CN113621575B - 岩藻聚糖硫酸酯在细胞模型构建中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供岩藻聚糖硫酸酯在细胞模型构建中的应用，属于药物研发和细胞模型构建技术领域。本发明通过研究意外发现，岩藻聚糖硫酸酯能够明显缩短Caco‑2细胞单层模型构建时间，本模型建立过程安全、环保，建立的Caco‑2细胞单层表面生长出微绒毛结构，具有小肠上皮细胞相似的功能，可用于药物吸收转运研究。当在科研或实验中需要建立Caco‑2细胞单层模型时，可以使用本发明中的所述方法建模。本发明中对不同来源的岩藻聚糖硫酸酯进行研究，筛选出具有促Caco‑2细胞单层模型建立的岩藻聚糖硫酸酯，扩宽了岩藻聚糖硫酸酯的应用途径，并且为岩藻聚糖硫酸酯的开发和研究提供了理论和实验基础，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于药物研发和细胞模型构建技术领域，具体涉及岩藻聚糖硫酸酯在细胞模型构建中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
岩藻聚糖硫酸酯通常来源于褐藻细胞壁和一些海洋无脊椎动物组织。岩藻聚糖硫酸酯是一种复杂的水溶性硫酸化多糖，通常由L-岩藻糖，硫酸盐基团组成，也含有一定比例的其他单糖成分，包括糖醛酸，半乳糖，木糖，甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，阿拉伯糖和木糖。不同来源的岩藻聚糖硫酸酯在结构方面差异较大。通常，岩藻聚糖硫酸酯的组成和结构取决于海藻种类，产地位置，收获季节，和提取方法，其分子量(Mw)可在10,000至100,000Da之间变化，受这些因素影响，岩藻聚糖硫酸酯表现出许多有益于治疗应用的生物活性，主要包括：抗肿瘤，抗氧化，抗凝血，抗血栓形成，免疫调节，抗病毒和抗炎作用等。
Caco-2细胞系(Human colon adenocarcinoma Caco-2cell line)是一种人克隆结肠腺癌细胞。将一定密度的Caco-2细胞在聚碳酯纤维膜上，在每天更换培养基的条件下培养21d后，Caco-2细胞表面会出现致密的微绒毛结构，这种分化状态使Caco-2细胞拥有和正常小肠上皮细胞相似的物质转运条件和所需的代谢酶，具备研究药物吸收转运的条件，故Caco-2细胞模型广泛用于模拟药物在肠道黏膜内的吸收转运情况，例如研究药物被动的旁细胞和跨细胞扩散或研究药物的主动摄取和外排机制。
但传统的Caco-2细胞单层模型的存在许多缺点，如耗时长、成本高等。因此，更快更有效的细胞培养过程将提供一种更具成本效益的筛选化合物的过程。为了使模型适应快速筛选的需求，研究人员已经通过许多努力来加快Caco-2细胞单层的制备过程。例如使用含有补充2％铁的小牛血清、生长因子和激素组合的培养基进行细胞培养，这通常可以将Caco-2细胞单层模型的建模时间缩短3d。而最近研究表明，在Caco-2细胞单层模型建模过程中加入嘌呤霉素可以将建模时间缩短至7d。这一发现，虽然在很大程度上缩短了建模时间，但发明人发现，仍然存在诸多问题：
第一，模型建立时间长。至少通过7d的长培养期以使Caco-2细胞单层完全分化，而长时间的培养过程限制了模型的产量和实用性；
第二，成本高。长时间的培养需要投入更多的人力物力，消耗大；
第三，增加实验风险。7天的连续更换培养液增加了细胞和空气接触的时间，同时也增加了细胞的染菌风险。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供岩藻聚糖硫酸酯在细胞模型构建中的应用。本发明通过研究意外发现，岩藻聚糖硫酸酯能够明显缩短Caco-2细胞单层模型构建时间，不仅提高了实验的安全性，使染菌风险降低，同时还减少了实验中的成本投入。因此具有良好的实际应用之价值。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供岩藻聚糖硫酸酯在细胞模型构建中的应用。
所述细胞模型为Caco-2细胞模型。
