CN113633771A - 氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物预防治疗纤维化的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物预防和治疗肠纤维化和肺纤维化的用途。所述的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物具有下述结构：
Figure DDA0003255487010000011
实验证明，氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物在光动力治疗葡聚糖硫酸钠和三硝基苯磺酸构建的大、小鼠肠纤维化模型中，可以明显减轻结肠炎症及纤维化程度，抑制结肠组织中胶原的分泌和沉积，同时通过抑制AOC1的表达来抑制上皮间充质转化程度，从而预防和治疗肠纤维化。氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物在光动力治疗博来霉素构建的小鼠肺纤维化模型中，可以明显减轻肺组织炎症及纤维化程度，从而预防和治疗肺纤维化。

Description

氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物预防治疗纤维化的用途
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物预防和治疗肠纤维化和肺纤维化的用途，特别是涉及四个赖氨酸修饰的氨基四苯基卟啉化合物在制备抗肠纤维化和抗肺纤维化药物中的应用。
背景技术
肠纤维化是肠道慢性炎症和损伤活动过度的、不可逆的损伤愈合反应。大量慢性炎性细胞的反复浸润会导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)异常聚集、间质细胞大量增殖，从而形成肠纤维化[1,2]。肠纤维化是炎症性肠病常见的并发症，且其在克罗恩病中的患病率明显高于溃疡性结肠炎。肠壁纤维化导致肠道变形缩短，肠腔狭窄，甚至引起肠梗阻和穿孔[3]。目前常用的临床药物如皮质类固醇、氨基水杨酸、免疫抑制剂以及生物制剂抗肿瘤坏死因子抗体，虽然可以改善肠道炎症，但疗效欠佳，导致手术切除术成为严重症状性肠纤维化的唯一选择。因此，防治甚至逆转肠纤维化已成为临床IBD治疗中亟待解决的重要问题。
肺纤维化是一种由诸多原因引起的以肺泡结构严重破坏，弥散性肺泡炎症及肺间质纤维化为特点的疾病。随着工业化的不断发展，肺纤维化发病人数逐年增加，但是由于缺乏有效的治疗手段，患者的预后差，死亡率高，严重影响人类健康。
肠道间质细胞是参与肠纤维化发生的关键细胞，是产生ECM的主要细胞，包括肠成纤维细胞、肠肌成纤维细胞和平滑肌细胞等，活化的肠成纤维细胞主要来源于组织中间质细胞、上皮或内皮转化的间质细胞[4-6]。近年来研究表明，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肠成纤维细胞来源的一条重要途径[7,8]。EMT是组织形成、癌症发生以及器官纤维化的关键中间过程，其特征在某些病理、生理及环境等因素作用下，上皮细胞失去细胞极性及细胞间连接，且上皮细胞标志物如E细胞钙黏蛋白、细胞角蛋白等逐渐消失，而间质细胞标志物如成纤维细胞特异蛋白、平滑肌激动蛋白等逐渐增多的过程。
有多项研究表明，EMT促进肠道纤维化[9-12]。含铜胺氧化酶1(Amine oxidasecopper-containing 1,AOC1)是一种含铜的胺氧化酶，催化丙胺和精胺等化合物的降解。同时，有报道表明下调AOC1可抑制上皮-间充质转化EMT的过程[13]。
光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)是当前国际上正在发展的一种新技术，它是利用光敏剂的光动力反应，选择性的作用于靶组织，并产生组织效应的治疗方法[14]。其优点为毒副作用性小，治疗时间短，靶向性强，在治疗的同时不危及正常组织。随着各种内窥镜和纤维光学技术的飞速发展，利用光动力疗法治疗内腔疾病逐渐成为可能。有研究显示PDT可以治疗炎症性肠病[13]，而是否可以改善肠纤维化程度还需要进一步研究。
本实验室设计合成了具有良好理化性质的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物LD4，研究表明该化合物可以促进结肠粘膜愈合，调节肠道菌群，改善溃疡性结肠炎的临床症状，同时降低AOC1介导的粘膜炎症反应。基于上述结果，我们将该光敏剂用于肠纤维化和肺纤维化的PDT预防和治疗。结果发现LD4-PDT可以降低Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表达，通过下调AOC1抑制EMT的过程，进而减轻炎症反应及胶原沉积，改善肠纤维化程度。同时，也发现LD4-PDT可改善肺纤维化程度。我们的研究显示LD4干预肠纤维化和肺纤维化可能是通过AOC1发挥作用并有望开发出一种新型的高效低毒预防和治疗纤维化的光敏剂。
