CN113604377A - 一种枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种枯草芽孢杆菌菌剂,属于微生物技术领域,具体,所述的枯草芽孢杆菌为JQ‑0101D,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,保藏时间:2021年3月19号,保藏登记号为CGMCC No.22039。本发明对该菌进行培养发酵,形制成菌剂,其菌剂能有效抑制腐霉属、疫霉属、镰刀属,对五加科人参属植物根腐病有良好的生防作用,并对酸杆菌生长繁殖有一定促进效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
连作障碍,是指连续在同一土壤上栽培同种作物或近缘作物引起的作物生长发育异常。症状一般为生长发育不良,产量、品质下降,极端情况下,局部死苗,不发苗或发苗不旺;多数受害植物根系发生褐变、分支减少,活力低下,分布范围狭小,导致吸收水分、养分的能力下降。
人参、西洋参是严重忌连作药用植物,用重茬地继续栽种人参一般在第2年以后存苗率降至30%以下,有大约70%土地上的人参须根脱落、烧须,根周皮烂红色、长满病疤,致使人参地上部分死亡,有的地块几乎全部绝苗。因此,老参地连作障碍问题成为一直困扰参业发展的重大技术难题。三七生长环境特殊,种植区域受限,且存在严重的连作障碍。同为五加科人参属的三七连作最突出的表现是“病多,产量低”,连作地根腐病的发病率平均为23.9%,相当于新栽地的3.5倍,且随着连作年限延长,根腐病发病越重。连作表现为植株基本全部死亡,缩短轮作年限则表现为发病严重和保苗率低等现象,致使产量低、质量差。
目前为解决连作障碍最简单的方式就是轮作,换地种植,但是人参、西洋参和田七均为多年生草本植物,为实现轮作,吉林省平均每年要砍伐7 000多hm2森林,抚松、靖宇、集安等老参区已基本无林可伐;虽然栽(种)参的同时还林,但由于树种单一,造成生物多样性丧失、水土流失明显增加、涵养水源能力降低、土壤肥力下降、森林生态平衡失调等一系列生态问题,对长白山的生态环境已构成严重威胁。
发明内容
针对现有技术中存在的,五加科人参属的人参、西洋参和三七存在严重的连作障碍的问题,本发明提供一种枯草芽孢杆菌菌剂,以及其制备方法,能够在一定程度上缓解五加科人参属经济作物的连作障碍问题。
一种枯草芽孢杆菌菌剂,由枯草芽孢杆菌经种子活化、种子培养、发酵培养后制成的菌剂,所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为JQ-0101D,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,保藏时间:2021年3月19号,保藏登记号为CGMCC No.22039。
其中,所述的菌剂优选为液体菌剂。
同时,本发明提供该菌剂的制备方法,具体如下:
a .菌种活化:将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于固体培养基上,于35-38℃培养34-38h,挑取单菌落转接到斜面培养基上,于35-38℃培养16-24h,用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液;
b .一级种子液制备:按照5%-10%的接种量向种子培养基中接入步骤a制备的接种液,转速200-260rpm,温度35-38℃,摇床培养16-24h,作为一级种子液;
c.二级种子液制备:按照0.5%-3%的接种量向种子培养基中接入步骤b制备的一级种子液,通气量为0.4-1.5vvm,搅拌速度为180-260rpm,培养时间为18-24h,作为二级种子液;
d .发酵培养:按照5%-10%的接种量向发酵培养基中接入步骤c制备的二级种子液,通气量为0.4-1.5vvm,搅拌速度为180rpm-260rpm,培养时间为24h-30h,得到发酵液;
e .将上述发酵液通过水洗和分子筛浓缩,得到枯草芽孢杆菌液体菌剂。
其中,所述步骤b和步骤c中的种子培养基的组成成分及其重量百分比为:葡萄糖1-2%、蛋白胨1-1.5%、酵母粉0.6-1%、牛肉膏0.5-0.7%、氯化钠0.5%,其余为水。
其中,所述步骤d中的发酵培养基的组成成分及其重量百分比为:葡萄糖3-5%、蛋白胨0.5-1.5%、酵母粉0.03-0.08%、蛋白胨0.1-0 .3%、豆粕粉0.5-1 .5%、硫酸镁0.01-0.05%、硫酸锰0.01-0 .05%,其余为水。
