CN113637027B - 一种苯基三氮唑二羧酸-罗丹明b衍生物荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种苯基三氮唑二羧酸‑罗丹明B衍生物荧光探针及其制备方法与应用。本发明基于2‑苯基‑1,2,3‑三氮唑‑4,5‑二羧酸与罗丹明B衍生物选择性检测Hg2+、ClO‑荧光探针，该探针在溶液测试中，利用紫外吸收光谱和荧光光谱进行了响应时间和pH值优化实验，在通过选择性实验和离子干扰实验，探针可选择性检测Hg2+、ClO‑，不受同离子的干扰，并且细胞毒性小，并成功应用于HeLa细胞的荧光成像。

Description

一种苯基三氮唑二羧酸-罗丹明B衍生物荧光探针及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种苯基三氮唑二羧酸-罗丹明B衍生物荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
随着工业的迅速发展，带来经济效应的同时，所带来的污染对环境也构成了极大的威胁。而重金属离子Hg2+的污染更是不容忽视。汞离子作为最具毒害的重金属离子之一，被排放到土壤或水体中，通过食物链富集生命体造成威胁，因此而引发的各类疾病如阿尔茨海默症、水俣病、肢端疼痛症、尿毒症，已严重影响到人们的生活。正常含量的次氯酸可维持基本的生命活动，同时在免疫系统中起到防御疾病的作用。然而，当次氯酸根(≥1000mg/L)则会引起体内生物分子氧化，进而导致各种生理疾病，包括关节炎、动脉粥样硬化、肝硬化和癌症。因此考虑到金属汞离子以及超量的次氯酸根对人类危害极大。本发明提供一种由2- 苯基-1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸与罗丹明B选择性检测Hg2+、ClO-荧光探针，并进行了探针L2对HeLa细胞的毒性测试和成像实验。
发明内容
本发明提供了一种基于2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸与罗丹明B酰肼衍生物选择性检测Hg2+、ClO-荧光探针的制备和应用。该探针检测过程简单、方便。实现本发明的技术方案：
本发明提供一种式L2结构的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸与罗丹明B酰肼衍生物，其特征在于所述式L2结构如下：
Figure BDA0003174759440000011
本发明的另一实施方案提供一种上述式L2结构的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5- 二羧酸与罗丹明B酰肼衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的合成：
Figure BDA0003174759440000021
丁炔二酸二乙酯与叠氮化钠于有机溶剂中反应，得到2H-1,2,3-三氮唑-4,5- 二羧酸二乙酯。
所述有机溶剂选自DMF、DMSO、甲苯、乙腈、DMF、二氧六环中的一种或几种，反应温度为60-90℃。
(2)2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的合成：
Figure BDA0003174759440000022
将步骤(1)得到的2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯溶于THF、吡啶中，在苯硼酸、醋酸铜作用下，反应得到2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯；该反应体系处于氧气环境下，反应温度为50-70℃。
(3)2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯的合成：
Figure BDA0003174759440000023
首先将步骤(2)得到的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸乙酯在碱性条件下脱除乙氧基后，调pH至1.0得到2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸，然后，在二氯亚砜或草酰氯作用下，得到2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯。所述碱性条件优选NaOH、KOH、NaOCH3、NaOEt的甲醇或乙醇溶液。
(4)罗丹明B酰肼的合成：
Figure BDA0003174759440000031
罗丹明B与水合肼反应得到罗丹明B酰肼。
(5)式L2的合成：
Figure BDA0003174759440000032
将步骤(3)得到的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯与步骤(4)得到的罗丹明B酰肼反应得到式L2探针。
本发明的另一实施方案提供式L2在检测Hg2+中的应用。
本发明的另一实施方案提供式L2在检测ClO-中的应用。
本发明的另一实施方案提供式L2在制备检测Hg2+、ClO-荧光探针中的应用。
本发明的另一实施方案提供式L2在HeLa细胞的荧光成像中的应用。
本发明基于2-苯基-1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸与罗丹明B选择性检测Hg2+、 ClO-荧光探针，该探针在溶液测试中，利用紫外吸收光谱和荧光光谱进行了响应时间和pH值优化实验，在通过选择性实验和离子干扰实验，探针可选择性检测 Hg2+、ClO-，不受同离子的干扰，并且细胞毒性小，并成功应用于HeLa细胞的荧光成像。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或技术方案，下面将对实施例或技术方案中所需要使用的附图做简介介绍。
图1是2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的1H NMR图；
图2是2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的13C NMR图；
图3是2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的MS图；
图4是罗丹明B酰肼的1H NMR图；
图5是罗丹明B酰肼的13C NMR图；
