CN113616534A - 抑制par-2活化角质细胞组合物及其在面膜中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抑制PAR‑2活化角质细胞组合物及其在面膜中的应用，本发明提供了一种抑制PAR‑2活化角质细胞的组合物，所述组合物包含海藻糖、生物糖胶‑1、烟酰胺、氨甲环酸，以PAR‑2为作用靶点，通过抑制PAR‑2的活性影响其对黑色素转运的介导作用，抑制角质细胞被PAR‑2活化后对黑色素体的吞噬作用，阻碍黑色素在角质层的积累和沉积，起到预防紫外线照射或皮肤炎症状态下色素沉着问题。本发明还将该组合物应用在面膜中，提供了一种抑制色素沉着的面膜；通过测试实验表明，本发明的面膜对PAR‑2活性具有抑制作用，对黑色素生成和色素沉着均有抑制作用，且产品安全性较好。

Description

抑制PAR-2活化角质细胞组合物及其在面膜中的应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种抑制PAR-2活化角质细胞组合物及其在面膜中的应用。
背景技术
色素沉着是因各种原因引起色素增加导致皮肤颜色加深。最常见的原因为日晒，也可因遗传、代谢、内分泌、肿瘤、炎症性疾病、物理、机械、化学性刺激及先天性因素引起。主要临床表现为皮肤颜色加深或出现颜色较正常肤色颜色深的斑点、斑片或斑块。目前针对皮肤色素沉着多以发生后改善为主，更多的治疗方针是对已沉积的色素进行淡色或剥脱，包括用维生素C将黑色素还原为黑色素前体以及对角质层进行焕肤等，前者治疗周期较长，后者显效较快但具有一定风险。
人体皮肤角质层代谢周期长达28天，色素沉着后黑素数量会不断累积、聚集，最终形成黑素聚合物，通过肌肤自身代谢黑素聚合物是较为困难的，通过维生素C等还原剂对色素进行淡色效果缓慢，医美上常采取果酸、乳酸、水杨酸焕肤法来治疗色素沉着，它通过高浓度果酸“破坏”肌肤表皮和部分真皮，来激发肌肤自身的保护功能，令肌肤细胞快速再生，达到焕肤的目的。它的显效时间比较快速，但也要承担一部分风险，可能出现皮肤干燥、脱皮、瘙痒、刺痛、发红、灼热感等不适症状，皮肤屏障也容易遭到破坏。因此，开发一款能抑制色素沉着的产品尤为重要。
鉴于此，申请此专利。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种抑制PAR-2活化角质细胞组合物，本发明的抑制PAR-2活化角质细胞组合物，能够对PAR-2活性有抑制作用，且对黑色素生成和色素沉着均有抑制作用。
本发明的一个目的是提供一种抑制PAR-2活化角质细胞组合物。
本发明的另一个目的是提供一种采用上述的抑制PAR-2活化角质细胞组合物制成的面膜。
本发明的再一个目的是提供一种制备所述面膜的方法。
一种抑制PAR-2活化角质细胞组合物，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物包括以下原料中的至少三种，所述原料为：海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸。
进一步的，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物包括海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸，所述海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸的添加量之比为(0.5-5)：(0.05-3)：(0.01-5)：(0.01-3)。
一种采用所述的抑制PAR-2活化角质细胞组合物制成的面膜，所述面膜由膜布浸入包含所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物的精华液中制得，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物按精华液总重量的百分比计为：0.5-5％的海藻糖、0.05-3％的生物糖胶-1、0.01-5％的烟酰胺和0.01-3％的氨甲环酸。