参考文献
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发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物作为预防和治疗肠纤维化药物的用途。
本发明的第二个目的是提供氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物作为预防和治疗肺纤维化药物的用途。
本发明的目的主要通过以下技术方案实现：
氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物在制备预防和治疗肠纤维化药物的应用，所述的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物具有下述结构：
Figure BDA0003255485990000031
所述的药物为光动力治疗药物。
氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物在制备预防和治疗肺纤维化药物的应用，所述的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物具有下述结构：
Figure BDA0003255485990000041
所述的药物为光动力治疗药物。
实验证明：氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物在光动力治疗葡聚糖硫酸钠和三硝基苯磺酸构建的大、小鼠肠纤维化模型中，可以明显减轻结肠炎症及纤维化程度，抑制结肠组织中胶原的分泌和沉积，同时通过抑制AOC1的表达来抑制上皮间充质转化程度，从而预防和治疗肠纤维化。氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物在光动力治疗博来霉素构建的小鼠肺纤维化模型中，可以明显减轻肺组织炎症及纤维化程度，从而预防和治疗肺纤维化。
附图说明
图1为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对葡聚糖硫酸钠建立的小鼠肠纤维化模型平均体重的影响。
图2为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对葡聚糖硫酸钠建立的小鼠肠纤维化模型结肠长度的影响。
图3为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对葡聚糖硫酸钠建立的小鼠肠纤维化模型结肠通透性的影响。
图4为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对葡聚糖硫酸钠建立的小鼠肠纤维化模型结肠组织HE染色图(×100)。
图5为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对葡聚糖硫酸钠建立的小鼠肠纤维化模型结肠组织Masson染色图(×100)。
图6为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对葡聚糖硫酸钠建立的小鼠肠纤维化模型结肠组织中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表达水平的影响。
图7为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对葡聚糖硫酸钠建立的小鼠肠纤维化模型结肠组织中TNF-α和IL-6蛋白表达水平的影响。
图8为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对葡聚糖硫酸钠建立的小鼠肠纤维化模型结肠组织中AOC1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平的影响。
图9为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对三硝基苯磺酸建立的大鼠肠纤维化模型结肠组织HE染色图(×100)。
图10为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对三硝基苯磺酸建立的大鼠肠纤维化模型结肠组织Masson染色图(×100)。
图11为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对三硝基苯磺酸建立的大鼠肠纤维化模型结肠组织中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表达水平的影响。
