CN113597428A

CN113597428A - 重组流感抗原

Info

Publication number: CN113597428A
Application number: CN202080019855.2A
Authority: CN
Inventors: B·勃兰登堡; T·里切尔; F·J·麦尔德; M·A·C·容格尼伦; I·金; Y·宋; J·P·M·朗格戴克
Original assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2021-11-02
Also published as: JP2022530439A; EA202192921A1; BR112021020907A2; KR20220005002A; CA3137448A1; MX2021012991A; WO2020216844A1; US20220204567A1; AU2020263900A1; EP3959228A1

Abstract

本发明提供了重组的甲型流感血凝素(HA)多肽，这些多肽包含甲型流感病毒HA的HA1和HA2结构域，并且包含如下这样的氨基酸序列，其中：(a)位置355处的氨基酸是W；并且(b)位置432处的氨基酸是I和/或位置380处的氨基酸是I；并且其中该HA多肽的氨基酸序列中氨基酸位置的编号是根据HA的氨基酸序列中氨基酸的编号，该HA源自H3N2流感参照株，特别是H3N2A/爱知/2/68参照株(SEQ ID NO:1)；并且提供了其免疫原性片段、编码所述多肽或免疫原性片段的核酸分子、以及其用途。

Description

重组流感抗原

本发明(至少部分)是根据由HHS授予的合同号HHSO100201700018C在政府支持下进行的。政府享有本发明的某些权利。

引言

本发明涉及医学领域。本文提供了重组的甲型流感血凝素(HA)多肽、编码所述多肽的核酸、包含所述多肽的药物组合物、及其使用方法。

背景技术

流感病毒是主要的人病原体，引起呼吸系统疾病(通常称为“流行性感冒”或“流感”)，其严重性范围为从亚临床感染至可导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床效应随流感株系的毒力以及宿主的暴露、病史、年龄和免疫状态而变。据估计每年世界范围内有约10亿人经历流感病毒感染，导致3百万至5百万例严重疾病，并且估计有300,000至500,000例流感相关死亡。这些感染大多数可以归因于携带H1或H3血凝素亚型的甲型流感病毒，较小贡献来自乙型流感病毒，因此在季节性疫苗中包括所有三种的代表。当前的免疫实践依赖于流行的流感病毒的早期鉴定以允许及时生产有效的季节性流感疫苗。除了在预测将在下一季节期间占主导的株系方面的固有困难以外，抗病毒抗性和免疫逃逸还在当前疫苗预防发病和死亡的失效中起作用。除此以外，由源自动物宿主并重配以增加人-人传播的高毒力病毒株系引起大范围流行病的可能性也对全球健康造成严重且现实的威胁。

甲型流感病毒在自然界中分布广泛，并且可以感染多种鸟类和哺乳动物。流感病毒是属于正粘病毒科的包膜RNA病毒。其基因组由八个单链RNA区段组成，这些单链RNA区段编码11种不同的蛋白质：一种核蛋白(NP)、三种聚合酶蛋白(PA、PB1和PB2)、两种基质蛋白(M1和M2)、三种非结构蛋白(NS1、NS2和PB1-F2)以及两种外部糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。这些病毒是基于HA和NA蛋白的抗原结构的差异来分类的，其不同组合代表独特的病毒亚型，这些病毒亚型进一步分类为特定流感病毒株系。虽然所有已知亚型都可以在鸟类中发现，但是当前流行的人甲型流感亚型是H1N1和H3N2。系统发育分析表明，血凝素细分为两个主要组别：尤其H1、H2、H5和H9亚型在系统发育组1中，并且尤其H3、H4和H7亚型在系统发育组2中。

乙型流感病毒株系严格地是人株系。乙型流感病毒株系内HA中的抗原变异小于在甲型株系内观察到的那些。乙型流感病毒的两种遗传性和抗原性不同的谱系在人体中流行，以B/山形/16/88(还称作B/山形)和B/维多利亚/2/87(B/维多利亚)谱系为代表。虽然由乙型流感病毒引起的疾病谱通常轻于由甲型流感病毒引起的疾病谱，但是对于乙型流感病毒感染仍经常观察到需要住院的严重疾病。

已知中和流感病毒的抗体主要针对血凝素(HA)。血凝素是一种锚定在病毒外壳中并且具有双重功能的三聚体糖蛋白：它负责与细胞表面受体唾液酸结合，并且在吸收后，它介导病毒膜和内体膜的融合，从而导致病毒RNA释放到细胞的细胞溶质中。HA包括号称的头部结构域和茎部结构域。对病毒膜的附接是由连接至茎部结构域的C-末端锚定序列(还称作跨膜结构域)介导的。蛋白在指定环中经翻译后裂解，产生两个多肽：HA1和HA2(完整序列称为HA0)。膜远端头部结构域主要源自HA1，而膜近端茎部结构域主要源自HA2(图1)。

由于流感病毒普遍存在，避免被病毒感染几乎是不可能的。接种疫苗在控制流感蔓延和大规模流行方面发挥至关重要的作用。许多流感疫苗的制造方法均涉及在鸡蛋中进行病毒重配、适应和生长。然而，这些现有方法存在局限。并非所有流感病毒株系在蛋中生长良好并且必须进行适应性调整或构建病毒重配体。HA在生产期间发生的改变可能导致株系不同于流行株系并且可提供次最优水平的保护。另一弊端是那些蛋过敏人群可能会对蛋基疫苗中残留的卵蛋白表现出超敏反应。此外，蛋基方法依赖于不间断的蛋供应，其可能易受供应中断(如万一发生禽类疾病)的影响。需要使用不依赖于蛋供应的方法生产疫苗，并且其中疫苗蛋白的生产比在蛋基方法中受到更严格的控制。将细胞培养物中产生的HA重组形式(rHA)用作流感疫苗的抗原来源，来替代源自蛋类的流感疫苗抗原。然而，在使用这些方法时，遇到过以下难题：保持rHA的免疫原性、维持其常规四级结构、以及确保三聚体rHA的高产率。因此，仍然需要用于流感疫苗或用于诊断的替代性抗原供应方法，以解决现有挑战。

发明内容

本发明的一些方面总结如下。另外的方面描述于本专利申请的具体实施方式、实例、附图、以及权利要求部分。

在第一方面，本发明涉及重组的甲型流感血凝素(HA)多肽，这些多肽包含甲型流感病毒HA的HA1结构域和HA2结构域，并且包含如下这样的氨基酸序列，其中：

(a)位置355处的氨基酸是色氨酸(W)；并且

(b)位置432处的氨基酸是异亮氨酸(I)和/或位置380处的氨基酸是I；

并且其中该HA多肽的氨基酸序列中氨基酸位置的编号是根据HA的氨基酸序列中氨基酸的编号，该HA源自H3N2流感参照株，特别是H3N2 A/爱知(Aichi)/2/68参照株(SEQID NO:1)。

在另一方面，本发明涉及包含至少两个HA多肽的多聚体多肽，特别是包含三个如本文所述的HA多肽的三聚体多肽。

根据本发明，令人惊讶地表明可以高水平获得重组的流感HA多肽(特别是重组的三聚体HA多肽)，并且与野生型HA多肽(未添加异源氨基酸序列，如异源三聚化结构域)相比，具有增高的解链温度，指示更好的稳定性。此外，本发明的HA多肽被正确折叠，如抗HA抗体与HA多肽的结合所示，这些抗HA抗体例如但不限于抗体CR9114、CR8020和/或CR6261。因此当施用于受试者(特别是人类受试者)时，这些多肽可以诱导针对HA的免疫应答。三聚体多肽包含野生型天然HA的四级结构，并且因此将天然表位(包括HA分子膜近端茎部的保守表位)呈递至免疫系统。

在另一方面，本发明提供了编码重组流感HA多肽的核酸分子。

在又另一方面，本发明提供了包含编码流感HA多肽的核酸分子的载体，特别是重组腺病毒载体。

在另一方面，本发明提供了免疫原性组合物，这些免疫原性组合物包含根据本发明的流感HA多肽、核酸分子和/或载体，以及药学上可接受的载剂。

在另一方面，本发明提供了流感HA多肽、编码所述流感HA多肽的核酸分子和/或包含所述核酸分子的载体，用作药物，特别是用作用于预防和/或治疗流感疾病(特别是由来自系统发育组1和/或2的甲型流感病毒株系引起的疾病或病症)的疫苗。

本发明还提供了用于在有需要的受试者中诱导针对流感HA的免疫应答的方法，这些方法包括向该受试者施用根据本发明的流感HA多肽、核酸分子和/或载体。在又另一方面，提供了用于预防流感疾病和/或接种针对流感疾病的疫苗的方法，这些方法包括向有需要的人(如鉴定为有感染流感疾病风险的人)施用如上所述的多肽或免疫原性组合物。

在仍另一方面，提供了用于生产如上所定义的重组HA多肽的方法，该方法包括在原核或真核细胞(如哺乳动物细胞(例如CHO细胞)或昆虫细胞)中表达如上所述的核酸分子，任选地进一步包括从所述细胞中纯化/分离所述rHA。

在又另一方面，本发明提供了HA多肽作为研究工具或诊断工具，或作为用于生产抗体的流感抑制剂的靶标的用途。

附图说明

图1.A.本发明多肽单体的三维图示，其中指示出了突变的位置。血凝素(HA)头部为深灰色，茎部为浅灰色；B.本发明多肽单体(黑色：头部；浅灰色：茎部)的示意图，其中指示出了突变的位置。

图2.A.流感HA的系统发育树。指示出甲型流感组1和甲型流感组2以及乙型流感的不同亚型；B.如通过OCTET(抗His2传感器)确定的蛋白质表达水平。最后一栏示出了本发明稳定的可溶性HA三聚体与野生型(WT)HA相比在表达水平上的增加倍数；C.尺寸排阻色谱(SEC)曲线-虚线代表WT HA，而黑色实线代表根据本发明的稳定HA多肽。

图3.A.本发明经纯化的三聚体(T)多肽(黑线)以及具有折叠子(Foldon)三聚化结构域的WT多肽(灰线)的SEC分析(需要注意的是UFV4239不包含折叠子结构域)。WT-折叠子纯化多肽在-80℃下储存后显示峰加宽以及多聚体形成(*)。由于UFV4239中缺少三聚化结构域，仅表达和纯化了单体(M)；B和C.通过差示扫描荧光测定法(DSF，以℃计的Tm₅₀值)进行经纯化多肽的温度稳定性分析；D.单克隆抗体(mAb)CR6261、CR8020、CT149、CR9114和多结构域抗体MD3606的结合(ELISA，EC₅₀值)。

图4.A.如通过OCTET(抗His2传感器)确定的蛋白质表达水平；B.EXPI-293细胞培养上清液的SEC分析。UFV181007包含突变K380I和突变E432I(黑色虚线)。UFV181005包含突变H355W和突变M478I(灰色虚线)。稳定化突变的组合(UFV1810009，黑线)。

图5.A.如通过OCTET(抗His2传感器)确定的蛋白质表达水平。最后一栏示出了本发明稳定的可溶性HA三聚体与野生型(WT)HA相比在表达水平上的增加倍数；B.尺寸排阻色谱(SEC)曲线-虚线代表WT HA，而黑色实线代表根据本发明的另外的稳定HA多肽。