进一步的，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物按精华液总重量的百分比计为：0.5-2％的海藻糖、0.1-1％的生物糖胶-1、1-3％的烟酰胺和0.5-3％的氨甲环酸。
进一步的，所述精华液按重量百分比计还包括：0.1％-10％的保湿剂、0.1％-10％的皮肤调理剂、0.01％-1％的丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.01％-1％的对羟基苯乙酮、0.01-1％的精氨酸和0.1％-15％的多元醇。
更进一步的，所述保湿剂为海藻糖、普鲁兰多糖、银耳多糖、鼠李糖、棉籽糖、尿素、泛醇、小核菌胶、透明质酸钠、卵磷脂、水溶性硅油、酵母提取物、聚甘油、甘油葡糖苷、芦芭胶、β-葡聚糖及γ-聚谷氨酸钠的一种或多种。
更进一步的，所述皮肤调理剂为羟苯基丙酰胺苯甲酸、燕麦蒽酰胺、神经酰胺、生育酚乙酸酯、水解胶原、积雪草提取物及尿囊素的一种或多种。
更进一步的，所述多元醇为甘油、甲基丙二醇、1,2-己二醇、丁二醇、1,2-戊二醇及1,3-丙二醇的一种或多种。
制备所述面膜的方法，所述方法包括以下步骤：
S1：按原料配比称取原料质量，将所有保湿剂用甘油分散备用；
S2：将对羟基苯乙酮于80-85℃溶于多元醇中，溶解均匀，形成对羟基苯乙酮溶液备用；
S2：在主锅中加入丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物于去离子水浸泡10min至料体湿润，搅拌中加入步骤S1制备的所有用甘油分散后的保湿剂和步骤S2得到的所述对羟基苯乙酮溶液，搅拌并升温至80-85℃，至原料溶解均匀，搅拌速率10-150r/min，保温灭菌30-60mins；
S3：将所述主锅温度降至50-55℃，加入精氨酸，搅拌均匀，搅拌速率10-150r/min；然后将温度降至40-45℃后，依次加入所有的抑制PAR-2活化角质细胞组合物、皮肤调理剂，搅拌均匀，搅拌速率10-150r/min；主锅温度降至38℃后，停止搅拌，出料即为精华液；
S4：将膜布浸入步骤S3得到的所述精华液中，即得面膜。
蛋白酶激活受体家族属于耦联G蛋白受体的一个亚家族，目前共发现4种分子，即PAR-1、2、3、4，蛋白酶激活受体2(PAR-2)是一种7次跨膜的耦联G蛋白受体分子，主要定位于胰腺、胃、肠道的上皮细胞、平滑肌细胞；肾脏、肺、卵巢、子宫、及血管的上皮细胞或内皮细胞，在皮肤组织中也有较高量的表达，活化后引起信号级联反应，在色素转运和吞噬作用、痒觉过敏、炎症诱发等方面发挥作用。在表皮中，PAR-2只表达于角质形成细胞，不表达于黑素细胞；高表达于颗粒层，中度表达于棘细胞层和基底层。
肤色是由表皮中黑素的产生和分布决定的。黑素体是黑素细胞特有的细胞器，含有黑素合成所必须的酶和结构蛋白。在黑素细胞内含有黑素的黑素体从最初的核周细胞质转移至突起是由微管蛋白及肌动蛋白组成的运动蛋白介导的，黑素体为角质形成细胞摄取,并分散到细胞浆中，决定皮肤肤色。目前黑素相关合成机理较成熟，转运机制主要有四种学说：①吞噬作用：角质形成细胞通过吞入黑素细胞的突出末梢，然后将黑素等摄入至细胞内；②内吞作用：黑素细胞释放出黑素体，然后被角质形成细胞以内吞方式摄取；③主动转运：黑素体被黑素细胞直接注入角质形成细胞中；④孔道转运：黑素细胞膜和角质形成细胞膜之间形成一系列连续的孔道，黑素体可以通过这些孔道转运。目前，一般认为，黑素转运以PAR-2介导的吞噬作用为主，多种转运机制共存。在皮肤晒黑过程中，紫外线一方面通过促使角质形成细胞分泌内皮素等影响黑素细胞的树突形成和黑素合成：另一方面是通过影响PAR-2的活性来介导表皮色素转运。