图12为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对博莱霉素建立的小鼠肺纤维化模型肺组织HE染色图(×200)。
图13为本发明实施例1的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物对博莱霉素建立的小鼠肺纤维化模型肺组织Masson染色图(×200)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围：
实施例1氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物(LD4)的合成
将Boc-Lys(Boc)-OH(467.67mg，1.35mmol)置于反应瓶中，N2保护下加入干燥的THF 20ml，磁子搅拌。冷却至-17℃，加入三乙胺(197.60μl，1.42mmol)和氯甲酸乙酯(131.10μl，1.38mmol)反应1h，生成白色沉淀，过滤，弃去沉淀。取四氨基卟啉(202.40mg，0.30mmol)溶解于15ml THF中，将上述滤液加入，室温搅拌反应14h。TLC(二氯甲烷：甲醇：氨水＝60:1:0.6)监测反应进程。反应完全后，将反应液倒入冰水中，析出沉淀，过滤，水洗3次，得到紫色固体。最后柱层析分离(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇：氨水＝30:1:0.4)得产物596.13mg，产率93％。
将上述步骤得到的100.00mg样品用10ml干燥的CH2Cl2溶解，缓慢滴加三氟乙酸10ml，室温反应30min。旋除溶剂，加入无水乙醚，生成浅绿色沉淀，过滤，30ml二氯甲烷和30ml无水乙醚各洗涤3次。再用20ml蒸馏水将绿色沉淀溶解，氨水调节PH 7-8，析出紫色沉淀，过滤，水洗2次，柱层析分离得到氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物LD4 51.96mg，产率87％。
实施例2氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物(LD4)预防和治疗肠纤维化
本发明实施例1制备的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物LD4治疗葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠肠纤维化的在体实验过程，包括如下步骤：
C57BL/6J小鼠正常组饮用纯净水，其余各组采用1.5％DSS水饮用一周，纯净水恢复两周，接着2％DSS水饮用一周恢复两周，再循环一次2％DSS水饮用一周来建立肠纤维化模型。将小鼠随机分为6组，每组10只，处理方法如下：1.Control组(生理盐水)；2.DSS组(DSS饮水)；3.LD4-PDTL组(DSS饮水和低剂量LD4 60μg/kg灌肠)；4.LD4-PDTM组(DSS饮水和中剂量LD4 120μg/kg灌肠)；5.LD4-PDTH组(DSS饮水和高剂量LD4 240μg/kg灌肠)；6.柳氮磺胺吡啶(SASP)组(DSS饮水和阳性对照药物SASP 500mg/kg灌胃)。建立肠纤维化模型后，第9周开始治疗。LD4每隔1天灌肠一次，同时灌胃SASP，共4次。每次LD4灌肠后30min，结肠用密集的650nm PDT系统照射，能量密度为25J/cm2。每日测量体重和摄食量。第11周，禁食24小时后处死所有小鼠，取全结肠和血，解剖并保存在-80℃，部分组织用4％多聚甲醛固定。
血清中FITC-dextran荧光强度检测动物肠道的通透性可以通过使用荧光示踪剂检测血清中的荧光强度进行半定量检测。取正常收集无溶血血清，称取FITC-dextran粉末200μg，溶于5ml血清中，倍比稀释10次，再使用酶标仪检测荧光强度，即可得到标准曲线。LD4-PDT治疗后，处死动物当天，提前4h禁食。灌胃配制好的FITC-dextran示踪剂，剂量0.6mg/g体重。动物处死前取血，收集无溶血血清。将血清加入96孔板中，每孔100μl，使用酶标仪检测荧光强度(激发光488nm，发射光520nm)，通过标准曲线公式可计算出动物血清中FITC-dextran的含量。
标本获取分析取出固定在4％的多聚甲醛的结肠组织，脱水、包埋、切片(厚度为5μm)，进行HE染色和Masson染色，每组切片染色完成后进行炎症程度和纤维化组织病理学分析。
蛋白免疫印迹组织使用RIPA裂解液4℃ 30min裂解，12000rpm，4℃离心20min。使用BCA法进行蛋白定量。根据体积取适量样品加入4×loading buffer后，100℃煮沸变性10min。蛋白用12％SDS-PAGE预制胶分离，然后转移到PVDF膜上。膜用5％脱脂牛奶封闭，TBST稀释一抗，抗体浓度根据说明书配置。
