CN113607693A - 分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法与凝血酶检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法，所述该凝胶光栅由基底和基底上的相互平行的凝胶条组成，凝胶条之间的间隙为凝胶光栅的狭缝，所述凝胶条由凝血酶响应型分子印迹凝胶构成；所述凝血酶响应型分子印迹凝胶是由含凝血酶印迹复合物的凝胶在洗脱掉凝胶网络中的凝血酶后形成的。本发明还提供了基于分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法。本发明可提高凝血酶检测的灵敏度和便捷性，所述凝血酶检测方法的检出限低至10‑12mol/L，能实现对10‑12～10‑7mol/L浓度级别的凝血酶的检测，特别适用于超灵敏定量检测尿液中凝血酶。

Description

分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法与凝血酶检测方法
技术领域
本发明属于生物标志物检测领域，涉及分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法，以及基于所述分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法。
背景技术
凝血酶是一种多功能的丝氨酸蛋白酶，它作为凝血瀑布中主要的效应蛋白质，可以促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，实现速效止血。同时，凝血酶还作为激素调节血小板聚集、内皮细胞激活和生物血管中的其他重要响应。更重要的是，最近的报道指出，凝血酶还可作为尿液中的生物标志物，用于检测肾小球肾炎、肝炎、狼疮、糖尿病以及癌症等疾病信号。因此，实现凝血酶的灵敏检测具有非常重要的意义。
对于凝血酶的检测，虽然凝血分析仪等仪器具有较高的精度，但该方法需要依赖大型昂贵的分析设备和专业人员的操作，无法满足便捷的检测需求，因而目前研究较多的主要是生物传感器检测法。王晓工课题组通过将凝血酶特异性适配体及其互补序列共聚到凝胶网络内部，制备了适配体功能化的凝胶衍射光栅。当凝胶光栅与凝血酶特异性适配体相互作用时，会使适配体与互补序列之间的相互作用被破坏，导致光栅的几何参数和折射率改变，从而实现对凝血酶的检测。但在他们的实验中，仅使用了一种能识别凝血酶的适配体，且直接将适配体共聚到凝胶网络中，导致凝血酶与适配体的结合位点不足，因而对凝血酶的检测限仅到0.1μM。正常情况下，在凝血过程中，人血液中凝血酶的浓度会在nM与较低的μM之间变化。为了实现凝血酶的检测，目前用于凝血酶检测的生物传感器检测方法需要进行荧光标记或采用额外的信号增强方式，存在着检测操作过程繁琐、检测设备昂贵以及检测限高等问题，无法达到实际需求。因此，开发出可用于凝血酶灵敏便捷检测的方法是十分必要的。
近年来，随着分子印迹技术的迅速发展，分子印迹材料已被应用于生物传感器的构建之中。分子印迹技术也叫分子模板技术，当模板分子与聚合物单体接触时会有多重作用点，在单体聚合过程这种结合作用会被记忆下来，当模板分子去除后，聚合物中会形成与模板分子空间结构相匹配、具有空间位点的空穴。由于分子印迹技术形成的分子印迹聚合物具有良好的空间三维形态，因此模板分子的去除不会影响作用位点的再结合能力。分子印迹技术由于其特有的构效预定性、特异识别性和实用性等特点，在蛋白质、DNA、细胞以及病毒等生物大分子的检测识别中已有应用。Spivak课题组利用凝血酶作为模板，使用分子印迹技术制备了适配体功能化的水凝胶，利用适配体对凝血酶的特异性识别能力，直接测量水凝胶的体积变化实现对凝血酶的检测，但是该方法依靠手工测量凝胶体积变化，产生的误差很大，检测的准确度有待提高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法，以及基于所述分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法，以提高凝血酶检测的灵敏度和便捷性。
本发明的主要技术构思：将分子印迹技术与智能凝胶光栅传感技术相结合，以凝血酶作为印迹模板、以两种可与凝血酶不同位点结合的凝血酶特异性核酸适配体A1和凝血酶特异性核酸适配体A2，以及N-异丙基丙烯酰胺作为共聚单体，与交联剂一起聚合得到凝胶网络，之后再去除凝胶网络中的印迹模板，得到可特异性识别凝血酶的分子印迹智能凝胶，将该分子印迹智能凝胶与智能凝胶光栅传感技术结合，制备成可特异性识别凝血酶而引起衍射光强度变化的分子印迹智能凝胶光栅，以实现对凝血酶的灵敏传感检测。
为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供的分子印迹智能凝胶光栅，该凝胶光栅由基底和基底上的相互平行的凝胶条组成，凝胶条之间的间隙为凝胶光栅的狭缝，所述凝胶条由凝血酶响应型分子印迹凝胶构成；
所述凝血酶响应型分子印迹凝胶是由含凝血酶印迹复合物的凝胶在洗脱掉凝胶网络中的凝血酶后形成的；所述凝血酶印迹复合物是由凝血酶特异性核酸适配体A1、凝血酶特异性核酸适配体A2与凝血酶的不同位点结合形成的，凝血酶特异性核酸适配体A1的核苷酸序列为5'-/5Acryd/GGT TGG TGT GGT TGG-3'，凝血酶特异性核酸适配体A2的核苷酸序列为5'-/5Acryd/AGA CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'；
所述含凝血酶印迹复合物的凝胶是由N-异丙基丙烯酰胺、凝血酶印迹复合物与交联剂交联反应形成的，在交联反应过程中，N-异丙基丙烯酰胺的碳碳双键、凝血酶印迹复合物中的凝血酶特异性核酸适配体A1的5'端以及凝血酶特异性核酸适配体A2的5'端上的碳碳双键与交联剂上的碳碳双键发生加成反应形成凝胶网络；交联反应过程中，控制N-异丙基丙烯酰胺与交联剂的摩尔比为1:(0.01～0.05)，凝血酶印迹复合物与交联剂的摩尔比为1:(1000～5000)。