图6是2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4,5-二羧酸二乙酯的1H NMR图；
图7是2-苯基-2H-1,2,3-三唑-4,5-二羧酸二乙酯的13C NMR图；
图8是L2探针的1H NMR图；
图9是L2探针的13C NMR图；
图10是L2探针的MS图；
图11是探针L2与Hg2+作用的时间荧光变化图；
图12是探针L2与ClO-作用的时间荧光变化图；
图13是探针L2测定Hg2+浓度滴定实验荧光变化图；
图14是荧光探针L2测定ClO-浓度滴定实验荧光变化图；
图15是常见金属离子对探针L2检测Hg2+的荧光选择性图；
图16是常见金属离子对探针L2检测ClO-的荧光选择性图；
图17是常见金属离子对探针L2检测Hg2+的荧光抗干扰性图；
图18是常见阴离子对探针L2检测ClO-荧光抗干扰性图；
图19是探针L2和探针加Hg2+在不同pH缓冲溶液中最大荧光强度变化图；
图20是探针L2对HeLa细胞的毒性测试图；
图21是探针L2、L2+Hg2+、L2+ClO-在HeLa细胞中成像图。
具体实施方式
为了便于发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的合成：
Figure BDA0003174759440000041
称取2.50g(14.69mmol，1eq)丁炔二酸二乙酯在250mL圆底烧瓶中，加入DMSO100mL作溶剂，在室温下搅拌半小时后，再称取NaN3 1.91g(29.38mmol， 2eq)缓慢加入圆底烧瓶中，，然后升温至80℃，通过TLC监测反应，反应完毕后，冷却至室温，缓慢加入100mL水搅拌，淬灭反应，然后使用3mol/L HCl调节PH 值为2左右，反应体系颜色由深棕色变为红色，使用乙酸乙酯和水萃取，有机相使用饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥，柱层析PE/EA＝2:1，即可得到黄色油状液体，即为2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯。结构确证见图1-图3，1H NMR (400MHz,Chloroform-d)δ4.47(q,J＝7.1Hz,4H),1.41(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ160.36,139.20,62.90,14.54.
(2)2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的合成：
Figure BDA0003174759440000051
称取2H-1,2,3-三氮唑(7.50mmol，1eq)到100mL圆底烧瓶中，加入2mL吡啶， 40mLTHF，搅拌均匀，称取醋酸铜(7.50mmol，1eq)到圆底烧瓶中，再称取苯硼酸15.0mmol(2eq)缓慢加入圆底烧瓶中，圆底烧瓶接通冷凝管，冷凝管上口连接三通阀，氧气球使用橡皮筋固定在三通阀上面，使用水泵抽真空，使整个体系处于氧气环境下，然后升温至60℃，通过TLC监测反应程度。反应结束后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析PE/EA＝10:1，即可得到浅黄色油状液体，即为2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯。结构确证见图6-图7，1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ8.15(d,J＝7.8Hz,1H),7.51(t,J＝7.7Hz,1H),7.45(t,J＝7.2Hz,1H),4.49(q,J＝7.1Hz,2H),1.44(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ 160.14(s),140.87(s),138.83(s),129.64(s),129.45(s),129.29(s),119.93(s),115.27 (s),62.27(s),14.15(s).
(3)2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯的合成：
Figure BDA0003174759440000052
将步骤(2)得到的产物移取在100mL圆底烧瓶，加入无水乙醇40mL，称取KOH固体0.6g，搅拌均匀后加热回流3小时。通过TLC监测反应结束，蒸除溶剂，加热少量水溶解固体。在使用浓盐酸调节PH值为1，搅拌出现大量白色固体析出，抽滤，烧杯残余固体使用少量稀盐酸洗涤抽滤，固体自然晾干，即可得到2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸，然后加入SOCl2 2mL，加热回流3小时后，蒸出多余的SOCl2，直到接收瓶不在有液体滴落后，使用水泵抽压，圆底烧瓶出现白色固体产物(即为2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯，不需纯化，直接投入下步反应)。
(4)罗丹明B酰肼的合成：
Figure BDA0003174759440000061
在100m L单口圆底烧瓶中，分别加入30mL乙醇与10.5mmol罗丹明B。室温下搅拌，然后缓慢滴入50％的水合肼(12mL)。滴加结束，搅拌回流，TLC检测反应完毕后，冷却溶液，然后减压蒸去乙醇。在烧瓶中加入1mol/L的HCl 50m L，得到橙红色溶液；在不断搅拌下，慢慢加入1mol/L NaOH溶液，调pH到9-10 之间，出现大量白色沉淀。抽滤，用少量水洗涤滤饼3次。真空干燥后，得到罗丹明B酰肼。结构确证见图4-图5；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(d,J＝5.8 Hz,1H),7.53–7.41(m,2H),6.98(d,J＝5.9Hz,1H),6.35(d,J＝16.6Hz,6H),4.26(s,2H),3.33–3.25(m,8H),1.08(t,J＝7.0Hz,12H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6) δ165.82,153.49,152.33,148.60,132.89,128.60,128.13,123.93,122.65, 108.27,105.83,97.89,65.28,44.16,12.90.
