CN113597468A - 用于快速扩增的突变型Taq聚合酶 - Google Patents

用于快速扩增的突变型Taq聚合酶 Download PDF

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Abstract

本发明包括一种突变型Taq聚合酶，该突变型Taq聚合酶可以在时间被限制到少至一秒钟的延伸条件下显著地延伸和扩增靶序列。所述突变型Taq聚合酶或其生物活性片段具有表I所示的区别于野生型的一种或多种取代。

Description

用于快速扩增的突变型Taq聚合酶
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，在此通过引用将其全部内容并入本文。上述ASCII副本创建于2020年2月27日，名为Abclonal-Fast_SL.txt，大小为2,224,491字节。
背景技术
在用于DNA扩增的聚合酶链式反应(PCR)过程中，将靶标-引物-聚合酶-dNTP-缓冲液混合物在不同温度下连续加热循环反应，使靶标DNA链去退火(通常在约90-99℃下进行)，引物-靶标DNA链退火(通常在约40-70℃下进行)，以及DNA聚合酶介导的引物延伸(通常在约50-72℃下进行)，从而产生新的互补的扩增子链。反应过程可包括多达25-45个循环以产生足够的扩增。
PCR通常使用热稳定的DNA聚合酶进行，这些酶可以抵挡与去退火相关联的高温而不会因蛋白热变性而失活。
提高PCR速度可具有显著的商业优势，扩增的样品可以更快速地生成，冷热循环反应周期更少。现有的Taq聚合酶以有限的速率延伸引物。
因此，明显需要能够实现提高速度的PCR扩增的热稳定的DNA聚合酶。
发明内容
本发明包括具有与野生型相异的一个或多个点突变的突变型Taq聚合酶(SEQ IDNO：4显示带有C末端His标记的核苷酸野生型序列；SEQ ID NO：5显示野生型氨基酸序列)，具有如下表I所示的一个或多个氨基酸点取代(在以下位点的一个或多个位点处)：
Figure BDA0003259871080000011
Figure BDA0003259871080000021
Figure BDA0003259871080000031
Figure BDA0003259871080000041
Figure BDA0003259871080000051
Figure BDA0003259871080000061
Figure BDA0003259871080000071
本发明还包括具有以上显示的一个或多个氨基酸位点取代的突变型Taq聚合酶，其中Taq聚合酶序列的剩余部分与野生型Taq聚合酶具有至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少99％的同一性。
本发明还包括编码上述任何突变型Taq聚合酶的核酸序列，包括序列表中的相应序列，以及编码上述或序列表中列出的任何突变型Taq聚合酶的氨基酸序列的所有简并核酸序列；以及含有该核酸序列的载体和经该核酸序列转化并能表达上述突变型Taq聚合酶的细胞。
本发明还包括包含上述突变型Taq聚合酶的任何一种的组合物或试剂盒、编码它们的核酸序列或包含该核酸序列的载体。本发明还包括一种扩增目标核酸的方法，其中将上述突变型Taq聚合酶中的任何一种设计用于扩增目标核酸的反应混合物中，并使该反应混合物处于扩增目标核酸的条件中。
上述突变型Taq聚合酶比野生型能更快速地扩增靶标DNA序列，如以下实施例和附图中的结果所示。
附图说明
图1显示若干凝胶的合并图像，各图像代表使用突变型Taq聚合酶之一进行PCR反应后的结果。“WT”代表野生型(SEQ ID NO 4和5)。各突变以数字或数字加字母命名，对应于表格I所列的突变位点和序列之一。所有突变位点和相应序列列于下方，顺序显示于图1中。各凝胶电泳图显示了扩增含有序列SEQ ID NO:1的目标核酸后，进行凝胶电泳将扩增产物分离的结果。各凝胶显示两个泳道，因为对各突变体设置平行重复，然后将结果整合到图1的合并凝胶中。
A391F(SEQ ID NO 234-235)；E397K(SEQ ID NO 236-237)；E401K(SEQ ID NO238-239)；A407F(SEQ ID NO 240-241)；A414F(SEQ ID NO 242-243)；E507Q(SEQ ID NO270-271)；E507R(SEQ ID NO 272-273)；E507T(SEQ ID NO276-277)；E520V(SEQ ID NO282-283)；E537K(SEQ ID NO 292-293)；E537A(SEQ ID NO 286-287)；E537F(SEQ ID NO288-289)；E537I(SEQ ID NO290-291)；E537R(SEQ ID NO 302-303)；E537Y(SEQ ID NO304-305)；N565R(SEQ ID NO 308-309)；A570F(SEQ ID NO 312-313)；S575I(SEQ IDNO314-315)；S577I(SEQ ID NO 316-317)；D578R(SEQ ID NO 322-323)；D578F(SEQ ID NO318-319)；E337K(SEQ ID NO 198-199)；P338G(SEQ ID NO200-201)；Y339A(SEQ ID NO202-203)；D344R(SEQ ID NO 204-205)；E347K(SEQ ID NO 206-207)；A348F(SEQ ID NO208-209)；R349D(SEQ ID NO210-211)；L351S(SEQ ID NO 212-213)；L361S(SEQ ID NO214-215)；L365S(SEQ ID NO 216-217)；G366P(SEQ ID NO 218-219)；P368G(SEQ ID NO220-221)；M374S(SEQ ID NO 222-223)；L380S(SEQ ID NO 224-225)；D381R(SEQ IDNO226-227)；P382G(SEQ ID NO 228-229)；S383I(SEQ ID NO 230-231)；N384R(SEQ ID NO232-233)；E201K(SEQ ID NO 116-117)；E209K(SEQ ID NO118-119)；E230K(SEQ ID NO128-129)；E230A(SEQ ID NO 120-121)；E230C(SEQ ID NO 122-123)；E230F(SEQ ID NO124-125)；E230H(SEQ ID NO126-127)；E230N(SEQ ID NO 164-165)；E230P(SEQ ID NO166-167)；E315K(SEQ ID NO 182-183)；D320R(SEQ ID NO 184-185)；L322S(SEQ IDNO186-187)；A323F(SEQ ID NO 188-189)；R328D(SEQ ID NO 190-191)；G330P(SEQ ID NO192-193)；R334D(SEQ ID NO 194-195)；P336G(SEQ ID NO196-197)；D578R(SEQ ID NO322-323)；G32P(SEQ ID NO 402-403)；T34I(SEQ ID NO 408-409)；E39K(SEQ ID NO 26-27)；Q42R(SEQ ID NO 406-407)；E101K(SEQ ID NO 46-47)；V103S(SEQ ID NO 410-411)；Y116A(SEQ ID NO 412-413)；E117K(SEQ ID NO 48-49)；E130K(SEQ ID NO 50-51)；K131E(SEQ ID NO52-53)；E132K(SEQ ID NO 54-55)；D144R(SEQ ID NO 6-7)，E159K(SEQ IDNO56-57)；I163S(SEQ ID NO 404-405)；E189K(SEQ ID NO 62-63),E189T(SEQ ID NO 112-113)；E189W(SEQ ID NO 114-115)。