上述分子印迹智能凝胶光栅的技术方案中，所述交联剂为四臂-聚乙二醇丙烯酰胺、八臂-聚乙二醇丙烯酰胺或二臂-聚乙二醇丙烯酰胺。
上述分子印迹智能凝胶光栅的技术方案中，该凝胶光栅的周期与光栅高度之比为1:(0.01～0.1)，该凝胶光栅在干态或湿态下的周期与光栅高度之比通常都在该比例范围内。通常，该凝胶光栅的周期为1700～1800nm，光栅高度为30～200nm。
上述分子印迹智能凝胶光栅的技术方案中，所述基底为硅烷化处理的石英玻璃片，凝胶条通过共价键与基底结合，具体地，石英玻璃片经过硅烷化处理后，硅烷偶联剂通过与石英玻璃片表面的羟基反应生成Si-O键从而结合在石英玻璃片表面，同时，硅烷偶联剂中具有可聚合的双键，会参与到N-异丙基丙烯酰胺、凝血酶印迹复合物与交联剂交联反应的过程中，使得聚合后形成的水凝胶被稳定地固定在石英玻璃片表面。凝胶条通过共价键与基底结合可确保凝胶光栅周期的稳定，进而保证衍射效率测试过程中衍射光斑位置的固定，凝胶光栅在识别凝血酶后将凝胶条的体积变化转变为光栅高度的变化，进而引起衍射光强度的改变，从而将凝胶条的体积变化稳定地转变为衍射光强度的变化。
本发明还提供了上述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)配制凝胶预聚液
将凝血酶特异性核酸适配体A2加入凝血酶溶液中，搅拌20～40min，然后加入凝血酶特异性核酸适配体A1，搅拌20～40min，得到含凝血酶印迹复合物的溶液；凝血酶特异性核酸适配体A1以及凝血酶特异性核酸适配体A2与凝血酶的摩尔比均为1:(0.02～1)；
向含凝血酶印迹复合物的溶液中加入N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、引发剂以及加速剂，在冰浴条件下充分震荡溶解，得到凝胶预聚液；凝胶预聚液中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度0.5～2.5mol/L，N-异丙基丙烯酰胺与交联剂的摩尔比为1:(0.01～0.05)，N-异丙基丙烯酰胺与引发剂的摩尔比为1:(0.005～0.05)，N-异丙基丙烯酰胺与加速剂的摩尔比为1:(0.02～0.2)，凝血酶印迹复合物与交联剂的摩尔比为1:(1000～5000)；
(2)制备含凝血酶的凝胶光栅
将凝胶预聚液滴加到基底上，将凝胶光栅模板压在凝胶预聚液上，在4～10℃的条件下反应4～12h，剥离凝胶光栅模板，得到含凝血酶的凝胶光栅；
(3)洗涤去除凝胶网络中的凝血酶
将含凝血酶的凝胶光栅置于PBS缓冲液中浸泡洗涤，以去除未完全聚合的反应物，然后取出置于盐酸胍与氯化钠的混合溶液中充分浸泡以去除含凝血酶的凝胶光栅的凝胶网络结构中的凝血酶，在盐酸胍与氯化钠的混合溶液中浸泡的过程中，每隔6～12h更换一次盐酸胍与氯化钠的混合溶液，浸泡完成后，取出置于PBS缓冲液中充分浸泡洗涤，即得分子印迹智能凝胶光栅。
上述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法的步骤(3)中，所述盐酸胍与氯化钠的混合溶液中，盐酸胍的浓度为3～6mol/L、氯化钠的浓度为1～2mol/L。
上述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法的步骤(3)中，所述PBS缓冲液的pH值为7.4、浓度为1～3mmol/L。
上述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法的步骤(3)中，每隔6～12h更换一次盐酸胍与氯化钠的混合溶液，通常在更换4～6次盐酸胍与氯化钠的混合溶液后，即可实现对含凝血酶的凝胶光栅的凝胶网络结构中的凝血酶的完全去除。
上述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法的步骤(2)中，所述基底为硅烷化处理的石英玻璃片。进一步地，石英玻璃片的硅烷化处理方法如下：
将洗净的石英玻璃片浸没于含硅烷偶联剂的醋酸-醋酸钠缓冲液中保持10～30min，然后在50～60℃的烘箱中保持10～20min，用去离子水洗涤，干燥，即完成石英玻璃片的硅烷化处理；所述含硅烷偶联剂的醋酸-醋酸钠缓冲液中，硅烷偶联剂的体积百分浓度0.5％～2％，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.5～5.5、浓度为0.05～0.2mol/L。所述硅烷偶联剂为3-(丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷或乙烯基三氯硅烷。
以上述分子印迹智能凝胶光栅为基础，本发明还提供了一种基于分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法，该方法使用包括上述分子印迹智能凝胶光栅的光学检测装置进行检测，步骤如下：
(1)确定凝血酶浓度的换算关系式
①将空白试样加入光学检测装置的石英样品池中浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，计算空白试样的衍射效率；
②按照标样中凝血酶浓度由低到高的顺序依次用凝血酶浓度已知的标样替换步骤①的空白试样，分别测定各标样对应的衍射效率，得到一系列标样对应的衍射效率；
③计算各标样对应的衍射效率相对于空白试样的衍射效率的变化率，记作相对衍射效率，得到一系列相对衍射效率，以相对衍射效率为横坐标、以凝血酶浓度为纵坐标绘制工作曲线，确定凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系式；
(2)测量待测试样中的凝血酶浓度
①采用与步骤(1)相同的凝胶光栅替换原凝胶光栅，向光学检测装置的石英样品池中加入空白试样浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，计算空白试样的衍射效率；
②采用凝血酶浓度未知的待测试样替换步骤(2)①中的空白试样，测定待测试样的衍射效率；
