CN113584165A - 在辅助化疗前判断辅助化疗与患者适配度的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在辅助化疗前判断辅助化疗与患者适配度的试剂盒和方法,试剂盒内有检测TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的表达程度的试剂。判断方法包括:在患者接受辅助化疗前,基于TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4中的至少三种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,预测出胃癌患者接受辅助化疗时的适配度值,在适配度值超过预设值时,判定患者与辅助化疗适配度较高适于接受辅助化疗,反之判定患者与辅助化疗适配度较低,不适于接受辅助化疗。本申请能够在辅助化疗之前通过TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4五种基因在胃癌原发灶和癌旁正常组织样品中的表达程度的组合结果来预测胃癌患者是否适于采用辅助化疗,以此可指导胃癌患者后续的化疗方案选择。
Description
技术领域
本申请涉及胃癌辅助化疗的选择领域,具体而言,涉及在辅助化疗前判断辅助化疗与患者适配度的试剂盒和方法。
背景技术
胃癌诊疗指南推荐进展期胃癌病人术后常规进行辅助化疗,辅助化疗是目前唯一被证实可以提高根治术后胃癌患者总体生存率的治疗手段,同时,胃癌的辅助化疗具有较高的血液毒性和胃肠道副反应发生率,甚至一些患者因为严重的毒副反应死亡,可以说化疗的副作用广泛存在,很多年老体弱患者难以耐受化疗。而针对不同的患者,化疗效果的差异是比较大的,也即化疗效果对有些人具有较好的疗效,而对有些人则效果不太好,因此,在胃癌患者接受手术治疗后,如何判定患者是否要采用相应的化疗方案就非常重要。而判断化疗药物对手术后的患者是否具有较好的疗效,不易在临床患者身上进行观测。而目前的化疗药物研究中缺乏一种可在实验室内对胃癌肿瘤样本进行试验,以预测化疗药物有效性的方法。因此,找到可以预测化疗药物有效性的标记物,并以此开发出专用的试剂盒,在化疗药物的研发中至关重要。
为了寻找到上述标志物,学者们进行了众多根据分子标志指导化疗药物选择的研究,大部分研究使用TS、DPD、OPRT等指导氟尿嘧啶类化疗,ERCC1、XRCC1等指导铂类化疗,但是这些研究结果始终未获公认,存在众多相互矛盾的证据,目前尚无任何单分子标志物可以用来指导验证化疗药物的效果。联合使用多个标志物可能能够解决单个分子预测效果不佳的问题,目前此类研究集中于两个方向。一方面,一些研究将预后预测模型用来预测化疗药物效果,尽管在各自研究中预测效果较好,但这些模型从未得到外部数据证实。同时,众多研究指出预后标志物并不一定能够预测哪些样本能够从更大强度的化疗药物中获益,“预后标志”不能等同于“预测标志”,使用预后模型预测化疗药物效果并无理论依据。另一方面,一些研究则试图使用分子分型(TCGA分型和Cheong分型)来预测化疗药物效果,发明人在前期工作中测试了这两个重要模型,结果发现二者对化疗疗效预测效果均不理想。
发明内容
本申请的目的在于,解决现有技术中存在的至少问题之一。
为了解决上述问题,本申请第一方面提供了一种用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒。
本申请第二方面提供了一种在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的试剂在制备试剂盒中的应用。
本申请第三方面提供了一种在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法。
本申请第一方面的技术方案提供了一种用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,该试剂盒包括以下至少三种试剂:
用于检测TGFA基因的表达程度的试剂;
用于检测HCFC1基因的表达程度的试剂;
用于检测KLF7基因的表达程度的试剂;
用于检测WARS1基因的表达程度的试剂;
用于检测WNT4基因的表达程度的试剂。
其中,试剂盒可具体包括以上2种、3种、4种试剂。优选地,试剂盒包括以上5种试剂。
根据本申请提供的用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,该试剂盒包括有针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的原位杂交试剂,也即该试剂盒中包括TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针,通过试剂盒中每种基因对应的探针,可以测量胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的对应基因的表达程度。此后便可比较每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,并根据比较结果综合分析出该胃癌组织样品对应的患者与对应的辅助化疗的适配度,以此便可在患者接受辅助化疗之前,确定患者是否适用于采用该化疗方案进行治疗,若判断出患者与辅助化疗的适配度较高,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较好,因而可认定患者适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则可建议该患者选择辅助化疗。若判断出患者与辅助化疗的适配度较低,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较差,则可认定患者不适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则不建议该患者选择辅助化疗。该种方式,由于能够在患者接受辅助化疗之前,先判断了辅助化疗与患者的适配度,从而可根据适配度来确定患者是否适于采取辅助化疗。这样便能够对胃癌患者的治疗进行临床指导,使患者选取更适合自己的治疗方法,这样既可避免患者采取的化疗方案不对而导致身体受损,又可避免用户为不合适的方案支付治疗费用。该种试剂盒能够对化疗方案起到决策指导价值,具有深远的意义和推广性。