图2展示若干凝胶的合并图像，各图像代表使用突变型Taq聚合酶之一进行PCR的结果，其中靶标及反应条件与图1所示的相同，其中每个突变体按照图2中出现的顺序显示在图1中。“WT”代表野生型(SEQ ID NO 4和5)。
D732N(SEQ ID NO 16-17)；D732Y(SEQ ID NO 366-367)；E742K(SEQ ID NO 378-379)；E742D(SEQ ID NO 370-371)；E742H(SEQ ID NO 374-375)；E742N(SEQ ID NO 382-383)；E742P(SEQ ID NO 384-385)；E742T(SEQ ID NO386-387)；E742V(SEQ ID NO 388-389)；E742Y(SEQ ID NO 390-391)；E745K(SEQ ID NO 392-393)；R801D(SEQ ID NO 396-397)；K804E(SEQ ID NO398-399)；E805K(SEQ ID NO 400-401)；“1518”是V518A(SEQ ID NO280-281)；“1569”是T569A(SEQ ID NO 310-311)；D578R(SEQ ID NO 322-323)；D578H(SEQID NO 320-321)；D578V(SEQ ID NO 328-329)；I584S(SEQ ID NO330-331)；E626K(SEQ IDNO 332-333)；N627R(SEQ ID NO 334-335)；V631S(SEQ ID NO 336-337)；W645A(SEQ ID NO340-341)；T664I(SEQ ID NO342-343)；A675F(SEQ ID NO 344-345)；E694K(SEQ ID NO346-347)；Q698R(SEQ ID NO 348-349)；S699I(SEQ ID NO 350-351)；E708K(SEQ IDNO352-353)；D732A(SEQ ID NO 354-355)；D732K(SEQ ID NO 356-357)；D732M(SEQ ID NO358-359)。
图3显示若干凝胶的合并图像，各图像代表其中突变型Taq聚合酶之一进行PCR的结果，其靶标和条件与图1所示的相同，其中每个突变体在两个位点有突变，该突变体的序列如表I所示，其名称与图3所示的相同。“WT”代表野生型(SEQ ID NO 4和5)。
图4显示若干凝胶的合并图像，各图像代表其中使用突变型Taq聚合酶之一进行PCR的结果，其靶标和条件与图1所示的相同，其中一些突变体在一个位点处具有突变，而一些突变体在两个位点处具有突变，其他的突变体在三个位点处有突变，所有突变体的序列如表I所示，其名称与图4中所示的相同。“WT”代表野生型(SEQ ID NO 4和5)。
图5显示若干凝胶的合并图像，各图像代表使用扩增靶序列SEQ ID:1的突变型Taq聚合酶之一进行PCR的结果，靶标和条件与图1中所示的相同，其中一些突变体在两个位点处具有突变，而其他的突变体在三个位点处具有突变，所有突变体的序列如表I所示，其名称与在图5中所示的相同。“WT”代表野生型(SEQ ID NO 4和5)。
序列表总述
SEQ ID NO 4和5分别是组胺标记的野生型Taq聚合酶的氨基酸和核苷酸序列。上表I所列各突变体的氨基酸和DNA序列以与在表I中的相同顺序列于序列表中，，从表I中的第一个突变体序列开始，即D144R，SEQ ID NO 6和7(分别为其氨基酸和核苷酸序列)。每个突变型Taq聚合酶氨基酸序列(偶数，从SEQ ID NO 6开始到SEQ ID NO 412结束)后为其唯一的核苷酸编码序列(奇数，从SEQ ID NO 7开始到SEQ ID NO 413结束)。
具体实施方式
术语“生物活性片段”是指突变型Taq聚合酶的任何片段、衍生物、同源物或类似物，该突变型Taq聚合酶具有以该生物分子为特征的体内或体外活性。例如，突变型Taq聚合酶可以具有多种生物活性，包括DNA结合活性、核苷酸聚合活性、引物延伸活性、链置换活性、逆转录酶活性、切口引发的聚合酶活性、3'-5'外切酶(校对)活性、热稳定性、离子稳定性、精确性(accuracy)、持续合成能力等。突变型Taq聚合酶的“生物活性片段”是指任何能催化核苷酸(包括其同源物和类似物)聚合成核酸链的片段、衍生物、同源物或类似物。在某些实施方式中，突变型Taq聚合酶的生物活性片段、衍生物、同源物或类似物在关注的任何体内或体外试验中都具有突变型Taq聚合酶的生物活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或以上，所述试验例如是，诸如DNA结合试验、核苷酸聚合试验(可能依赖于模板或独立于模板)、引物延伸试验、链置换试验、逆转录酶试验、校对测定、精确性测定、热稳定性测定、离子稳定性测定等等。
聚合酶片段的生物活性可以通过以下任一种来测定：在特定反应条件下片段的体外引物延伸活性；特定反应条件下片段的体外聚合活性；特定的反应条件下片段的体外热稳定性；高离子强度条件下片段的体外稳定性；特定的反应条件下片段在体外的精确性；在特定反应条件下片段的体外持续合成能力；在特定反应条件下片段的体外链置换活性；特定反应条件下片段的体外读长(read-length)活性；特定反应条件下片段的体外链偏置活性；特定反应条件下片段的体外校对活性；特定反应条件下由聚合酶片段进行的体外测定的输出，如测序通量或平均读长；以及特定反应条件下体外核苷酸聚合反应的输出，如聚合酶片段的原始精确性，以便在核苷酸聚合反应中并入正确的核苷酸。
在某些实施方式中，生物活性片段可以包括突变型Taq聚合酶的DNA结合域的任何部分或催化域的任何部分。在某些实施方式中，生物活性片段可选择性地包括突变型Taq聚合酶的25、50、75、100、150或更多个连续氨基酸残基。修饰聚合酶的生物活性片段可以包括至少25个连续氨基酸残基，所述氨基酸残基与从SEQ ID NO 6到SEQ ID NO 412的任意一个或多个偶数序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。本发明还包括编码上述任何氨基酸序列的多核苷酸(即从SEQ ID NO：7到SEQ ID NO:413的奇数序列的编码部分，其中每个奇数多核苷酸序列编码在先的偶数突变型Taq聚合酶)。
生物活性片段可通过转录后加工或翻译或者剪接RNA的翻译产生，或者可以通过工程、大量合成、或其他合适的操作产生。生物活性片段包括在天然或内源性细胞中表达的片段，以及在细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等表达系统中产生的片段。