图6.温度应力前后，经纯化且稳定的HA的尺寸排阻色谱(SEC)曲线。示出了多肽在实验前(虚线)以及分别在4℃(黑色实线)和37℃(灰色实线)下孵育60天后的曲线。

定义

以下给出如本发明中所用的术语的定义。

根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在的(或“标准”)氨基酸或其变体中的任何一种(像例如D-脯氨酸(脯氨酸的D-对映异构体))或非天然存在于蛋白质中的任何变体(像例如正亮氨酸)。标准氨基酸可以基于它们的性质分成几种类别。重要的因素是电荷、亲水性或疏水性、大小和官能团。这些性质对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用很重要。一些氨基酸具有特殊的性质，例如半胱氨酸，其可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥)；脯氨酸，其与多肽骨架形成循环；以及甘氨酸，其比其他氨基酸更具柔性。表3示出了标准氨基酸的缩写和性质。

如本文所用，术语“包括(included或including)”被视为后面有措辞“但不限于”。

如本文所用，术语“感染”意指通过流感病毒在细胞或受试者中繁殖和/或存在的入侵。在一个实施例中，感染是“活性”感染，即其中病毒在细胞或受试者中复制的一种感染。此类感染的特征在于病毒从最初被病毒感染的细胞、组织和/或器官传播到其他细胞、组织和/或器官。感染还可以是潜伏性感染，即其中病毒不复制的一种感染。在某些实施例中，感染是指由于病毒在细胞或受试者中的存在或由于病毒对细胞或受试者的入侵而引起的病理状态。

流感病毒通常分为流感病毒类型：甲型、乙型和丙型。如本文所用，术语“流感病毒亚型”是指以血凝素(H)和神经酰胺酶(N)病毒表面蛋白的组合为特征的甲型流感病毒变体。根据本发明，流感病毒亚型可以用其H号表示，例如像“包含H3亚型的HA的流感病毒”、“H3亚型的流感病毒”或“H3流感”，或用H号和N号的组合表示，例如像“流感病毒亚型H3N2”或“H3N2”。术语“亚型”具体包括每种亚型中的所有个体“株系”，这些“株系”通常是由突变引起的并且显示不同的致病性谱，包括天然分离株以及人造突变体或重配体等。此类株系还可以称为病毒亚型的各种“分离株”。因此，如本文所用，术语“株系”和“分离株”可以互换使用。人类流感病毒株系或分离株的当前命名法包括病毒的类型(属)(即甲型、乙型或丙型)、首次分离的地理位置、株系编号和分离年份，通常在括号中给出了HA和NA的抗原描述，例如A/莫斯科/10/2000(H3N2)。非人类株系在命名法中还包括起源宿主。

这些甲型流感病毒亚型可以通过参考其系统发育组进一步分类。系统发育分析表明，血凝素细分为两个主要组别：尤其是在系统发育组1(“组1”流感病毒)中的H1、H2、H5和H9亚型，以及尤其是在系统发育组2(“组2”流感病毒)中的H3、H4、H7和H10亚型。

如本文所用，术语“流感病毒疾病”或“流感”是指因流感病毒例如甲型或乙型流感病毒在受试者中的存在而引起的病理状况。如本文所用，术语“疾病”和“病症”可互换使用。在特定的实施例中，该术语是指由受试者感染流感病毒而引起的呼吸系统疾病。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”旨在包括多核苷酸，如DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可以是单链或双链的。如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以进行化学或生物化学修饰或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(如不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等))、侧链部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和经修饰的键(例如，α异头核酸等)。除非另有说明，否则提及核酸序列涵盖其互补序列。因此，提及具有特定序列的核酸分子应理解为涵盖具有其互补序列的其互补链。互补链还可用于例如反义疗法、杂交探针和PCR引物。

如本文所用，HA中氨基酸的编号基于H3编号，如Winter等人(Nature[自然]292:72-75,1981)所述。因此，本发明多肽中的氨基酸残基或氨基酸位置的编号对应于H3 HA中氨基酸的编号(特别是，A/爱知/2/68的HA中氨基酸位置的编号)，如Winter等人(1981)所述和在图2中所示。编号特别对应于SEQ ID NO:1中氨基酸位置的编号。例如，用语“位置355处的氨基酸”是指位于位置355处(根据Winter等人(1981)的H3编号)的氨基酸残基，即是指位于SEQ ID NO:1中位置355处的氨基酸残基。技术人员将理解，其他流感病毒株系和/或亚型(如H1、H5、或H7 HA)中的等效氨基酸可以通过序列比对来确定。因此，应当注意且本领域的技术人员将会理解的是，例如，如果与SEQ ID NO:1相比添加或移除另外的氨基酸残基，则不同的HA序列可能具有不同的编号系统。照此，应理解的是当特定氨基酸残基通过其编号来指代时，描述不仅限于位于精确编号位置(从所给氨基酸序列的开头数起时的)的氨基酸，而是旨在任何和所有HA序列中的等效/对应氨基酸残基，即使该残基处于不同的精确编号位置，例如如果HA序列比SEQ ID NO:1短或长，或与SEQ ID NO:1相比具有插入或缺失。本领域的技术人员例如通过将给定HA序列与SEQ ID NO:1进行比对，可以容易地确定本文所列举的任何特定编号的残基的对应/等效氨基酸位置。因此，在涉及流感HA蛋白的特定氨基酸残基的实施例中，应理解的是本发明不限于仅在那些精确编号的氨基酸位置具有特定氨基酸残基(例如，在位置355处存在色氨酸(W)和/或位置432和/或位置380处存在异亮氨酸(I))的序列。

如本领域技术人员已知的，“多肽”是指通过酰胺键连接的氨基酸的聚合物。如本文所用，该术语可指通过共价酰胺键连接的单条多肽链。该术语还可指通过非共价相互作用如离子接触、氢键、范德华接触和疏水性接触缔合的多条多肽链。本领域技术人员将认识到，该术语包括已被修饰的多肽，例如通过翻译后加工如信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接和O-连接的糖基化)、蛋白酶裂解和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)修饰的多肽。

如本文所用，术语“野生型”是指源自天然流行的流感病毒的HA。

具体实施方式

流感病毒对全球公共卫生具有重大影响，造成每年数百万例的严重疾病、数千人死亡以及相当大的经济损失。当前的三价流感疫苗会引发对疫苗株系和密切相关的分离株的有效中和抗体应答，但是很少扩展到亚型中更多不同的株系或其他亚型。另外，对适当的疫苗株系的选择呈现出许多挑战，并经常产生次优保护作用。此外，目前无法预测下一大流行病毒的亚型，包括其出现的时间和地点。

血凝素(HA)是源自甲型流感病毒的主要包膜糖蛋白，是中和抗体的主要靶标。血凝素在进入过程中具有两种主要功能。首先，血凝素通过与唾液酸受体的相互作用介导病毒附着于靶细胞表面。其次，在病毒胞吞作用后，血凝素随后介导病毒膜和内体膜融合，以将其基因组释放到靶细胞的细胞溶质中。

HA是包含约500个氨基酸/单体的胞外结构域的三聚体蛋白，并且包含三个相同的亚单元(单体)，每个亚单元含有两个通过二硫键连接的多肽，HA1和HA2。每个单体在最初表达为HA0，并且随后宿主蛋白酶将其裂解为经由所述二硫键连接的HA1和HA2结构域。

大部分N-末端结构域(HA1结构域，长度为约320-330个氨基酸)形成膜远端球状结构域(头部结构域)，该膜远端球状结构域含有受体结合位点和被病毒中和抗体识别的大多数表位。较小的C-末端结构域(HA2结构域，长度为约180个氨基酸)形成茎状结构(茎部结构域)，该茎状结构将球状结构域锚定在细胞膜或病毒膜中。最保守的区域之一是裂解位点周围的序列，特别是HA2 N-末端的23个氨基酸(融合肽)，该序列在所有甲型流感病毒亚型中是保守的。此区域的一部分在HA前体分子(HA0)中以表面环的形式暴露，但是当HA0裂解为HA1和HA2时变得无法接近。

如上所述，流感HA蛋白是病毒表面发现的主要蛋白。病毒粒子表面发现的HA呈三聚体形式。三聚体通过三个单体中每一个的羧基末端处的跨膜序列锚定在病毒膜上。流感疫苗的主要保护疗效归因于针对HA蛋白的抗血凝素抗体。这强调了对构象上相关的HA蛋白产生免疫应答的重要性。

为生产代表甲型流感病毒血凝素(HA0)的胞外结构域的可溶性多肽，HA需要在不具有其天然跨膜结构域和胞质结构域下进行表达。稳定的三聚体可溶性野生型(WT)HA在哺乳动物细胞中的表达往往很差。为提高(至少)三聚化水平，通常将异源三聚化结构域(例如折叠子三聚化结构域；Stevens等人Science[科学]303(5665):1866-1870,2004)遗传融合至多肽的C-末端。不幸的是，添加异源三聚化结构域引入了不想要的新表位并且总是降低多肽的表达水平或可能改变多肽的四级结构。

本发明提供了稳定的重组甲型流感血凝素(HA)多肽，这些多肽包含甲型流感病毒HA的HA1和HA2结构域，并且包含如下这样的氨基酸序列，其中：

(a)位置355处的氨基酸是W；并且

(b)位置432处的氨基酸是I和/或位置380处的氨基酸是I；

并且其中该HA多肽的氨基酸序列中氨基酸位置的编号是根据HA的氨基酸序列中氨基酸的编号，该HA源自H3N2流感参照株，特别是H3N2 A/爱知/2/68参照株(SEQ ID NO:1)。

根据本发明，令人惊讶地发现未添加折叠子结构域或任何其他异源三聚化结构域的稳定性重组HA多肽(特别是可溶性HA三聚体多肽)可通过在HA多肽核心中出现特定氨基酸突变来获得。

在某些方面，本发明因此提供了重组的甲型流感血凝素(HA)多肽，这些多肽包含甲型流感病毒HA的HA1和HA2结构域，并且包含如下这样的氨基酸序列，其中：

(a)位置355处的氨基酸突变为W；并且

(b)位置432处的氨基酸突变为I和/或位置380处的氨基酸突变为I；

并且其中该HA多肽的氨基酸序列中氨基酸位置的编号是根据HA的氨基酸序列中氨基酸的编号，该HA源自H3N2流感参照株，特别是H3N2 A/爱知/2/68参照株(SEQ ID NO:1)。因为这些突变均为“隐蔽(buried)”突变(即这些残基的侧链未暴露在蛋白表面)，所以HA多肽的抗原性将不会改变。