其中,本申请中,辅助化疗包括基于5-氟尿嘧啶(5FU-based)的化疗、基于羟基脲HU的化疗、基于6-巯基嘌呤的化疗等。由于胃癌辅助化疗药物存在一定的共性,因此,关于辅助化疗与胃癌患者的适配度的疗效判断针对的辅助化疗类型包括常规的化疗方式。
进一步地,用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,还包括以下一种或多种试剂:
胃蛋白酶、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶、DEPC、3%柠檬酸、2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC、原位杂交用PBS。
在该技术方案中,试剂盒是用来进行基因表达程度检测的。而在基因表达检测试验中,需要对待测样品进行一定的处理。因此,试剂盒中除了包括针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针试剂之外,还包括一些对待测样品进行处理的其他试剂,比如胃蛋白酶、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶、DEPC、3%柠檬酸、2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC、原位杂交用PBS中的一种或多种。其中,现有方案中,检测基因表达的试剂盒比较多,因而试剂盒中,也可只包括针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针试剂。其他的常规试剂可由用户临配置,而优选地,试剂盒中除了包括针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针试剂之外,还包括一些不太常规的试剂,比如胃蛋白酶、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶等。而3%柠檬酸、2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC、原位杂交用PBS等可让用户临时配置。
本申请第二方面的技术方案提供了一种在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的试剂在制备试剂盒中的应用,其中,
试剂包括以下至少三种试剂:
用于检测TGFA基因的表达程度的试剂;
用于检测HCFC1基因的表达程度的试剂;
用于检测KLF7基因的表达程度的试剂;
用于检测WARS1基因的表达程度的试剂;
用于检测WNT4基因的表达程度的试剂;
判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的判断过程为:基于TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4中的至少三种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值。
其中,试剂盒可具体包括以上2种、3种、4种试剂。优选地,试剂盒包括以上5种试剂。
根据本申请提供的用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,该试剂盒包括有针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的原位杂交试剂中的至少三种,优选是包括五种。也即该试剂盒中包括TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针,通过试剂盒中每种基因对应的探针,可以测量胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的对应基因的表达程度。此后便可比较每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,并根据比较结果综合分析出该胃癌组织样品对应的患者与对应的辅助化疗的适配度,以此便可在患者接受辅助化疗之前,确定患者是否适用于采用该化疗方案进行治疗,若判断出患者与辅助化疗的适配度较高,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较好,因而可认定患者适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则可建议该患者选择辅助化疗。若判断出患者与辅助化疗的适配度较低,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较差,则可认定患者不适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则不建议该患者选择辅助化疗。该种方式,由于能够在患者接受辅助化疗之前,先判断了辅助化疗与患者的适配度,从而可根据适配度来确定患者是否适于采取辅助化疗。这样便能够对胃癌患者的治疗进行临床指导,使患者选取更适合自己的治疗方法,这样既可避免患者采取的化疗方案不对而导致身体受损,又可避免用户为不合适的方案支付治疗费用。该方法能够对化疗方案的选择起到决策指导价值,具有深远的意义和推广性。
在上述应用中,试剂包括以上五种试剂,在HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,每有一个基因在胃癌组织样品中的表达程度高于癌旁正常组织样品中的表达程度时,计1分,在胃癌组织样品中TGFA基因的表达强度低于癌旁正常组织样品中TGFA基因的表达程度时,计1分,统计出的总分即为适配度值,在适配度值大于等于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,在适配度值小于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