PAR-2通常能够被胰蛋白酶Ⅱ和Ⅳ、肥大细胞产生的两种类胰蛋白酶、凝血因子Ⅶa和Xa以及一些根据“连系配体”序列合成的多肽所激活，且激活后是不可逆的，其介导黑素的转运，在皮肤色素着色中发挥关键作用。人体皮肤经紫外线照射后可诱导PAR-2的高表达，并可促进PAR-2在角质形成细胞膜上的移位和激活，增强角质形成细胞对黑素小体的吞噬，促进和加速黑素转运，最后导致皮肤的晒黑。PAR-2一般仅表达在基底上皮细胞层，经紫外线照射后，PAR-2可表达于整个表皮层，角质形成细胞的PAR-2酶切激活能力增强，从而在色素转运范围和转运量上增强色素转运。紫外线可导致皮肤产生多种炎症反应，如炎症介质产生、炎症细胞浸润等，急性炎症反应临床上可表现为皮肤红斑、肿胀及水疱形成，自觉烧灼感和疼痛。皮肤在炎症反应状态下，一方面PAR-2表达会直接增加影响角质细胞的吞噬作用；另一方面胰蛋白酶或类胰蛋白酶活性也会增加，胰蛋白酶为PAR-2的激活剂，会进一步提升PAR-2的活性，促进角质细胞吞噬黑色素；紫外线照射后皮肤在炎症状态下会有慢性皮损，受损组织会释放大量的丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶会活化PAR-2的活性，抑制板层小体的释放，阻碍屏障修复，加快色素沉着。因此，抑制PAR-2活化角质细胞能够有效预防紫外线照射后皮肤炎症状态下的色素沉着问题。
海藻糖是由特殊双糖分子构成的非还原性糖，性质非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形特殊的保护膜，有效的保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。第二军医大学奚悦在《海藻糖对UVB照射皮肤的保护作用及机制研究》表明，海藻糖通过抑制UVB对DNA的损伤达到对角质形成细胞的保护作用。因此，海藻糖具有抗紫外线功能，能够抑制紫外线辐照皮肤后诱导PAR-2的高表达，抑制皮肤晒黑或色素沉着的发生。
生物糖胶-1主要成分是L-岩藻糖，L-岩藻糖具有重要的生理作用，它参与细胞的识别与粘附、糖链的合成、肿瘤的发生与转移以及参与ABO血型H抗原形成。L-岩藻糖可促进纤维母细胞生长从而避免因辐射、紫外线照射而杀死纤维母细胞，造成皮肤缺少胶原蛋白，皮肤松弛的结果，也可减低皮肤中蛋白水解酶MMP-2和MMP-9的活性，从而减少对皮肤的损伤。L-岩藻糖对皮肤系统和呼吸系统具有抗炎作用，可通过保护细胞表面蛋白质来阻止发生炎症并及时转移健康细胞。因此，在紫外线引起的急性炎症反应状态下，L-岩藻糖可以通过对皮肤的抗炎作用，抑制炎症状态下PAR-2表达量的增加，减轻色素沉着。
烟酰胺在化妆品中的应用包括改善色素沉着和减少皱纹、改善色斑和红斑等，其中对色素沉着的改善作用，原因在于通过影响黑素细胞与角质形成细胞间通路，抑制黑色素小体由黑素细胞向角质形成细胞的转运。在紫外线引起的急性炎症反应状态下，不仅会直接引起PAR-2表达量增加，还会增加胰蛋白酶和类胰蛋白的表达。在专利CN 103002869A中，C.L.斯万松等人通过设计实验验证了单组分烟酰胺对胰蛋白酶有抑制作用，而胰蛋白酶是PAR-2的激活剂，因此烟酰胺能够通过抑制紫外线急性炎症状态下胰蛋白酶的活性来抑制PAR-2的活性。
紫外线照射所致皮肤炎症状态下，受损组织会释放大量丝氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶能够破坏角桥粒结构,使角质层完整性受损，并可通过活化PAR-2通路，抑制板层小体的释放，抑制屏障功能的修复。北京大学皮肤性病学硕士孙楠等人发表论文《氨甲环酸对治疗玫瑰痤疮患者皮肤屏障功能和炎症反应的影响》，研究表明，氨甲环酸可通过抑制角质层丝氨酸蛋白酶活性及抗菌肽LL-37表达，修复玫瑰痤疮患者受损的屏障功能，有效改善玫瑰痤疮诱发的色素沉积。因此，氨甲环酸能够在紫外线急性炎症状态下，通过抑制受损阻止丝氨酸蛋白酶的活性来下调PAR-2的活性。