(5)式L2的合成：
Figure BDA0003174759440000062
称取步骤(3)得到的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯100mg(1.0eq)化合物圆底烧瓶中，加入10mL二氯甲烷搅拌溶解后，缓慢加入步骤(4)得到的罗丹明B 酰肼356mg(2.0eq)，然后再滴加过量三乙胺作缚酸剂，常温下搅拌12h以上，通过TLC监测反应结束后，旋蒸，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析 PE/EA＝1:1，即可得到白色固体产物L2。结构确证见图8-图10；1H NMR(400MHz, CDCl3)δ10.00(s,2H),7.93(m,J＝9.5,6.8,1.8Hz,4H),7.48-7.41(m,4H), 7.39-7.34(m,3H),7.10-7.05(m,2H),6.75(d,J＝8.8Hz,4H),6.32(s,4H),6.26(d,J ＝8.2Hz,4H),3.24(d,J＝6.9Hz,16H),1.08(t,J＝7.0Hz,24H).13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ164.46(s),157.44(s),153.43(s),152.71(s),152.65(s),148.93(s),139.87(s),138.44(s),133.05(s),133.03(s),129.27(s),128.88(s),128.03(s), 123.87(s),123.47(s),120.03(s),114.25(s)107.94(s),104.23(s),97.87(s)44.31(s), 12.67(s).质谱检测HRMS m/z([M+H]+):Calcd for1109.5276；found:1110.5261.
实施例2
(1)标准离子的配制
取相应体积Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd3+、 Co2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+金属阳离子标准溶液和ClO-、S2-、SCN-、 CN-、CO3 2-、SO4 2-、AcO-、NO2 -、NO3 -、Br-、F-、I-、Cl-、ClO2 -阴离子标准溶液以及H2O2溶液于10mL的比色管中，加去离子水定容配制为1.0×10-3mol/L mol/L标准溶液。
(2)探针溶液的配制
称取57mg的探针L2于50mL的容量瓶中，使用DMSO定容配制为1.0× 10-3mol/L的溶液。
实施例3
离子干扰实验：
为了研究探针L2的光学性质，在DMF/Tris-HCl(1:1,v/v,20μM)溶液中考察了各种金属离子的荧光光谱。探针L2的激发波长为560nm。加入等量的离子后，探针L2在585nm处只有Hg2+使其荧光强度出现明显增强，其他离子几乎没有变化，如图15所示。响应时间在很短的时间内完成。同样，在甲醇(20μM)溶液中考察了各种阴离子的荧光光谱。探针L2的激发波长为555nm。加入等量的离子后，探针 L2在578nm处只有ClO-使其荧光强度出现明显增强，其他离子几乎没有变化，如图16所示。响应时间在很短的时间内完成。这表明探针对Hg2+和ClO-具有高选择性和特异性。此外，如图11，12所示，探针L2和离子作用后比较稳定，在1800s内荧光强度没有发生明显的增加或下降趋势。
实施例4
滴定实验:
通过荧光滴定实验考察探针L2对Hg2+和ClO-的灵敏度。随着Hg2+和ClO-浓度的增加，探针L2荧光在逐渐增强，如图13，14所示。这可能是由于探针L2对Hg2+发生配位反应，发生内酰胺开环释放荧光，而ClO-的氧化作用，使得L2断键释放荧光。此外，在一定范围内，L2对Hg2+和ClO-存在线性关系(R1＝0.98021， R2＝0.99592)。根据公式DL＝3σ/k，计算出L2对Hg2+的检出限约为7.45nM，对ClO-的检出限约为0.67μM，这对于检测Hg2+和ClO-具有潜在的应用价值。
实施例5
离子共存实验：
优良的选择性是影响荧光探针性能的重要因素之一。因此，为了测试离子竞争实验合成的探针，在DMF/Tris-HCl(1:1,v/v,20μM)溶液中，加入10μM的Hg2+测试荧光强度，然后在分别加入其他金属离子，荧光强度没有发生明显的变化，如图17所示。在甲醇(20μM)溶液中，加入20μM的ClO-测荧光强度，然后在分别加入其他离子，荧光强度没有发生明显的变化，如图18所示。说明探针L2对Hg2+和ClO-具有较高的选择性。
实施例6
pH优化实验：