在这里，短语“保守性氨基酸取代”或“保守性突变”是指一种氨基酸被另一种具有共同性质的氨基酸所取代。从功能上定义单个氨基酸之间共同性质的方法是分析同源生物中相应蛋白质之间氨基酸变化的标准化频率(Schulz(1979)Principles of ProteinStructure，Springer-Verlag)。根据这样的分析，可以这样限定氨基酸群组，其中群组内的氨基酸优先相互替换，因此它们对整个蛋白质结构的影响彼此最相似(Schulz(1979)supra)。以这种方式定义的氨基酸群组的实例包括：“带电/极性群组”，包括Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His；“芳香族或环状群组”，包括Pro、Phe、Tyr和Trp；以及“脂肪族群组”，包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Ser、Thr和Cys。在每一个群组中，还可以确定子群组。例如，带电荷/极性氨基酸群组可以再分为亚群组：“正电荷亚群组”包括Lys、Arg和His；包括Glu和Asp的“负电荷亚群组”；以及包括Asn和Gln的“极性亚群组”。另外，芳香族或环状群组可以再分为亚群组，包括：“氮环亚群组”，包括Pro、His和Trp；和“苯基亚群组”，包括Phe和Tyr。在另一个实例中，脂肪族群组可再分为亚群组，包括：“大脂肪族非极性亚群组”，包括Val、Leu和Ile；“脂肪族微极性亚群组”，包括Met、Ser、Thr和Cys；以及包括Gly和Ala的“小残基亚群组”。保守性突变的实例包括在上述亚群组内的氨基酸的氨基酸取代，例如，但不限于：Lys替换Arg，或反之，这样可以保持正电荷；Glu替换Asp，或反之，这样可以保持负电荷；Ser替换Thr，或反之，这样可以保持游离-OH；Gln替换Asn，或反之，这样可以保持游离-NH2。“保守性变体”是包括取代替换了参考多肽上的一个或多个氨基酸的一个或多个氨基酸的多肽(例如，多肽的序列已在出版物或序列数据库中发表，或其序列已由核酸测序技术检出)，多肽具有具备共同性质的氨基酸，例如属于如上所述的相同氨基酸群体或亚群体。
当提及基因时，“突变体”是指相对于天然或野生型基因具有至少一个碱基(核苷酸)改变、缺失或插入的基因。突变(一个或多个核苷酸的改变、缺失和/或插入)可以发生在基因的编码区，也可以发生在内含子、3'UTR、5'UTR或启动子区。作为非限制性实例，突变基因可以是在启动子区域内具有插入物的基因，从而上调或下调基因的表达；可以是具有缺失的基因，导致产生非功能蛋白、截短蛋白、显性负蛋白或无蛋白；或者，可以是具有一个或多个点突变的基因，导致编码蛋白质的氨基酸发生变化，或者导致基因转录本的异常剪接。
“天然发生的”或“野生型”是指在自然中发现的形式。例如，天然发生或野生型多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，例如未经人工有意修饰的Taq聚合酶序列。
关于核酸或多肽序列的术语“百分比同一性”或“同源性”定义为在将序列调整以获得最大百分比同一性并如在必要时引入间隔以获得最大百分比同源性之后，在候选序列中的核酸或氨基酸残基与已知多肽的百分比同一性。N端或C端插入或缺失不应被解释为影响同源性。核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或同一性可通过BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)分析使用采用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx的算法来确定(Altschul(1997)，Nucleic Acids Res.25，3389-3402，和Karlin(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，2264-2268)，其定制用于序列相似度搜索。BLAST程序使用的方法是，首先考虑查询序列和数据库序列之间的具有和不具有间隔的相似片段，然后评估所有识别出的匹配项的统计显著性，最后只总结那些满足预期显著性阈值的匹配项。关于序列数据库相似度搜索的基本问题的讨论，见Altschul(1994)，《自然遗传学》第6期，119-129页。柱形图、描述、比对结果、期望值(即，用于报告针对数据库序列的匹配项的统计显著性阈值)、截断值、矩阵和过滤(低复杂度)等搜索参数可以是默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915-10919)，推荐用于长度超过85个单位(核苷酸碱基或氨基酸)的查询序列。
使用突变型Taq聚合酶
在一些实施方式中，本发明涉及用于进行核苷酸聚合反应的方法(及其相关试剂盒、系统、设备和组合物)，包括以下或者由以下组成：在一个或多个核苷酸存在的情况下，使突变型Taq聚合酶或其生物活性片段与核酸模板接触，并使用该修饰聚合酶或其生物活性片段聚合所述一个或多个核苷酸中的至少一个。相对于野生型，突变型Taq聚合酶或其生物活性片段包括表I中所述的一个或多个氨基酸修饰，且与野生型相比，突变型Taq聚合酶或其生物活性片段能更快速地扩增靶序列。
在某些实施方式中，所述方法还包括以依赖模板的方式使至少一个核苷酸聚合。在某些实施方式中，在热循环条件下进行所述聚合。在某些实施方式中，所述方法还包括在引物与核酸模板接触之前、期间或之后将它们进行杂交，其中所述聚合包括使用突变型Taq聚合酶或其生物活性片段将至少一个核苷酸聚合到引物的端部上。在一些实施方式中，所述聚合在能够检测聚合或其生物活性片段的传感器附近进行。在某些实方式中，该方法还可包括使用传感器检测指示经修饰的聚合酶或其生物活性片段发生聚合反应的信号。在某些实施方式中，传感器是离子敏场效应晶体管(ISFET)。在某些实施方式中，传感器可包括在聚合反应中的可检测标签或可检测试剂。
在某些实施方式中，所述方法还包括确定被经修饰的聚合酶聚合的一个或多个核苷酸的同一性。在某些实施方式中，所述方法还包括确定被经修饰的聚合酶聚合的核苷酸的数目。
在一些实施方式中，本发明涉及用于检测核苷酸掺入的方法(以及相关的试剂盒、系统、装置和组合物)，包括以下或者由以下组成：使用突变型Taq聚合酶或其生物活性片段、核酸模板和一个或多个核苷酸三磷酸酯进行核苷酸掺入；生成核苷酸掺入；以及检测所述核苷酸掺入。检测核苷酸掺入可以通过适当的方法进行，如PAGE、荧光、dPCR定量、核苷酸副产物生成(如氢离子或焦磷酸检测；适合的核苷酸副产物检测系统，包括但不限于下一代测序平台，如Rain Dance、Roche 454和Ion Torrent Systems))或核苷酸延伸产物检测(如延伸产物的光学检测或标记的核苷酸延伸产物的检测)。在某些实施方式中，用于检测核苷酸掺入的方法(以及相关的试剂盒、系统、装置和组合物)包括以下或由以下组成：通过使用突变型Taq聚合酶或其生物活性片段检测核苷酸掺入。