具体的，所述应用包括：岩藻聚糖硫酸酯在缩短Caco-2细胞模型构建时间中的应用。
其中，对岩藻聚糖硫酸酯来源不做具体限定，包括但不限于裙带菜、巨藻、墨角藻和海带来源的岩藻聚糖硫酸酯；经试验证明，裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯对Caco-2细胞单层模型建立具有显著的促进作用，因此优选为裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯。
本发明的第二个方面，提供一种Caco-2细胞模型的构建方法，所述构建方法包括：在Caco-2细胞模型构建过程中，向培养基中加入岩藻聚糖硫酸酯。
具体的，所述构建方法包括：
使用嘌呤霉素培养基培养Caco-2细胞，向嘌呤霉素培养基中加入岩藻聚糖硫酸酯，每天换液，连续培养5天即得。
本发明的第三个方面，提供上述构建方法获得的Caco-2细胞模型。
本发明的第四个方面，提供上述Caco-2细胞模型在药物吸收、转运模型中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1)上述技术方案中Caco-2细胞单层模型建立方法简单、易操作、重复性较好、应用范围较广，且减少了建模时间，由原来的7天缩短至5天，这不仅提高了实验的安全性，使染菌风险降低，同时还减少了实验中的成本投入。本模型建立过程安全、环保，建立的Caco-2细胞单层表面生长出微绒毛结构，具有小肠上皮细胞相似的功能，可用于药物吸收转运研究。当在科研或实验中需要建立Caco-2细胞单层模型时，可以使用上述技术方案中的所述方法建模。
2)上述技术方案中对不同来源的岩藻聚糖硫酸酯进行研究，筛选出具有促Caco-2细胞单层模型建立的岩藻聚糖硫酸酯，扩宽了岩藻聚糖硫酸酯的应用途径，并且为岩藻聚糖硫酸酯的开发和研究提供了理论和实验基础，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中不同多糖对Caco-2细胞建模电阻值的影响；
图2为本发明实施例2中MTT法检测岩藻聚糖硫酸酯的细胞毒性；
图3为本发明实施例3中不同细胞密度对Caco-2细胞单层模型电阻值(TEER)建立的影响；
图4为本发明实施例4中岩藻聚糖硫酸酯浓度对Caco-2细胞单层模型TEER值建立的影响；其中，a为不同岩藻聚糖硫酸酯浓度下TEER值增长柱形图；b为不同岩藻聚糖硫酸酯浓度下TEER值增长趋势折线图；
图5为本发明实施例中不同Caco-2细胞单层模型AKP活性检测(AP/BL)；
图6为本发明实施例中不同Caco-2细胞单层模型对转铁蛋白转运影响；
图7为本发明实施例中扫描电镜下Caco-2细胞单层模型形态；其中，a为Caco-2细胞单层，Bar＝200μm；b为Caco-2细胞单层，Bar＝20μm；c为Caco-2细胞单层，Bar＝10μm；d为微绒毛结构，Bar＝4μm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
岩藻聚糖硫酸酯是一种复杂的水溶性硫酸化多糖，通常来源于褐藻细胞壁和一些海洋无脊椎动物组织。不同来源的岩藻聚糖硫酸酯在结构和组成方面存在差异，从而也导致生物活性的不同。其生物活性主要包括：抗肿瘤，抗氧化，抗凝血，抗血栓形成，免疫调节，抗病毒和抗炎作用等。
Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，可以用来进行模拟药物体内肠转运的实验。药物体内的吸收特性是新药研发成功的一个重要参考因素，故开发有效的药物筛选模型在新药研发中有重要作用。Caco-2细胞模型具有快速、准确以及需药量少等优点，已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。但传统的Caco-2细胞模型建立时间长，常需至少21天，这极大的限制了它的应用，最近有研究表明，可通过在Caco-2细胞单层模型建立过程中加入嘌呤霉素，将建模时间缩短至7天，这一发现虽然在很大程度上缩短了建模时间，但仍然存在着实验成本高、耗时较长、染菌风险高等诸多问题。