在该技术方案中,通过实验发现,HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因在胃癌组织样品中的表达程度相较癌旁正常组织样品来说一般较好。而TGFA基因在胃癌组织样品中的表达程度相较癌旁正常组织样品来说一般较差。因此,HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,只要发现一种基因在胃癌组织样品中的表达程度较好时,都将计一分,如果四种基因在胃癌组织样品的表达都好于在癌旁正常组织样品中的表达,则计4分。而对于TGFA基因,则是在胃癌组织样品中的表达程度较差时,计一分,表达较好时,不计分,此后在所有的基因表达试验完成后,统计总分,若总分大于等于3分,则判定该患者做辅助化疗的疗效较好,因而该患者适合做辅助化疗,若总分低于3分,则判定该患者做辅助化疗的疗效较差,不易做辅助化疗。这样便可在患者选择化疗方案之前,提前对疗效进行预测,以降低患者用错治疗方案的概率。
本申请第三方面的技术方案提供了一种在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,包括:
提取未辅助化疗的胃癌患者的胃癌组织样品和癌旁正常组织样品;
通过原位杂交实验分别测量胃癌组织样品中TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4五种基因中至少三种基因的表达程度;
通过原位杂交实验分别测量癌旁正常组织样品中TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4五种基因中至少三种基因的表达程度;
基于至少三种基因中每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值,在适配度值大于等于预设分值时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,反之,则判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
根据本申请提供的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,能够先测量胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的对应基因的表达程度。此后便可比较每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,并根据比较结果综合分析出该胃癌组织样品对应的患者与对应的辅助化疗的适配度,以此便可在患者接受辅助化疗之前,确定患者是否适用于采用该化疗方案进行治疗,若判断出患者与辅助化疗的适配度较高,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较好,因而可认定患者适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则可建议该患者选择辅助化疗。若判断出患者与辅助化疗的适配度较低,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较差,则可认定患者不适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则不建议该患者选择辅助化疗。该种方式,由于能够在患者接受辅助化疗之前,先判断了辅助化疗与患者的适配度,从而可根据适配度来确定患者是否适于采取辅助化疗。这样便能够对胃癌患者的治疗进行临床指导,使患者选取更适合自己的治疗方法,这样既可避免患者采取的化疗方案不对而导致身体受损,又可避免用户为不合适的方案支付治疗费用。该方法能够对化疗方案的选择起到决策指导价值,具有深远的意义和推广性。
在上述方法中,预设分值为3分,基于上述五种基因中每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值。且该步骤具体包括:
分别比较胃癌组织样品与癌旁正常组织样品中HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因的表达程度,在HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,每有一个基因在胃癌组织样品中的表达程度高于癌旁正常组织样品中的表达程度时,计1分;
对比胃癌组织样品与癌旁正常组织样品中TGFA基因的表达程度,当胃癌组织样品中TGFA基因的表达强度低于癌旁正常组织样品中TGFA基因的表达程度时,计1分;
统计所计的总分,统计出的总分即为适配度值。
在该技术方案中,通过实验发现,HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因在胃癌组织样品中的表达程度相较癌旁正常组织样品来说一般较好。而TGFA基因在胃癌组织样品中的表达程度相较癌旁正常组织样品来说一般较差。因此,HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,只要发现一种基因在胃癌组织样品中的表达程度较好时,都将计一分,如果四种基因在胃癌组织样品的表达都好于在癌旁正常组织样品中的表达,则计4分。而对于TGFA基因,则是在胃癌组织样品中的表达程度较差时,计一分,表达较好时,不计分,此后在所有的基因表达试验完成后,统计总分,若总分大于等于3分,则判定该患者做辅助化疗的疗效较好,因而该患者适合做辅助化疗,若总分低于3分,则判定该患者做辅助化疗的疗效较差,不易做辅助化疗。这样便可在患者选择化疗方案之前,提前对疗效进行预测,以降低患者用错治疗方案的概率。
进一地,通过原位杂交实验分别测量胃癌组织样品中或癌旁正常组织样品中任一种基因的表达程度的步骤具体包括:
对待测样品进行石蜡包埋,切片;
对待测样品脱蜡至水;
对待测样品中的内源性过氧化物酶进行灭活;
暴露待测样品核酸片段:对待测样品切片滴加柠檬酸稀释的胃蛋白酶,消化,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品,通过蒸馏水洗涤待测样品;