在某些实施例中，多肽包含位置355处的氨基酸(特别是组氨酸(H))到色氨酸(W)的突变和位置432和/或位置380处的氨基酸到异亮氨酸(I)的突变。

本发明的HA多肽，具有位置355处的氨基酸残基W(例如，通过引入位置355处氨基酸(特别是H)到W的突变)，与位置432处的氨基酸I(例如，通过引入位置432处的氨基酸到I的突变)的组合；或具有位置432处I和位置380处的I(例如，通过引入位置432处和位置380处到I的突变)的组合，与不具有这些氨基酸突变的HA多肽相比，表现出在哺乳动物细胞中表达水平增加、三聚倾向增加(例如，如通过AlphaLISA、Octet、和SEC所测量的)、和/或热稳定水平提高(例如，如通过动态扫描荧光法/量热法(DSF/DSC)所测量的)。此外，所有测试抗体与本发明多肽的结合强度均小于5nM(通过Octet和ELISA测量)。这清楚的表明这些多肽与天然的、野生型HA在结构上(在一级、二级、三级和四级结构方面)是等效的。此外，这些新颖的HA多肽不需要存在任何人工(异源)序列，如接头序列、标签序列、或三聚化结构域序列。

在某些实施例中，HA多肽包含如下这样的氨基酸序列，其中：

(a)位置388处的氨基酸是M；和/或

(b)位置478处的氨基酸是I。

已经表明，至少在某些HA亚型中，这些突变进一步提高了HA多肽的稳定性。

在某些实施例中，所述HA单体不包含蛋白酶裂解位点。如上所述，流感HA0蛋白(在HA1和HA2中)的裂解是其活性所必需的，通过引起宿主内体膜与病毒膜的融合而促进病毒基因组进入靶细胞。在某些实施例中，本发明的多肽包含天然蛋白酶裂解位点。因此，已知跨越HA1和HA2的Arg(R)-Gly(G)序列(即氨基酸位置329和330)是胰蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶的识别位点，并且通常被裂解以激活血凝素(图1A)。在某些实施例中，通过使位置329处的氨基酸残基突变为除精氨酸(R)或赖氨酸(K)以外的任何氨基酸，去除了蛋白酶裂解位点。在某些实施例中，位置329处的氨基酸残基不是精氨酸(R)。在一个优选的实施例中，多肽包含位置329处的氨基酸到谷氨酰胺(Q)的突变。因此，在某些实施例中，本发明的多肽包含裂解位点敲除突变R329Q，以防止在施用后体外或体内产生期间或之后对分子的推定裂解。裂解位点敲除突变(例如R329Q突变)从而确保对低pH触发的构象改变不敏感，并且维持HA的融合前构象。

根据本发明，HA1和/或HA2结构域可包含流感HA多肽的完整(即全长)HA1和/或HA2结构域，或可包含至少部分的HA1和/或HA2结构域。

为了产生分泌型(可溶性)HA多肽，在某些实施例中，HA单体包含截短的HA2结构域。因此，在某些实施例中，本发明多肽中的HA单体不包含跨膜结构域和胞质结构域。特别地，在某些实施例中，多肽单体包含在C-末端处截短的HA2结构域。因此，根据本发明的截短的HA2结构域通过在HA2结构域C-末端和/或N-末端处缺失一个或多个氨基酸残基而比全长HA2序列短。因此，本发明还进一步提供了包含HA细胞外结构域(胞外结构域，ECD)或由其组成的重组HA多肽。

在某些实施例中，从与位置515处的氨基酸相对应的氨基酸开始的HA2结构域的C-末端部分已缺失，从而基本上去除了整个跨膜和胞质结构域。

在某些实施例中，胞外结构域C-末端处的一个或多个氨基酸也已经被缺失。根据本发明，已经发现，即使当HA2结构域的较大部分缺失时，也可以提供稳定的可溶性三聚体HA多肽。因此，在某些实施例中，从位置500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、或514处的氨基酸序列开始的HA2结构域的C-末端部分已经被缺失(根据如Winter等人(同上)所述的H3编号)，以在细胞中表达后产生可溶性多肽。

类似地，HA1结构域可以是完整的(即全长HA1结构域)或至少其部分。在某些实施例中，多肽包含截短的HA1结构域。HA1结构域可在HA1结构域的N-末端和/或C-末端处被截短。

在某些实施例中，HA多肽不包含信号序列。信号序列(有时称为信号肽、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)是存在于预定进入分泌途径的大多数新合成的蛋白质的N端的短肽(通常长度为16至30个氨基酸)。信号序列的作用是促使细胞将蛋白质易位，通常易位至细胞膜。在许多情况下，包含信号肽的氨基酸一旦达到其最终目的地，就会从蛋白质上裂解下来。在流感HA中，信号序列通常包含全长HA0的氨基酸序列的前16个氨基酸(对应于根据H3编号从位置-6到位置10的氨基酸)。

本发明还提供了HA多肽的免疫原性片段。在某些实施例中，至少部分的构成头部结构域的HA1结构域可能已经被缺失了，以提供本发明HA多肽的免疫原性片段，如无头的HA多肽(即仅含茎部(stem-only)多肽)。

本发明的多肽代表(衍生于)甲型流感病毒的流感病毒血凝素(HA)。如上所述，甲型流感含有多种HA亚型，这些亚型可分成两个主要的组别：组1和组2(图2A)。可将本发明多肽中的稳定化突变应用到甲型流感的所有血凝素类型中。

在某些实施例中，HA1和HA2结构域源自组1或组2甲型流感病毒。在某些实施例中，HA1和HA2结构域源自相同的组1或组2病毒。在某些实施例中，HA1和HA2结构域源自不同的组1病毒或源自不同的组2病毒，或HA1和HA2结构域源自来自不同组的甲型流感病毒，例如HA2结构域源自组1病毒而HA2结构域源自组2病毒，或反之亦然。在某些实施例中，头部结构域(即形成头部结构域的HA1结构域中的至少部分)与茎部结构域(即形成流感HA多肽的茎部结构域的HA2结构域中的部分)源自不同的流感病毒。

在某些特定实施例中，HA1和/或HA2结构域源自甲型流感病毒，该甲型流感病毒选自由以下组成的组：包含H1亚型的HA的流感病毒，例如源自甲型流感病毒/加利福尼亚州/07/2009或A/密歇根/45/2015；包含H2亚型的HA的流感病毒，例如源自甲型流感病毒/Env/MPU3156/2005；包含H5亚型的HA的流感病毒，例如源自甲型流感病毒/赤颈鸭(EurasianWigeon)/MPF461/2007；包含H9亚型的HA的流感病毒，例如源自甲型流感病毒/香港/1073/1999；包含H3亚型的HA的流感病毒，例如源自H型流感病毒/香港/1/1968或A/巴拿马/2007/1999；包含H14亚型的HA的流感病毒，例如源自甲型流感病毒/野鸭(Mallard)/阿斯特拉罕/263/1982；包含H7亚型的HA的流感病毒，例如源自甲型流感病毒/野鸭/荷兰/12/2000；以及包含H10亚型的HA的流感病毒，例如源自甲型流感病毒/鸡/德国/N/1949。技术人员将理解，本发明的多肽还可能衍生自来自组1或组2的其他甲型流感病毒株系的HA。

在某些优选的实施例中，取决于HA亚型(即组1或组2)，HA多肽或其免疫原性片段结合至结合分子CR9114、CR6261、CR8020和/或MD3606。因此，提供了新颖的HA多肽，这些新颖的HA多肽展现出抗体CR6261(包含SEQ ID NO:2的重链可变区和SEQ ID NO:3的轻链可变区)和/或抗体CR9114(包含SEQ ID NO:6的重链可变区和SEQ ID NO:7的轻链可变区)、和/或抗体CR8020(包含SEQ ID NO:4的重链可变区和SEQ ID NO:5的轻链可变区)和/或多结构域抗体MD3606(SEQ ID NO:8)的特异性表位。当单独地或与其他预防性和/或治疗性治疗组合在体内施用时，本发明的多肽可用于引发流感病毒中和抗体。

在某些实施例中，将本发明的HA多肽或其免疫原性片段连接至纳米粒子，例如像聚合体、脂质体、病毒体、病毒样颗粒、或自组装纳米粒子。可以将多肽与纳米粒子组合、包裹在纳米粒子中或与纳米粒子缀合(例如共价连接或吸附)。

本发明进一步提供了包含至少两个如上所述的HA多肽或其免疫原性片段的多聚体多肽。

在某些优选的实施例中，多聚体多肽是三聚体并且包含三个如上所述的HA多肽或其免疫原性片段。

在某些实施例中，本发明因此提供了稳定的重组稳定三聚体甲型流感血凝素(HA)多肽或其免疫原性片段，所述多肽包含三个HA单体，所述HA单体各自包含甲型流感病毒HA的HA1和HA2结构域，并且包含如下这样的氨基酸序列，其中：

(a)位置355处的氨基酸是W；并且

(b)位置432处的氨基酸是I，或位置432处的氨基酸是I且位置380处的氨基酸是I；

如上所述，根据本发明已经表明，通过以下方式可以提高稳定的HA三聚体的表达水平和三聚化：通过具有位置355处的氨基酸残基W(例如，通过引入位置355处氨基酸到W的突变)，与位置432处的氨基酸I(例如，通过引入位置432处的氨基酸到I的突变)的组合；或具有位置432处的I和位置380处的I(例如，通过引入位置432处和位置380处到I的突变)的组合。因此，与不具有这些氨基酸突变的HA多肽相比，本发明的多肽表现出在哺乳动物细胞中表达水平提高、三聚倾向增加(例如，如通过AlphaLISA、Octet、和SEC测量的)、和/或热稳定水平提高(例如，如通过动态扫描荧光法/量热法(DSF/DSC)测量的)。

在一个特定实施例中，本发明的HA多肽在40℃下是稳定的，持续至少3天。

本发明进一步提供了编码本发明的流感HA多肽或其免疫原性片段的核酸分子。本领域技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子可以编码相同的多肽。还应当理解，技术人员可以使用常规技术产生不影响由所描述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映有待表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核酸分子”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。

在某些实施例中，对编码流感HA多肽或其免疫原性片段的核酸分子进行密码子优化，用于在哺乳动物细胞(如人细胞)中表达。密码子优化的方法是已知的并且先前已经描述(例如WO 96/09378)。

本发明进一步提供了用于生产如上所定义的重组HA多肽或其免疫原性片段的方法，这些方法包括在原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞，如CHO或PER.C6)中表达如上所述的核酸分子；所述方法任选地包括从所述细胞中纯化/分离重组HA多肽或其免疫原性片段的步骤。重组流感HA多肽或其免疫原性片段可以根据认为适合技术人员生产重组多肽的任何技术(包括本文描述的技术)来制备。因此，本发明的多肽可以通过本领域已知的标准方法合成为DNA序列，并使用合适的限制酶和本领域已知的方法克隆并随后在体外或体内表达。编码本发明HA多肽或其免疫原性片段的核苷酸序列可根据本领域技术人员所熟知的技术来合成、和/或克隆和表达。参见例如，Sambrook等人,MolecularCloning,a Laboratory Manual[分子克隆，实验室手册],第1-3卷,冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Press),冷泉港,纽约(1989)。使用重组DNA技术来生产流感疫苗提供了几点优势。这包括避免感染性病毒在蛋中的适应和传代步骤，以及在更安全且更严格控制的条件下生产纯化程度更高的蛋白质。此外，并不是必须包括病毒失活步骤。可以使用任何适合的克隆及表达系统来重组生产本发明的HA多肽。