针对现有技术问题，基于现有的科研技术成果，本发明在前人的基础上，经过长期的研究和实验探索，解决了建模耗时长、成本高的缺点，成功将E.Sevin等建立的7天Caco-2细胞单层模型，进一步缩短至5天。本发明不仅提供了一种更具成本效益的筛选化合物的过程，并且提高了Caco-2细胞单层模型的产量和实用性，为Caco-2细胞单层模型以后的研究和应用提供新的理论依据。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供岩藻聚糖硫酸酯在细胞模型构建中的应用。
所述细胞模型为Caco-2细胞模型。
具体的，所述应用包括：岩藻聚糖硫酸酯在缩短Caco-2细胞模型构建时间中的应用。
其中，对岩藻聚糖硫酸酯来源不做具体限定，包括但不限于裙带菜、巨藻、墨角藻和海带来源的岩藻聚糖硫酸酯；经试验证明，裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯对Caco-2细胞单层模型建立具有显著的促进作用，因此优选为裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯。
本发明又一具体实施方式中，提供一种Caco-2细胞模型的构建方法，所述构建方法包括：在Caco-2细胞模型构建过程中，向培养基中加入岩藻聚糖硫酸酯。
其中，所述岩藻聚糖硫酸酯的浓度控制为1～800μg/ml，如1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和800μg/ml，经试验验证，在800μg/ml范围内，岩藻聚糖硫酸酯在24h内对Caco-2细胞没有毒性，其中，50μg/ml岩藻聚糖硫酸酯即对Caco-2细胞单层模型建立具有显著的促进作用。
所述岩藻聚糖硫酸酯包括但不限于裙带菜、巨藻、墨角藻和海带来源的岩藻聚糖硫酸酯；优选为裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯。
具体的，所述构建方法包括：
使用嘌呤霉素培养基培养Caco-2细胞，向嘌呤霉素培养基中加入岩藻聚糖硫酸酯，每天换液，连续培养5天即得。
其中，所述Caco-2细胞为人结肠腺癌Caco-2细胞。
所述嘌呤霉素培养基为含有嘌呤霉素的(不含双抗)DMEM完全培养基；
其中，嘌呤霉素浓度为0.1～0.5μg/mL，如0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL和0.5μg/mL；优选为0.4μg/mL。通过加入嘌呤霉素也能有效缩短Caco-2细胞模型的构建时间。
所述岩藻聚糖硫酸酯的浓度控制为1～800μg/ml，如1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和800μg/ml，其中，50μg/ml岩藻聚糖硫酸酯即对Caco-2细胞单层模型建立具有显著的促进作用。
所述岩藻聚糖硫酸酯包括但不限于裙带菜、巨藻、墨角藻和海带来源的岩藻聚糖硫酸酯；优选为裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯。
本发明又一具体实施方式中，提供上述构建方法获得的Caco-2细胞模型。
本发明又一具体实施方式中，提供上述Caco-2细胞模型在药物吸收、转运模型中的应用。
本发明又一具体实施方式中，提供一种促进Caco-2细胞单层模型建立的药物，包括岩藻聚糖硫酸酯。步骤如下：
用嘌呤霉素培养基(PM-DMEM，含0.4μg/mL嘌呤霉素(不含双抗)的DMEM完全培养基)配制50μg/ml的裙带菜、巨藻、墨角藻、洁晶来源的岩藻聚糖硫酸酯以及50μg/ml聚甘露糖醛酸。按8000cells/well的细胞密度将Caco-2细胞加入Transwell上室，每天加药，检测并记录电阻值。
测量电阻值的目的是通过电阻值的变化初步筛选出具有促Caco-2细胞单层模型电阻值增加的岩藻聚糖硫酸酯，并用于进一步实验。结果如图1，裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯促电阻值增加效果最明显。