综上，本发明的原料中海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺、氨甲环酸分别对紫外线、紫外线下急性炎症反应、紫外线急性炎症反应状态下胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶活性的升高有抑制作用，能够多靶点抑制PAR-2的高表达，减少PAR-2活化角质细胞对黑色素的吞噬作用，减少色素沉着。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种抑制PAR-2活化角质细胞的组合物，所述组合物包含海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺、氨甲环酸，以PAR-2为作用靶点，通过抑制PAR-2的活性影响其对黑色素转运的介导作用，抑制角质细胞被PAR-2活化后对黑色素体的吞噬作用，阻碍黑色素在角质层的积累和沉积，起到预防紫外线照射或皮肤炎症状态下色素沉着问题。
本发明还将该组合物应用在面膜中，提供了一种抑制色素沉着的面膜产品；通过测试实验表明，本发明的抑制PAR-2活化角质细胞组合物制备的面膜对PAR-2活性具有抑制作用，对黑色素生成和色素沉着均有抑制作用，且产品安全性较好。
附图说明
图1表示本发明中实施例1-3、对比例1-5、市售样品对PAR-2活性的抑制作用比较；
图2表示实施例1-3、对比例1-5、市售产品的细胞活率比较；
图3表示实施例1-3、对比例1-5、市售产品的黑色素含量比较。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在一些具体的实施例中，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物包括以下原料：海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸，所述海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸的添加量之比为(0.5-5)：(0.05-3)：(0.01-5)：(0.01-3)。
采用所述的抑制PAR-2活化角质细胞组合物制成的面膜，所述面膜由膜布浸入包含所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物的精华液中制得，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物按精华液总重量的百分比计为：0.5-5％的海藻糖、0.05-3％的生物糖胶-1、0.01-5％的烟酰胺和0.01-3％的氨甲环酸；所述精华液按重量百分比计还包括：0.1％-10％的保湿剂、0.1％-10％的皮肤调理剂、0.01％-1％的丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.01％-1％的对羟基苯乙酮、0.01-1％的精氨酸和0.1％-15％的多元醇。
进一步的，所述保湿剂为海藻糖、普鲁兰多糖、银耳多糖、鼠李糖、棉籽糖、尿素、泛醇、小核菌胶、透明质酸钠、卵磷脂、水溶性硅油、酵母提取物、聚甘油、甘油葡糖苷、芦芭胶、β-葡聚糖及γ-聚谷氨酸钠的一种或多种。
进一步的，所述皮肤调理剂为羟苯基丙酰胺苯甲酸、燕麦蒽酰胺、神经酰胺、生育酚乙酸酯、水解胶原、积雪草提取物及尿囊素的一种或多种。
进一步的，所述多元醇为甘油、甲基丙二醇、1,2-己二醇、丁二醇、1,2-戊二醇及1,3-丙二醇的一种或多种。
制备所述面膜的方法，所述方法包括以下步骤：
S1：按原料配比称取原料质量，将所有保湿剂用甘油分散备用；
S2：将对羟基苯乙酮于80-85℃溶于多元醇中，溶解均匀，形成对羟基苯乙酮溶液备用；
S2：在主锅中加入丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物于去离子水浸泡10min至料体湿润，搅拌中加入步骤S1制备的所有用甘油分散后的保湿剂和步骤S2得到的所述对羟基苯乙酮溶液，搅拌并升温至80-85℃，至原料溶解均匀，搅拌速率10-150r/min，保温灭菌30-60mins；
S3：将所述主锅温度降至50-55℃，加入精氨酸，搅拌均匀，搅拌速率10-150r/min；然后将温度降至40-45℃后，依次加入所有的抑制PAR-2活化角质细胞组合物、皮肤调理剂，搅拌均匀，搅拌速率10-150r/min；主锅温度降至38℃后，停止搅拌，出料即为精华液；
S4：将膜布浸入步骤S3得到的所述精华液中，即得面膜。
