CN113599574A - 一种用于肌肉修复的再生材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于肌肉修复的再生材料及其制备方法。将含镁、含锌和含锶的物质充分溶解或分散于去离子水中，镁、锌、锶元素的原子比为1～1000：1：1；按总质量分数10～50%，加入可降解水凝胶基质，充分搅拌后得到粘稠液体；再在25℃～90℃下密封静置,得到一种用于肌肉修复的再生材料，可填充到肌肉损伤处，恢复损伤部位肌肉收缩力的传递，并适配损伤部位的形变，原位释放生物活性镁、锌、锶离子，发挥抑制肌纤维凋亡和肌肉坏死、降低氧化应激反应、调控巨噬细胞极化行为等多重作用，可同时促进肌纤维、神经和血管再生，抑制疤痕组织形成和脂肪变性、预防治疗后的肌肉萎缩、恢复肌肉生物力学功能。

Description

一种用于肌肉修复的再生材料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种用于肌肉修复的再生材料及其制备方法。

背景技术

骨骼肌发生轻微病损时，肌肉卫星细胞在病损处微环境调控下可以完成病损修复。然而，战争、严重创伤、交通事故或肿瘤切除等导致的大体积肌肉缺损(volumetricmuscle loss，VML)，长期卧床、衰老等导致的肌肉萎缩，重建手术、外周动脉疾病和肢体创伤导致的肌肉缺血病损等情况下肌肉不能完全修复，以致形成大量的疤痕组织和脂肪变性、肌肉萎缩、肌肉坏死，严重影响外观和功能。目前临床对VML的传统治疗手段为肌瓣自体移植和异体移植，这些方法不仅受免疫排斥和损害供体部位的限制，且移植后不能完全恢复受损肌肉的收缩功能；肌肉萎缩通过理疗，康复锻炼可以缓解，但过程缓慢且恢复有限；针对肌肉缺血病损，已开发出高压氧室、溶栓药物和局部血管生长因子等治疗方案，然而，在完全恢复血液流动方面取得的成功有限。因此亟需开发可用于多种肌肉病损治疗的有效方案。

生物材料植入到病损肌肉中，对病损区域的微环境进行调控，有望促进肌肉病损的修复。虽然脱细胞的细胞外基质通过提供细胞生长所需要的生物信号，可以支持成肌细胞的增殖，肌源性标志物的表达和促再生生长因子的分泌，但其大量获取成本较高，再生肌纤维能力有限，治疗效果也因细胞外基质来源、制备方式、病损部位、病损类型的不同而有较大差异。

具有高生物安全性和生物可降解性的水凝胶材料可填充在肌肉病损部位，为肌肉再生提供三维支架，其中包括天然水凝胶材料，如胶原蛋白、壳聚糖、明胶、透明质酸、淀粉等，以及多种人工合成水凝胶材料。然而，上述水凝胶缺乏促进肌肉再生所需的生物学功能，无法有效提升肌肉病损修复。目前仍需开发可促进肌纤维和肌肉再生，重建再生肌肉组织的血管化和神经支配，恢复肌肉功能，最终修复肌肉病损的生物材料。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提供一种能有效提升肌肉修复、安全性高、毒副作用低，可生物降解的再生材料及其制备方法。

实现本发明目的的技术方案是提供一种用于肌肉修复的再生材料，该材料以可降解水凝胶为基质，包括含镁物质、含锌物质、含锶物质的功能性成分；所述材料中镁元素、锌元素和锶元素的总物质的量浓度为0.1～10mol/L, 镁元素、锌元素、锶元素的原子比为1～1000：1：1。

本发明技术方案中，可生物降解水凝胶包括基于纤维蛋白原、壳聚糖、纤维素、海藻酸、明胶、胶原、透明质酸、聚乙二醇、淀粉的可降解水凝胶中的一种，或任意组合。

含镁物质包括可生物降解吸收的纯镁、镁合金、含镁无机盐、含镁氧化物、含镁氢氧化物、含镁有机物、含镁陶瓷、含镁生物玻璃中的一种，或任意组合；其中，含镁无机盐包括氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、碳酸镁、硅酸镁；含镁物质中除锌、锶、镁之外的其它金属元素含量≤1wt%。

含锌物质包括可生物降解吸收的纯锌、锌合金、含锌无机盐、含锌氧化物、含锌氢氧化物、含锌有机物、含锌陶瓷、含锌生物玻璃中的一种，或任意组合；其中，含锌无机盐包括氯化锌、硝酸锌、硫酸锌、碳酸锌、硅酸锌；含锌物质中除锌、锶、镁之外的其它金属元素含量≤1wt%。