在一些实施方式中，本发明涉及用于扩增核酸的方法(以及相关的试剂盒、系统、装置和组合物)，该方法通过在适当的条件下使突变型Taq聚合酶或其生物活性片段接触并扩增核酸；采用聚合酶链反应、乳液聚合酶链反应、等温扩增反应、重组酶链扩增反应、近接扩增、滚环扩增或链置换扩增等方法扩增核酸。扩增包括在溶液中克隆扩增核酸，以及在固体载体上克隆扩增核酸，例如核酸珠、流细胞、核酸阵列或存在于固体载体表面的孔。
在一些实施方式中，用于扩增核酸的方法包括在桥式PCR条件下扩增核酸。桥式PCR条件包括将一个或多个扩增的核酸杂交到固体载体上。杂交的一个或多个扩增核酸可作为进一步扩增的模板。
在某些实施方式中，本发明一般涉及用于通过使用突变型Taq聚合酶或其生物活性片段将至少一个核苷酸结合到引物端部上来合成核酸的方法(以及相关的试剂盒、系统、装置和组合物)。任选地，该方法还包括检测至少一个核苷酸在引物端部上的结合。一些实施方式中，该方法还包括确定结合到引物端部上的至少一个核酸的同一性。在一些实施方式中，该方法可包括确定结合到引物端部上的所有核苷酸的同一性。在一些实施方式中，该方法包括以依赖模板的方式合成核酸。在某些实施方式中，该方法可包括在溶液中、在固体载体上或在乳液(如emPCR)中合成核酸。
制备突变型Taq聚合酶
在某些实施方式中，为了提供能进行快速聚合反应的突变型Taq聚合酶，可在一个或多个氨基酸、2个或多个氨基酸、3个或多个氨基酸或更多个氨基酸上发生氨基酸取代，包括野生型序列的氨基酸总数的多达30％被取代。突变型Taq聚合酶的一些实施方式可与野生型具有70％至99.99％的同一性。突变型Taq聚合酶的所有实施方式包括表I中所示的取代中的一个或多个，还包括对野生型序列其余部分的取代、插入或修饰。在一些实施方式中，为了提供可进行快速聚合反应的突变型Taq聚合酶，可包括表1所示的取代中的数个取代。这些额外的取代不仅限于表1中所示的组合。表1中的组合以及其他组合，可与表1中的其他取代或突变型Taq聚合酶一起使用(突变型Taq酶包括对野生型序列的取代、插入或修饰)。
本发明的突变型Taq聚合酶可在任何合适的宿主系统中表达，所述宿主系统包括细菌、酵母、真菌、杆状病毒、植物或哺乳动物的宿主细胞。对于细菌宿主细胞，用于引导本公开的核酸结构转录的合适启动子包括从以下获得：大肠杆菌乳糖操纵子，天蓝链霉菌琼脂糖基因(dagA)，枯草芽孢杆菌左旋蔗糖酶基因(sacB)，地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)，硬脂芽孢杆菌嗜热性麦芽淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢杆菌xylA和枯草芽孢杆菌xylB和原核-β内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl Acad.Sci.USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl Acad.Sci.USA 80:21-25)。
对于丝状真菌宿主细胞，用于引导本公开的核酸结构转录的合适启动子包括从用于以下的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶，米黑根毛霉天门冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)，米黑根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉三糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰酰胺酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)以及NA2-tpi启动子(来自用于黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉三糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂交)及其突变、截短和杂交启动子。
在酵母宿主中，适用的启动子可来自用于酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油激酶的基因。其他对酵母宿主细胞适用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8:423-488阐述。
对于杆状病毒表达，以衍生自鳞翅目(蛾类和蝴蝶)、如草地贪夜蛾的昆虫细胞系为宿主。基因表达受强启动子(如pPolh)的调控。
植物表达载体基于农杆菌的Ti质粒或基于烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯X病毒或豇豆花叶病毒。植物表达载体中常用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。
对于哺乳动物表达，可使用培养的哺乳动物细胞系如中国仓鼠卵巢(CHO)、COS，包括人类细胞系如HEK和HeLa，生产突变型Taq聚合酶。哺乳动物表达载体的实例包括腺病毒载体、pSV和pCMV系列质粒载体、牛痘和逆转录病毒载体以及杆状病毒。用于巨细胞病毒(CMV)和SV40的启动子在哺乳动物表达载体中常用来驱动基因表达。非病毒启动子，如延伸因子(EF)-1启动子也是众所周知的。
用于表达的对照序列也是适宜的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列可有效连接到编码多肽的核酸序列的3'端。可以使用任何在所选宿主细胞中发挥作用的终止子。
例如，可以从用于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、黑曲霉邻氨基苯甲酸酯合成酶、黑曲霉-α葡萄糖苷酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子。
可以从用于酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因中获得酵母菌宿主细胞的示例性终止子。
用于昆虫、植物和哺乳动物宿主细胞的终止子也是众所周知的。
对照序列也可能是合适的前导序列，为mRNA的非翻译区域，对宿主细胞的翻译有重要意义。前导序列可有效地连接到编码多肽的核酸序列的5'端。可以使用任何在所选宿主细胞中发挥作用的前导序列。丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列可从用于米曲霉TAKA淀粉酶和黑曲霉三糖磷酸异构酶的基因中获得。适合酵母宿主细胞的前导序列可从用于酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因中获得。
对照序列也可以是聚腺苷酸化序列，该序列可以有效地连接到核酸序列的3'端，并且当被转录时，宿主细胞将其识别为信号，以将多腺苷残基添加到转录后的mRNA上。本发明中可以使用在所选宿主细胞中能发挥功能的任何聚腺苷酸化序列。丝状真菌宿主细胞的示例性聚腺苷化序列可来自用于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、黑曲霉邻氨基苯甲酸酯合成酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。