在一些更为具体的实施例中，提供了一种抑制PAR-2活化角质细胞组合物包括以下原料组分：
海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸，海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸的添加量之比为5：3：0.01：3；或者，海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸的添加量之比为0.5：0.05：5：0.01。
实施例1
本实施例提供了一种面膜，所述面膜由膜布浸入包含抑制PAR-2活化角质细胞组合物(PAR-2抑制剂)的精华液中制得，精华液按重量百分比计包括下表1中的成分：
表1实施例1的精华液成分与配比
Figure BDA0003228638750000081
Figure BDA0003228638750000091
制备上述面膜的方法，包括以下步骤：
S1：按原料配比称取原料质量，将所有保湿剂用甘油分散备用；
S2：将对羟基苯乙酮于80-85℃溶于多元醇中，溶解均匀，形成对羟基苯乙酮溶液备用；
S2：在主锅中加入丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物于去离子水浸泡10min至料体湿润，搅拌中加入步骤S1制备的所有用甘油分散后的保湿剂和步骤S2得到的所述对羟基苯乙酮溶液，搅拌并升温至80-85℃，至原料溶解均匀，搅拌速率10-150r/min，保温灭菌30-60mins；
S3：将所述主锅温度降至50-55℃，加入精氨酸，搅拌均匀，搅拌速率10-150r/min；然后将温度降至40-45℃后，依次加入所有的抑制PAR-2活化角质细胞组合物、皮肤调理剂，搅拌均匀，搅拌速率100-150r/min；主锅温度降至38℃后，停止搅拌，出料即为精华液；
S4：将膜布浸入步骤S3得到的所述精华液中，即得面膜。
实施例2
本实施例提供了一种面膜，所述面膜由膜布浸入包含抑制PAR-2活化角质细胞组合物(PAR-2抑制剂)的精华液中制得，精华液按重量百分比计包括下表2中的成分：
表2实施例2的精华液成分与配比
Figure BDA0003228638750000092
Figure BDA0003228638750000101
实施例2制备面膜的方法同实施例1。
实施例3
本实施例提供了一种面膜，所述面膜由膜布浸入包含抑制PAR-2活化角质细胞组合物(PAR-2抑制剂)的精华液中制得，精华液按重量百分比计包括下表3中的成分：
表3实施例3的精华液成分与配比
Figure BDA0003228638750000102
Figure BDA0003228638750000111
实施例3制备面膜的方法同实施例1。
对比例1
本对比例提供了一种面膜，所述面膜由膜布浸入精华液中制得，本对比例与实施例1-3的区别在于：精华液中添加抑制PAR-2活化角质细胞组合物不含海藻糖，精华液按重量百分比计包括下表4中的成分：
表4对比例1的精华液成分与配比
Figure BDA0003228638750000112
对比例1制备面膜的方法同实施例1。
对比例2
本对比例提供了一种面膜，所述面膜由膜布浸入精华液中制得，本对比例与实施例1-3的区别在于：精华液中添加抑制PAR-2活化角质细胞组合物不含生物糖胶-1，精华液按重量百分比计包括下表5中的成分：
表5对比例2的精华液成分与配比
Figure BDA0003228638750000121
对比例2的制备方法同实施例1。
对比例3
本对比例提供了一种面膜，所述面膜由膜布浸入精华液中制得，本对比例与实施例1-3的区别在于：精华液中添加抑制PAR-2活化角质细胞组合物不含烟酰胺，精华液按重量百分比计包括下表6中的成分：
表6对比例3的精华液成分与配比
Figure BDA0003228638750000122
Figure BDA0003228638750000131
对比例3面膜的制备方法同实施例1。
对比例4