在优选的实施例中，在哺乳动物细胞中生产多肽或其免疫原性片段。在某些实施例中，当在合适的细胞(例如哺乳动物细胞)中表达时，多肽被糖基化。因此，多肽可以含有一个或多个天然的和/或引入的(即非天然的)糖基化基序。

血凝素序列可通过本领域已知的标准重组方法来生产，如聚合酶链式反应(PCR)或逆转录酶PCR、逆向工程化或可合成DNA。对于PCR，可使用公开可用数据库中可获得的血凝素核苷酸序列来制备引物。多核苷酸构建体可以从PCR盒组装并且依次克隆到含有选择性标记的载体中，以便在宿主细胞中增殖。然后可以通过注射、转染或电穿孔或其他方法(例如磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔)将重组载体引入到宿主细胞中。商用转染试剂如Lipofectamine(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)也是可获得的。

可以通过本领域已知的方法(包括阴离子和/或阳离子交换色谱法、亲和色谱法)从重组细胞培养物中回收和分离/纯化HA多肽或其免疫原性片段。可使用技术(如SDS-PAGE)来分析这些从分离/纯化技术中洗脱的蛋白质的级分。此类方法是本领域技术人员所熟知的并且本文未作详细展示。还可以通过本领域已知的光谱方法(例如，圆二色光谱法、傅立叶变换红外光谱法和NMR光谱法或X射线晶体学)分析纯化的多肽，以研究所需结构如螺旋和β折叠的存在。ELISA、AlphaLISA、生物层干涉测量法(Octet)和FACS等可用于研究本发明的多肽与广泛中和抗体如CR6261和/或CR9114的结合。因此，可以选择具有正确构象的根据本发明的多肽。可以例如通过在非还原条件下使用SDS凝胶电泳、在广泛中和抗体如CR6261和/或CR9114的抗体Fab片段的存在下使用尺寸排阻色谱法，以及使用不同标记抗体的AlphaLISA来分析三聚体含量。可以如上所述在温度应力、冻融循环、增加的蛋白质浓度或搅动之后评估多肽的稳定性。可以通过差示扫描荧光法(DSF)进一步评估多肽的解链温度。

在一些实施例中，本发明提供了重组的流感HA多肽，这些重组的流感HA多肽衍生自以下任一流感HA氨基酸序列、包含以下任一流感HA氨基酸序列、或由以下任一流感HA氨基酸序列组成，这些流感HA氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52或其任何变体或片段，这些变体或片段与这些氨基酸序列具有至少约40％或50％或60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％或98％或99％同一性，其中这些流感HA多肽包含位置355处的色氨酸(W)和位置432和/或380处的异亮氨酸(I)，其中氨基酸编号是基于SEQ ID NO:1的序列，或在对应于这些氨基酸位置的氨基酸位置处，例如，如通过将HA氨基酸序列与SEQ ID NO:1进行比对所确定的。

在某些实施例中，本发明提供了重组的流感HA多肽，这些重组的流感HA多肽衍生自以下氨基酸残基/氨基酸、包含以下氨基酸残基/氨基酸、或由以下氨基酸残基/氨基酸组成：SEQ ID NO:10的氨基酸残基18-518、SEQ ID NO:12的氨基酸残基18-518、SEQ ID NO:14的氨基酸残基16-514、SEQ ID NO:16的氨基酸残基17-516、SEQ ID NO:18的氨基酸残基19-512、SEQ ID NO:20的氨基酸残基17-521、SEQ ID NO:22的氨基酸残基17-521、SEQ ID NO:24的氨基酸残基18-523、SEQ ID NO:26的氨基酸残基19-515、SEQ ID NO:28的氨基酸残基17-515、SEQ ID NO:33的氨基酸残基17-521、SEQ ID NO:34的氨基酸18-518、SEQ ID NO:35的氨基酸18-518、SEQ ID NO:36的氨基酸18-517、SEQ ID NO:38的氨基酸18-518、SEQ IDNO:40的氨基酸17-521、SEQ ID NO:42的氨基酸17-521、SEQ ID NO:44的氨基酸17-521、SEQID NO:47的氨基酸17-519、SEQ ID NO:50的氨基酸17-521、SEQ ID NO:51的氨基酸19-515、或SEQ ID NO:52的氨基酸17-514。

在某些实施例中，HA多肽包含的氨基酸序列衍生自以下各项、包含以下各项、或由以下各项组成：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52。

本发明进一步涉及包含编码本发明HA多肽或其免疫原性片段的核酸分子的载体。

在某些实施例中，载体是人重组腺病毒。因此，本发明还提供了重组腺病毒载体，这些重组腺病毒载体包含编码根据本发明的HA多肽或其免疫原性片段的核酸分子。重组腺病毒载体可编码膜结合HA，并且因此编码包含HA2结构域的HA多肽，该HA2结构域包含跨膜结构域和胞质结构域。腺载体还可以编码可溶性多肽并且因此编码包含截短的HA2结构域的HA多肽。

重组腺病毒载体的制备在本领域是熟知的。如本文所用，针对腺病毒的术语“重组”暗示它已被人工修饰，例如其具有在其中以保持活性地克隆的经改变的末端和/或其包含异源基因，即它不是天然存在的野生型腺病毒。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在腺病毒基因组的E1区域(例如，E1a区域和/或E1b区域)的至少一种必需基因功能中是有缺陷的，E1区域属于病毒复制所必需的腺病毒基因组。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必需E3区域的至少部分中是有缺陷的。在某些实施例中，载体在E1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必需E3区域的至少部分中是有缺陷的。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，意味着腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或更多个区域的每一个中的一个或多个必需基因功能上是有缺陷的。例如，上述E1缺陷的，或E1、E3缺陷的腺病毒载体可以进一步在E4区域的至少一个必需基因和/或E2区域(例如，E2A区域和/或E2B区域)的至少一个必需基因上是有缺陷的。腺病毒载体、其构建方法及其繁殖方法在本领域中是熟知的，并且在例如美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913中有所描述。

在某些实施例中，腺病毒是血清型26的人腺病毒。

本发明进一步提供了免疫原性组合物，这些免疫原性组合物包含根据本发明的HA多肽、其免疫原性片段、核酸、和/或载体，以及药学上可接受的载剂。本发明特别地涉及包含治疗有效量的本发明的多肽、免疫原性片段、核酸和/或载体的药物组合物。这些药物组合物还包含药学上可接受的载剂。在本上下文中，术语“药学上可接受的”意指该载剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们施用的受试者中引起不必要或不良的影响。此类药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版,A.R.Gennaro编辑,马克出版公司(Mack Publishing Company)[1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins[肽和蛋白质的制药配方开发],S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis[2000]；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients[药用赋形剂手册],第3版,A.Kibbe编辑,英国医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。术语“载剂”是指与多肽、核酸和/或载体一起施用的稀释剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液及右旋糖和甘油水溶液可以例如用作液体载剂，特别是对于注射液而言。

本发明进一步涉及如本文所述的HA多肽、免疫原性片段、核酸和/或载体，用作药物。本发明特别地涉及如本文所述的HA多肽、核酸、和/或载体，用于在诱导针对流感病毒(特别是针对流感病毒的HA分子)的免疫应答(优选地包括引发中和抗体)中使用。在一个优选的实施例中，本发明涉及如本文所述的HA多肽、免疫原性片段、核酸和/或载体，用作流感疫苗使用。

本发明还涉及在有需要的受试者中诱导针对甲型流感病毒的免疫应答的方法(特别是用于引发抗体的方法)，这些方法包括向所述受试者施用如上所述的HA多肽、免疫原性片段、核酸分子和/或载体。根据本发明的受试者优选是能够感染流感病毒或以其他方式可以从诱导针对流感病毒的免疫应答中受益的哺乳动物，此类受试者例如是啮齿类动物(例如小鼠、白鼬)，或是家畜或农场动物，或是非人类灵长类动物，或是人。优选地，受试者是人类受试者，如鉴定为有感染流感疾病风险的人。

在某些实施例中，本发明的HA多肽、免疫原性片段、核酸分子和/或载体与佐剂组合施用。可以在本发明的多肽、核酸分子和/或载体施用之前、同时或之后施用佐剂。合适的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，像例如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体(如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT、百日咳毒素PT或破伤风类毒素TT)；基质M；或其组合。另外，可以使用已知的免疫增强技术，如将本发明的多肽与本领域已知的蛋白质融合以增强免疫应答(例如破伤风类毒素、CRM197、rCTB、细菌鞭毛蛋白等)，或将这些多肽包括在病毒体中，或其组合。此外，可使用由相同腺载体共同递送或编码的遗传佐剂。

根据本发明的HA多肽、免疫原性片段、核酸分子、和/或载体的施用可以使用标准的施用途径来进行。非限制性实例包括肠胃外施用，如静脉内、皮内、透皮、肌内、皮下等，或粘膜施用，例如鼻内、经口等。技术人员将能够确定施用根据本发明的多肽、核酸分子和/或载体以便诱导免疫应答的各种可能性。

本发明进一步提供了在有需要的受试者中预防和/或治疗(优选预防)流感病毒疾病的方法，这些方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的HA多肽、免疫原性片段、核酸分子和/或载体。治疗有效量是指多肽、免疫原性片段、核酸和/或载体有效预防、缓解和/或治疗因感染流感病毒而引起的疾病或病症的量。预防涵盖抑制或减少流感病毒的传播或者抑制或减少与流感病毒感染相关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如本文所用，缓解可以是指减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。

需要治疗的受试者包括已经患有因感染流感病毒而引起的病状的受试者，以及其中要预防感染流感病毒的那些受试者。因此，可以将本发明的多肽、免疫原性片段、核酸和/或载体施用于原初受试者(即，未患有因流感病毒感染引起的疾病或尚未感染流感病毒和当前未感染流感病毒的受试者)，或施用于已经感染了流感病毒的受试者。

在一个实施例中，预防和/或治疗可以针对易受流感病毒感染的患者群组。此类患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁、并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、免疫功能低下的受试者以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的患者。

本发明的多肽、免疫原性片段、核酸分子和/或载体可以与一种或多种其他活性剂(如替代性流感疫苗、单克隆抗体、抗病毒剂、抗菌剂和/或免疫调节剂)组合施用于受试者。一种或多种其他活性剂可有益于治疗和/或预防流感病毒疾病或者可改善与流感病毒疾病相关的症状或病症。在一些实施例中，一种或多种其他活性剂是止痛药、退烧药或缓解或协助呼吸的治疗剂。

本发明的HA多肽或其片段还可以用作研究工具、诊断工具、或抗体试剂或治疗用抗体生产的靶标。例如，在一些实施例中，HA多肽可以例如在ELISA测定、Biacore/SPR结合测定、和/或本领域已知的用于抗体结合的其他测定中用作分析物，用于分析和/或测量抗HA抗体的结合和/或滴度。作为另一个实例，本发明HA多肽可用以分析、和/或比较抗HA抗体的功效。