用含有多聚甲醛的固定液对待测样品进行固定;
对待测样品加预杂交液并孵育;
对待测样品滴加针对相应基因的原位杂交试剂,将盖玻片盖在切片上,杂交;
揭掉盖玻片,用2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC对杂交后的待测样品分别进行洗涤;
对待测样品滴加封闭液,孵育;
对待测样品滴加生物素化鼠抗地高辛,孵育,通过原位杂交用PBS对待测样品进行洗涤;
对待测样品滴加SABC,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品;
对待测样品滴加生物素化过氧化物酶,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品;
DAB显色:使用DAB显色专用试剂盒进行显色。在1ml蒸馏水中加入显色剂A,B,C各一滴,混匀,配置成DAB显色液。将显色液滴加至标本上,于显微镜下观察标本显色情况,据此控制显色时间,一般在30分钟内。DAB显色结束后充分水洗;
对待测样品使用苏木素进行二次染色,复染后水洗;
对待测样品使用盐酸酒精进行分化,洗掉样品中过染的蓝色;
对待测样品使用饱和碳酸锂溶液充分蓝化,蓝化后水洗;
使用浓度梯度由低至高的酒精对待测样品脱水,脱水后可使用二甲苯对待测样品进行透明,增加样品的透光率;
使用中性树胶封片;
根据待测样品的染色情况,确定待测样品的阴性、弱阳性、中阳性、强阳性的面积占比,对该待测样品进行组织化学评分,以确定对应基因的表达程度,其中,组织化学评分的公式为:H=(弱阳性面积占比×1)+(中阳性面积占比×2)+(强阳性面积占比×3)。
在该技术方案中,有两组样品,一个胃癌组织样品,一个癌旁正常组织样品。而每个样品需要进行5次基因表达的检测。因此,在基因表达程度比较的试验中,需要做5组对比试验,总共十次试验。而按照上述的操作顺序,便可准确地检测出每种基因在胃癌组织样品和癌旁正常组织样品中的表达程度,其中,表达程度用组织化学评分表示,这样就实现了表达程度的量化计算。此后便可基于5中基因表达的综合结果来进行化疗疗效的预测。
其中,在通过原位杂交实验分别测量胃癌组织样品中或癌旁正常组织样品中任一种基因的表达程度的步骤中,在使用探针与组织内RNA杂交后,先加入了能与探针特异性结合的生物素化鼠抗地高辛,再加入了能与生物素化鼠抗地高辛特异性结合的SABC,最后还加入了能与SABC特异性结合的生物素化过氧化物酶,最后通过DAB与生物素化过氧化物酶的反应实现显色。而通过生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶三者递进的特异性结合,能够产生级联放大效应,使实验结果更加显著。
更进一步地,对待测样品中的内源性过氧化物酶进行灭活的步骤具体包括:配置灭活用洗涤溶液:将蒸馏水与浓度为30%的H202按照10:1进行混合,室温5-10分钟;通过配置的灭活用洗涤溶液对待测样品洗涤3次。
更进一步地,对待测样品加预杂交液并孵育的步骤具体包括:湿盒制备,在干杂交盒底部加浓度20%的甘油20ml,按每张切片20μl加预杂交液,恒温箱38-42℃孵育2-4小时,吸取多余液体,不做冲洗;在对待测样品滴加相应基因的杂交液,将盖玻片盖在切片上,杂交的步骤中,按每张切片20μl滴加杂交液,将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上,恒温箱38-42℃杂交过夜。
更进一步地,用2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC对杂交后的待测样品分别进行洗涤的步骤具体包括:使用37℃的2×SSC洗涤5分钟,重复2次;使用37℃的0.5×SSC洗涤15分钟;使用37℃的0.2×SSC洗涤15分钟,若在该过程中,出现非特异性染色,则使用37℃的0.2×SSC洗涤15分钟,洗涤次数1次或2次。
更进一步地,对待测样品滴加生物素化过氧化物酶,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品的步骤具体包括:对待测样品滴加滴加生物素化过氧化物酶,在37℃环境孵育20分钟,使用原位杂交用PBS洗4次,每次5分钟。
在一具体方案中,本申请中,测量基因表达效果所使用的胃癌组织样品和癌旁正常组织样品均从胃癌切除手术中切除下来的组织中提取出来的,即本申请中,所有的实验样品都是以离体样本进行的。因为,胃癌切除手术中,为了确保肿瘤的扩散,在手术切除时,都会尽量的多切一些,即切除的除了带有肿瘤的胃癌组织外,还有一些正常的不带有肿瘤的组织,即本申请中所谓的癌旁正常组织样品。同时,该种设置,直接从胃癌切除手术中切除下来的组织中提取样品,不用额外专门从患者中提取样本,能够简化判断适配度的操作过程,减少患者的痛苦。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
结合附图并参考以下详细说明,本发明各实施例的上述和其他特征、优点及方面将变得更加明显。在附图中,相同或相似的附图标记表示相同或相似的元素,其中:
图1示出了本发明的实施例提供的试剂盒的结构框图;
图2示出了本发明的实施例提供的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法的流程示意图;
图3示出了本发明另一实施例中提供的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法的流程示意图。
其中,图1中的结构名称与标号的对应关系如下:
100试剂盒,102用于检测TGFA基因的表达程度的试剂,104用于检测HCFC1基因的表达程度的试剂,106用于检测KLF7基因的表达程度的试剂,108用于检测WARS1基因的表达程度的试剂,110用于检测WNT4基因的表达程度的试剂。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、实施例和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的实施例进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的全部其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明的技术思路是,以遗传算法和支持向量机两种人工智能算法为核心,利用GEO和TCGA数据库中的RNA芯片和高通量测序数据,使用5-fold交叉控制模型过拟合,使用STEPP确定cut-off,建立了由TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4五个基因构成的胃癌辅助化疗疗效的预测模型,并基于模型提供了一种利用原位杂交技术预测胃癌辅助化疗疗效的试剂盒。
具体而言,在本申请中,基于人工智能算法建立了胃癌辅助化疗疗效的预测模型的步骤如下:
(1)建立整合数据集:于NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)和The CancerGenome Atlas(TCGA)数据库下载全部公开发表的包含取自胃癌病人原发灶RNA表达的数据集,根据数据集对应的临床病理信息进行病例筛选,随后进行数据标准化处理,建立整合数据集并随机划分病例为“训练”集和“测试”集。
(2)应用人工智能技术建立胃癌辅助化疗疗效预测模型:将病例划分为“化疗获益组”和“化疗不获益组”,使用LIBSVM-3.23工具构建支持向量机(Support Vector Machine,SVM)模型。模型训练过程中使用循环代码优选两个重要参数“cost”和“gamma”。应用遗传算法进行变量筛选,使用5折交叉验证(5-fold cross-validation)避免训练过程中出现过拟合(over-fit)。
(3)预测模型的测试与评价:采用“盲法测试”,在整个模型训练过程中研究者对于“测试”集数据情况处于不知情状态。应用获得的最优SVM模型对“测试”集数据进行预测,随后证实了预测“化疗获益组”和“化疗不获益组”的实际化疗获益情况符合预期。
而经过上述实验后,申请人发现,TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因与胃癌辅助化疗的疗效有很大的关系。从而找到了胃癌辅助化疗的疗效与这五种基因之间的关联。这样便可基于GFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因作为预测胃癌辅助化疗的疗效的分子标记物。具体而言,基基于与疗效的大致规律如下:HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4在胃癌组织样品中的基因表达程度相对该基因在癌旁组织中的基因表达程度越高,则胃癌辅助化疗疗效越有效。TGFA在胃癌组织样品中的基因表达程度相对该基因在癌旁组织中的基因表达程度越低,则胃癌辅助化疗疗效越有效。而基于上述发现的规律,本申请提供了一种用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒、在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,以及试剂盒对应的用途,以及上述五种基因在用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度中的用途。
本申请第一方面的技术方案提供了一种用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒100,如图1所示,该试剂盒100包括以下至少三种试剂:用于检测TGFA基因的表达程度的试剂102、用于检测HCFC1基因的表达程度的试剂104、用于检测KLF7基因的表达程度的试剂106、用于检测WARS1基因的表达程度的试剂108、用于检测WNT4基因的表达程度的试剂110。
根据本申请提供的用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,该试剂盒包括有针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的原位杂交试剂中的至少三种,最好是包括5种。也即该试剂盒中包括TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针中的至少两个,通过试剂盒中每种基因对应的探针,可以测量胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的对应基因的表达程度。此后便可比较每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,并根据比较结果综合分析出该胃癌组织样品对应的患者与对应的辅助化疗的适配度,以此便可在患者接受辅助化疗之前,确定患者是否适用于采用该化疗方案进行治疗,若判断出患者与辅助化疗的适配度较高,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较好,因而可认定患者适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则可建议该患者选择辅助化疗。若判断出患者与辅助化疗的适配度较低,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较差,则可认定患者不适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则不建议该患者选择辅助化疗。该种方式,由于能够在患者接受辅助化疗之前,先判断了辅助化疗与患者的适配度,从而可根据适配度来确定患者是否适于采取辅助化疗。这样便能够对胃癌患者的治疗进行临床指导,使患者选取更适合自己的治疗方法,这样既可避免患者采取的化疗方案不对而导致身体受损,又可避免用户为不合适的方案支付治疗费用。该种试剂盒能够对化疗方案起到决策指导价值,具有深远的意义和推广性。
其中,本申请中,辅助化疗包括基于5-氟尿嘧啶(5FU-based)的化疗、基于羟基脲HU的化疗、基于6-巯基嘌呤的化疗等。由于胃癌辅助化疗药物存在一定的共性,因此,关于辅助化疗与胃癌患者的适配度的疗效判断针对的辅助化疗类型包括常规的化疗方式。
