CN113584599A - 一种高效构建cDNA文库的方法 - Google Patents

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朱也
陈彦羽
陈莉
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Abstract

本发明涉及cDNA文库技术领域，且公开了一种高效构建cDNA文库的方法，该高效构建cDNA文库的方法，将寡脱氧胸苷酸引物和总RNA混合物注入低盐缓冲液中退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，使用末端转移酶对S2中获得的两条cRNA的端口添加均聚物(A)或(G)，然后对载体的端口添加均聚物(T)或(C),cRNA和末端和载体RNA末端退火后粘连，转化为重组分子。将S3中获得的重组分子经过基因培养转化后成为宿主细胞，将宿主细胞放置在琼脂平板上，通过琼脂平板中添加相应的筛选物质，直接鉴别筛选所含重组子的菌落，直接鉴别筛选所含重组子的菌落，更简便容易的确定出现在文库中的重组子。

Description

一种高效构建cDNA文库的方法
技术领域
本发明涉及cDNA文库技术领域，具体为一种高效构建cDNA文库的方法。
背景技术
cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的 cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合，具有组织或细胞特异性。 cDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从中筛选到所需目的基因，并用于表达，但是现有的构建cDNA文库的方法仍然存在一些不足之处，比现有的构建cDNA 文库的步骤繁琐，在进行缓冲液更换时cRNA容易丢失，同时存在污染现象。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效构建cDNA文库的方法，具备简化制作步骤等优点，解决了在进行缓冲液更换时cRNA容易丢失，同时存在污染现象的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高效构建cDNA文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将寡脱氧胸苷酸引物和总RNA混合物注入低盐缓冲液中退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分理出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，将寡脱氧胸苷酸引物从 mRNA中解离获得杂合分子；
S2：将S1中获得的杂合分子通过反转录酶催化获得第一条cRNA链，之后用核糖核酸酶水解杂合分子中的RNA链，获得小片段RNA为合成第二条 cRNA链的引物，之后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸三磷酸，最后加入异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶，将各片段连接获得第二条cRNA链；
S3：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，使用末端转移酶对S2 中获得的两条cRNA的端口添加均聚物(A)或(G)，然后对载体的端口添加均聚物(T)或(C),cRNA和末端和载体RNA末端退火后粘连，转化为重组分子；
S4：将S3中获得的重组分子经过基因培养转化后成为宿主细胞，将宿主细胞放置在琼脂平板上，通过琼脂平板中添加相应的筛选物质，直接鉴别筛选所含重组子的菌落。
优选的，S1中的低盐缓冲液和洗脱缓冲液均放置在玻璃材质的烧杯和试管内部，烧杯和试管的表面均通过高温焙烤，且烧杯和试管的表面均涂抹有 0.1％焦碳酸二乙酯，在mRNA的反应中添加核酸酶抑制剂，避免mRNA酶对mRNA 进行降解。
优选的，S2中第一条cRNA链的引物为六核苷酸引物，杂合分子中的RNA 链通过碱溶液水解，引物与RN A样品在反应前混合预热至60°，反转录酶催化时需温育7min。
优选的，低盐缓冲液和洗脱缓冲液均通过煮沸过的冷却水配置，冷却水均通过焦碳酸二乙酯处理。
优选的，S2中的反应温度为37°，S1中的磁分离器为电磁铁，当电磁铁通电时磁分离器的磁感应强度增加，继而对磁性球珠进行吸附。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种高效构建cDNA文库的方法，具备以下有益效果：
1、该一种高效构建cDNA文库的方法，通过将寡脱氧胸苷酸引物和总RNA 混合物注入低盐缓冲液中退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分理出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，将寡脱氧胸苷酸引物从mRNA中解离获得杂合分子，将S1中获得的杂合分子通过反转录酶催化获得第一条cRNA链，之后用核糖核酸酶水解杂合分子中的RNA链，获得小片段RNA为合成第二条cRNA链的引物，之后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸三磷酸，最后加入异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶，将各片段连接获得第二条cRNA链，可以避免在进行缓冲液更换时cRNA不会丢失，整体减少了污染现象。
2、该一种高效构建cDNA文库的方法，通过质粒和噬菌体载体制作克隆 RNA的载体，使用末端转移酶对S2中获得的两条cRNA链的端口添加均聚物 (A)或(G)，然后对载体的端口添加均聚物(T)或(C),cRNA和末端和载体RNA 末端退火后粘连，转化为重组分子，将S3中获得的重组分子经过基因培养转化后成为宿主细胞，将宿主细胞放置在琼脂平板上，通过琼脂平板中添加相应的筛选物质，直接鉴别筛选所含重组子的菌落，直接鉴别筛选所含重组子的菌落，更简便容易的确定出现在文库中的重组子。
附图说明
图1为本发明流程示意图；
图2为本发明步骤示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，一种高效构建cDNA文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将寡脱氧胸苷酸引物和总RNA混合物注入低盐缓冲液中退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分理出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，将寡脱氧胸苷酸引物从 mRNA中解离获得杂合分子；