统计学分析采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 6进行数据分析。所有数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析进行统计学分析，当P<0.05认为有统计学意义。
LD4-PDT对DSS诱导的小鼠肠纤维化模型体重和结肠长度的影响结果表明，正常对照组小鼠体重稳步上升；与对照组相比，DSS组小鼠体重有所下降；与DSS相比，LD4-PDT增加了小鼠的体重(图1)。肉眼观察取出的动物结肠组织，可发现正常对照组的小鼠结肠内壁完整，皱襞规整，血管纹理清晰，无明显的糜烂、溃疡或肉芽肿。DSS组可见结肠缩短，黏膜显著充血水肿，散在性糜烂或溃疡伴出血及溃疡。其他给药组动物的结肠也可见不同程度的病理损伤，但是结肠的长度和肠壁变薄情况均有不同程度改善。此外，LD4-PDT小鼠结肠长度明显长于DSS小鼠结肠(图2)。因此，LD4-PDT增加DSS诱导的小鼠体重和结肠长度。
LD4-PDT对DSS诱导的小鼠肠纤维化模型肠道通透性的影响炎症性肠病的动物肠道上皮和肠道黏膜都会有不同程度的损伤，而肠道上皮屏障是肠道固有免疫的重要组成部分，通过测定肠壁通透性来确定疾病的活动性。我们通过灌胃实验动物异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran)，检测其血清中荧光强度可以间接反映动物肠道的通透性。数据显示，正常对照组小鼠血清中FITC含量很低，说明肠道通透性正常。DSS组的FITC含量明显升高说明肠道通透性增加，肠壁有损伤，而LD4-PDT和SASP各组的FITC含量均有显著降低，说明药物对保护肠道有一定的作用(图3)。
LD4-PDT对DSS诱导的小鼠肠纤维化模型炎症程度和纤维化程度的影响HE染色病理学分析显示，DSS组上皮细胞脱落，膜下层炎性细胞浸润，溃疡形成，粘膜腺体排列紊乱、破坏、消失，杯状细胞减少甚至消失，发生大量的炎性细胞浸润。与DSS组相比，LD4-PDT处理可使小鼠结肠病理症状明显减轻(图4)。小鼠结肠组织Masson染色病理学分析显示，DSS组小鼠结肠组织细胞外基质明显增生，有大量染蓝的胶原纤维增生沉积，形成广泛的纤维化；而LD4-PDT各治疗组与DSS组相比显著减轻结肠组织胶原纤维沉积(图5)。与DSS组相比，用药各剂量组小鼠结肠组织中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表达显著性降低(图6)。结果表明LD4-PDT可以减少DSS诱导肠纤维化的小鼠结肠组织胶原纤维生成，抑制胶原沉积减轻肠纤维化。进一步检测结肠组织中IL-6和TNF-α表达。结果显示，与DSS组相比，LD4-PDT治疗后的小鼠结肠组织中IL-6和TNF-α含量较低(图7)。
LD4-PDT对AOC1/EMT通路影响检测小鼠结肠组织中AOC1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。结果显示，与DSS组相比，LD4-PDT各剂量组小鼠结肠组织中AOC1和Vimentin蛋白表达显著性降低，E-cadherin蛋白表达显著升高(图8)。
实施例3氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物(LD4)预防和治疗肠纤维化
本发明实施例1制备的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物LD4治疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠肠纤维化的在体实验过程，包括如下步骤：
大鼠在模型诱导前禁食24h，使用10％水合氯醛麻醉。使用150mg/kg的TNBS，直径3mm聚乙烯橡胶导管(插入近端肛门直肠8cm)注射大鼠结肠内，建立肠纤维化模型。将大鼠随机分为6组，每组6只，处理方法如下：1.Control组(生理盐水)；2.TNBS组(TNBS灌肠)；3.LD4-PDTL组(TNBS和低剂量LD4，60μg/kg，均灌肠)；4.LD4-PDTM组(TNBS和中剂量LD4，120μg/kg，均灌肠)；5.LD4-PDTH组(TNBS和高剂量LD4 240μg/kg，均灌肠)；6、SASP组(TNBS灌肠及阳性对照药物，SASP 500mg/kg，灌胃)。以TNBS灌肠当日为第0天，第7天开始治疗。LD4每隔1天灌肠一次，同时灌胃SASP，共4次。每次治疗后30min，结肠部位用密集的650nm PDT系统照射，能量密度为25J/cm2。治疗结束，第19日禁食24h后处死所有大鼠，取全结肠和血，解剖并保存在-80℃，部分组织用4％多聚甲醛固定。
标本获取分析取出固定在4％的多聚甲醛的结肠组织，脱水、包埋、切片(厚度为5μm)，进行HE染色和Masson染色，每组切片染色完成后进行炎症程度和纤维化组织病理学分析。