进一步地,用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,还包括以下试剂:
胃蛋白酶、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶、DEPC、3%柠檬酸、2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC、原位杂交用PBS。
在该技术方案中,试剂盒是用来进行基因表达程度检测的。而在基因表达检测试验中,需要对待测样品进行一定的处理。因此,试剂盒中除了包括针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针试剂之外,还包括一些对待测样品进行处理的其他试剂,比如胃蛋白酶、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶、DEPC、3%柠檬酸、2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC、原位杂交用PBS中的一种或多种。其中,现有方案中,检测基因表达的试剂盒比较多,因而试剂盒中,也可只包括针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针试剂。其他的常规试剂可由用户临配置,而优选地,试剂盒中除了包括针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针试剂之外,还包括一些不太常规的试剂,比如胃蛋白酶、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶等。而3%柠檬酸、2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC、原位杂交用PBS等可让用户临时配置。
本申请第二方面的技术方案提供了一种在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的试剂在制备试剂盒中的应用,试剂包括以下至少三种试剂:
用于检测TGFA基因的表达程度的试剂;
用于检测HCFC1基因的表达程度的试剂;
用于检测KLF7基因的表达程度的试剂;
用于检测WARS1基因的表达程度的试剂;
用于检测WNT4基因的表达程度的试剂;
判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的判断过程为:基于TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4中的至少三种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值。
根据本申请提供的用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,该试剂盒包括有针对TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的原位杂交试剂,也即该试剂盒中包括TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这五种基因的探针,通过试剂盒中每种基因对应的探针,可以测量胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的对应基因的表达程度。此后便可比较每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,并根据比较结果综合分析出该胃癌组织样品对应的患者与对应的辅助化疗的适配度,以此便可在患者接受辅助化疗之前,确定患者是否适用于采用该化疗方案进行治疗,若判断出患者与辅助化疗的适配度较高,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较好,因而可认定患者适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则可建议该患者选择辅助化疗。若判断出患者与辅助化疗的适配度较低,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较差,则可认定患者不适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则不建议该患者选择辅助化疗。该种方式,由于能够在患者接受辅助化疗之前,先判断了辅助化疗与患者的适配度,从而可根据适配度来确定患者是否适于采取辅助化疗。这样便能够对胃癌患者的治疗进行临床指导,使患者选取更适合自己的治疗方法,这样既可避免患者采取的化疗方案不对而导致身体受损,又可避免用户为不合适的方案支付治疗费用。该方法能够对化疗方案的选择起到决策指导价值,具有深远的意义和推广性。
在上述应用中,试剂包括以上五种试剂,在HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,每有一个基因在胃癌组织样品中的表达程度高于癌旁正常组织样品中的表达程度时,计1分,在胃癌组织样品中TGFA基因的表达强度低于癌旁正常组织样品中TGFA基因的表达程度时,计1分,统计出的总分即为适配度值,在适配度值大于等于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,在适配度值小于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
在该技术方案中,通过实验发现,HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因在胃癌组织样品中的表达程度相较癌旁正常组织样品来说一般较好。而TGFA基因在胃癌组织样品中的表达程度相较癌旁正常组织样品来说一般较差。因此,HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,只要发现一种基因在胃癌组织样品中的表达程度较好时,都将计一分,如果四种基因在胃癌组织样品的表达都好于在癌旁正常组织样品中的表达,则计4分。而对于TGFA基因,则是在胃癌组织样品中的表达程度较差时,计一分,表达较好时,不计分,此后在所有的基因表达试验完成后,统计总分,若总分大于等于3分,则判定该患者做辅助化疗的疗效较好,因而该患者适合做辅助化疗,若总分低于3分,则判定该患者做辅助化疗的疗效较差,不易做辅助化疗。这样便可在患者选择化疗方案之前,提前对疗效进行预测,以降低患者用错治疗方案的概率。