本发明又一具体实施方式中，所述的细胞为人结肠腺癌Caco-2细胞系。
本发明又一具体实施方式中，所选的糖均为海洋多糖，其中裙带菜、巨藻、墨角藻来源的岩藻聚糖硫酸酯均为Sigma公司。
本发明又一具体实施方式中，提供一种缩短Caco-2细胞单层模型建立的方法，包括以下步骤：
取20-50代细胞复苏，培养至对数生长期，配制50μg/ml的裙带菜来源的Fuc-PM-DMEM培养基，将Caco-2细胞按照8000cells/well加入Transwell小室上室中，下室加入相应培养基。每天换液。即得。
本发明又一具体实施方式中，所述的细胞为人结肠腺癌Caco-2细胞系。
本发明又一具体实施方式中，所选的糖均为岩藻聚糖硫酸酯，其中裙带菜、巨藻、墨角藻来源的岩藻聚糖硫酸酯均为Sigma公司。
以纯PM-DMEM培养基作为标准对照品，裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯对Caco-2细胞单层模型建立具有显著的促进作用(浓度为50μg/ml)。
本发明中裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯有显著的促Caco-2细胞单层模型建立作用，说明可以将岩藻聚糖硫酸酯用于新药研发中药物吸收、转运模型建立中。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：不同多糖对Caco-2细胞建模中电阻值的影响
据前人研究，模型建立第7天电阻值达到500Ω·cm-2，证明Caco-2细胞单层致密性完整，达到模型建立电阻值要求。
细胞培养：取20-50代细胞复苏，培养至对数生长期，用嘌呤霉素培养基将Caco-2细胞按照8000cells/well加入Transwell上室中，下室加入1000μL相应的培养基。
加药：24h后将加药组Transwell上室培养基更换为含有50μg/mL不同多糖的嘌呤霉素培养基(Fuc-PM-DMEM)，下室仍为嘌呤霉素培养基，进行Caco-2细胞单层模型建模，每天更换培养液，检测并记录电阻值。连续培养5d。本次实验所用的多糖为岩藻聚糖硫酸酯和聚甘露糖醛酸(PM)，其中岩藻聚糖硫酸酯来源于墨角藻、裙带菜、巨藻以及海带。
(3)结果如图1所示，六个组的电阻值在第5天时都达到了500Ω，其中，与空白组相比，裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯电阻值增长最大，其它多糖虽也促进了电阻值的增长，但无法达到其他规定的指标，故选择裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯是最佳选择。
实施例2：MTT法检测岩藻聚糖硫酸酯对Caco-2细胞的毒性
(1)细胞培养：细胞密度为105/ml，每孔100ul细胞悬液，边缘孔100ul的HBSS。
(2)加药处理：分别加入50，100，200，400，800μg/mL的岩藻聚糖硫酸酯，设置6个复孔，并设置一组空白对照。
(3)MTT法：避光条件下，每孔10ulMTT。培养箱培养四小时后，吸净培养液，每孔加入100ulDMSO。酶标仪测量OD值，计算细胞存活率。
(4)结果如图2所示，在测试浓度0-800μg/ml范围内，岩藻聚糖硫酸酯在24h内对Caco-2细胞没有毒性。
实施例3：Caco-2细胞密度对模型建立的影响
(1)细胞培养：用嘌呤霉素培养基(PM-DMEM，含0.4μg/mL嘌呤霉素(不含双抗)的DMEM完全培养基)，按2000cells/well、4000cells/well、6000cells/well、8000cells/well的细胞密度将Caco-2细胞加入Transwell(孔径：0.4μm，表面积：0.336cm2)上室中，下室加入1000μL嘌呤霉素培养基，设置3组平行，设置空白对照组，培养7d，每天换液。
(2)电阻检测：建模期间，每天使用Millicell-ERS伏安计固定时间点检测Caco-2细胞单层的跨膜电阻值(Trans epithelium electrical resistance，TEER)以检测初始细胞密度对Caco-2细胞单层跨膜电阻值增长的影响。