本对比例提供了一种面膜，所述面膜由膜布浸入精华液中制得，本对比例与实施例1-3的区别在于：精华液中添加抑制PAR-2活化角质细胞组合物不含氨甲环酸，精华液按重量百分比计包括下表7中的成分：
表7对比例4的精华液成分与配比
Figure BDA0003228638750000132
Figure BDA0003228638750000141
对比例4面膜的制备方法同实施例1。
对比例5
本对比例提供了一种面膜，所述面膜由膜布浸入精华液中制得，本对比例与实施例1-3的区别在于：精华液中未添加抑制PAR-2活化角质细胞组合物，精华液按重量百分比计包括下表8中的成分：
表8对比例5的精华液成分与配比
Figure BDA0003228638750000142
对比例5的制备方法同实施例1。
为了进一步证明本发明面膜对PAR-2活性的抑制作用、产品安全性、黑色素生成抑制作用、色素沉着抑制作用，对上述实施例1-3及对比例1至5与市售产品进行ELISA实验、细胞增殖测试、黑色素数量测定及紫外线诱导人体皮肤黑化模型祛斑美白功效测试。
(1)ELISA实验
试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人蛋白酶激活受体2(PAR-2)水平。用纯化的人蛋白酶激活受体2(PAR-2)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入蛋白酶激活受体2(PAR-2)，再与HRP标记的蛋白酶激活受体2(PAR-2)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的蛋白酶激活受体2(PAR-2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，OD值越小则代表测试样品颜色越浅，蛋白酶激活受体2浓度越小。
测试结果如图1所示，从图1可以看出，实施例1-3、对比例1-4相较于对比例5及市售样品，450nm处的吸光度值明显减少，吸光度值越小表明所测样品颜色越浅，根据样品颜色深浅与样品中蛋白酶激活受体2呈正相关的原理，说明实施例1-3和对比例1-4蛋白酶激活受体2的含量较少，有比较明显的抑制PAR-2活性的作用。其中实施例1-3和对比例1-4的PAR-2抑制剂质量分数总和均为5％，本发明中PAR-2抑制剂共有四种，其中对比例1-4为任意三种PAR-2抑制剂的组合物，实施例1-3则为包含上述四种抑制剂的组合物，从图中可以看出实施例1-3的PAR-2活性的抑制效果较明显优于对比例1-4，说明四种PAR-2抑制剂组合物搭配使用具有更优异的协同作用。
(2)细胞增殖测试
细胞活率一般采用MTT法测定，MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。酸化异丙醇能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
测试方法：HaCaT细胞种96孔板，加入DMEM培养液，培养24h，待细胞完全贴壁，换成待测样品配制的新鲜DMEM培养液，培养24h。弃去旧培养基，加入含MTT的培养基，培养4h，弃去配液，加入酸化异丙醇溶解1h，测定OD，计算细胞活率。细胞活率＝样品组/对照组×100％。
测试结果如图2所示，从图2可以看出，实施例1-3和对比例1-5的细胞活率均明显高于市售产品，且实施例1-3与对比例1-4相比细胞活率相近，说明实施例1-3中PAR-2抑制剂组合物协同作用后，虽然有较高的PAR-2活性抑制作用，仍能够保持较高的细胞活性，保证产品的安全性。此外，保持较高的细胞活力能够增强皮肤新陈代谢的能力，对于实现护肤产品的功效性提供了良好的基础。
(3)黑色素含量测定