蛋白免疫印迹组织使用RIPA裂解液4℃ 30min裂解，12000rpm，4℃离心20min。使用BCA法进行蛋白定量。根据体积取适量样品加入4×loading buffer后，100℃煮沸变性10min。蛋白用12％SDS-PAGE预制胶分离，然后转移到PVDF膜上。膜用5％脱脂牛奶封闭，TBST稀释一抗，抗体浓度根据说明书配置。
统计学分析采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 6进行数据分析。所有数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析进行统计学分析，当P<0.05认为有统计学意义。蛋白组学采用t-test进行差异分析，p≤0.05，Fold change≥1.5倍，定义为差异蛋白。
LD4-PDT对TNBS诱导的大鼠肠纤维化模型炎症程度和纤维化程度的影响HE染色病理分析显示，DSS组中存在大量的炎性细胞浸润。与TNBS组相比，LD4-PDT处理可使大鼠结肠炎症程度明显减轻(图9)。大鼠结肠组织Masson染色病理学分析显示，TNBS组中大鼠结肠组织胶原纤维增生沉积显著增加；而LD4-PDT各治疗组与TNBS组相比结肠组织胶原纤维沉积显著减轻(图10)。同样与TNBS组相比，用药各剂量组中大鼠结肠组织中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表达显著性降低(图11)。因此，结果表明LD4-PDT可以减轻TNBS诱导的肠纤维化。
实施例4氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物(LD4)预防和治疗肺纤维化
本发明实施例1制备的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物LD4治疗博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的在体实验过程，包括如下步骤：
15只ICR雄性小鼠随机分为对照组(Control)，模型组(BLM)，LD4-PDT组(240μg/kg，气管滴注)，每组5只。对照组气管内滴入0.9％氯化钠注射液，其余各组小鼠经气管给予博来霉素(BLM)溶液5mg/kg，建立肺纤维化模型。造模后第二天开始，LD4(240μg/kg，100μl)每周气管滴注一次，滴注药物30min后，在4、5肋骨之间进针于右肺中叶处用650nm PDT系统照射，能量密度为25J/cm2。连续三周，第22日禁食24h后处死所有小鼠，肺组织用4％多聚甲醛固定。
标本获取分析取出固定在4％的多聚甲醛的结肠组织，脱水、包埋、切片(厚度为5μm)，进行HE染色和Masson染色，每组切片染色完成后进行炎症程度和纤维化组织病理学分析。
统计学分析采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 6进行数据分析。所有数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析进行统计学分析，当P<0.05认为有统计学意义。
HE染色图和Masson染色图显示对照组小鼠的肺组织结构清晰，肺泡完整，肺间隔未见明显增厚、水肿、炎症及纤维化表现；模型组小鼠的肺组织肺泡结构完全破坏消失，炎性细胞浸润，胶原沉积明显增加；LD4-PDT组小鼠的肺组织炎性细胞浸润区域较模型组明显减少，肺组织结构较模型组明显完整，肺泡炎程度及纤维化程度较模型组呈现不同程度的降低(图12和图13)。
综上所述，LD4在光动力治疗葡聚糖硫酸钠和三硝基苯磺酸构建的肠纤维化模型动物时，可以明显减轻结肠炎症及纤维化程度，可抑制结肠组织中胶原的分泌和沉积，同时通过抑制AOC1的表达来进一步抑制上皮间充质转化程度，从而预防和治疗肠纤维化。LD4在光动力治疗博来霉素构建的小鼠肺纤维化模型时，可以明显减轻肺组织炎症及纤维化程度，从而预防和治疗肺纤维化。

Claims (4)

1.氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物在制备预防和治疗肠纤维化药物的应用，所述的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物具有下述结构：
Figure FDA0003255485980000011
2.根据权利要求1所述的用途，其特征是所述的药物为体内光动力治疗药物。
3.氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物在制备预防和治疗肺纤维化药物的应用，所述的氨基酸修饰氨基四苯基卟啉化合物具有下述结构：
Figure FDA0003255485980000012
4.根据权利要求3所述的用途，其特征是所述的药物为体内光动力治疗药物。
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