S2：将S1中获得的杂合分子通过反转录酶催化获得第一条cRNA链，之后用核糖核酸酶水解杂合分子中的RNA链，获得小片段RNA为合成第二条 cRNA链的引物，之后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸三磷酸，最后加入异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶，将各片段连接获得第二条cRNA链；
S3：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，使用末端转移酶对S2 中获得的两条cRNA链的端口添加均聚物(A)或(G)，然后对载体的端口添加均聚物(T)或(C),cRNA和末端和载体RNA末端退火后粘连，转化为重组分子；
S4：将S3中获得的重组分子经过基因培养转化后成为宿主细胞，将宿主细胞放置在琼脂平板上，通过琼脂平板中添加相应的筛选物质，直接鉴别筛选所含重组子的菌落。
具体的：S1中的低盐缓冲液和洗脱缓冲液均放置在玻璃材质的烧杯和试管内部，烧杯和试管的表面均通过高温焙烤，且烧杯和试管的表面均涂抹有 0.1％焦碳酸二乙酯。
根据上述方案：在mRNA的反应中添加核酸酶抑制剂，避免mRNA酶对mRNA 进行降解。
具体的：S2中第一条cRNA链的引物为六核苷酸引物，杂合分子中的RNA 链通过碱溶液水解。
根据上述方案：引物与RN A样品在反应前混合预热至60°，反转录酶催化时需温育7min。
具体的：S2中的反应温度为37°，S1中的磁分离器为电磁铁。
根据上述方案：当电磁铁通电时磁分离器的磁感应强度增加，继而对磁性球珠进行吸附。
在使用时，将寡脱氧胸苷酸引物和总RNA混合物注入低盐缓冲液中退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分理出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，将寡脱氧胸苷酸引物从mRNA中解离获得杂合分子，将S1中获得的杂合分子通过反转录酶催化获得第一条cRNA链，之后用核糖核酸酶水解杂合分子中的RNA链，获得小片段RNA为合成第二条cRNA链的引物，之后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸三磷酸，最后加入异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶，将各片段连接获得第二条cRNA链，可以避免在进行缓冲液更换时cRNA不会丢失，整体减少了污染现象。
通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，使用末端转移酶对S2中获得的两条cRNA链的端口添加均聚物(A)或(G)，然后对载体的端口添加均聚物(T)或(C),cRNA和末端和载体RNA末端退火后粘连，转化为重组分子，将S3中获得的重组分子经过基因培养转化后成为宿主细胞，将宿主细胞放置在琼脂平板上，通过琼脂平板中添加相应的筛选物质，直接鉴别筛选所含重组子的菌落，更简便容易的确定出现在文库中的重组子。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种高效构建cDNA文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将寡脱氧胸苷酸引物和总RNA混合物注入低盐缓冲液中退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分理出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，将寡脱氧胸苷酸引物从mRNA中解离获得杂合分子；
S2：将S1中获得的杂合分子通过反转录酶催化获得第一条cRNA链，之后用核糖核酸酶水解杂合分子中的RNA链，获得小片段RNA为合成第二条cRNA链的引物，之后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸三磷酸，最后加入异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶，将各片段连接获得第二条cRNA链；
S3：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，使用末端转移酶对S2中获得的两条cRNA的端口添加均聚物(A)或(G)，然后对载体的端口添加均聚物(T)或(C),cRNA和末端和载体RNA末端退火后粘连，转化为重组分子；
S4：将S3中获得的重组分子经过基因培养转化后成为宿主细胞，将宿主细胞放置在琼脂平板上，通过琼脂平板中添加相应的筛选物质，直接鉴别筛选所含重组子的菌落。
2.根据权利要求1所述的一种高效构建cDNA文库的方法，其特征在于：所述S1中的低盐缓冲液和洗脱缓冲液均放置在玻璃材质的烧杯和试管内部，所述烧杯和试管的表面均通过高温焙烤，且烧杯和试管的表面均涂抹有0.1％焦碳酸二乙酯。
3.根据权利要求1所述的一种高效构建cDNA文库的方法，其特征在于：所述S2中第一条cRNA链的引物为六核苷酸引物，所述杂合分子中的RNA链通过碱溶液水解。
4.根据权利要求1所述的一种高效构建cDNA文库的方法，其特征在于：所述低盐缓冲液和洗脱缓冲液均通过煮沸过的冷却水配置，冷却水均通过焦碳酸二乙酯处理。
5.根据权利要求1所述的一种高效构建cDNA文库的方法，其特征在于：所述S2中的反应温度为37°，所述S1中的磁分离器为电磁铁。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104388426A (zh) * 2012-02-28 2015-03-04 盛司潼 一种Oligo dT引物及构建cDNA文库的方法

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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
罗进贤: "分子生物学引论", 中山大学出版社, pages: 408 - 410 *

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