(3)如图3所示，建模过程中，所有实验组电阻值随时间增长递增，在8000cell/well细胞密度下，模型建立第7天电阻值达到500Ω·cm-2，证明Caco-2细胞单层致密性完整，达到模型建立电阻值要求，因此选择该细胞密度—8000cell/well，用于岩藻聚糖硫酸酯对电阻值增长研究。
实施例4：岩藻聚糖硫酸酯浓度对Caco-2细胞单层模型建立的影响
(1)细胞培养：用含有15％(v/v)胎牛血清的PM-DMEM培养基培养Caco-2细胞。选择8000cells/well的细胞密度将Caco-2细胞加入Transwell上室中，下室加入1000μL嘌呤霉素培养基，设置3组平行。
(2)加药：12h后，将Transwell上室和下室的培养基更换为含有不同浓度(100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL)岩藻聚糖硫酸酯的嘌呤霉素培养基，设置3组平行，培养7d，每天换液。
(3)电阻检测：建模期间，每天使用Millicell-ERS伏安计固定时间点检测Caco-2细胞单层的TEER值，以检测岩藻聚糖硫酸酯对Caco-2细胞单层跨膜电阻值增长的影响。
(4)如图4所示，在模型建立过程中加入25μg/mL-100μg/mL的岩藻聚糖硫酸酯可以在这一过程中显著加快TEER值增长，使电阻值在第4d起即可达到500Ω·cm2，并在第5d起达到相对稳定的水平，且50μg/mL岩藻聚糖硫酸酯浓度下电阻值增加速度最为快速，在第5d时可达到780Ω·cm2，因此50μg/mL为最佳浓度。
结合以上实施例说明，通过在Caco-2细胞单层模型建立过程中加入50μg/mL裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯可以进一步将Caco-2细胞单层模型建立的时间缩短至5d。
实施例5：碱性磷酸酶活性测定实验
碱性磷酸酶是肠上皮细胞的标记酶，其浓度代表Caco-2细胞单层的极性和功能，实验测定5天Caco-2细胞单层模型的AKP(AP/BL)的值，当值大于1.5时，则说明达到模型建立标准。
(1)细胞培养：取20-50代细胞复苏，培养至对数生长期，用嘌呤霉素培养基将Caco-2细胞按照8000cells/well加入Transwell上室中，下室加入1000μL相应的培养基，12h后将加药组Transwell上室和下室培养基更换为含有50μg/mL岩藻聚糖硫酸酯的嘌呤霉素培养基(Fuc-PM-DMEM)进行Caco-2细胞单层模型建模，每天更换培养液，连续培养5d。
(2)活性检测：在模型建立的第5d收集小室顶侧和基底侧的培养基，根据碱性磷酸酶试剂盒说明书检测两种模型顶侧和基底侧(AP/BL)AKP的活性。
(3)AKP活性如图5所示，在5天的培养中添加50μg/mL岩藻聚糖硫酸酯影响的Caco-2细胞单层模型AKP活性(AP/BL)为1.58，满足Caco-2细胞单层模型的标准(>1.5)，而未加入岩藻聚糖硫酸酯建模的Caco-2细胞单层模型AKP(AP/BL)活性为1.38，未达到建模标准。
实施例6荧光素钠透过率——渗透性实验
荧光素钠是一种有机化合物，具有极强的黄绿色荧光，是一种检测生物膜渗透性的渗透标志物，可用荧光检测器检测。通过检测transwell小室的上下室中荧光素钠浓度的差异可以判断5天Caco-2细胞单层模型建立成功与否。
(1)细胞培养：取20-50代细胞复苏，培养至对数生长期，用含有50μg/mL岩藻聚糖硫酸酯的PM-DMEM培养基(Fuc-PM-DMEM)与PM-DMEM培养基分别将Caco-2细胞按照8000cells/well加入Transwell小室上室中，下室加入1000μL相应的培养基进行培养，每天换液。