含锶物质包括可生物降解吸收的纯锶、锶合金、含锶无机盐、含锶氧化物、含锶氢氧化物、含锶有机物、含锶陶瓷、含锶生物玻璃中的一种，或任意组合；其中，含锶无机盐包括氯化锶、硝酸锶、硫酸锶、碳酸锶、硅酸锶；含锶物质中除锌、锶、镁之外的其它金属元素含量≤1wt%。

上述用于肌肉修复的再生材料的制备方法包括如下步骤：

(1)按镁元素、锌元素和锶元素的总物质的量浓度0.1～10mol/L，将含镁物质、含锌物质和含锶物质充分溶解或分散于去离子水中，其中，镁元素、锌元素、锶元素物质的量的比为1～1000：1：1；

(2)按总质量分数10～50%，将可降解水凝胶基质加入到步骤（1）制备的溶液或分散液中，在温度为4℃～120℃的条件下充分搅拌，得到粘稠液体；

(3）将步骤（2）得到的粘稠液体在温度为25℃～90℃的条件下密封静置10分钟以上，得到用于肌肉修复的再生材料。

按本发明技术方案制备的肌肉修复的材料，在37℃，应变1%，0.1～10 Hz流变学测量条件下，存储模量为0.1～20 kPa，损耗角正切值tanδ为0.1～1.2。材料具有的流变学性能，使其可通过微创手术注射到肌肉病损部位，并动态适配病损部位的形变和力学环境。材料在病损处3～42天完全降解，保证材料植入肌肉中无毒副作用，支架降解周期与肌肉再生周期匹配，为肌肉再生提供再生空间。

材料在肌肉病损后填充在病损部位，降解过程中按一定比例原位释放Mg²⁺离子、Zn²⁺离子和Sr²⁺离子，抑制肌肉病损后的肌纤维凋亡和肌肉坏死反应、降低氧化应激反应、调控巨噬细胞极化行为，可同时促进肌纤维、神经和血管再生，抑制疤痕组织形成和脂肪变性、预防治疗后再次发生肌肉萎缩、长期恢复肌肉生物力学功能。上述多方面可显著促进肌肉病损的修复。

本发明提供了一类可注射、粘弹性、生物可降解的材料，可填充在肌肉病损部位，为肌肉病损修复提供三维支架，材料降解周期与肌肉再生周期匹配。更为重要的是，本发明提供的肌肉修复材料，随着材料降解，材料原位释放生物活性镁、锌、锶离子，可显著促进肌肉修复，有望用于VML损伤、肌肉萎缩、肌肉缺血损伤等肌肉病损的修复治疗。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明提供的肌肉修复材料可显著促进肌肉病损修复，抑制疤痕组织形成和脂肪变性、预防治疗后再次发生肌肉萎缩、长期恢复肌肉生物力学功能，而且安全性高、毒副作用低，可生物降解，降解周期与肌肉再生周期匹配。

2.本发明材料的制备具有环境友好、成本低廉、工艺简单、设备要求低的优势，而且材料易于长期存储、使用简单，易于临床转化。

3.本发明提供的肌肉修复的材料可通过微创手术注射到肌肉病损部位，力学性能与天然肌肉组织相当，并可动态适配病损部位的形变，因此，使用时可避免对正常肌肉造成损伤。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的骨骼肌缺损修复的水凝胶材料用于诱导成肌细胞分化所得的成熟肌管染色对比图片，(a)图为采用无离子淀粉水凝胶对照组，(b)图为本实施例提供的镁锌锶淀粉水凝胶组；

图2 是本发明实施例1提供的骨骼肌缺损修复的水凝胶材料用于修复大鼠胫骨前肌VML损伤的肌肉形态学和组织学染色对比图片，(a1)图为无离子淀粉水凝胶对照组的肌肉外观图片，(b1)图为本实施例镁锌锶淀粉水凝胶修复组的肌肉外观图片，(a2)图为无离子淀粉水凝胶对照组的肌肉横截面H&E染色图片，(b2) 图为本实施例镁锌锶淀粉水凝胶修复组的肌肉横截面H&E染色图片；

图3是本发明实施例2提供的骨骼肌缺血损伤修复的水凝胶材料用于体外成管实验的管腔形成对比图片，(a)图为聚乙烯醇/淀粉水凝胶对照组，(b) 图为本实施例聚乙烯醇/淀粉/镁锌锶金属颗粒水凝胶组。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步的阐述。

实施例1

按镁元素、锌元素、锶元素的总物质的量浓度分别为3.15mol/L、1.26mol/L、1.26mol/L，将氯化镁、氯化锌、氯化锶充分溶解于去离子水中。按总质量分数15%,将玉米淀粉加入到上述制备的溶液中，在70℃下充分搅拌，得到粘稠液体。在37℃下密封静置48小时,得到用于骨骼肌缺损修复的水凝胶材料。