在上述应用中,试剂也可包括以上五种试剂中的三种,比如,包括HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这四种基因的对应的任意三种探针,然后按照要求做对比实验,并在每有一个基因在胃癌组织样品中的表达程度高于癌旁正常组织样品中的表达程度时,计1分,在总分大于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,在适配度值小于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
在上述应用中,任意三种试剂也可具体为HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4这四种基因的对应的任意2种探针和TGFA基因的探针。同样,也是在总分大于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,在适配度值小于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
在上述应用中,试剂也可包括以上五种试剂中的任意四种,使用方法和之前一样,而是否匹配的分值可根据需要设置成3分、四分或者5分。当然,2分也可以。但分值越高,判断地越精准。
在上述应用中,试剂也可仅仅包括以上五种试剂中的两种,当建议,最好是包括三种以上,以便能够确保对比实验的组数,以确保适配的精准度。
本申请第三方面的技术方案提供了一种在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,该方法如图2所示,包括:
S202,提取未辅助化疗的胃癌患者的胃癌组织样品和癌旁正常组织样品;该样品均为离体样品,其中,样品可具体从肿瘤切除手术中切除下来的组织中获取。
S204,通过原位杂交实验分别测量胃癌组织样品中TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4五种基因的表达程度。
S206,通过原位杂交实验分别测量癌旁正常组织样品中TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4五种基因的表达程度。
S208,基于上述五种基因中每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值,在适配度值大于等于预设分值时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,反之,则判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
具体而言,在判断上述五种基因的表达程度对化疗疗效的影响时,遵循的规则时:胃癌组织样品相比癌旁正常组织样品的表达程度越高,则判定胃癌组织样品受化疗药物影响越大;胃癌组织样品相比癌旁正常组织样品的表达程度越低,则判定患者接受辅助化疗的疗效越好。反之,则说明患者接受辅助化疗的疗效越差。
根据本申请提供的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,能够先测量胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的对应基因的表达程度。此后便可比较每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,并根据比较结果综合分析出该胃癌组织样品对应的患者与对应的辅助化疗的适配度,以此便可在患者接受辅助化疗之前,确定患者是否适用于采用该化疗方案进行治疗,若判断出患者与辅助化疗的适配度较高,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较好,因而可认定患者适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则可建议该患者选择辅助化疗。若判断出患者与辅助化疗的适配度较低,则说明患者采用辅助化疗后,效果会比较差,则可认定患者不适于接受辅助化疗,在治疗方案选择时,则不建议该患者选择辅助化疗。该种方式,由于能够在患者接受辅助化疗之前,先判断了辅助化疗与患者的适配度,从而可根据适配度来确定患者是否适于采取辅助化疗。这样便能够对胃癌患者的治疗进行临床指导,使患者选取更适合自己的治疗方法,这样既可避免患者采取的化疗方案不对而导致身体受损,又可避免用户为不合适的方案支付治疗费用。该方法能够对化疗方案的选择起到决策指导价值,具有深远的意义和推广性。
在一具体实施例中,本申请采用计分的形式测定辅助化疗与患者之间的适配度。其中,如图3所示,基于上述五种基因中每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值,并判断胃癌患者是否适于接受辅助化疗的步骤具体包括:
S302,从肿瘤切除手术中切除下来的组织中提取出患者辅助化疗之前的胃癌组织样品与癌旁正常组织样品;该样品均为离体样品,其中,样品可具体从肿瘤切除手术中切除下来的组织中获取。
S304,判断胃癌组织样品与癌旁正常组织样品中HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因的表达程度,每有一个上述基因在胃癌组织样品中的表达程度高于癌旁正常组织样品,计1分。
S306,对比胃癌组织样品与癌旁正常组织样品中TGFA基因的表达程度,当胃癌组织样品中该基因的表达强度低于癌旁正常组织样品时,计1分。
S308,加和总分,当总分数大于等于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,当总分数低于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