③计算待测试样的衍射效率相对于步骤(2)①中空白试样的衍射效率的相对衍射效率，根据凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系，计算待测试样中凝血酶的浓度；
控制步骤(1)与步骤(2)的测试温度相同并且在20～35℃范围内的恒定温度。
本发明通过实验证实，本发明提供的凝血酶检测方法的检出限低至10-12mol/L，能实现对10-12～10-7mol/L浓度级别的凝血酶的检测，特别适用于超灵敏定量检测尿液中凝血酶。
上述凝血酶检测方法中，所采用的光学检测装置包括激光光源、装有上述分子印迹智能凝胶光栅的石英样品池，用于探测零级衍射光强度的第一硅光电探测器和用于探测一级衍射光强度的第二硅光电探测器，数据采集系统和计算机处理系统；分子印迹智能凝胶光栅的基底固定在石英样品池的内壁上，分子印迹智能凝胶光栅的狭缝垂直于水平面，石英样品池最好是置于控温热台上的加热平台上以调控测试温度，石英样品池位于激光器与第一、第二硅光电探测器之间，激光器发出的激光束垂直照射分子印迹智能凝胶光栅并产生衍射透出石英样品池，第一硅光电探测器与第二硅光电探测器分别对准零级衍射和一级衍射的光斑，硅光电探测器与数据采集系统连接，数据采集系统与计算机处理系统连接。激光器、第一及第二硅光电探测器、数据采集系统和计算机处理系统最好是安装在阻尼隔振光学平台上，以减少外界环境的振动对测试结果的干扰。
上述凝血酶检测方法中，所采用的光学检测装置的激光器发出的激光束的波长为510～635nm，第一和第二硅光电探测器的探测波长和功率应与激光器发出的波长和功率相匹配。
上述凝血酶检测方法中，所述衍射效率是指一级衍射光强度I1与零级衍射光强度I0之比，所述相对衍射效率是指标样或待测试样的衍射效率相对于空白试样的衍射效率的变化率，计算公式如式(1)所示：
Figure BDA0003201323560000051
式(1)中，RDE为相对衍射效率，DET,0为空白试样在温度为T时的衍射效率，DET为标样或待测试样在温度为T时的衍射效率。
本发明实现对待测试样中凝血酶的检测的原理如下：
本发明提供的分子印迹智能凝胶光栅，由基底和基底上的相互平行的凝胶条组成，所述凝胶条由凝血酶响应型分子印迹凝胶构成，该凝血酶响应型分子印迹凝胶由含凝血酶印迹复合物的凝胶在洗脱掉凝胶网络中的印迹模板凝血酶后形成。当本发明提供的分子印迹智能凝胶光栅处于含凝血酶的待测溶液中时，待测溶液中的凝血酶与凝胶光栅的凝胶网络中的凝血酶特异性核酸适配体A1和A2结合，它们的结合会导致凝胶网络内部的非共价交联点增加，凝胶网络内部的交联密度上升，进而造成凝胶条的体积收缩，导致透过凝胶光栅的衍射光强度发生变化。利用光电探头检测该衍射光信号，则可实现对凝血酶的灵敏便捷检测。由于凝胶条的凝胶网络中形成了与凝血酶分子空间结构相匹配的、具有空间位点的稳定空穴，因此凝血酶与凝胶网络中的凝血酶特异性核酸适配体A1和A2的再结合能力被大大提升，这可使凝胶光栅对凝血酶的检测灵敏度大幅增强，实现对凝血酶的高灵敏传感检测。
与现有技术相比，本发明的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明将分子印迹技术与智能凝胶光栅传感技术相结合，以凝血酶作为印迹模板、以及两种可以分别与凝血酶不同位点结合的凝血酶特异性核酸适配体作为共聚单体，制备了一种适配体功能化的凝血酶印迹型智能凝胶光栅传感器。该凝胶光栅可特异性识别凝血酶，当本发明提供的分子印迹智能凝胶光栅处于含凝血酶的待测溶液中时，待测溶液中的凝血酶与凝胶光栅的凝胶网络中的凝血酶特异性核酸适配体A1和A2结合，它们的结合会导致凝胶网络内部的非共价交联点增加，凝胶网络内部的交联密度上升，进而造成凝胶条的体积收缩，导致透过凝胶光栅的衍射光强度发生变化。通过检测该衍射光信号，即可实现对凝血酶的灵敏便捷检测。
2.由于凝胶光栅上的凝胶条的凝胶网络中形成了与凝血酶分子空间结构相匹配的、具有空间位点的稳定空穴，因此凝血酶与凝胶网络中的凝血酶特异性核酸适配体的再结合能力被大大提升，这可使凝胶光栅对凝血酶的检测灵敏度大幅增强，从而实现了对凝血酶的高灵敏传感检测。进一步地，该凝胶光栅上的凝胶条通过共价键固定在基底上，因此在凝胶体积收缩的过程中，凝胶光栅的周期可基本保持固定，只有凝胶光栅的起伏高度会发生明显变化，进而引起衍射光强度的变化，而布拉格衍射角不变，这也有利于提高对凝血酶的检测灵敏度。
3.由于本发明在制备凝胶光栅的过程中采用了大分子交联剂的使用，交联后的PNIPAM高分子网络结构可在其体积变化过程中保持良好的透明度，这保证了在测试过程中得到高强度的衍射光信号。同时，大分子交联剂的链长使得在分子识别过程中凝胶具有更优异的溶胀性能。以上因素也有利于提高对凝血酶的检测灵敏度。
4.本发明还提供了基于所述分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法，实验表明，该方法对凝血酶的检出限低至10-12mol/L，能实现对10-12～10-7mol/L浓度级别的凝血酶的检测，可用于超灵敏检测尿液中生物标志物凝血酶的浓度。相对于现有技术，本发明的检测方法的检测灵敏度更高，并且无需依赖于额外的信号增强方式，为生物标志物的体外凝胶光栅传感检测提供了新途径。
附图说明
图1是分子印迹智能凝胶光栅的制备过程示意图和凝血酶响应原理示意图，图1中，h2和h1分别表示凝胶光栅识别凝血酶前后的凝胶光栅的高度。
图2是石英玻璃片的硅烷化处理过程示意图。
图3是实施例1制备的凝胶光栅的化学组分分析结果，其中a)图是DNA标准曲线，b)图是凝胶预聚液和洗脱液的紫外吸光度曲线。
图4是实施例1制备的凝胶光栅光学照片(a图)和SEM照片(b图)。
图5是实施例1制备的凝胶光栅的AFM照片，其中的a、c两图分别为干态下的凝胶光栅的二维、三维形貌图片，b、d两图是凝胶光栅在缓冲液中达到溶胀平衡后的湿态二维、三维形貌图片。
图6是实施例1制备的凝胶光栅衍射效率随温度变化曲线。
图7是实施例1制备的凝胶光栅在不同温度下的透光度。
图8是实施例1制备的凝胶光栅在不同蛋白质缓冲液中的RDE。