其中,将步骤d所述发酵液可进行喷雾干燥,进口温度150-200℃,出口温度50-90℃,加入喷雾载体可溶性淀粉,得到枯草芽孢杆菌粉剂。
该菌剂应用于防治植物真菌病害,所述的真菌病害具体为根腐病,所述的植物具体为五加科人参属植物。
以东北林地为例,通过对五加科人参属植物连作后的土壤进行微生物种群的菌群丰度分析,五加科人参属连作地相较于新地,较为明显的特征:细菌的酸杆菌(科)丰度明显下降,由原来的30.40%降低至11.90%。而真菌(属)的菌群丰度中,新地几乎不含有腐霉属、疫霉属、镰刀属(腐霉属0.01%、疫霉属0.21%、镰刀属0.27%,可忽略不计),而连作后,该三种真菌(属)种群的菌群丰度分别爆涨至1.91%、6.11%和2.76%,而这三种真菌恰恰是导致根腐病的主要病原菌。
本发明的菌剂具备广谱抗菌能力,能一定程度上同时对腐霉属、疫霉属、镰刀属具备杀灭和抑制作用,更多的,并不影响酸杆菌的生长繁殖。
本发明有益效果
本发明提供的菌株具备广谱抑菌能力,能同时对导致人参根腐病的多种病原菌有抑菌作用,尤其是根腐病主要病原菌-腐皮镰孢菌有良好的抑菌能力。同时其发酵产物对酸杆菌(科)的生长繁殖有一定的促进效果。
具体实施方式
以下结合具体实施列进一步说明
实施例1 菌剂的制备
(1)菌种活化:将低温保存的枯草芽孢杆菌JQ-0101D菌株接种于LB固体培养基上,于36℃培养36h;挑取单菌落转接到LB斜面培养基上,于36℃培养20h,用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液。
(2)一级种子液制备:按照10%(体积百分比)的接种量向种子培养基中接入步骤
(1)制备的接种液,转速220rpm,温度36℃,摇床培养20h,作为一级种子液。
3)二级种子液制备:按照3%(体积百分比)的接种量向种子培养基中接入步骤
(2)制备的一级种子液,通气量为1 .0vvm,搅拌速度为220rpm,培养时间为20h。作为二级种子液。
所述种子培养基的组成成分及其重量百分比为:葡萄糖2%、蛋白胨1 .5%、酵母粉1%、牛肉膏0.7%、氯化钠0.5%,其余为水。
(4)发酵培养:按照10%(体积百分比)的接种量向发酵培养基中接入步骤(3)制备的二级种子液,通气量为1 .0vvm,搅拌速度为220rpm,培养时间为28h,得到发酵液。
所述发酵培养基的组成成分及其重量百分比为:葡萄糖5%、蛋白胨1 .5%、酵母粉0.08%、蛋白胨0 .3%、豆粕粉1 .5%、硫酸镁0 .03%、硫酸锰0 .03%,其余为水。
(5)将上述发酵液通过水洗和分子筛浓缩,得到活菌数为109CFU/ml以上的枯草芽孢杆菌液体菌剂。
实施例2 抗菌性检测
在中间带有隔板的平皿中,一边移取200μL上述制备好的109CFU/毫升的枯草芽孢杆菌发酵液于LB培养基上,用灭菌后的涂布棒涂布均匀,待其表面干燥;一边分别接种3种病原菌于PDA培养基上,将平板置于25℃下培养。做3组平行,用涂布无菌生理盐水的LB培养基做对照,72h后观测抑菌效果。
实验结果如表1
病原菌种类
抑制效果
注:+抑制效果弱,菌落半径抑制率10%以下,影响真菌菌丝生长;++抑菌效果明显,菌落半径抑制率10%-20%之间;+++抑制效果显著,菌落半径抑制率20%以上;三次重复取平均。
由此可见,该菌剂对镰刀属抑菌效果最为明显,对于腐霉属和疫霉属均有不同程度的抑菌能力。
实施例3 对酸杆菌(科)的作用(定性实验)
以柠檬酸杆菌为土壤酸杆菌(科)代表,分别进行以下两种操作,做3组平行:
1)接种至MRS基础培养基中直接进行摇床,8h后,检测OD600=0.6;
2)取JQ-0101D发酵液,过滤除菌丝,以此取代MRS基础培养基中的水,其他成分不变,将改良后的培养基按照5%接种量,接种柠檬酸杆菌,后摇床8h,检测OD600=0.8。
由此可见,枯草芽孢杆菌JQ-0101D发酵产物对酸杆菌的繁殖有促进作用。
Claims (8)
1.一种枯草芽孢杆菌菌剂,其特征在于,所述的菌剂由枯草芽孢杆菌经种子活化、种子培养、发酵培养后制成的菌剂,所述的枯草芽孢杆菌为JQ-0101D,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,保藏登记号为CGMCC No.22039。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌剂,其特征在于,所述的菌剂优选为液体菌剂。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌剂,其特征在于,该菌剂的制备方法包括如下步骤:
a .菌种活化:将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于固体培养基上,于35-38℃培养34-38h,挑取单菌落转接到斜面培养基上,于35-38℃培养16-24h,用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液;
b .一级种子液制备:按照5%-10%的接种量向种子培养基中接入步骤a制备的接种液,转速200-260rpm,温度35-38℃,摇床培养16-24h,作为一级种子液; c.二级种子液制备:按照0.5%-3%的接种量向种子培养基中接入步骤b制备的一级种子液,通气量为0.4-1.5vvm,搅拌速度为180-260rpm,培养时间为18-24h,作为二级种子液;
d .发酵培养:按照5%-10%的接种量向发酵培养基中接入步骤c制备的二级种子液,通气量为0.4-1.5vvm,搅拌速度为180rpm-260rpm,培养时间为24h-30h,得到发酵液;
e .将上述发酵液通过水洗和分子筛浓缩,得到枯草芽孢杆菌液体菌剂。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌菌剂,其特征在于,所述步骤b和步骤c中的种子培养基的组成成分及其重量百分比为:葡萄糖1-2%、蛋白胨1-1.5%、酵母粉0.6-1%、牛肉膏0.5-0.7%、氯化钠0.5%,其余为水。
5.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌菌剂,其特征在于,所述步骤d中的发酵培养基的组成成分及其重量百分比为:葡萄糖3-5%、蛋白胨0.5-1.5%、酵母粉0.03-0.08%、蛋白胨0.1-0 .3%、豆粕粉0.5-1 .5%、硫酸镁0.01-0.05%、硫酸锰0.01-0 .05%,其余为水。
6.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌菌剂,其特征在于,将步骤d所述发酵液进行喷雾干燥,进口温度150-200℃,出口温度50-90℃,加入喷雾载体可溶性淀粉,得到枯草芽孢杆菌粉剂。
7.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌剂,其特征在于,该菌剂应用于防治植物真菌病害,所述的真菌病害具体为根腐病,所述的植物具体为五加科人参属植物。
8.根据权利要求7所述的枯草芽孢杆菌菌剂,其特征在于,所述的五加科人参属植物具体为人参、田七和西洋参。
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CN113603525A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-11-05 | 山东京青农业科技有限公司 | 一种五加科人参属植物专用有机菌肥及其制备方法 |
CN114163273A (zh) * | 2021-12-11 | 2022-03-11 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 一种利用甜菜糖蜜预防西洋参根腐病的组合物及其制备方法 |
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CN103703121A (zh) * | 2010-11-09 | 2014-04-02 | 韩国生命工学研究院 | 新型枯草芽孢杆菌菌株及其对植物根腐病的防治用途 |
CN104031863A (zh) * | 2014-06-14 | 2014-09-10 | 福建农林大学 | 一株用于拮抗太子参专化型尖孢镰刀菌的枯草芽孢杆菌 |
CN105586298A (zh) * | 2016-03-11 | 2016-05-18 | 山东京青农业科技有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌、菌剂、菌剂的制备方法和菌剂的应用 |
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2021
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