(2)检测：当用Fuc-PM-DMEM培养基建模的Caco-2细胞单层模型达到第5d，用PM-DMEM培养基建模的Caco-2细胞单层模型达到第7d时，用HBSS缓冲液洗涤Caco-2细胞单层三次，并在顶侧供应池加入400μL HBSS缓冲液，基底侧接收池加入1000μL HBSS缓冲液，然后在CO2培养箱中孵育30min进行平衡；随后将上下两室HBSS缓冲液吸尽，在顶侧加入250μL的10μg/mL荧光素钠溶液，基底侧加入1000μL HBSS缓冲液，分别放置于37℃恒温培养不同时间(30、60、120、180min)；孵育完成后，收集基底侧转运介质200μL于96全黑孔板中，测定荧光强度，并计算荧光素钠在5天Caco-2细胞单层模型和7天Caco-2细胞单层模型中的转运浓度和透过率，每组设置三个平行。
表1不同时间不同岩藻聚糖硫酸酯浓度处理后荧光素钠表观渗透系数Papp(×10- 7cm/s)
注：荧光素钠的回归方程为y＝98782x+15085(R2＝0.9999，范围为0.1-50ng/mL)
表2不同时间、不同岩藻聚糖硫酸酯浓度荧光素钠透过率RT(％)
(3)荧光素钠透过率如表1、2所示，建模5d后Caco-2细胞模型标志物荧光素钠在30-180min的Papp均小于1×10-6cm/s。且荧光素钠透过率很低，与7天模型的空白组相比无显著性差异，达到Caco-2细胞单层模型的标准。
实施例6：5天Caco-2细胞单层模型对物质吸收的影响
转铁蛋白是一种大分子单链糖蛋白，可作为网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用的标志物。它和葡聚糖可以检测建成的5天Caco-2细胞单层模型是否具有肠上皮细胞应有的生物活性(如大分子物质的转运、吸收)。
(1)细胞培养：取20-50代细胞复苏，培养至对数生长期，用Fuc-PM-DMEM培养基与PM-DMEM培养基分别将Caco-2细胞按照8000cells/well加入Transwell小室上室中，下室加入1000μL相应的培养基进行培养，每天换液。
(2)检测：当用Fuc-PM-DMEM培养基建模的Caco-2细胞单层模型达到第5d，PM-DMEM培养基建模的Caco-2细胞单层模型达到第7d，且TEER＞500Ω·cm2后，用HBSS缓冲液洗涤Caco-2细胞单层三次，并在顶侧供应池加入400μL HBSS缓冲液，基底侧接收池加入1000μLHBSS缓冲液，然后在CO2培养箱中孵育30min以进行平衡；将上下两室液体吸尽，在两种模型的顶侧分别加入250μL的10μg/mL转铁蛋白溶液和葡聚糖溶液，基底侧加入1000μL HBSS缓冲液，分别放置于37℃恒温培养120min，待孵育完成后，收集基底侧转运介质200μL于96全黑孔板中，进行荧光强度测量，并计算相关表观渗透系数，每组设置三个平行。
表3转铁蛋白吸收表观渗透系数Papp(×10-5cm/s)差异
注：转铁蛋白的回归方程为y＝559348x+5050.3(R2＝0.9991，范围为0.001-2.5μg/mL)
表4葡聚糖吸收表观渗透系数Papp(×10-6cm/s)差异
注：葡聚糖的回归方程为y＝28575x+11675(R2＝0.9993，范围为0.01-10μg/mL)
(3)如表3、图6所示，Caco-2细胞7天单层模型与Caco-2细胞5天单层模型在120min内对转铁蛋白吸收的表观渗透系数分别为4.45±0.18×10-5cm/s和4.61±0.05×10-5cm/s，结果表明，转铁蛋白在两种Caco-2细胞单层模型中的吸收转运没有显著性差异。
如表4所示，7天Caco-2细胞单层模型与5天Caco-2细胞单层模型在120min内对葡聚糖吸收的表观渗透系数分别为4.56±0.28×10-6cm/s和4.46±0.57×10-6cm/s，结果表明，葡聚糖在两种Caco-2细胞单层模型中的吸收转运没有显著性差异。因此，网格蛋白和小窝蛋白介导的物质吸收作用以及通过巨胞饮途径街道的物质吸收作用可能并不受岩藻聚糖硫酸酯加入的影响。
实施例7：岩藻聚糖硫酸酯作用下Caco-2细胞单层电镜状态
(1)细胞培养：取20-50代细胞复苏，培养至对数生长期，用Fuc-PM-DMEM培养基将Caco-2细胞按照8000cells/well加入Transwell小室上室中，下室加入1000μL相应的培养基进行培养，每天换液，培养至第5d。