图9是实施例1制备的凝胶光栅在不同浓度凝血酶溶液中的AFM图片。
图10是实施例1制备的凝胶光栅的结构参数随凝血酶浓度变化情况，其中a)b)两图分别是光栅高度和光栅周期随凝血酶浓度的变化曲线。
图11是以本发明提供的凝胶光栅为基础搭建的光学检测装置的结构示意图，图中，1—激光光源、2—凝胶光栅、3—石英样品池，4-1—第一硅光电探测器、4-2—第二硅光电探测器、5—数据采集系统、6—计算机处理系统6。
图12是不同温度下凝胶光栅的衍射效率随凝血酶浓度的变化趋势。
图13是凝血酶浓度与RDE之间的线性定量关系。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明所述分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法与凝血酶检测方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明保护的范围。
下述各实施例中，将凝血酶特异性核酸适配体A1(简称A1)和凝血酶特异性核酸适配体A2(简称A2)的核苷酸序列分别为5'-/5Acryd/GGT TGG TGT GGT TGG-3'(见SEQ IDNO.1)，5'-/5Acryd/AGA CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'(见SEQ ID NO.2)，核苷酸序列中的Acryd代表可聚合的甲基丙烯酰胺基，是通过修饰改性将该基团连接到5'末端的碱基上的。A1和A2为已有的核苷酸序列，可委托专业公司合成。
下述实施例中，以本发明提供的凝胶光栅为基础，搭建如图11所示的光学检测装置，该光学检测装置包括激光光源1、装有本发明所述凝胶光栅2的石英样品池3，用于探测零级衍射光强度的第一硅光电探测器4-1和用于探测一级衍射光强度的第二硅光电探测器4-2，数据采集系统5和计算机处理系统6。
凝胶光栅的基底固定在石英样品池的内壁上，凝胶光栅的狭缝垂直于水平面，石英样品池置于控温热台上的加热平台上以调控测试温度，石英样品池位于激光器与第一、第二硅光电探测器之间，激光器发出的激光束垂直照射凝胶光栅并产生衍射透出石英样品池，第一硅光电探测器与第二硅光电探测器分别对准零级衍射和一级衍射的光斑，硅光电探测器与数据采集系统连接，数据采集系统与计算机处理系统连接。激光器、第一及第二硅光电探测器、数据采集系统和计算机处理系统安装在阻尼隔振光学平台上，以减少外界环境的振动对测试结果的干扰。所述第一、第二硅光探测器为光电探头(DSi200,Zolix)。
在使用上述光学检测装置开始检测开始前，应调节位于样品池后方的第一、第二硅光探测器的高度和位置，使激光束垂直照射凝胶光栅后产生的零级衍射和一级衍射光的光斑恰好对准第一、第二硅光探测器接受屏的中心位置。测试时采用的激光器为He-Ne激光器，激光是波长为635nm。
实施例1
本实施例中，制备分子印迹智能凝胶光栅，其制备过程和凝血酶响应原理示意图如图1所示，步骤如下：
(1)基底的硅烷化处理
将石英玻璃片置于浓硫酸溶液中超声15min以去除石英玻璃片表面的无机物杂质，然后置于去离子水中超声15min并用去离子水清洗干净。将清洗后的玻璃片置于丙酮中超声15min以去除玻璃片表面的有机物杂质，然后置于去离子水中超声15min并用去离子水清洗干净，将清洗干净后的石英玻璃片置于去离子水中备用。这一步的目的是将碳氢化合物污染保持在最低限度，同时确保石英玻璃片在浸入含硅烷偶联剂的溶液中时，石英玻璃片可保持完全可湿润状态。
如图2所示，采用浸涂的方式对石英玻璃片进行硅烷化处理：配制pH＝5、浓度为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，然后按照硅烷偶联剂与醋酸-醋酸钠缓冲液的体积比为1:99的比例将硅烷偶联剂3-(丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(3-MAPTMS)加入到醋酸-醋酸钠缓冲液中，搅拌30min以充分进行水解反应，然后加入洗涤后的石英玻璃片，浸没10min，将石英玻璃片取出置于60℃的恒温烘箱中保持10min，用去离子水冲洗去除石英玻璃片表面物理粘附的硅烷偶联剂分子。将硅烷化处理的石英玻璃片在负压下干燥，置于干燥柜中备用。
(2)配制凝胶预聚液
将A2加入凝血酶(thrombin)溶液中，搅拌30min，然后加入A1，搅拌30min，得到含凝血酶印迹复合物A1-thrombin-A2的溶液。A2与凝血酶的摩尔比为1:1，A1与凝血酶的摩尔比为1:0.94。
向含凝血酶印迹复合物的溶液中加入N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、交联剂四臂-聚乙二醇丙烯酰胺(tetra-arm PEGAAm)，在冰浴条件下充分震荡溶解，然后加入浓度为10wt.％的过硫酸铵溶液，再加入加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)，在冰浴条件下充分震荡溶解，得到凝胶预聚液，将凝胶预聚液置于冰浴中备用。
凝胶预聚液中，NIPAM的浓度1.5mol/L，NIPAM与tetra-arm PEGAAm的摩尔比为1:0.03，NIPAM与引发剂的摩尔比为1:0.02，NIPAM与加速剂的摩尔比为1:0.04，凝血酶印迹复合物与tetra-arm PEGAAm的摩尔比为1:3800。
(3)微接触印刷法制备含凝血酶的凝胶光栅
采用微接触印刷法，用微量移液枪取8μL凝胶预聚液，迅速滴到硅烷化处理的石英玻璃片表面，迅速将凝胶光栅模板轻轻压印在凝胶预聚液上并保证光栅模板与硅烷化处理的石英玻璃片之间保持紧密结合，转移至5℃的环境中，经自由基引发交联反应，交联6h后剥离凝胶光栅模板，得到含凝血酶的凝胶光栅。所述凝胶光栅模板的尺寸为18mm×12mm，材质为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，其上具有光栅图案，凝胶光栅模板的周期为1728nm，光栅高度为39nm。