对照序列也可以是信号肽编码区，其可编码与多肽的‘氨基末端相连的氨基酸序列，并将编码的多肽导入细胞分泌途径。核酸序列的编码序列的5'端可能固有包含信号肽编码区，该信号肽编码区在翻译阅读框中与编码分泌的多肽的编码区天然地连接在一起。或者，编码序列的5'端可以包含与编码序列异源的信号肽编码区。当编码序列不天然地包含信号肽编码区时，可能需要外源信号肽编码区。
另一种情况是，外源信号肽编码区可能只是替代自然信号肽编码区以提高多肽分泌。但是，可以使用将表达的多肽导入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码区域可从用于芽孢杆菌NCIB 11837麦芽糖淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶，地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶，地衣芽孢杆菌β内酰胺酶，硬脂芽孢杆菌嗜热中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得。关于信号肽进一步信息由Simonen和Palva，1993，Microbiol Rev 57:109-137阐述。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区可以是从用于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、柔毛腐质霉脂肪酶的基因获得的信号肽编码区。
酵母宿主细胞的有效信号肽可以来自用于酿酒酵母菌α因子和酿酒酵母转化酶的基因。其它宿主细胞系统的信号肽也是众所周知的。
对照序列也可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。合成的多肽称为前酶或前多肽(在某些情况下称为酶原)。前多肽通常是无活性的，可以通过催化或自催化将前多肽裂解转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可从用于枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉乳糖酶(WO 95/33836)的基因获得。
当多肽的氨基末端同时存在信号肽和前肽区时，前肽区紧邻多肽的氨基末端，信号肽紧邻前肽区的氨基末端。
还希望添加调控序列，其允许相对于宿主细胞的生长调控突变型Taq聚合酶的表达。调控系统的实例是可导致基因表达开放或关闭以对化学或物理刺激作出反应的那些调控系统，包括调控化合物的存在。在原核宿主细胞中，合适的调控序列包括lac、tac和trp操作系统。在酵母宿主细胞中，合适的调控系统包括例如ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，合适的调控序列包括TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子。其他宿主细胞的调控系统也是众所周知的。
调控序列的其他实例还可以是促使基因扩增的那些序列。在真核生物系统中，这些序列包括：二氢叶酸还原酶基因，其在甲氨蝶呤存在时扩增；以及金属硫蛋白基因，其在重金属存在时扩增。在这种情况下，本发明中编码KRED多肽的核酸序列将与调控序列有效连接在一起。
另一个实施方式包括包含编码工程化突变型Taq聚合酶或其变体的多核苷酸的重组表达载体，以及一个或多个表达调控区域(如启动子和终止子)，以及复制起点，取决于它们将被引入其中的宿主类型)。上述各种核酸和对照序列可以连接在一起产生重组表达载体，该表达载体可以包括一个或多个合适的限制性位点，以便在这些位点插入或取代编码突变型Taq聚合酶的核酸序列。另外，突变型Taq聚合酶的核酸序列可以通过以下表达：将核酸序列或包含这些序列的核酸结构插入合适的载体中以用于表达。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，以便将所述编码序列与用于表达的合适的对照序列有效连接。
重组表达载体可以是任何载体(如质粒或病毒)，其可便利地用于重组DNA程序，并能帮助表达突变型Taq聚合酶的多核苷酸序列。载体的选择通常取决于载体与要引入载体的宿主细胞的兼容性。载体可以是线性质粒，也可以是闭环质粒。
作为染色体外实体存在的表达载体可以自主复制，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外因素、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何保证自我复制的方法。另一种情况是，当被引入宿主细胞中时，载体可以整合到基因组中，并与已整合到其中的染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒，或两个或多个载体或质粒，它们一起包含将被引入宿主细胞基因组中的总DNA，或转座子。
在此，表达载体优选包含一个或多个可选择标记，可便于选择转化的细胞。可选择标记是其产物可提供生物杀灭剂或对病毒的抗性，对重金属的抗性，以及原营养型对营养缺乏型的抗性等的基因。细菌可选择标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或产生抗生素抗性，如对氨苄西林、卡那霉素、氯霉素(实施例1)或四环素的抗性的标记。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记包括以下但不限于：amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)，bar(草丁膦乙酰转移酶)，hph(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸还原酶)，pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)，sC(硫酸盐腺嘌呤转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸盐合成酶)及其类似物。用于曲霉细胞中的实例包括构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因及吸水链霉菌的bar基因。昆虫、植物和哺乳动物细胞的可选择标记也是众所周知的。
本发明的表达载体优选包含允许载体整合到宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。为了整合到宿主细胞基因组中，载体依赖于编码该多肽的核酸序列或载体的任何其他元素，通过同源或非同源重组方式整合到基因组中。
另一种情况是，表达载体可包含用于引导通过同源重组整合到宿主细胞基因组的额外核酸序列。额外核酸序列使载体能在染色体的精确位点处整合到宿主细胞基因组中。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件还可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组。
