaagtttgag gcaataacag gtctgtgatg cccttagacg 1380
ttctgggccg cacgcgcgct acactgacgg agccagcgag tctaaccttg gccgagaggt 1440
cttggtaatc ttgtgaaact ccgtcgtgct ggggatagag cattgtaatt attgctcttc 1500
aacgaggaat tcctagtaag cgcaagtcat cagcttgcgt tgattacgtc cctgcccttt 1560
gtacacaccg cccgtcgcta gtaccgattg aatggcttag tgaggcctca ggatctgctt 1620
agagaagggg gcaactccat ctcagagcgg agaattggac aaac 1664

Claims (10)

1.一株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421，其已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61681，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。
2.一种酱油或者酱的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将酿酒酵母菌接种于酱醪进行酱油发酵或者酱发酵的步骤；所述酿酒酵母菌为权利要求1所述的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)ZB421。
3.根据权利要求2所述的酱油或者酱的制备方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌的扩培方式采用流加发酵。
4.根据权利要求3所述的酱油或者酱的制备方法，其特征在于，流加发酵的步骤包括：
提供混合物Ⅰ和混合物Ⅱ，所述混合物Ⅰ的组分包含硫酸镁、硫酸锌、酵母膏以及水，所述混合物Ⅱ的组分包含蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵、食盐、酵母膏以及水；
将所述酿酒酵母菌接种于所述混合物Ⅰ进行培养并于培养过程中流加所述混合物Ⅱ。
5.根据权利要求4所述的酱油或者酱的制备方法，其特征在于，所述混合物Ⅰ中的所述组分的质量百分比为：硫酸镁0.8‰-1.2‰，硫酸锌0.3‰-0.5‰，酵母膏1.5‰-2.5‰，pH值为4.6-5.0；
或/和，所述混合物Ⅱ中的所述组分的质量百分比为：蛋白胨1.8％-2.2％，葡萄糖1.8％-2.2％，硫酸铵0.8％-1.2％，食盐2.8％-3.2％，酵母膏0.8％-1.2％，pH值为4.6-5.0。
6.一种酱油或者酱的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将酿酒酵母菌接种于酱醪进行酱油发酵或者酱发酵的步骤；所述酿酒酵母菌的扩培方式采用流加发酵。
7.根据权利要求6所述的酱油或者酱的制备方法，其特征在于，流加发酵的步骤包括：
提供混合物Ⅰ和混合物Ⅱ，所述混合物Ⅰ的组分包含硫酸镁、硫酸锌、酵母膏以及水，所述混合物Ⅱ的组分包含蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵、食盐、酵母膏以及水；
将所述酿酒酵母菌接种于所述混合物Ⅰ进行培养并于培养过程中流加所述混合物Ⅱ。
8.根据权利要求7所述的酱油或者酱的制备方法，其特征在于，所述混合物Ⅰ中的所述组分的质量百分比为：硫酸镁0.8‰-1.2‰，硫酸锌0.3‰-0.5‰，酵母膏1.5‰-2.5‰，pH值为4.6-5.0；
或/和，所述混合物Ⅱ中的所述组分的质量百分比为：蛋白胨1.8％-2.2％，葡萄糖1.8％-2.2％，硫酸铵0.8％-1.2％，食盐2.8％-3.2％，酵母膏0.8％-1.2％，pH值为4.6-5.0。
9.根据权利要求3至8任一项所述的酱油或者酱的制备方法，其特征在于，流加发酵采用的条件包括：温度为28℃-32℃，时长为18h-22h，通气量为6L/min-10L/min；或/和，酱油发酵的方式采用高盐稀态发酵。
10.权利要求2至9任一项所述的制备方法获得的酱油或者酱。
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