经过该步骤的反应后，凝胶预聚液转变成了凝胶状态，说明凝胶预聚液中的各组分实现了成功聚合。
(4)洗涤去除凝胶网络中的凝血酶
将含凝血酶的凝胶光栅置于pH＝7.4、浓度为2mmol/L的PBS缓冲液中，浸泡洗涤以去除未完全聚合的反应物，然后取出置于盐酸胍与氯化钠的混合溶液中浸泡使凝血酶变性以去除含凝血酶的凝胶光栅的凝胶网络结构中的凝血酶，在盐酸胍与氯化钠的混合溶液中浸泡的过程中，每隔6h更换一次盐酸胍与氯化钠的混合溶液，更换5次洗涤液之后，取出置于pH＝7.4、浓度为2mmol/L的PBS缓冲液中充分浸泡洗涤，平衡之后即得分子印迹智能凝胶光栅。所述盐酸胍与氯化钠的混合溶液中，盐酸胍的浓度为4.3mol/L、氯化钠的浓度为1.4mol/L。
实施例2
本实施例中，测试分子印迹智能凝胶光栅的化学组分，步骤如下：
(1)使用紫外-可见光分光光度计测定DNA(A1和A2)标准溶液的吸光度值，根据标准溶液中DNA的含量及其在紫外光波长为257nm处吸光度值，绘制得到的DNA浓度-吸光度标准曲线，如图3的a)图所示，其中横坐标DNA浓度代表的是DNA测试含量与理论加入量的比值。该标准曲线的线性回归方程为y＝0.0021x-0.0005，相关系数R2为0.9984，表明DNA含量与理论加入值的比例在0～14％范围内都遵循比尔定律，即吸光物质DNA的浓度与其吸光度成正比。
因此，通过测定实施例1的步骤(4)洗涤含凝血酶的凝胶光栅的洗脱液的吸光度值，利用该标准曲线即可计算出洗脱液中DNA含量与理论加入量的比值，进而计算得到被聚合到智能凝胶网络中的DNA比例。
(2)对实施例1的步骤(4)洗涤含凝血酶的凝胶光栅的洗脱液进行多次透析，以除去会干扰紫外吸光值的凝血酶和其他小分子杂质后，测定所得透析液的吸光度曲线，如图3的b)图中的凝胶洗脱液所示，从图中可以看到在波长为257nm处的吸光度为0.01。根据步骤(1)中的标准曲线计算得到该透析液中DNA浓度为5％，而透析液的总体积为5mL，进行吸光度测试时量取了3mL透析液，所以透析液中总的DNA含量为8.3％。说明透析液中的DNA含量仅占凝胶预聚液中DNA理论加入值的8.3％，即其余的约91.7％的DNA被成功的聚合到了凝胶网络内部。
实施例3
本实施例中，表征实施例1制备的分子印迹智能凝胶光栅的形貌特征。
1.实施例1制备的凝胶光栅的光学照片如图4的a图所示，在剥离光栅模板后，得到了具有与凝胶光栅模板尺寸相同凝胶光栅，该凝胶光栅的尺寸为18mm×12mm。从光学图片还可以看到，在自然光照下，该凝胶光栅表面发生了非常明显的衍射现象，即在凝胶光栅表面可观察到不同颜色的条纹。
实施例1的凝胶光栅的扫描电镜(SEM)照片如图4的b图所示，由图可知，凝胶光栅具有大面积规整的微观结构，这种大面积的微观规整结构保证了测试结果的稳定性和可重复性。同时该凝胶光栅具有与凝胶光栅模板互补的微结构。
2.使用原子力显微镜(AFM)观察实施例1的步骤(4)制备的凝胶光栅在干态和湿态下的微观形貌，如图5所示，其中的a、c两图分别为干态下的凝胶光栅的二维、三维形貌图片，b、d两图是凝胶光栅在缓冲液中达到溶胀平衡后的湿态二维、三维形貌图片。对AFM图进行截面分析可知：干态下的凝胶光栅的周期为1728nm，光栅高度为39nm；湿态下的凝胶光栅的周期为1740nm，光栅高度为154nm。
对比凝胶光栅在干态和湿态下的微观形貌可知，凝胶光栅在溶胀前后都具有非常规整的光栅结构。从具体的结构参数可知，凝胶光栅在从干态吸水发生体积溶胀后，凝胶光栅的高度增长了约4倍，但周期基本保持不变。
对比凝胶光栅从干态到吸水溶胀后发生的体积变化可知，凝胶光栅的体积变化主要表现为凝胶光栅高度的大幅增长，整个过程中周期保持稳定。这主要是因为在制备凝胶光栅前对石英玻璃片进行了硅烷化处理，硅烷偶联剂通过与石英玻璃表面的羟基反应生成Si-O键而结合在玻璃片表面，另一方面，由于所述硅烷偶联剂本身带有可聚合的双键，因而硅烷偶联剂会参与到凝胶预聚液的自由基聚合反应中，使得聚合后形成的水凝胶被稳定地固定在石英玻璃片表面。
凝胶光栅的周期的稳定保证了衍射效率测试过程中衍射光斑位置的固定，光栅高度的变化则会引起衍射光强度的较大改变，从而实现将凝胶光栅的体积变化稳定的转化为衍射光强度的变化。
实施例4
本实施例中，以实施例1制备的凝胶光栅为基础，搭建如图11所示的光学检测装置，并利用该光学检测装置考察凝胶光栅的温度响应性能。
将5mL的PBS缓冲液(pH＝7.4、浓度为2mmol/L)加入石英样品池中，通过控温热台调节石英样品池中溶液的温度，并将一个可测温的热敏电阻插入石英样品池内的溶液中，以实时监测溶液温度。分别测试凝胶光栅在20℃到50℃之间每隔5℃的温度点下的，一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，测试时当在石英样品池中溶液达到设定温度后，均需平衡30min再进行测试并记录数据。
凝胶光栅的衍射效率随温度变化曲线如图6所示，由图可知，凝胶光栅的衍射效率随温度的升高而增大，且在35℃时发生了比较明显的增加。这是因为在温度较低时，PNIPAM的酰胺基团会与水分子作用形成氢键，使得溶剂中的水分子在PNIPAM高分子链周围形成一个由氢键连接构成的高度有序化溶剂壳层，此时的水凝胶呈现高度溶胀的亲水状态。而随着温度的升高，酰胺基团与水分子间的氢键作用被破坏，PNIPAM高分子本身的疏水基团之间的相互作用增强并形成疏水层，使凝胶网络内部的水分子排出，引起高分子收缩并发生体积减小。由于凝胶光栅被硅烷偶联剂固定在石英玻璃片表面，所以凝胶光栅的体积变化仅体现为光栅高度的变化和随之发生凝胶光栅折光率的变化。在衍射过程中，这两种改变同时发生，最终体现为凝胶光栅的衍射效率随温度的升高而增大。
实施例5
本实施例中，测试实施例1制备的分子印迹智能凝胶光栅的透光率随温度的变化情况。
凝胶光栅的检测原理是基于衍射光强度的变化，而凝胶光栅上的凝胶材料本身的透光率对透过凝胶材料后的光强度有很大的影响。由于本发明采用了对温度敏感的PNIPAM高分子材料，因此确定凝胶光栅在不同温度下的透光率，对于衍射光强度的测定是非常必要的。在波长为635nm处测定凝胶光栅在20℃到50℃之间每隔5℃的温度点下的透光率，结果如图7所示。