本发明的HA多肽或其片段还可以用于生成治疗性抗体和/或可用作研究工具的抗体，或用于任何其他所希望的用途。例如，本发明的HA多肽可以用于非人动物的免疫以获得针对HA蛋白的抗体，用作研究工具和/或治疗剂使用。然后，可以从动物中获得此类抗体(可以是单克隆抗体或多克隆抗体)和/或产生此类抗体的细胞。

用作诊断工具的本发明的多肽可以包含标签，该标签对适合于给定测定法的任何检测技术是有用的。所使用的标签将取决于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法。这些方法可以在溶液中进行，或可以使本发明的一种或多种多肽结合或附着至载剂或底物，例如微量滴定板(实例：用于ELISA)、膜和珠等。

在以下实例和附图中进一步说明了本发明。这些实例并非旨在以任何方式限制本发明的范围。

实例

实例1：可溶性HA多肽-本发明多肽的结构和设计元素

为生产代表甲型流感病毒血凝素(HA0)的胞外结构域的可溶性多肽，HA需要在不具有其天然跨膜结构域和胞质结构域下进行表达。稳定的三聚体可溶性野生型(WT)HA在哺乳动物细胞中的表达往往很差。为提高(至少)三聚化水平，通常将折叠子三聚化结构域遗传融合至多肽的C-末端。不幸的是，添加折叠子结构域引入了不想要的新表位并且总是降低多肽的表达水平或可能改变多肽的结构。根据本发明，已经发现通过在HA多肽核心中(特别是在氨基酸位置355和位置432处或在氨基酸位置355和位置380和位置432处)引入特定的氨基酸突变，可以在不添加折叠子或任何其他非天然三聚化序列的情况下提高可溶性稳定HA三聚体的表达水平和三聚化水平。注意，对于本发明HA单体中的氨基酸位置的编号而言，使用的是Winter等人1981的H3编号(同上)。因此，本发明HA多肽单体中氨基酸位置的编号是根据HA中氨基酸位置的编号，该HA源自H3N2流感参照株，特别是H3N2 A/爱知/2/68参照株(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列)。

根据本发明，图1A中示出了甲型流感H1 A/加利福尼亚州/07/2009株系的HA中的关键突变的主要结构元件和位置(图1A)。如图所示，HA单体包含截短的HA2结构域(特别是在氨基酸位置514后被截短的HA2结构域，即HA2结构域的C-末端部分从氨基酸位置515处开始被缺失)，以便缺失跨膜结构域和胞质结构域并且产生HA的可溶性胞外结构域(图1B)。

通过使位置329处的天然一元裂解位点氨基酸精氨酸(R)突变(图1B)成例如谷氨酰胺(Q)，可以使得本发明的多肽对蛋白酶裂解产生抗性。与天然全长的HA相反，包含R329Q突变的多肽不能被丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)裂解。HA的裂解使得蛋白质经历膜融合和病毒进入所需的构象变化。

实例2：与不同亚型的野生型HA相比，可溶性稳定HA的表达

在此实例中，选择几种来自组1和组2的流感病毒的HA并且表达为稳定的可溶性三聚体HA多肽，并且与其各自的野生型可溶性HA胞外结构域(即，不具有跨膜结构域和胞质内结构域)进行比较。根据本发明，将位置355处的色氨酸(W)以及位置380和位置432处的异亮氨酸(I)引入到五个不同的组1株系和五个不同的组2株系的HA氨基酸序列中，如果这些氨基酸尚不存在于HA氨基酸序列中，则这些不同的株系包括在人类中流行最广的八个亚型(图2A)。此外，将甲硫氨酸(M)引入一些多肽中在位置388处的A-螺旋的顶端。除了在衍生自A/野鸭/荷兰/12/200(UFV181146)和A/鸡/德国/N/1949(UFV181147)的多肽中之外，在位置478处引入异亮氨酸或者如果其已经存在于WT序列中则将其保留。将本发明多肽在Expi293F培养上清液中的表达水平和三聚化与其各自的可溶性WT多肽(不具有本发明的突变)进行比较。

表1示出了根据本发明制备的多肽。

表1.本发明的多肽

+意指在所述位置存在所述氨基酸；空单元格意指不存在所述氨基酸(即，存在野生型氨基酸残基)

合成编码图2和表1中所列的多肽的DNA片段(金斯瑞公司(Genscript))，并将其克隆到pcDNA2004表达载体(具有增强型CMV启动子的经修饰pcDNA3质粒)中。本发明的多肽包括用于位点特异性生物素化、筛选目的和纯化目的的C-末端接头-分选酶-接头-His标签，并且其在真核Expi293F悬浮细胞系中以微量(200μL)产生。野生型(WT)全长(FL)HA多肽含有用于筛选目的的接头-His标签。

使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Gibco，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))用工业级DNA(≤0.01EU/μg的内毒素水平并且≥90％的超螺旋含量)于96半深孔板(System Duetz)中以2.5E+06vc/mL的细胞密度对细胞进行瞬时转染，并且使细胞在含有Expi293表达培养基的摇瓶(Gibco，赛默飞世尔科技公司)中于37℃，250rpm，8％CO₂和75％湿度下进行孵育。在第3天收获含有分泌型多肽的细胞培养上清液，并且通过离心(以400xg离心10分钟)使其澄清，然后过滤(96孔滤板，0.22μm PVDF膜，康宁公司(Corning))。

使用OCTET平台(福特生物有限公司(FortéBio))通过生物层干涉测量法评估收获的培养上清液中表达的可溶性HA多肽的水平。简而言之，使用抗HIS(HIS2)生物传感器(福特生物有限公司)通过测量稀释系列的经纯化的多肽UFV180436的明确定义的参照批次的结合移位来建立标准曲线。随后，测量预先稀释(于动力学缓冲液中，福特生物有限公司)的含有本发明多肽的细胞培养上清液的结合移位，并且使用已建立的标准曲线来计算多肽的浓度。

使用Vanquish系统(赛默飞世尔科技公司)和BEH 200A色谱柱(沃特斯公司(Waters)，注射体积40μL，流速0.35mL/min)通过超高效液相色谱法(UHPLC)中的分析性尺寸排阻色谱法(SEC)来评估Expi293F细胞培养收获物中已表达的多肽及其四级结构(可表明该多肽是单体、三聚体、还是多聚体)的存在。通过Helios光散射检测器(怀雅特技术公司(Wyatt Technology))来监测洗脱。通过Astra 6软件包(怀雅特技术公司)分析SEC图谱。结果与结论

如通过OCTET所测定的，在不同株系的野生型HA中的位置355处引入色氨酸、和在位置380和/或432处引入异亮氨酸致使所有测试的本发明多肽的表达增加(图2B)。

粗细胞培养上清液的SEC分析表明了当在本发明的多肽中引入稳定化突变时，对于所有可溶性稳定HA，明显的三聚体(T)峰出现在6至7分钟之间的保留时间处，该峰高于对其各自野生型HA胞外结构域所观察到的三聚体峰(图2C)。注意，不同流感HA亚型间保留时间的差异可能是由糖基化的水平和复杂性差异而导致的。

总之，数据证实在本发明的HA多肽中引入突变355W、380I和/或432I致使稳定的可溶性三聚体HA的表达和形成的增加。

实例3：与含有折叠子三聚化结构域的野生型HA相比，经纯化的三聚体全长HA的体外表征

为了进一步表征关键的稳定化突变355W、380I和/或432I的贡献，在HA胞外结构域多肽(即，不包括TM和IC结构域)中引入突变，所述HA胞外结构域多肽衍生自H1株系A/加利福尼亚州/07/2009(UFV181009)、A/密歇根/45/2015(UFV181091)，以及H3株系A/香港/1/1968(UFV180660)和A/印第安纳/11/2011(UFV181099)；并且将其与含有折叠子三聚化结构域的野生型(WT)HA胞外结构域(除了缺少折叠子三聚化结构域的UFV4239(SEQ ID NO:29)以外)进行比较。多肽包含如表2中所示的氨基酸。所有多肽进一步含有用于纯化和筛选目的的His标签，并且是在ExpiCHO细胞中生产的，之后对其进行纯化和表征。

如实例2所述合成编码本发明多肽的DNA片段。在ExpiCHO悬浮细胞(350mL规模)中生产多肽，并且使用ExpiFectamine转染试剂(Gibco，赛默飞世尔科技公司)根据制造商的方案通过瞬时转染各自的工业级DNA来在ExpiCHO表达培养基中培养这些多肽。根据制造商的方案，在转染后1天向细胞培养物中添加ExpiFectamine CHO增强子和ExpiCHO进料(Gibco，赛默飞世尔科技公司)。在32℃，5％CO2下孵育ExpiCHO转染的细胞悬浮液，并且在第7-11天间收获含有分泌型多肽的培养上清液。通过离心使培养上清液变澄清，之后在0.2μm瓶顶过滤器(康宁公司)上过滤。

从收获的培养上清液中，按照两步方案使用

25系统(通用医疗生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences))来对his标记的本发明多肽和其各自的含有折叠子三聚化结构域的野生型株系进行纯化。首先，使用预填充的cOmplete His标签纯化柱(罗氏公司)进行固定化金属亲和色谱，该柱用1 mM的咪唑洗涤，并用300 mM的咪唑洗脱。第二，使用HiLoad Superdex 200 pg 26/600柱(通用医疗生命科学公司)进行尺寸排阻色谱。将三聚体峰的级分合并，并在-80℃下冷冻和储存(1个月和6个月)。

如实例2所述，通过超高效液相色谱法(UHPLC)中的分析性SEC来评估经纯化的本发明多肽的三聚体含量。每种经纯化的多肽各注射20μg并且使其在柱上运行。

通过差示扫描荧光测定法(DSF)经监测添加至6μg多肽溶液中的Sypro橙染料(赛默飞世尔科技公司)的荧光发射，来确定经纯化多肽的热稳定性。随着温度从25℃逐渐升高到95℃(每小时60℃)，多肽去折叠并且荧光染料与暴露的疏水性残基结合，这导致了发射的特性改变。使用ViiA7实时PCR机(应用生物系统公司(Applied BioSystems))测量解链曲线，并通过Spotfire套件(Tibco软件公司)计算Tm₅₀值。Tm₅₀值表示50％的蛋白质去折叠时的温度，因此是多肽温度稳定性的量度。

通过在ELISA中测试抗原性(抗体结合的EC₅₀值)来评估经纯化多肽的三维构象。为此，以10nM的浓度对多肽进行涂覆，并且与稀释系列的单克隆抗体(mAb)一起孵育：特别是CR6261(组1特异性)、CR8020(组2特异性)、CR9114(组1和组2特异性)、以及MD3606(组1和组2特异性多结构域抗体)，使用70nM作为起始浓度。通过与第二抗体抗人Fc HRP(小鼠抗人IgG，杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))一起孵育来确定抗体结合，并且通过添加POD底物来使其可视化。使用EnSight^TM多模式读板器(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))进行读出。使用Spotfire套件(Tibco软件公司)和图3D中列出的平均偏差和标准偏差来计算两个独立实验的EC₅₀值。

结果与结论

表2.本发明的多肽

多肽(SEQ ID NO)	355W	380I	388M	432I	478I
						UFV181009(10)	+	+		+	+
UFV181091(12)	+	+		+	+
						UFV180660(20)	+	+	+	+
UFV181099(33)	+	+		+