按照国标浸提标准0.1g/mL配制材料浸提液，在37℃条件下培养24h后离心（4500rpm，15min）取上清液，用0.22μm滤头滤菌得到浸提液。使用镁锌锶淀粉水凝胶浸提液诱导成肌细胞分化，对照组为无离子淀粉水凝胶的浸提液，7天后使用抗肌球蛋白重链抗体/DAPI进行染色观察。

使用戊巴比妥麻醉300g左右的SD大鼠，称重，按照公式：胫骨前肌重量=0.0017*大鼠体重-0.0716，计算出胫骨前肌的质量。暴露右侧胫骨前肌，切除约10*7*3mm体积的肌肉，边切边称重，直至切除的质量达到总质量的25%。注入水凝胶，完全填充缺损处，缝合筋膜、皮肤。4周后通过形态学及组织学染色观察其修复情况。

本实施例培养所得的成熟肌管染色图片见附图1所示，(a)图为采用无离子淀粉水凝胶对照组，(b)图为本实施例提供的镁锌锶淀粉水凝胶组；与无离子淀粉水凝胶的对照组相比，可以看到镁锌锶淀粉水凝胶浸提液显著促进肌管成熟，表现为平均肌管直径增粗，融合指数增加。

本实施例中的形态学和组织学染色图片见附图2所示，(a1)图为无离子淀粉水凝胶对照组的胫骨前肌外观形貌的形态学照片，(b1)图为本实施例镁锌锶淀粉水凝胶修复组的肌肉外观图片，(a2)图为无离子淀粉水凝胶对照组的肌肉横截面H&E染色图片，(b2) 图为本实施例镁锌锶淀粉水凝胶修复组的胫骨前肌肉横截面H&E染色图片；水凝胶修复VML术后4周，与无离子淀粉水凝胶对照组相比，本实施例镁锌锶淀粉水凝胶修复组肌肉形态饱满，表面光滑无瘢痕，组织学染色可以看出镁锌锶淀粉水凝胶修复组新生肌纤维明显增多，脂肪浸润和疤痕组织减少。

本实施例制备的肌肉修复的材料，在37℃，应变1%，0.1～10 Hz流变学测量条件下，存储模量为0.1～20 kPa，损耗角正切值tanδ为0.1～1.2。材料具有的流变学性能，使其可通过微创手术注射到肌肉病损部位，并动态适配病损部位的形变和力学环境。材料在病损处3～42天完全降解，保证材料植入肌肉中无毒副作用，支架降解周期与肌肉再生周期匹配，为肌肉再生提供再生空间。

实施例2

配置淀粉和聚乙二醇水溶液，质量分数分别为10%和6%，90℃下充分搅拌，待聚乙二醇完全溶解后，按镁元素、锌元素、锶元素的总物质的量浓度分别为1.74mol/L、0.48mol/L、0.48mol/L，将过800目的镁、锌、锶金属颗粒加入到上述溶液中，在80℃下继续加热搅拌，得到粘稠液体。最后，在37℃下密封静置36小时,得到用于骨骼肌缺损修复的水凝胶材料。

按照国标浸提标准0.1g/mL配制材料浸提液，在37℃条件下培养24h后离心（4500rpm，15min）取上清液，用0.22μm滤头滤菌得到浸提液。将冻融后的基质胶在冰上铺于24 孔培养板内，置于 4℃冰箱 30 分钟去除气泡，然后置于细胞培养箱内半小时成胶；将HUVECs接种至已铺有基质胶的 24孔培养板内，然后加入上述配置的聚乙烯醇/淀粉/镁锌锶金属颗粒水凝胶浸提液，对照组加入聚乙烯醇/淀粉水凝胶的浸提液，继续培养12小时后取出，显微镜下拍照。

使用戊巴比妥麻醉300g左右的SD大鼠。暴露分离右下肢股动脉两段，间隔2mm，用5-0 Ethilon缝合，然后切开中间部分，用5-0 Ethilon缝合两断端，创建股四头肌缺血病损模型。在股四头肌表面注射水凝胶，覆盖在肌肉表面，缝合筋膜、皮肤。6周后通过Microfil血管灌注、Micro-CT三维重建股四头肌缺血病损部位血管网络观察其血管再生情况。

本实施例培养所得的体外成管图片见附图3所示，(a)图为聚乙烯醇/淀粉水凝胶对照组，(b) 图为聚乙烯醇/淀粉/镁锌锶金属颗粒水凝胶组。可以看到，聚乙烯醇/淀粉/镁锌锶金属颗粒水凝胶浸提液显著促进体外管腔生成，管腔总长度及分支点数量均显著高于聚乙烯醇/淀粉水凝胶对照组。动物实验结果显示聚乙烯醇/淀粉/镁锌锶金属颗粒水凝胶组新生血管数量显著增加，缺血损伤的股四头肌内部形成密集的血管网络。而聚乙烯醇/淀粉水凝胶对照组股四头肌血管稀疏，周围几乎没有新生血管。