由图7可知，凝胶光栅在以上各个温度点的透光率均大于99％，说明在测试温度范围内凝胶光栅具有优异的透光性能，即凝胶光栅对波长为635nm的光几乎没有吸收。这主要是因为在制备凝胶光栅时使用了大分子交联剂tetra-arm PEGAAm。一方面，由于该大分子交联剂本身具有非常均匀的结构，所以由它交联而成的水凝胶分子网络内部结构也非常均匀。另一方面，亲水的聚乙二醇链直接作为水凝胶网络的主链，可在一定程度上阻止PNIPAM长链的疏水聚集，使水凝胶内部结构始终保持均相。因此，即使水凝胶在升温过程中体积发生变化，其透光率的差距也非常小，对衍射光强度的影响基本可以忽略，在不同温度下均可保持非常高的透光度。
实施例6
本实施例中，以实施例1制备的凝胶光栅为基础，搭建如图11所示的光学检测装置，并利用该光学检测装置考察凝胶光栅对凝血酶的特异性识别能力。
为了研究凝胶光栅对凝血酶是否具有特异性识别能力，选用人类免疫球蛋白(IgG)、牛血清蛋白(BSA)和溶菌酶(Lysozyme)作为控制组，以凝血酶(Thrombin)作为实验组，分别测试凝胶光栅对它们的识别性能。检测前使用pH＝7.4、浓度为2mmol/L的PBS溶解控制组及实验组中各蛋白质，各组蛋白质的浓度均为10-7mol/L。
分别将5mL各控制组的蛋白质溶液加入石英样品池中，通过控温热台调节石英样品池中溶液的温度保持在30℃。测试凝胶光栅的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，测试时当在石英样品池中溶液达到设定温度后，均需平衡30min再进行测试并记录数据，计算相对衍射效率(RDE)。
结果如图8所示，由图可知，在IgG、BSA和Lysozyme的溶液中，凝胶光栅的RDE均小于0.01，而当向样品液中加入相同浓度的凝血酶后，凝胶光栅的RDE则高达0.11，说明凝胶光栅对凝血酶具有高选择性。
实施例7
本实施例中，测试实施例1制备的凝胶光栅对凝血酶的检测能力。
1.测试凝胶光栅在不同浓度凝血酶缓冲液中的结构参数
将凝胶光栅置于凝血酶浓度分别为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.4、浓度为2mmol/L)中充分浸泡，之后测试AFM图片，结果如图9所示。
图9的a～f图分别为凝胶光栅在10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L的PBS缓冲液中充分浸泡后的AFM图片。由图9可知，在不同浓度的凝血酶溶液中，凝胶光栅均具有非常规整的光栅形貌。对AFM图片的截面进行分析可知，凝胶光栅在不同浓度的凝血酶缓冲液中的光栅高度不同，图9的a～f图中的光栅高度分别为：145、136、128、116、108、99nm，光栅周期分别为：1742、1758、1760、1739、1739、1756nm。
凝胶光栅的结构参数随凝血酶浓度的变化曲线如图10所示，其中的a)b)两图分别为光栅高度和光栅周期随凝血酶浓度的变化曲线。由图可知，凝胶光栅的高度随凝血酶浓度的增加而明显减小，但在不同凝血酶浓度下的光栅周期基本保持固定。
这是因为当溶液中的凝血酶与凝胶光栅接触时，凝胶网络中的凝血酶特异性核酸适配体A1和A2会特异性识别凝血酶，凝血酶和凝血酶特异性核酸适配体的结合会导致凝胶网络内部的非共价交联点增加，导致凝胶网络的交联密度上升，使得凝胶条发生体积收缩。由于凝胶光栅上的凝胶条的底面被硅烷偶联剂固定石英玻璃片表面，所以凝胶条的体积收缩主要体现为光栅高度的减小，而光栅周期则基本保持不变。同时，相较于常规凝胶光栅网络中杂乱无章排布的凝血酶特异性核酸适配体而言，本发明在发生聚合反应之前，凝血酶已经和A1、A2偶联形成了复合物A1-thrombin-A2，在聚合反应过程中这种复合物A1-thrombin-A2的结构就被整体聚合到了凝胶光栅的空间网络中。因此在去除凝胶网络中的凝血酶模板后，A1、A2在凝胶光栅的凝胶网络中是以凝血酶为模板规整排布的。这在一定程度上降低了再识别的传质阻力，使得对凝血酶的检测灵敏度优于未使用分子印迹技术的常规凝胶光栅。该实验结果也证实了本发明的凝胶光栅可实现对低浓度凝血酶的检测。
2.以实施例1制备的凝胶光栅为基础，搭建如图11所示的光学检测装置，并利用该光学检测装置考察凝胶光栅对凝血酶的检测能力。
用pH＝7.4、浓度为2mmol/L的PBS缓冲液作为溶剂配制凝血酶浓度分别为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L的待测溶液。由于尿液的温度与体温类似，通常是36～37℃，且在排出身体后温度会快速下降，直到降至室温(约为23～25℃)。因此本实施例测试凝胶光栅在20～35℃的各待测溶液中，每隔5℃作为一个温度测试点，凝胶光栅的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，在测试之前需要在每个设定温度点平衡20min。以pH＝7.4、浓度为2mmol/L的PBS缓冲液作为空白试样。结果如图12所示。
由图12可知，在测试温度范围内，凝胶光栅的DET/DET,0随着凝血酶浓度的增加而线性增大。这主要是由于凝血酶与凝血酶特异性核酸适配体A1、A2的结合，引起凝胶光栅发生体积收缩，导致光栅高度降低而造成的。
实施例8
本实施例中，以实施例1制备的凝胶光栅为基础，搭建如图11所示的光学检测装置，利用该光学检测装置对不同浓度的凝血酶标准溶液进行检测，确定凝血酶浓度的换算关系式，步骤如下：
(1)用pH＝7.4、浓度为2mmol/L的PBS缓冲液作为溶剂配制凝血酶浓度分别为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L的标样。
(2)以pH＝7.4、浓度为2mmol/L的PBS缓冲液作为空白试样，将空白试样加入光学检测装置的石英样品池中浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，计算空白试样的衍射效率；