SEC分析结果证实不同流感HA株系的本发明多肽中存在氨基酸(或同时引入稳定化氨基酸)能够纯化高纯度且稳定的可溶性三聚体HA多肽。观察到衍生自H1 A/加利福尼亚州/07/2009(UFV181009)的纯化多肽的氨基酸的稳定化效果最好，而相对应的野生型构建体(UFV4239，SEQ ID NO:29)并不具有折叠子三聚化结构域且只在本发明的稳定多肽显示高纯度的三聚体峰时才产生单体峰(图3A)。其他H1株系A/密歇根/45/2015以及H3株系A/香港/1/1968和A/印第安纳/11/2011的野生型HA分子与另外的C-末端折叠子结构域一起表达并且确实形成三聚体HA。但是，与其各自的本发明的稳定多肽不同的是，具有折叠子结构域的野生型HA的三聚体峰要更宽且不对称，并且显示出肩峰，这表明在不希望的构象(*)或较不紧凑的折叠中存在替代性高分子量和/或低分子量多肽(Seok等人,Sci.Rep.[科学报告]8；7(1)-7540,2017)。

所有多肽的进一步表征显示出包含稳定化氨基酸的本发明多肽与具有或不具有(UFV4239，SEQ ID NO:29)折叠子三聚化结构域的WT多肽相比，展现出显著更高的热稳定性(图3B和图3C)。

引入的稳定化突变是隐蔽突变(即，这些突变位于HA多肽内部而不位于其表面)，并且因此不应该影响单体HA或三聚体HA的表面。为确认HA表面的完整性，通过ELISA来评估一组所熟知的广泛中和性抗体与多肽的结合。本发明的野生型多肽和稳定多肽根据其预期结合宽度显示了与所有抗体具有相当的结合，其中EC₅₀值在低nM范围内。观察到CR9114与衍生自H3 A/香港/1/1968和H3 A/印第安纳/11/2011的本发明HA多肽之间结合的改善(约4-8倍)(图3D)。

总之，此实例中所述的本发明的多肽从细胞培养上清液中纯化为高纯度三聚体多肽，并且与WT HA(具有或不具有折叠子三聚化结构域)相比表现出改善的热稳定性并且适当折叠。

实例4：稳定化突变组合的表征

为评估在本发明多肽中组合稳定化突变的有益效果，在H1株系A/加利福尼亚州/07/2009的HA胞外结构域中逐步引入组合355W+478I以及组合380I+432I(图4A，“.”是指存在H1野生型(WT)残基，未发生变化，如第一行所列)。

如实例2所述合成编码本发明多肽的DNA片段。如实例2所述包括用于位点特异性生物素化以及筛选目的和纯化目的的C-末端接头-分选酶-接头-His标签的多肽在真核Expi293F细胞中以微量(200μL)产生。如实例2所述，通过OCTET确定已表达多肽的水平，并且通过分析性SEC来分析三聚体含量。

结果与结论

对本发明多肽(具有稳定化突变的不同组合)的表达水平的评估揭示了突变380I和突变432I(如存在于UFV181007(SEQ ID NO:35)中)不影响表达，但与WT构建体相比，三聚体水平显著提高(图4B)。添加突变355W和突变478I(例如UFV181005：SEQ ID NO:34)致使表达显著增加(图4A)但未观察到三聚体的形成(图4B)。当将355W、478I、380I和432I组合(例如在UFV181009：SEQ ID NO:10中)时，表达水平提高(图4A)并且细胞培养上清液中的三聚体含量显著提高(图4B)。

总之，突变355W和突变478I提高了本发明多肽的表达水平，而突变380I和突变432I促进了三聚体形成。稳定化突变的组合协同提高了本发明多肽的表达水平和三聚体水平。

实例5：与多个HA亚型中的野生型HA相比，另外的可溶性稳定HA的表达

在此实例中，表达了其他另外的稳定HA并且与其各自的野生型可溶性HA胞外结构域进行比较(图5A)。将位置355处的色氨酸(W)和位置380和位置432处的异亮氨酸(I)引入到两个另外的组1株系和四个另外的组2株系的HA的氨基酸序列中。转染后三天，将多肽在Expi293F培养上清液中的表达水平和三聚化与其各自不具有本发明的突变的可溶性WT多肽进行比较。表4示出了根据本发明制备的另外的多肽。

如实例2所述合成编码本发明多肽的DNA片段。如实例2所述，将质粒在真核Expi293F细胞中以微量(200μL)进行转染。表达的所有多肽都都包括用于筛选目的和纯化目的的C-末端接头His标签，而稳定多肽包括位于His标签之前的另外的分选酶-接头序列，用于位点特异性生物素化。如实例2所述，通过OCTET确定已表达多肽的水平，并且通过分析性SEC来分析三聚体含量。

结果与结论

如实例2中所观察到的，在不同株系的野生型HA中的位置355处引入色氨酸，并且在位置380和位置432处引入异亮氨酸致使所有这些另外测试的多肽的表达增加(基于OCTET测量值)。对于衍生自H1 A/南卡罗来纳州/1/1918(UFV181084)的HA，观察到唯一例外：其显示了如通过OCTET所测定的少量下降(图5A)但不基于SEC的曲线下面积(图5B)。

粗细胞培养上清液的SEC分析显示当在所有另外的可溶性稳定HA中引入稳定化突变时，与各自的野生型HA胞外结构域相比，观察到了更多的三聚体多肽(T)且更少的单体多肽(M)和高分子量物质(图5B)。如实例2中所注意的，不同流感HA亚型间保留时间的差异可能是由糖基化的水平和复杂性差异而导致的。

总之，数据证实在本发明的另外的HA多肽中引入突变355W、380I和/或432I致使稳定的可溶性三聚体HA的表达和形成的增加。

实例6：经纯化的三聚体全长HA的体外表征(另外的数据)

在此实例中，将另外的稳定HA表达、纯化、并且暴露于长期温度应力。这些HA，UFV190839(SEQ ID NO:50)、UFV190068(SEQ ID NO:51)以及UFV190841(SEQ ID NO:52)分别衍生自H3 A/香港/1/1968、H7 A/野鸭/NL/12/2000、以及H10 A/鸡/德国/N/1949。简而言之，将经纯化的三聚体多肽在4℃(冰箱)和37℃(恒温箱)下储存60天，之后通过分析性SEC评估蛋白质完整性。

根据本发明，将位置355处的色氨酸(W)和位置380和位置432处的异亮氨酸(I)引入到三个不同的组2株系的HA的氨基酸序列中。

如实例2所述合成编码本发明多肽的DNA片段。如实例3所述，在真核ExpiCHO细胞中以中量(30mL)产生多肽，并且在第5天收获。表达的所有多肽都包括C-末端接头-分选酶-接头His标签，用于位点特异性生物素化、筛选目的和纯化目的。如实例3所述，通过两步方案来纯化蛋白质，而此时使用的是HiLoad Superdex 200 16/600柱(通用医疗生命科学公司)。如实例2所述，通过OCTET确定已表达多肽的水平，并且通过分析性SEC来分析三聚体含量，其中偏差是此时使用了Unix-C 300A柱(赛分科技公司(Sepax Technologies))。

结果与结论

SEC分析结果表明包括纯化后获得的稳定化氨基酸的本发明多肽具有高纯度并且是三聚体。此外，可溶性HA多肽对温度应力具有抗性；与应力前对材料所观察到的相比，在4℃和37℃下孵育60天没有影响蛋白质的量和三聚体状态(图6)，并且在37℃下孵育后，衍生自H10的HA中仅观察到少量的非三聚体多肽(约4.75分钟的保留时间)。

如实例2中所注意的，不同流感HA亚型间保留时间的差异可能是由糖基化的水平和复杂性差异而导致的。此外，与施加应力60天后的材料相比，对起始材料所观察到的保留时间的小的差异可能是由于柱老化导致的(即，内部对照也观察到了相似位移)。

总之，将本实例所述的本发明多肽从培养上清液中纯化为高纯度三聚体多肽，并且对温度应力显示出高度惰性，持续60天的时间段。

表3.标准氨基酸、缩写和性质

氨基酸	3个字母	1个字母	侧链极性	侧链电荷(pH 7.4)
					丙氨酸	Ala	A	非极性	中性
精氨酸	Arg	R	极性	正电荷
					天冬酰胺	Asn	N	极性	中性
天冬氨酸	Asp	D	极性	负电荷
					半胱氨酸	Cys	C	非极性	中性
谷氨酸	Glu	E	极性	负电荷
					谷氨酰胺	Gln	Q	极性	中性
甘氨酸	Gly	G	非极性	中性
					组氨酸	His	H	极性	正电荷(10％)中性(90％)
异亮氨酸	Ile	I	非极性	中性
					亮氨酸	Leu	L	非极性	中性
赖氨酸	Lys	K	极性	正电荷
					甲硫氨酸	Met	M	非极性	中性
苯丙氨酸	Phe	F	非极性	中性
					脯氨酸	Pro	P	非极性	中性
丝氨酸	Ser	S	极性	中性
					苏氨酸	Thr	T	极性	中性
色氨酸	Trp	W	非极性	中性
					酪氨酸	Tyr	Y	极性	中性
缬氨酸	Val	V	非极性	中性

序列

SEQ ID NO：1 CAA24269.1血凝素(甲型流感病毒(A/爱知/2/1968(H3N2))(不包括信号序列)

CR6261 VH蛋白(SEQ ID NO：2)

EVQLVESGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFRSYAISWVRQAPGQGPEWMGGIIPIFGTTKYAPKFQGRVTITADDFAGTVYMELSSLRSEDTAMYYCAKHMGYQVRETMDVWGKGTTVTVSS

CR6261 VL蛋白(SEQ ID NO：3)

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNDYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEANYYCATWDRRPTAYVVFGGGTKLTVL

CR8020 VH蛋白(SEQ ID NO：4)

QVQLQQSGAEVKTPGASVKVSCKASGYTFTSFGVSWIRQAPGQGLEWIGWISAYNGDTYYAQKFQARVTMTTDTSTTTAYMEMRSLRSDDTAVYYCAREPPLFYSSWSLDNWGQGTLVTVSS

CR8020 VL蛋白(SEQ ID NO：5)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMNYLAWFQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRISGSGSGTDFTLTISRLEPADFAVYYCQQYGTSPRTFGQGAKVEIK

CR9114 VH蛋白(SEQ ID NO：6)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS

CR9114 VL蛋白(SEQ ID NO：7)

SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL

MD3606蛋白(SEQ ID NO：8)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSISIFDIYAMDWYRQAPGKQRDLVATSFRDGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYLCHVSLYRDPLGVAGGMGVYWGKGALVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLKLSCAASGRTYAMGWFRQAPGKEREFVAHINALGTRTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTEYLEMNNLKPEDTAVYYCTAQGQWRAAPVAVAAEYEFWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAATGFTLENKAIGWFRQTPGSEREGVLCISKSGSWTYYTDSMRGRFTISRDNAENTVYLQMDSLKPEDTAVYYCATTTAGGGLCWDGTTFSRLASSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTSWMYWLRQAPGKGLEWVSVINTDGGTYYADSVKDRFTISRDNAKDTLYLQMSSLKSEDTAVYYCAKDWGGPEPTRGQGTQVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO 9：UFV181157(信号肽和标签标有下划线)

MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGSHHHHHH

SEQ ID NO 10：UFV181009(信号肽和标签标有下划线)

MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHWQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNIVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLINERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCIESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDSGSLPETGGGSHH HHHH

SEQ ID NO 11：UFV181134(信号肽和标签标有下划线)

MKAILVVLLYTFTTANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLNQSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIATRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFTMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPEGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREKIDGSHHHHHH

SEQ ID NO 12：UFV181091(信号肽和标签标有下划线)

MKAILVVLLYTFTTANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLNQSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIATRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFTMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPEGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHWQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNIVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLINERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCIESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREKIDSGSLPETGGGSHH HHHH

SEQ ID NO 13：UFV181153(信号肽和标签标有下划线)

MAIIYLILLFAAVRGDQICIGYHSNNSTEKVDTILERNVTVTHAQDILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLTVPEWSYIMEKENPRNGLCYPGSFNDYEELKHLLSSVTHFEKVKILPRDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKKGSNYPIAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDDAEQRTLYQNVGTYVSVGTSTLNKRSVPEIATRPKVNGQGGRMEFSWTILDMLDTINFESTGNLIAPEYGFRISKRGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAINTTLPFHNIHPLTIGECPKYVKSERLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQRAIDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFNNLEKRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGSHHHHHH

SEQ ID NO 14：UFV181154(信号肽和标签标有下划线)

MAIIYLILLFAAVRGDQICIGYHSNNSTEKVDTILERNVTVTHAQDILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLTVPEWSYIMEKENPRNGLCYPGSFNDYEELKHLLSSVTHFEKVKILPRDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKKGSNYPIAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDDAEQRTLYQNVGTYVSVGTSTLNKRSVPEIATRPKVNGQGGRMEFSWTILDMLDTINFESTGNLIAPEYGFRISKRGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAINTTLPFHNIHPLTIGECPKYVKSERLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHWSNDQGSGYAADKESTQRAIDGITNIVNSVIEKMNTQFEAVGKEFNNLEKRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMINERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDDECINSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKSGSLPETGGGSHHHHHH

SEQ ID NO 15：UFV181158(信号肽和标签标有下划线)

MEKIVLLFAIVSLVQSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCSLNGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDSPINGLCYPGDFNDYEELKHLLSSTNHFEKIQIIPRSSWSNHDASSGVSSACPYNGRSSFFRNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYVSVGTSTLNQRSVPEIATRPKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSGLEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSDRLVLATGLRNVPQRETRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYLHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGITNKINSIIDKMNTQFEAVGKEFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDDECMESVRNGTYDYPQYSEEARLNREEISGSHHHHHH

SEQ ID NO 16：UFV181159(信号肽和标签标有下划线)

MEKIVLLFAIVSLVQSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCSLNGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDSPINGLCYPGDFNDYEELKHLLSSTNHFEKIQIIPRSSWSNHDASSGVSSACPYNGRSSFFRNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYVSVGTSTLNQRSVPEIATRPKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSGLEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSDRLVLATGLRNVPQRETRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYLWSNEQGSGYAADKESTQKAIDGITNIINSIIDKMNTQFEAVGKEFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMINERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDDECIESVRNGTYDYPQYSEEARLNREEISSGSLPETGGGSHHHH HH

SEQ ID NO 17：UFV181155(信号肽和标签标有下划线)

METISLITILLVVTASNADKICIGHQSTNSTETVDTLTETNVPVTHAKELLHTEHNGMLCATSLGHPLILDTCTIEGLVYGNPSCDLLLGGREWSYIVERSSAVNGTCYPGNVENLEELRTLFSSASSYQRIQIFPDTTWNVTYTGTSRACSGSFYRSMRWLTQKSGFYPVQDAQYTNNRGKSILFVWGIHHPPTYTEQTNLYIRNDTTTSVTTEDLNRTFKPVIGPRPLVNGLQGRIDYYWSVLKPGQTLRVRSNGNLIAPWYGHVLSGGSHGRILKTDLKGGNCVVQCQTEKGGLNSTLPFHNISKYAFGTCPKYVRVNSLKLAVGLRNVPARSSRGLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYGFQHSNDQGVGMAADRDSTQKAIDKITSKVNNIVDKMNKQYEIIDHEFSEVETRLNMINNKIDDQIQDVWAYNAELLVLLENQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAMEDGKGCFELYHKCDDQCMETIRNGTYNRRKYREESRLERQKIEGSHHHHHH

SEQ ID NO 18：UFV181156(信号肽和标签标有下划线)

METISLITILLVVTASNADKICIGHQSTNSTETVDTLTETNVPVTHAKELLHTEHNGMLCATSLGHPLILDTCTIEGLVYGNPSCDLLLGGREWSYIVERSSAVNGTCYPGNVENLEELRTLFSSASSYQRIQIFPDTTWNVTYTGTSRACSGSFYRSMRWLTQKSGFYPVQDAQYTNNRGKSILFVWGIHHPPTYTEQTNLYIRNDTTTSVTTEDLNRTFKPVIGPRPLVNGLQGRIDYYWSVLKPGQTLRVRSNGNLIAPWYGHVLSGGSHGRILKTDLKGGNCVVQCQTEKGGLNSTLPFHNISKYAFGTCPKYVRVNSLKLAVGLRNVPARSSRGLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYGFQWSNDQGVGMAADRDSTQKAIDKITSIVNNIVDKMNKQYEIIDHEFSEVETRLNMINNKIDDQIQDVWAYNAELLVLLINQKTLDEHDANVNNLYNKVKRALGSNAMEDGKGCFELYHKCDDQCIETIRNGTYNRRKYREESRLERQKIESGSLPETGGGSHHHHHH

SEQ ID NO 19：UFV181141(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTSLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVGSHHHHHH

SEQ ID NO 20：UFV180660(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTSLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIWSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRWQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGILNRVIEKMNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGNYDHDVYRDEALNNRFQIKGVSGSLPETGGG SHHHHHH

SEQ ID NO 21：UFV181137(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVSNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVAQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLHQLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPSTDSDQISIYAQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSSPWVRGVSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVGSHHHHHH

SEQ ID NO 22：UFV181096(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVSNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVAQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLHQLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPSTDSDQISIYAQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSSPWVRGVSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRWQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGILNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVSGSLPETGGG SHHHHHH

SEQ ID NO 23：UFV181145(信号肽和标签标有下划线)

MIALILVALALSHTAYSQITNGTTGNPIICLGHHAVENGTSVKTLTDNHVEVVSAKELVETNHTDELCPSPLKLVDGQDCDLINGALGSPGCDRLQDTTWDVFIERPTAVDTCYPFDVPDYQSLRSILASSGSLEFIAEQFTWNGVKVDGSSSACLRGGRNSFFSRLNWLTKETNGNYGPINVTKENTGSYVRLYLWGVHHPSSDNEQTDLYKVATGRVTVSTRSDQISIVPNIGSRPRVRNQSGRISIYWTLVNPGDSIIFNSIGNLIAPRGHYKISKSTKSTVLKSDKRIGSCTSPCLTDKGSIQSDKPFQNVSRIAIGNCPKYVKQGSLMLATGMRNIPGKQAKGLFGAIAGFIENGWQGLIDGWYGFRHQNAEGTGTAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKYHQIEKEFEQVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDVTDSEMNKLFERVRRQLRENAEDQGNGCFEIFHQCDNNCIESIRNGTYDHNIYRDEAINNRIKINPVGSHHHHHH

SEQ ID NO 24：UFV180661(信号肽和标签标有下划线)

MIALILVALALSHTAYSQITNGTTGNPIICLGHHAVENGTSVKTLTDNHVEVVSAKELVETNHTDELCPSPLKLVDGQDCDLINGALGSPGCDRLQDTTWDVFIERPTAVDTCYPFDVPDYQSLRSILASSGSLEFIAEQFTWNGVKVDGSSSACLRGGRNSFFSRLNWLTKETNGNYGPINVTKENTGSYVRLYLWGVHHPSSDNEQTDLYKVATGRVTVSTRSDQISIVPNIGSRPRVRNQSGRISIYWTLVNPGDSIIFNSIGNLIAPRGHYKISKSTKSTVLKSDKRIGSCTSPCLTDKGSIQSDKPFQNVSRIAIGNCPKYVKQGSLMLATGMRNIPGKQAKGLFGAIAGFIENGWQGLIDGWYGFRWQNAEGTGTAADLKSTQAAIDQINGILNRLIEKMNEKYHQIEKEFEQVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDVTDSEMNKLFERVRRQLRENAEDQGNGCFEIFHQCDNNCIESIRNGTYDHNIYRDEAINNRIKINPVSGSLPETG GGSHHHHHH

SEQ ID NO 25：UFV181146(信号肽和标签标有下划线)

MNTQILVFALMAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNVPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKETMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKDPALIIWGIHHSGSTTEQTKLYGSGNKLITVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGQSGRIDFHWLILNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNINSRAVGKCPRYVKQESLLLATGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRHQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGKLNRLIEKTNQQFELIDNEFTEVEKQIGNVINWTRDSMTEVWSYNAELLVAMENQHTIDLADSEMNKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVGSHHHHHH

SEQ ID NO 26：UFV180664(信号肽和标签标有下划线)

MNTQILVFALMAIIPTNADKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVVNATETVERTNVPRICSKGKRTVDLGQCGLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERREGSDVCYPGKFVNEEALRQILRESGGIDKETMGFTYSGIRTNGATSACRRSGSSFYAEMKWLLSNTDNAAFPQMTKSYKNTRKDPALIIWGIHHSGSTTEQTKLYGSGNKLITVGSSNYQQSFVPSPGARPQVNGQSGRIDFHWLILNPNDTVTFSFNGAFIAPDRASFLRGKSMGIQSGVQVDANCEGDCYHSGGTIISNLPFQNINSRAVGKCPRYVKQESLLLATGMKNVPEIPKGRGLFGAIAGFIENGWEGLIDGWYGFRWQNAQGEGTAADYKSTQSAIDQITGILNRLIEKMNQQFELIDNEFTEVEKQIGNVINWTRDSMTEVWSYNAELLVAMINQHTIDLADSEMNKLYERVKRQLRENAEEDGTGCFEIFHKCDDDCMASIRNNTYDHSKYREEAMQNRIQIDPVSGSLPETGGGSHHHHH H

SEQ ID NO 27：UFV181147(信号肽和标签标有下划线)