对于自主复制，载体还包括使载体能够在关注的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例有P15A ori，或质粒pBR322，pUC19，pACYC177(该质粒具有P15Aori)，或能在大肠杆菌中复制的pACYC184，以及能在芽孢杆菌中复制的pUB110，pE194，pTA1060，或pAM31。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例有2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，ARS4和CEN6的组合。复制起点可具有突变，使其能够在宿主细胞中对温度敏感(参见，例如，Ehrlich，1978，Proc Natl Acad Sci USA 75:1433)。
突变型Taq聚合酶的核酸序列的多于一个拷贝可被插入宿主细胞，以增加基因产物的产量。增加核酸序列的拷贝数可以通过将至少一段额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中，或者通过包含可扩增的可选择标记基因与核酸序列，其中细胞包含可选择标记基因的扩增拷贝，由此通过在适当的可选择试剂的存在下培养细胞，来选择核酸序列的额外拷贝。
突变型Taq聚合酶多聚核苷酸的表达载体可商购获得。合适的商业表达载体包括Sigma-Aldrich Chemicals,St.Louis Mo.的p3xFLAGTM表达载体，其中包括用于在哺乳动物宿主细胞表达的CMV启动子和hGH聚腺苷酸化位点，还包括用于在大肠杆菌中扩增的pBR322复制起点和氨比西林抗性标记。其他合适的表达载体有pBluescriptII SK(-)和pBK-CMV，其可商购于Stratagene,LaJolla Calif.，以及来源于pBR322(Gibco BRL)、pUC(GibcoBRL)、pREP4、pCEP4(Invitrogen)或pPoly(lalajolla等，1987，Gene 57:19-201)的质粒。
本发明的用于编码突变型Taq聚合酶多肽的多核苷酸的表达的宿主细胞是本领域众所周知的并且包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、克非尔乳杆菌、短乳杆菌、小乳杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或毕赤酵母(ATCC登记号201178))；昆虫细胞，比如果蝇S2和鳞翅目Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS、BHK、293和Bowes黑色素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞适宜的培养基和生长条件在生物学领域也是众所周知的。
表达突变型Taq聚合酶多肽的多核苷酸可以通过本领域已知的各种方法导入细胞中。技术包括电穿孔，生物粒子轰击，脂质体介导转染，氯化钙转染，和原生质体融合。本领域技术人员可通过多种方式将多核苷酸导入细胞中。
根据已知的合成方法，编码突变型Taq聚合酶的多核苷酸可以用标准固相法制备。在某些实施方式中，多达100个碱基的片段可单独合成，然后进行连接(例如，通过酶或化学连接方法，或聚合酶介导的方法)以形成任何所需的连续序列。例如，多核苷酸可以通过化学合成制备，如Beaucage等，1981，Tet Lett22:1859-69所述的经典亚磷酰胺方法，或Matthes等，1984，EMBO J.3:81-05所述的方法，例如，其典型地以自动合成方法来实践。根据亚磷酰胺方法，可在自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，并在适当的载体上进行纯化、退火、连接和克隆。此外，基本上任何核酸都可以从各种商业来源获得，如The MidlandCertified Reagent Company,Midland,Tex.,The Great American Gene Company,Ramona,Calif.,ExpressGen Inc.Chicago,Ill.,以及Operon Technologies Inc.,Alameda,Calif。
宿主细胞中表达的工程化突变型Taq聚合酶可以使用任何一种或多种已知的蛋白纯化技术从细胞和/或培养基中回收，其中所述技术包括溶菌酶处理、超声、过滤、盐析、超离心和层析。适用于从大肠杆菌等细菌中裂解和高效提取蛋白质的溶液可从来自St.LouisMo.的Sigma-Aldrich的商标名CelLytic B.TM商购获得。
分离突变型Taq聚合酶多肽的色谱技术包括反相色谱、高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和亲和层析等。纯化条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等因素，并且对本领域技术人员显而易见。
在一些实施方式中，可使用亲和技术分离突变型Taq聚合酶。对于亲和层析纯化技术，可以使用任何特定结合于突变型Taq聚合酶多肽的抗体。为了产生抗体，各种宿主动物包括但不限于兔子、小鼠、大鼠等都可以通过注射化合物进行免疫。该化合物可以通过侧链官能基团或连接到侧链官能基团的连接器连接到合适的载体上，如BSA。根据宿主动物物种，各种免疫佐剂可以用来增强免疫应答反应，包括但不限于弗氏佐剂(Freund’s)(完全佐剂和不完全佐剂)，氢氧化铝等无机佐剂，表面活性物质，如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳化佐剂、钥孔虫戚血兰素、二硝基酚和潜在适用的生物性佐剂如BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌。
实施例
PCR中使用野生型和突变型taq聚合酶来扩增具有SEQ ID NO：1的序列的示例靶核酸:
CAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGA；使用具有SEQ ID NO：2的正向引物:CAGTGCTGCAATGATACC，以及具有SEQ ID NO：3的反向引物：TCCTTGAGAGTTTTCGCC。使用每个突变型Taq聚合酶进行PCR，以野生型为对照，一次一个，使用Bio-Rad T100热循环仪在以下条件下进行：95℃ 3分钟，在95℃下1秒进行25个循环，60℃ 1秒。最终扩增子在23℃保存。其余PCR条件和试剂浓度如下:
4μl突变型(或野生型)Taq聚合酶混合液，其中Taq聚合酶起始浓度为50ng/μl；
1X PCR缓冲液(配方如下)，2μl；
正向引物，SEQ ID NO:2(100uM)0.1μl；
反向引物，SEQ ID NO:3(100uM)0.1μl；
dNTP(10mM)0.8μl；以及
pUC19(1ng/μl)1μl。
通过加入蒸馏水使反应混合物总体积为20μl。
对SEQ ID NO:1进行PCR扩增后，对反应混合物中的扩增子进行凝胶电泳来分离，条件如下：1.2％琼脂糖凝胶(Agarose LE，Goldbio.com，cat:A-2Q1-1000)；1x缓冲液包括:20mM Triton-HCl、80mM Tris-Acetate、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、3mM Mg-醋酸盐、0.1％
Figure BDA0003259871080000221