(3)按照标样中凝血酶浓度由低到高的顺序依次用凝血酶浓度已知的标样替换步骤①的空白试样，分别测定各标样对应的衍射效率，得到一系列标样对应的衍射效率；
(4)计算各标样对应的衍射效率相对于空白试样的衍射效率的变化率，记作相对衍射效率，得到一系列相对衍射效率，以相对衍射效率为横坐标、以凝血酶浓度为纵坐标绘制工作曲线，确定凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系式。
控制步骤(2)～(4)的测试温度相同，本实施例中，分别控制测试温度为20、25、30、35℃进行测试，确定了凝血酶浓度与RDE之间的换算关系式，如图13所示。
基于以上实验结果，可得到凝血酶浓度([Thrombin])与RDE之间的线性定量关系为：
Figure BDA0003201323560000141
不同温度下系数a、b和相关系数R2如表1所示。
表1凝血酶浓度与RDE之间的线性定量关系中系数和相关系数列表
Figure BDA0003201323560000142
实施例9
本实施例中，以实施例1制备的凝胶光栅为基础，搭建如图11所示的光学检测装置，测试本发明的方法对人工尿液中凝血酶的检测能力。
(1)溶液配制
按照文献方法配置人工尿液，人工尿液的组分以及含量见表2。然后用人工尿液溶解凝血酶，配制凝血酶浓度分别为10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12mol/L的人工尿液标样。
(2)确定凝血酶浓度的换算关系式
①以不含凝血酶的人工尿液标准溶液作为空白试样，将空白试样加入光学检测装置的石英样品池中浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，计算空白试样的衍射效率；
②按照标样中凝血酶浓度由低到高的顺序依次用凝血酶浓度已知的标样替换步骤①的空白试样，分别测定各标样对应的衍射效率，得到一系列标样对应的衍射效率；
③计算各标样对应的衍射效率相对于空白试样的衍射效率的变化率，记作相对衍射效率，得到一系列相对衍射效率，以相对衍射效率为横坐标、以凝血酶浓度为纵坐标绘制工作曲线，确定凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系式。
(3)测量待测试样中的凝血酶浓度
①采用与步骤(2)中相同的凝胶光栅替换原凝胶光栅，向光学检测装置的石英样品池中加入空白试样浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，计算空白试样的衍射效率；
②采用凝血酶浓度未知的待测试样替换步骤(3)①中的空白试样，测定待测试样的衍射效率；待测试样由人工尿液和凝血酶配制而成；
③计算待测试样的衍射效率相对于步骤(3)①中空白试样的衍射效率的相对衍射效率，根据凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系，计算待测试样中凝血酶的浓度。
控制步骤(2)(3)中控制的测试温度为30℃。
检测结果如表3所示，检测结果表明，采用本发明的方法对人工尿液中的凝血酶进行监测的相对标准偏差(RSD)在-6.26％～5.05％以内，表明本发明提供的方法对人工尿液中的凝血酶具有优良的检测性能。
表2人工尿液的组成
Figure BDA0003201323560000151
Figure BDA0003201323560000161
表3人工尿液中凝血酶浓度实际值与测试值对比
Figure BDA0003201323560000162
实施例10
本实施例中，制备分子印迹智能凝胶光栅，操作过程与实施例1基本相同，不同之处仅在于：步骤(2)配制的凝胶预聚液中，凝胶预聚液中，NIPAM的浓度2.5mol/L，NIPAM与tetra-arm PEGAAm的摩尔比为1:0.05，NIPAM与引发剂的摩尔比为1:0.05，NIPAM与加速剂的摩尔比为1:0.2，凝血酶印迹复合物与tetra-arm PEGAAm的摩尔比为1:5000。在制备含凝血酶印迹复合物A1-thrombin-A2的溶液时，控制A2与凝血酶的摩尔比为1:0.9，A1与凝血酶的摩尔比为1:1。
实施例11
本实施例中，制备分子印迹智能凝胶光栅，操作过程与实施例1基本相同，不同之处仅在于：步骤(2)配制的凝胶预聚液中，凝胶预聚液中，NIPAM的浓度0.5mol/L，NIPAM与tetra-arm PEGAAm的摩尔比为1:0.01，NIPAM与引发剂的摩尔比为1:0.005，NIPAM与加速剂的摩尔比为1:0.02，凝血酶印迹复合物与tetra-arm PEGAAm的摩尔比为1:1000。在制备含凝血酶印迹复合物A1-thrombin-A2的溶液时，控制A2与凝血酶的摩尔比为1:1，A1与凝血酶的摩尔比为1:1。
序列表
<110> 四川大学
<120> 分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法与凝血酶检测方法
<130> 20210808
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
agaccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29

Claims (10)

1.一种分子印迹智能凝胶光栅，其特征在于，该凝胶光栅由基底和基底上的相互平行的凝胶条组成，凝胶条之间的间隙为凝胶光栅的狭缝，所述凝胶条由凝血酶响应型分子印迹凝胶构成；
所述凝血酶响应型分子印迹凝胶是由含凝血酶印迹复合物的凝胶在洗脱掉凝胶网络中的凝血酶后形成的；所述凝血酶印迹复合物是由凝血酶特异性核酸适配体A1、凝血酶特异性核酸适配体A2与凝血酶的不同位点结合形成的，凝血酶特异性核酸适配体A1的核苷酸序列为5'-/5Acryd/GGT TGG TGT GGT TGG-3'，凝血酶特异性核酸适配体A2的核苷酸序列为5'-/5Acryd/AGA CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'；