MYKVVVIIALLGAVKGLDRICLGHHAVANGTIVKTLTNEQEEVTNATETVESTNLNKLCMKGRSYKDLGNCHPVGMLIGTPVCDPHLTGTWDTLIERENAIAHCYPGATINEEALRQKIMESGGISKMSTGFTYGSSINSAGTTKACMRNGGDSFYAELKWLVSKTKGQNFPQTTNTYRNTDTAEHLIIWGIHHPSSTQEKNDLYGTQSLSISVESSTYQNNFVPVVGARPQVNGQSGRIDFHWTLVQPGDNITFSHNGGLIAPSRVSKLTGRGLGIQSEALIDNSCESKCFWRGGSINTKLPFQNLSPRTVGQCPKYVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGRGLFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNAQGTGQAADYKSTQAAIDQITGKLNRLIEKTNTEFESIESEFSETEHQIGNVINWTKDSITDIWTYQAELLVAMENQHTIDMADSEMLNLYERVRKQLRQNAEEDGKGCFEIYHTCDDSCMESIRNNTYDHSQYREEALLNRLNINSVGSHHHHHH

SEQ ID NO 28：UFV180662(信号肽和标签标有下划线)

MYKVVVIIALLGAVKGLDRICLGHHAVANGTIVKTLTNEQEEVTNATETVESTNLNKLCMKGRSYKDLGNCHPVGMLIGTPVCDPHLTGTWDTLIERENAIAHCYPGATINEEALRQKIMESGGISKMSTGFTYGSSINSAGTTKACMRNGGDSFYAELKWLVSKTKGQNFPQTTNTYRNTDTAEHLIIWGIHHPSSTQEKNDLYGTQSLSISVESSTYQNNFVPVVGARPQVNGQSGRIDFHWTLVQPGDNITFSHNGGLIAPSRVSKLTGRGLGIQSEALIDNSCESKCFWRGGSINTKLPFQNLSPRTVGQCPKYVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGRGLFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRWQNAQGTGQAADYKSTQAAIDQITGILNRLIEKMNTEFESIESEFSETEHQIGNVINWTKDSITDIWTYQAELLVAMINQHTIDMADSEMLNLYERVRKQLRQNAEEDGKGCFEIYHTCDDSCMESIRNNTYDHSQYREEALLNRLNINSSGSLPETGGGSHHHHH H

SEQ ID NO 29：UFV4239(信号肽和标签标有下划线)

MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGRSLVPRGSGHHH HHH

SEQ ID NO 30：UFV180843(信号肽和标签标有下划线)

MKAILVVLLYTFTTANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETSNSDNGTCYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLNQSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTTADQQSLYQNADAYVFVGTSRYSKKFKPEIATRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFTMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPEGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNVPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDKITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRNQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREKIDSGSLVPSGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSLPETGGGSHHHHHH

SEQ ID NO 31：UFV180436(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTSLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQSGSLVPSGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSLPETGGGSHHHHHH

SEQ ID NO 32：UFV170466(信号肽和标签标有下划线)

MKTIVALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSNSSFFSRLNWLTHLNFKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYNHDVYRDEALNNRFQSGSLVPRGSGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGSEPEA

SEQ ID NO 33：UFV181099(信号肽和标签标有下划线)

MKTIVALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSNSSFFSRLNWLTHLNFKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQSTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRWQNSEGRGQAADLKSTQAAIDQINGILNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYNHDVYRDEALNNRFQIKGVSGSLPETGGG SHHHHHH

SEQ ID NO 34：UFV181005(信号肽和标签标有下划线)

MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHWQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCIESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDSGSLPETGGGSHH HHHH

SEQ ID NO 35：UFV181007(信号肽和标签标有下划线)

MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNIVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLINERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDSGSLPETGGGSHH HHHH

SEQ ID NO 36：UFV181090(信号肽和标签标有下划线)

MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGESSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQKALYHTENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHWQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNIVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFIDIWTYNAELLVLLINERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECIESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDSGSLPETGGGSHHH HHH

SEQ ID NO 37：UFV181135(信号肽和标签标有下划线)

MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGESSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQKALYHTENAYVSWSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFIDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGSHHHHHH

SEQ ID NO 38：UFV181084(信号肽和标签标有下划线)

MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDLLLTASSWSYIVETSNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFEKFEIFPKTSSWPNHETTKGVTAACSYAGASSFYRNLLWLTKKGSSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHHPPTGTDQQSLYQNADAYVSVGSSKYNRRFTPEIAARPKVRDQAGRMNYYWTLLEPGDTITFEATGNLIAPWYAFALNRGSGSGIITSDAPVHDCNTKCQTPHGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHWQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNIVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLERRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLINERTLDFHDSNVRNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDACIESVRNGTYDYPKYSEESKLNREEIDSGSLPETGGGSHH HHHH

SEQ ID NO 39：UFV181131(信号肽和标签标有下划线)

MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDLLLTASSWSYIVETSNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFEKFEIFPKTSSWPNHETTKGVTAACSYAGASSFYRNLLWLTKKGSSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHHPPTGTDQQSLYQNADAYVSVGSSKYNRRFTPEIAARPKVRDQAGRMNYYWTLLEPGDTITFEATGNLIAPWYAFALNRGSGSGIITSDAPVHDCNTKCQTPHGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAIDGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLERRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVRNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDDACMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREEIDGSHHHHHH

SEQ ID NO 40：UFV181095(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEDFNWTGVAQDGKSYTCKRGSVNSFFSRLNWLHKLEYKYPALNVTMPNNGKFDKLYIWGVHHPSTDSDQTSLYVRASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRNGKSSIMRSDAPIGNCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRWQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGILNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDLTDSEMNKLFERTRKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVSGSLPETGGG SHHHHHH

SEQ ID NO 41：UFV181140(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEDFNWTGVAQDGKSYTCKRGSVNSFFSRLNWLHKLEYKYPALNVTMPNNGKFDKLYIWGVHHPSTDSDQTSLYVRASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRNGKSSIMRSDAPIGNCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTRKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVGSHHHHHH

SEQ ID NO 42：UFV181093(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYIFCQVLAQNLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNEKWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEGFNWTGVTQNGGSYACKRGPDKSFFSRLNWLYESESTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTDKEQTNLYVQASGRVTVSTKRSQQTIIPNVGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLINSNGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRWQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGILNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVSGSLPETGGG SHHHHHH

SEQ ID NO 43：UFV181136(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYIFCQVLAQNLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNEKWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEGFNWTGVTQNGGSYACKRGPDKSFFSRLNWLYESESTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTDKEQTNLYVQASGRVTVSTKRSQQTIIPNVGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLINSNGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVGSHHHHHH

SEQ ID NO 44：UFV181097(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQNGTSSSCKRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDNDQIFLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRWQNSEGIGQAADLKSTQAAINQINGILNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVSGSLPETGGG SHHHHHH

SEQ ID NO 45：UFV181138(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQNGTSSSCKRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDNDQIFLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGIGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVGSHHHHHH

SEQ ID NO 46：UFV181148(信号肽和标签标有下划线)

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SEQ ID NO 47：UFV181149(信号肽和标签标有下划线)

MLSIVILFLLVAENSSQNYTGNPVICMGHHAVANGTMVKTLTDDQVEVVTAQELVESQNLPELCPSPLRLVDGQTCDIINGALGSPGCDHLNGAEWDVFIERPNAMDTCYPFDVPDYQSLRSILANNGKFEFIAEEFQWTTVKQNGKSGACKRANVNDFFRRLNWLVKSDRNAYPLQNLTKVNNGDYARLYIWGVHHPSTDTEQTNLYKNNPGRVTVSTKTSQTSVIPNIGSRPWVRGQSGRISFYWTIVEPGDLIVFNTIGNLIAPRGHYKLNNQKKGTILNTAIPIGSCVSKCHTDKGSLSTTKPFQNISRIAIGDCPKYVKQGSLKLATGMRNIPEKASRGLFGAIAGFIENGWQGLIDGWYGFRWQNAEGTGTAADLKSTQAAIDQINGILNRLIEKTNEKYHQIEKEFEQVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDVTDSEMNKLFERVRRQLRENAEDKGNGCFEIFHKCDNNCIESIRNGTYDHDIYRDEAINNRFQIQGVSGSLPETGGGSH HHHHH

SEQ ID NO 50：UFV190839(信号肽和标签标有下划线)

MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTSLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRWQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGILNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALINQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVSGSLPETGGG SHHHHHH

SEQ ID NO 51：UFV190068(信号肽和标签标有下划线)

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SEQ ID NO 52：UFV190841(信号肽和标签标有下划线)

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Claims

1.一种重组的甲型流感血凝素(HA)多肽，该多肽包含甲型流感病毒HA的HA1和HA2结构域，并且包含如下这样的氨基酸序列，其中：

(a)位置355处的氨基酸是W；并且

(b)位置432处的氨基酸是I和/或位置380处的氨基酸是I；

2.根据权利要求1所述的HA多肽，该多肽包含如下这样的氨基酸序列，其中：

(a)位置388处的氨基酸是M；和/或

(b)位置478处的氨基酸是I。

3.根据权利要求1或2所述的HA多肽，其中该多肽在该HA1和HA2结构域之间不包含蛋白酶裂解位点。

4.根据权利要求1、2或3所述的HA多肽，其中该HA1和HA2结构域源自组1和/或组2甲型流感病毒。

5.根据前述权利要求中任一项所述的HA多肽，该多肽包含截短的HA1和/或HA2结构域。

6.根据权利要求5所述的HA多肽，其中该HA2结构域中的跨膜结构域和胞质内结构域已缺失。

7.根据权利要求5或6所述的HA多肽，其中至少从与位置515处的氨基酸相对应的氨基酸开始的HA2结构域的C-末端部分已缺失。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的HA多肽，该多肽包含位于该(截短的)HA2结构域的C-末端的检测和/或纯化标签。

9.一种根据权利要求1-8中任一项所述多肽的免疫原性片段。

10.一种多聚体多肽，该多聚体多肽包含至少两个根据权利要求1-8中任一项所述的HA多肽，或根据权利要求9所述的免疫原性片段。

11.根据权利要求10所述的多聚体多肽，其中该多肽是三聚体的并且包含三个根据权利要求1-8中任一项所述的HA多肽。

12.一种核酸，该核酸编码根据权利要求1-8、10、或11中任一项所述的HA多肽，或根据权利要求9所述的免疫原性片段。

13.一种载体，该载体包含根据权利要求11所述的核酸分子。

14.根据权利要求12所述的载体，其中该载体是重组腺病毒载体。

15.一种用于生产根据权利要求1-8、10、或11中任一项所述的重组HA多肽，或根据权利要求9所述的免疫原性片段的方法，该方法包括在原核或真核细胞中表达根据权利要求12所述的核酸分子；所述方法进一步任选地包括从所述细胞中分离该HA多肽或其片段的步骤。

16.一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含根据权利要求1-8、10、或11中任一项所述的HA多肽，根据权利要求9所述的免疫原性片段，根据权利要求12所述的核酸，和/或根据权利要求13或14所述的载体，以及药学上可接受的载剂。

17.根据权利要求1-8、10、或11中任一项所述的HA多肽，根据权利要求9所述的免疫原性片段，根据权利要求12所述的核酸，和/或根据权利要求13或14所述的载体，用于在诱导针对流感病毒的免疫应答中使用。

18.根据权利要求1-8、10、或11中任一项所述的HA多肽，根据权利要求9所述的免疫原性片段，根据权利要求12所述的核酸，和/或根据权利要求13或14所述的载体，用作疫苗使用。