实施例3

按镁元素、锌元素、锶元素的总物质的量浓度分别为4.94mol/L、1.85mol/L、1.85mol/L，将硝酸镁、氯化锌、碳酸锶充分溶解于去离子水中。按总质量分数20%将透明质酸加入到上述制备的溶液中，在60℃下充分搅拌，得到粘稠液体。在37℃下密封静置24小时,得到用于骨骼肌缺损修复的水凝胶材料。

使用戊巴比妥麻醉25g左右的ICR小鼠。显微镜下暴露右侧股二头肌深部的坐骨神经及其分支，用超细钳和弹簧显微解剖剪将胫骨与胫神经和腓总神经分支轻轻分离，用显微解剖剪尽可能贴近远端切断胫神经，使胫骨前肌完全且持久的去神经萎缩，最后将截断的胫神经末端用10-0尼龙线缝合到股二头肌前表面，在胫骨前肌表面注射水凝胶，覆盖在肌肉表面，缝合筋膜、皮肤。8周后通过Aurora Scientific肌肉力学测试系统测试其功能恢复情况。

Aurora Scientific肌肉力学测试系统测试结果显示，镁锌锶透明质酸水凝胶修复组的最大强直力、抗疲劳时间、峰值扭矩较无离子透明质酸水凝胶对照组显著提升，无离子透明质酸水凝胶对照组因失神经支配导致胫骨前肌萎缩明显，镁锌锶透明质酸水凝胶修复组肌肉萎缩程度降低。

Claims (9)

1.一种用于肌肉修复的再生材料，其特征在于：它以可降解水凝胶为基质，包括含镁物质、含锌物质、含锶物质的功能性成分；所述材料中镁元素、锌元素和锶元素的总物质的量浓度为0.1～10mol/L, 镁元素、锌元素、锶元素的原子比为1～1000：1：1。

2.根据权利要求1所述的一种用于肌肉修复的再生材料，其特征在于：所述的可生物降解水凝胶包括基于纤维蛋白原、壳聚糖、纤维素、海藻酸、明胶、胶原、透明质酸、聚乙二醇、淀粉的可降解水凝胶中的一种，或任意组合。

3.根据权利要求1所述的一种用于肌肉修复的再生材料，其特征在于：所述的含镁物质包括可生物降解吸收的纯镁、镁合金、含镁无机盐、含镁氧化物、含镁氢氧化物、含镁有机物、含镁陶瓷、含镁生物玻璃中的一种，或任意组合，含镁物质中除锌、锶、镁之外的其它金属元素含量≤1wt%。

4.根据权利要求1所述的一种用于肌肉修复的再生材料，其特征在于：所述的含锌物质包括可生物降解吸收的纯锌、锌合金、含锌无机盐、含锌氧化物、含锌氢氧化物、含锌有机物、含锌陶瓷、含锌生物玻璃中的一种，或任意组合，含锌物质中除锌、锶、镁之外的其它金属元素含量≤1wt%。

5.根据权利要求1所述的一种用于肌肉修复的再生材料，其特征在于：所述的含锶物质包括可生物降解吸收的纯锶、锶合金、含锶无机盐、含锶氧化物、含锶氢氧化物、含锶有机物、含锶陶瓷、含锶生物玻璃中的一种，或任意组合，含锶物质中除锌、锶、镁之外的其它金属元素含量≤1wt%。

6.根据权利要求3所述的一种用于肌肉修复的再生材料，其特征在于：所述的含镁无机盐包括氯化镁、硝酸镁、硫酸镁、碳酸镁、硅酸镁。

7.根据权利要求3所述的一种用于肌肉修复的再生材料，其特征在于：所述的含锌无机盐包括氯化锌、硝酸锌、硫酸锌、碳酸锌、硅酸锌。

8.根据权利要求4所述的一种用于肌肉修复的再生材料，其特征在于：所述的含锶无机盐包括氯化锶、硝酸锶、硫酸锶、碳酸锶、硅酸锶。

9.一种如权利要求1所述的用于肌肉修复的再生材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)按镁元素、锌元素和锶元素的总物质的量浓度0.1～10mol/L，将含镁物质、含锌物质和含锶物质充分溶解或分散于去离子水中，其中，镁元素、锌元素、锶元素物质的量的比为1～1000：1：1；

(2)按总质量分数10～50%，将可降解水凝胶基质加入到步骤（1）制备的溶液或分散液中，在温度为4℃～120℃的条件下充分搅拌，得到粘稠液体；

(3)将步骤（2）得到的粘稠液体在温度为25℃～90℃的条件下密封静置10分钟以上，得到用于肌肉修复的再生材料。

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