所述含凝血酶印迹复合物的凝胶是由N-异丙基丙烯酰胺、凝血酶印迹复合物与交联剂交联反应形成的，在交联反应过程中，N-异丙基丙烯酰胺的碳碳双键、凝血酶印迹复合物中的凝血酶特异性核酸适配体A1的5'端以及凝血酶特异性核酸适配体A2的5'端上的碳碳双键与交联剂上的碳碳双键发生加成反应形成凝胶网络；交联反应过程中，控制N-异丙基丙烯酰胺与交联剂的摩尔比为1:(0.01～0.05)，凝血酶印迹复合物与交联剂的摩尔比为1:(1000～5000)。
2.根据权利要求1所述分子印迹智能凝胶光栅，其特征在于，所述交联剂为四臂-聚乙二醇丙烯酰胺、八臂-聚乙二醇丙烯酰胺或二臂-聚乙二醇丙烯酰胺。
3.根据权利要求1所述分子印迹智能凝胶光栅，其特征在于，该凝胶光栅的周期与光栅高度之比为1:(0.01～0.1)。
4.根据权利要求1所述分子印迹智能凝胶光栅，其特征在于，所述基底为硅烷化处理的石英玻璃片，凝胶条通过共价键与基底结合。
5.权利要求1至4中任一权利要求所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制凝胶预聚液
将凝血酶特异性核酸适配体A2加入凝血酶溶液中，搅拌20～40min，然后加入凝血酶特异性核酸适配体A1，搅拌20～40min，得到含凝血酶印迹复合物的溶液；凝血酶特异性核酸适配体A1以及凝血酶特异性核酸适配体A2与凝血酶的摩尔比均为1:(0.02～1)；
向含凝血酶印迹复合物的溶液中加入N-异丙基丙烯酰胺、交联剂、引发剂以及加速剂，在冰浴条件下充分震荡溶解，得到凝胶预聚液；凝胶预聚液中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度0.5～2.5mol/L，N-异丙基丙烯酰胺与交联剂的摩尔比为1:(0.01～0.05)，N-异丙基丙烯酰胺与引发剂的摩尔比为1:(0.005～0.05)，N-异丙基丙烯酰胺与加速剂的摩尔比为1:(0.02～0.2)，凝血酶印迹复合物与交联剂的摩尔比为1:(1000～5000)；
(2)制备含凝血酶的凝胶光栅
将凝胶预聚液滴加到基底上，将凝胶光栅模板压在凝胶预聚液上，在4～10℃的条件下反应4～12h，剥离凝胶光栅模板，得到含凝血酶的凝胶光栅；
(3)洗涤去除凝胶网络中的凝血酶
将含凝血酶的凝胶光栅置于PBS缓冲液中浸泡洗涤，以去除未完全聚合的反应物，然后取出置于盐酸胍与氯化钠的混合溶液中充分浸泡以去除含凝血酶的凝胶光栅的凝胶网络结构中的凝血酶，在盐酸胍与氯化钠的混合溶液中浸泡的过程中，每隔6～12h更换一次盐酸胍与氯化钠的混合溶液，浸泡完成后，取出置于PBS缓冲液中充分浸泡洗涤，即得分子印迹智能凝胶光栅。
6.根据权利要求5所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述盐酸胍与氯化钠的混合溶液中，盐酸胍的浓度为3～6mol/L、氯化钠的浓度为1～2mol/L。
7.根据权利要求5所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述PBS缓冲液的pH值为7.4、浓度为1～3mmol/L。
8.根据权利要求5至7中任一权利要求所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述基底为硅烷化处理的石英玻璃片。
9.根据权利要求8所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，石英玻璃片的硅烷化处理方法如下：
将洗净的石英玻璃片浸没于含硅烷偶联剂的醋酸-醋酸钠缓冲液中保持10～30min，然后在50～60℃的烘箱中保持10～20min，用去离子水洗涤，干燥，即完成石英玻璃片的硅烷化处理；所述含硅烷偶联剂的醋酸-醋酸钠缓冲液中，硅烷偶联剂的体积百分浓度0.5％～2％，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.5～5.5、浓度为0.05～0.2mol/L。
10.一种基于分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法，其特征在于，该方法使用包括权利要求1至4中任一权利要求所述分子印迹智能凝胶光栅的光学检测装置进行检测，步骤如下：
(1)确定凝血酶浓度的换算关系式
①将空白试样加入光学检测装置的石英样品池中浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，计算空白试样的衍射效率；
②按照标样中凝血酶浓度由低到高的顺序依次用凝血酶浓度已知的标样替换步骤①的空白试样，分别测定各标样对应的衍射效率，得到一系列标样对应的衍射效率；
③计算各标样对应的衍射效率相对于空白试样的衍射效率的变化率，记作相对衍射效率，得到一系列相对衍射效率，以相对衍射效率为横坐标、以凝血酶浓度为纵坐标绘制工作曲线，确定凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系式；
(2)测量待测试样中的凝血酶浓度
①采用与步骤(1)相同的凝胶光栅替换原凝胶光栅，向光学检测装置的石英样品池中加入空白试样浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度I1和零级衍射光强度I0，计算空白试样的衍射效率；
②采用凝血酶浓度未知的待测试样替换步骤(2)①中的空白试样，测定待测试样的衍射效率；
③计算待测试样的衍射效率相对于步骤(2)①中空白试样的衍射效率的相对衍射效率，根据凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系，计算待测试样中凝血酶的浓度；
控制步骤(1)与步骤(2)的测试温度相同并且在20～35℃范围内的恒定温度。
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