黑色素含量测定原理:黑色素合成主要经历两个阶段，第一阶段是酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下生成L-二羟基苯丙氨酸多巴(L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)，并在酪氨酸酶作用下进一步生成多巴醌(Dopaquinone，DQ)，或者是酪氨酸酶催化酪氨酸直接氧化生成多巴醌。该阶段的反应是黑色素合成的关键步骤。多巴醌作为黑色素合成底物进入第二阶段反应。第二阶段又分为3个部分，当半胱氨酸或谷胱甘肽存在时，多巴醌与其反应生成半胱氨酰多巴或谷胱甘肽多巴，之后进一步氧化聚合生成褐黑素；当二者不存在时，多巴醌自身环化形成多巴色素，若多巴色素自发脱羧，形成5,6-二羟基吲哚(DHI)，在酪氨酸酶作用下进一步氧化聚合生成黑色素(DHI黑色素)；若多巴色素在TRP-2作用下发生互变异构现象转化成DHICA，则在TRP-1作用下生成黑色素(DHICA黑色素)。
通过NaOH将黑色素细胞裂解进而释放出黑色素，测定405nm处的吸光值。
测试方法:黑色素细胞种板，加入DMEM培养液，培养24h，待细胞完全贴壁，换成待测样品配制的新鲜DMEM培养液，培养24h。弃去旧培养基，加入含10％DMSO的1mol·L-1NaOH150-200μL溶解细胞，80℃孵育1h，405nm检测吸光度A，计算黑色素含量。黑色素含量＝样品组/对照组×100％。
测试结果如图3所示，从图3可以看出，实施例1-3和对比例1-4的黑色素数量明显低于对比例5，对比例5的黑色素含量略低于市售产品，其中实施例1-3的黑色素数量较明显低于对比例1-4，结合ELISA实验结果，说明四种PAR-2抑制剂组合物能够协同增效，应用于面膜产品中，通过抑制PAR-2的活性影响其介导角质细胞酵素吞噬黑色素小体。一般来讲，黑色素的合成速度和代谢速度是平衡的，若角质细胞受到PAR-2表达的影响过度吞噬黑素体，相应的黑素细胞也会加快合成黑色素的速度，黑色素含量因此会大大增加，而抑制PAR-2活化角质细胞不仅能够直接抑制角质细胞对黑素体的吞噬作用，也能间接抑制黑色素的合成速度，抑制黑色素含量的增加。
除此之外，烟酰胺和氨甲环酸不仅为PAR-2活性抑制剂，还能抑制黑色素的生成。烟酰胺对酪氨酸酶活性有抑制作用，能够抑制黑色素的生成，而氨甲环酸为人工合成的赖氨酸衍生物，能通过竞争纤溶酶原分子上的赖氨酸结合位点，抑制纤溶酶原转化为纤溶酶。一方面，能抑制纤溶酶释放纤维细胞生长因子，从而抑制黑色素细胞生长；另一方面，抑制纤溶酶释放花生四烯酸，经PEG2通路促进黑色素原的生成。
(4)紫外线诱导人体皮肤黑化模型祛斑美白功效测试
皮肤黑素指数(MI值):MI值表征黑色素指数，数值范围为0～999，测量数值越高说明皮肤中黑色素含量越高。皮肤黑色素探头的测定原理是基于光谱吸收的原理，通过测定特定波长的光照在人体皮肤上的反射量来确定皮肤中黑色素的含量。
测试方法：选择年龄在18～45岁的健康女性做为受试人群，受试者的工作均以室内为主，受试者排除条件符合《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》纳入、排除标准。在受试者的曲臂内侧设立研究模型，并对受试者的曲臂内侧进行区域划分，利用白色胶布制作带有9个圆孔(直径1.5cm，间距0.5cm，每行3孔，共3行)的模型并贴于受试者曲臂内侧。采用窄谱的中波紫外线(NB-UVB)治疗仪对其进行照射，在完成紫外线照射后要取下胶布。在曲臂内侧皮肤接受紫外线照射1周局部形成稳定的色素沉着后，将1-9号样品贴于色素沉积处15～20mins，每周2次。并分别在UVB照射1周、使用1-9号样品1周、2周、3周、4周后测定皮肤的黑色素含量(MI值)，1-11号样品分别为实施例1-3、对比例1-5、市售样品、阳性对照(7％抗坏血酸制品)、阴性对照(黑化区空白对照)。
测试结果如下表9所示：
表9实施例1-3、对比例1-5、市售样品皮肤黑色素含量(MI值)
Figure BDA0003228638750000181