(2)检测：将聚酯纤维膜连同细胞取下，用2.5％戊二醛4℃固定细胞过夜，用0.1mol·L-1PBS(pH＝7.2)洗3次，10min/次，经30％、50％、70％、90％和100％酒精梯度脱水各30min后，放入-40℃低温冰箱过夜，之后放入冷冻干燥机中冻干，干燥后的样品用导电胶固定在样品托上，在高真空镀膜仪中喷金，之后用Nova NanoSEM450场发射扫描电镜观察并拍照，加速电压5kV。
(3)如图7所示，低倍镜条件下，Caco-2细胞之间排列紧密，每个细胞呈现不规则圆形，细胞之间的边界清晰可见(图a)；10000和20000倍时，细胞表面可见覆盖一层不规则微绒毛，并且可以看到细胞层上呈现出较大的裂痕，这可能是因为冷冻干燥过程对细胞单层模型造成的破坏(图b、c)；当放大至50000倍时，可见细胞表面微绒毛清晰形态，微绒毛的长度在600-800nm左右，直径为80nm左右(图d)，这与之前的研究是一致的。该结果验证了通过加入岩藻聚糖硫酸酯建立的5天Caco-2细胞单层模型已经生长出微绒毛结构，这是反映该模型功能状态的一个重要指标，表明了Caco-2细胞单层模型的成功建立。
综上所述，证明加入岩藻聚糖硫酸酯后建立的Caco-2细胞单层模型具有与正常小肠上皮细胞相似的物质转运条件和所需的代谢酶，Caco-2细胞单层模型建模成功，说明可以将岩藻聚糖硫酸酯用于新药研发的药物吸收、转运模型建立中。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种Caco-2细胞模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：在Caco-2细胞模型构建过程中，使用嘌呤霉素培养基培养Caco-2细胞，向嘌呤霉素培养基中加入岩藻聚糖硫酸酯，每天换液，连续培养5天即得；
所述Caco-2细胞为人结肠腺癌Caco-2细胞；
所述嘌呤霉素培养基为含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基；
其中，嘌呤霉素浓度为0.1~0.5μg/mL；
所述岩藻聚糖硫酸酯的浓度控制为25~100μg/ml；
所述岩藻聚糖硫酸酯为裙带菜来源的岩藻聚糖硫酸酯。
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| JP2006304619A (ja) * | 2005-04-26 | 2006-11-09 | Kumamoto Univ | Ｃａｃｏ−２細胞を用いたエステル含有化合物の消化管吸収性の予測方法 |
| CN106701683A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-05-24 | 王荣 | 用于研究高原缺氧情况下药物吸收的细胞模型的建立方法 |
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Non-Patent Citations (3)
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| 岩藻聚糖硫酸酯吸收机制和组织分布研究;张娥;中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑(第9期);第1、16、24、26、28、39页 * |
| 岩藻聚糖硫酸酯的肠吸收及其药代动力学初步研究;褚福龙;中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑(第9期);正文第1-2页 * |
| 张娥.岩藻聚糖硫酸酯吸收机制和组织分布研究.中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑.2019,(第9期),第1、16、24、26、28、39页. * |
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