pH 8.8@25℃(Research Products International，cat:T22020-10.0)；凝胶尺寸12x14 cm；在200V下电泳20分钟。
实施例I
电泳结果如图1-5所示，其中包括表I中列出的多个突变型Taq聚合酶的各自凝胶电泳图像。
在本申请实施的实验的测试结果中(如图1-5所示)，测试中使用的每个突变体只经历1秒钟的延伸时间(在去退火之后)。图1-5中的突变体能够将SEQ ID:1寡核苷酸延长超过600bp，延长时间仅持续1秒钟。在相同条件下，野生型Taq聚合酶没有显示明显的延伸。
本申请实施的实验表明，即使在极短的延伸时间内，上述和表I所列突变型Taq聚合酶也能进行有效延伸。
本文所述的具体方法和组合物代表优选实施方案，并且是示例性的，并不意在限制本发明的范围。在考虑了本说明书之后，本领域技术人员将想到其他目的，方面和实施例，并且将其包含在由权利要求书的范围所限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文说明性地描述的本发明可以在不存在任何要素或限制的情况下适当地实践，这在本文中没有具体公开为必要的。因此，例如，在本文的每个实例中，在本发明的实施方式或实施例中，术语“包括”，“包含”，“包含”等中的任何一个都应被广泛且不受限制地阅读。可以以不同的步骤顺序来实践本文中所描述的步骤，并且它们不一定限于本文或权利要求中所指示的步骤的顺序。除非上下文另外明确指出，“一个(a/an)”和“该(the)”包括复数形式，并且复数形式包括单数形式。在任何情况下，专利商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员所作的任何陈述都不能解释为对专利的限制，除非这种陈述是明确的，且无条件或保留地由申请人在回应性写作中明确采用。
在此已经广泛地和概括地描述了本发明。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚类分组也构成本发明的一部分。已经采用的术语和表达被用作描述性的术语，而不是限制性的，并且不意图使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是可以理解，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变型，并且可以将这种修改和变型视为在由所附权利要求书限定的本发明的范围内。

Claims (16)

1.突变型Taq聚合酶，其包含在以下位点处对野生型序列的一种或多种突变：
D144R(SEQ ID NO 6-7)、D578S(SEQ ID NO 8-9)、
D732C(SEQ ID NO 10-11)、D732G(SEQ ID NO 12-13)、D732H(SEQ ID NO 14-15)、D732N(SEQ ID NO 16-17)、D732P(SEQ ID NO 18-19)、D732Q(SEQ ID NO 20-21)、D732S(SEQ ID NO 22-23)、D732T(SEQ ID NO 24-25)、
E39K(SEQ ID NO 26-27)、
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S577I(SEQ ID NO 316-317)、
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D578V(SEQ ID NO 328-329)、
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E626K(SEQ ID NO 332-333)、
N627R(SEQ ID NO 334-335)、
V631S(SEQ ID NO 336-337)、
H639E(SEQ ID NO 338-339)、
W645A(SEQ ID NO 340-341)、
T664I(SEQ ID NO 342-343)、
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E694K(SEQ ID NO 346-347)、
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S699I(SEQ ID NO 350-351)、
E708K(SEQ ID NO 352-353)、
D732A(SEQ ID NO 354-355)、D732K(SEQ ID NO 356-357)、D732M(SEQ ID NO 358-359)、D732R(SEQ ID NO 360-361)、
D732R/E742K(SEQ ID NO 362-363)、D732V(SEQ ID NO 364-365)、D732Y(SEQ ID NO366-367)、
E742A(SEQ ID NO 368-369)、E742D(SEQ ID NO 370-371)、E742F(SEQ ID NO 372-373)、E742H(SEQ ID NO 374-375)、E742I(SEQ ID NO 376-377)、E742K(SEQ ID NO 378-379)、E742M(SEQ ID NO 380-381)、E742N(SEQ ID NO 382-383)、E742P(SEQ ID NO 384-385)、E742T(SEQ ID NO 386-387)、E742V(SEQ ID NO 388-389)、E742Y(SEQ ID NO 390-391)、
E745K(SEQ ID NO 392-393)、
M751S(SEQ ID NO 394-395)、
R801D(SEQ ID NO 396-397)、
K804E(SEQ ID NO 398-399)、
E805K(SEQ ID NO 400-401)、
G32P(SEQ ID NO 402-403)、
I163S(SEQ ID NO 404-405)、
Q42R(SEQ ID NO 406-407)、
T34I(SEQ ID NO 408-409)、
V103S(SEQ ID NO 410-411)，以及
Y116A(SEQ ID NO 412-413)。
2.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其仅具有所列的突变之一。
3.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其具有所列的两种或多种突变。
4.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其中所述突变型聚合酶的剩余部分与野生型Taq聚合酶具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％，或至少99％的同一性。