从上表可以看出实施例1-3和对比例1-4应用在紫外线照射诱导色素沉着的模型皮肤上1周、2周、3周、4周后皮肤的黑素指数有明显的降低，且降低幅度明显大于对比例及市售样品。结合本发明验证实验中，实施例1-3和对比例1-4都比对比例5具有更好的抑制PAR-2活性的作用，实施例1-3对PAR-2活性抑制明显优于对比例1-4；且实施例1-3的黑色素数量较明显低于对比例1-4，说明实施例1-3中四种抑制剂组合使用有协同增效的作用，通过抑制PAR-2的活性来抑制角质细胞吞噬黑色素，减轻了黑色素在角质细胞累积后的显色，从而抑制了色素沉着，相较于市场上通过剥脱角质改善皮肤色度不均的问题，本发明面膜更温和实用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种抑制PAR-2活化角质细胞组合物，其特征在于，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物包括以下原料：海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸，所述海藻糖、生物糖胶-1、烟酰胺和氨甲环酸的添加量之比为(0.5-5)：(0.05-3)：(0.01-5)：(0.01-3)。
2.一种采用权利要求1所述的抑制PAR-2活化角质细胞组合物制成的面膜，其特征在于，所述面膜由膜布浸入包含所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物的精华液中制得，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物按精华液总重量的百分比计为：0.5-5％的海藻糖、0.05-3％的生物糖胶-1、0.01-5％的烟酰胺和0.01-3％的氨甲环酸。
3.根据权利要求2所述的面膜，其特征在于，所述抑制PAR-2活化角质细胞组合物按精华液总重量的百分比计为：0.5-2％的海藻糖、0.1-1％的生物糖胶-1、1-3％的烟酰胺和0.5-3％的氨甲环酸。
4.根据权利要求2或3所述的面膜，其特征在于，所述精华液按重量百分比计还包括：0.1％-10％的保湿剂、0.1％-10％的皮肤调理剂、0.01％-1％的丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、0.01％-1％的对羟基苯乙酮、0.01-1％的精氨酸和0.1％-15％的多元醇。
5.根据权利要求4所述的面膜，其特征在于，所述保湿剂为海藻糖、普鲁兰多糖、银耳多糖、鼠李糖、棉籽糖、尿素、泛醇、小核菌胶、透明质酸钠、卵磷脂、水溶性硅油、酵母提取物、聚甘油、甘油葡糖苷、芦芭胶、β-葡聚糖及γ-聚谷氨酸钠的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的面膜，其特征在于，所述皮肤调理剂为羟苯基丙酰胺苯甲酸、燕麦蒽酰胺、神经酰胺、生育酚乙酸酯、水解胶原、积雪草提取物及尿囊素的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的面膜，其特征在于，所述多元醇为甘油、甲基丙二醇、1,2-己二醇、丁二醇、1,2-戊二醇及1,3-丙二醇的一种或多种。
8.制备权利要求4-7任一项所述面膜的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：按原料配比称取原料质量，将所有保湿剂用甘油分散备用；
S2：将对羟基苯乙酮于80-85℃溶于多元醇中，溶解均匀，形成对羟基苯乙酮溶液备用；
S2：在主锅中加入丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物于去离子水浸泡10min至料体湿润，搅拌中加入步骤S1制备的所有用甘油分散后的保湿剂和步骤S2得到的所述对羟基苯乙酮溶液，搅拌并升温至80-85℃，至原料溶解均匀，搅拌速率10-150r/min，保温灭菌30-60mins；
S3：将所述主锅温度降至50-55℃，加入精氨酸，搅拌均匀，搅拌速率10-150r/min；然后将温度降至40-45℃后，依次加入所有的抑制PAR-2活化角质细胞组合物、皮肤调理剂，搅拌均匀，搅拌速率10-150r/min；主锅温度降至38℃后，停止搅拌，出料即为精华液；
S4：将膜布浸入步骤S3得到的所述精华液中，即得面膜。
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