证明pH荧光探针的检测能力是必不可少的。因此，研究pH对探针荧光强度的影响，以评价L2的潜在适用性，如图19所示。可见，在pH＝3.0～5.0酸性条件下，探针L2本身产生微弱荧光，而pH＝6.0～10.0在条件下，探针L2几乎没有荧光。当加入Hg2+后，pH＝6.0时荧光强度最大，当pH>8.0时，几乎没有荧光，这可能是 OH-跟Hg2+结合了，因此，后续的L2和Hg2+实验均选择DMF/Tris-HCl(1:1,v/v, pH＝6.0)体系进行测试的。
实施例7
细胞毒性实验:
取对数生长期的HeLa细胞，通过细胞计数，调整细胞浓度为2.5×104/孔，将DMEM细胞培养液加入到96孔板中，每孔100μL，在37℃5％CO2培养箱中培养24h，使用DMSO将L2配成0.025mol/L，取0.8μL到99.2μL的DMEM中，使得DMSO在细胞中含量小于等于4‰，L2的浓度为100μmol/L。依此方法，按梯度浓度将L2浓度调整为0、10、20、40、60、80μmol/L，将Hela细胞分为空白组和实验组，实验组按照上述浓度梯度每孔加入100μL，空白组只加培养液 100μL，每个浓度均设置10个复孔，然后放入CO2培养箱中继续培养24h后，每孔加入20μL MTT试剂，放人CO2培养箱中继续培养4h，使得MTT还原成蓝紫色结晶甲瓒，弃去培养液，每孔加入200μL DMSO轻微震荡使其充分溶解，通过酶标仪测定570nm处吸光值。重复实验3次，计算L2对HeLa细胞的毒性。如图20所示，在60μM浓度以下HeLa细胞存活率大于80％，探针具有良好的低毒性。
实施例8
细胞成像实验:
取对数生长期的HeLa细胞，将细胞培养液加入到6孔板中在37℃5％CO2培养箱中培养24h后，用4％多聚甲醛固定细胞20min，用PBS洗涤细胞3次，加入Triton X-100(1％)溶液处理细胞15min后，用PBS洗涤细胞3次，加入探针 L2(40Μm)孵育1h后，随后向6孔板中加入Hg2+和ClO-(40μM)，孵育0.5h后，用PBS洗涤细胞3次后，进行倒置荧光成像。如图21所示，单独探针L2的HeLa 细胞没有发出荧光，加入Hg2+和ClO-明显观察到HeLa细胞发出荧光。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则内，所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种式L2结构的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸与罗丹明B酰肼衍生物，其特征在于所述式L2结构如下：
Figure FDA0003174759430000011
2.权利要求1所述的L2结构的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸与罗丹明B酰肼衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的合成：
丁炔二酸二乙酯与叠氮化钠于有机溶剂中反应，得到2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯；
(2)2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯的合成：
将步骤(1)得到的2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯溶于THF、吡啶中，在苯硼酸、醋酸铜作用下，反应得到2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸二乙酯；该反应体系处于氧气环境下，反应温度为50-70℃；
(3)2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯的合成：
首先将步骤(2)得到的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸乙酯在碱性条件下脱除乙氧基后，调pH至1.0得到2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二羧酸，然后，在二氯亚砜或草酰氯作用下，得到2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯；
(4)罗丹明B酰肼的合成：
罗丹明B与水合肼反应得到罗丹明B酰肼；
(5)式L2的合成：
将步骤(3)得到的2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯与步骤(4)得到的罗丹明B酰肼反应得到式L2。
3.权利要求1所述的式L2在检测Hg2+中的应用。
4.权利要求1所述的L2在检测ClO-中的应用。
5.权利要求1所述的式L2在制备检测Hg2+、ClO-荧光探针中的应用。
6.权利要求1所述的式L2在HeLa细胞的荧光成像中的应用。
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