5.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其是以下之一：A391F(SEQ ID NO 234-235)；E397K(SEQ ID NO 236-237)；E401K(SEQ ID NO 238-239)；A407F(SEQ ID NO 240-241)；A414F(SEQ ID NO 242-243)；E507Q(SEQ ID NO 270-271)；E507R(SEQ ID NO 272-273)；E507T(SEQ ID NO 276-277)；E520V(SEQ ID NO 282-283)；E537K(SEQ ID NO 292-293)；E537A(SEQ ID NO 286-287)；E537F(SEQ ID NO 288-289)；E537I(SEQ ID NO 290-291)；E537R(SEQ ID NO 302-303)；E537Y(SEQ ID NO 304-305)；N565R(SEQ ID NO 308-309)；A570F(SEQ ID NO 312-313)；S575I(SEQ ID NO 314-315)；S577I(SEQ ID NO 316-317)；D578R(SEQ ID NO 322-323)；D578F(SEQ ID NO 318-319)；E337K(SEQ ID NO 198-199)；P338G(SEQ ID NO 200-201)；Y339A(SEQ ID NO 202-203)；D344R(SEQ ID NO 204-205)；E347K(SEQ ID NO 206-207)；A348F(SEQ ID NO 208-209)；R349D(SEQ ID NO 210-211)；L351S(SEQ ID NO 212-213)；L361S(SEQ ID NO 214-215)；L365S(SEQ ID NO 216-217)；G366P(SEQ ID NO 218-219)；P368G(SEQ ID NO 220-221)；M374S(SEQ ID NO 222-223)；L380S(SEQ ID NO 224-225)；D381R(SEQ ID NO 226-227)；P382G(SEQ ID NO 228-229)；S383I(SEQ ID NO 230-231)；N384R(SEQ ID NO 232-233)；E201K(SEQ ID NO 116-117)；E209K(SEQ ID NO 118-119)；E230K(SEQ ID NO 128-129)；E230A(SEQ ID NO 120-121)；E230C(SEQ ID NO 122-123)；E230F(SEQ ID NO 124-125)；E230H(SEQ ID NO 126-127)；E230N(SEQ ID NO 164-165)；E230P(SEQ ID NO 166-167)；E315K(SEQ ID NO 182-183)；D320R(SEQ ID NO 184-185)；L322S(SEQ ID NO 186-187)；A323F(SEQ ID NO 188-189)；R328D(SEQ ID NO 190-191)；G330P(SEQ ID NO 192-193)；R334D(SEQ ID NO 194-195)；P336G(SEQ ID NO 196-197)；D578R(SEQ ID NO 322-323)；G32P(SEQ ID NO 402-403)；T34I(SEQ ID NO 408-409)；E39K(SEQ ID NO 26-27)；Q42R(SEQ ID NO 406-407)；E101K(SEQ ID NO 46-47)；V103S(SEQ ID NO 410-411)；Y116A(SEQ ID NO 412-413)；E117K(SEQ ID NO 48-49)；E130K(SEQ ID NO 50-51)；K131E(SEQ ID NO 52-53)；E132K(SEQ ID NO 54-55)；D144R(SEQ ID NO 6-7)，E159K(SEQ ID NO 56-57)；I163S(SEQ ID NO404-405)；E189K(SEQ ID NO 62-63)，E189T(SEQ ID NO 112-113)；以及E189W(SEQ ID NO114-115)。
6.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其为以下之一：D732N(SEQ ID NO 16-17)；D732Y(SEQ ID NO 366-367)；E742K(SEQ ID NO 378-379)；E742D(SEQ ID NO 370-371)；E742H(SEQ ID NO 374-375)；E742N(SEQ ID NO 382-383)；E742P(SEQ ID NO 384-385)；E742T(SEQ ID NO 386-387)；E742V(SEQ ID NO 388-389)；E742Y(SEQ ID NO 390-391)；E745K(SEQ ID NO 392-393)；R801D(SEQ ID NO 396-397)；K804E(SEQ ID NO 398-399)；E805K(SEQ ID NO 400-401)；“1518”是V518A(SEQ ID NO 280-281)；“1569”是T569A(SEQID NO 310-311)；D578R(SEQ ID NO 322-323)；D578H(SEQ ID NO 320-321)；D578V(SEQ IDNO 328-329)；I584S(SEQ ID NO 330-331)；E626K(SEQ ID NO 332-333)；N627R(SEQ ID NO334-335)；V631S(SEQ ID NO 336-337)；W645A(SEQ ID NO 340-341)；T664I(SEQ ID NO342-343)；A675F(SEQ ID NO 344-345)；E694K(SEQ ID NO 346-347)；Q698R(SEQ ID NO348-349)；S699I(SEQ ID NO 350-351)；E708K(SEQ ID NO 352-353)；D732A(SEQ ID NO354-355)；D732K(SEQ ID NO 356-357)；以及D732M(SEQ ID NO 358-359)。
7.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶的生物活性片段。
8.载体，其整合有权利要求1的DNA序列之一。
9.载体，其整合有权利要求5的DNA序列之一。
10.载体，其整合有权利要求6的DNA序列之一。
11.细胞，其被权利要求1的DNA序列转化并表达权利要求1的DNA序列。
12.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其中所述突变型Taq聚合酶能够显著延伸引物，其中延伸条件为约1秒钟。
13.根据权利要求1所述的突变型Taq聚合酶，其中延伸温度为60℃，并且引物在约1秒钟内至少延伸600bp。
14.执行PCR的方法，其中延伸条件限制在短时间段内，所述方法包括：
向包含靶序列和靶序列引物的PCR混合物中添加权利要求1所述的突变型Taq聚合酶；以及
通过温度循环使所述靶序列扩增，以使所述引物退火到所述靶序列，并且其中所述引物的延伸条件是时间限制的，然后使延伸的引物去退火。
15.根据权利要求14所述的方法，其中延伸时间为约1秒钟。
16.根据权利要求15所述的方法，其中延伸温度为60℃，并且所述引物至少延伸600bp。
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