在该技术方案中,通过实验发现,HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因在胃癌组织样品中的表达程度相较癌旁正常组织样品来说一般较好。而TGFA基因在胃癌组织样品中的表达程度相较癌旁正常组织样品来说一般较差。因此,HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,只要发现一种基因在胃癌组织样品中的表达程度较好时,都将计一分,如果四种基因在胃癌组织样品的表达都好于在癌旁正常组织样品中的表达,则计4分。而对于TGFA基因,则是在胃癌组织样品中的表达程度较差时,计一分,表达较好时,不计分,此后在所有的基因表达试验完成后,统计总分,若总分大于等于3分,则判定该患者做辅助化疗的疗效较好,因而该患者适合做辅助化疗,若总分低于3分,则判定该患者做辅助化疗的疗效较差,不易做辅助化疗。这样便可在患者选择化疗方案之前,提前对疗效进行预测,以降低患者用错治疗方案的概率。
其中,本申请中有两组样品,一个胃癌组织样品,一个癌旁正常组织样品。而每个样品需要进行5次基因表达的检测。因此,在基因表达程度比较的试验中,需要做5组对比试验,总共十次试验。而按照下述的操作顺序,便可准确地检测出每种基因在胃癌组织样品和癌旁正常组织样品中的表达程度,其中,表达程度用组织化学评分表示,这样就实现了表达程度的量化计算。此后便可基于5中基因表达的综合结果来进行患者与辅助化疗的适配度的判定。
其中,检测任一基因在任一样品中的基因表达的试验,具体包括以下步骤:
对待测样品进行石蜡包埋,切片;
对待测样品脱蜡至水;
对待测样品中的内源性过氧化物酶进行灭活;
暴露待测样品核酸片段:对待测样品切片滴加柠檬酸稀释的胃蛋白酶,消化,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品,通过蒸馏水洗涤待测样品;
用含有多聚甲醛的固定液对待测样品进行固定;
对待测样品加预杂交液并孵育;
对待测样品滴加针对相应基因的原位杂交试剂,将盖玻片盖在切片上,杂交;
揭掉盖玻片,用2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC对杂交后的待测样品分别进行洗涤;
对待测样品滴加封闭液,孵育;
对待测样品滴加生物素化鼠抗地高辛,孵育,通过原位杂交用PBS对待测样品进行洗涤;
对待测样品滴加SABC,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品;
对待测样品滴加生物素化过氧化物酶,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品;
DAB显色:使用DAB显色专用试剂盒进行显色。在1ml蒸馏水中加入显色剂A,B,C各一滴,混匀,配置成DAB显色液。将显色液滴加至标本上,于显微镜下观察标本显色情况,据此控制显色时间,一般在30分钟内。DAB显色结束后充分水洗;
对待测样品使用苏木素进行二次染色,复染后水洗;
对待测样品使用盐酸酒精进行分化,洗掉样品中过染的蓝色;
对待测样品使用饱和碳酸锂溶液充分蓝化,蓝化后水洗;
使用浓度梯度由低至高的酒精对待测样品脱水,脱水后可使用二甲苯对待测样品进行透明,增加样品的透光率;
使用中性树胶封片;
根据待测样品的染色情况,确定待测样品的阴性、弱阳性、中阳性、强阳性的面积占比,对该待测样品进行组织化学评分,以确定对应基因的表达程度,其中,组织化学评分的公式为:H=(弱阳性面积占比×1)+(中阳性面积占比×2)+(强阳性面积占比×3)。
在该技术方案中,有两组样品,一个胃癌组织样品,一个癌旁正常组织样品。而每个样品需要进行5次基因表达的检测。因此,在基因表达程度比较的试验中,需要做5组对比试验,总共十次试验。而按照上述的操作顺序,便可准确地检测出每种基因在胃癌组织样品和癌旁正常组织样品中的表达程度,其中,表达程度用组织化学评分表示,这样就实现了表达程度的量化计算。此后便可基于5中基因表达的综合结果来进行化疗疗效的预测。
其中,在通过原位杂交实验分别测量胃癌组织样品中或癌旁正常组织样品中任一种基因的表达程度的步骤中,在使用探针与组织内RNA杂交后,先加入了能与探针特异性结合的生物素化鼠抗地高辛,再加入了能与生物素化鼠抗地高辛特异性结合的SABC,最后还加入了能与SABC特异性结合的生物素化过氧化物酶,最后通过DAB与生物素化过氧化物酶的反应实现显色。而通过生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶三者递进的特异性结合,能够产生级联放大效应,使实验结果更加显著。
更进一步地,灭活待测样品内源性过氧化物酶的步骤具体包括:配置灭活用洗涤溶液:将蒸馏水与浓度为30%的H202按照10:1进行混合,室温5-10分钟;通过配置的灭活用洗涤溶液对待测样品洗涤3次。
更进一步地,对待测样品加预杂交液并孵育的步骤具体包括:湿盒制备,在干杂交盒底部加浓度20%的甘油20ml,按每张切片20μl加预杂交液,恒温箱38℃-42℃孵育2-4小时,吸取多余液体,不做冲洗;在对待测样品滴加相应基因的杂交液,将盖玻片盖在切片上,杂交的步骤中,按每张切片20μl滴加杂交液,将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上,恒温箱38℃-42℃杂交过夜。
更进一步地,用2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC对杂交后的待测样品分别进行洗涤的步骤具体包括:使用37℃的2×SSC洗涤5分钟,重复2次;使用37℃的0.5×SSC洗涤15分钟;使用37℃的0.2×SSC洗涤15分钟,若在该过程中,出现非特异性染色,则使用37℃的0.2×SSC洗涤15分钟,洗涤次数1次或2次。
更进一步地,对待测样品滴加生物素化过氧化物酶,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品的步骤具体包括:对待测样品滴加滴加生物素化过氧化物酶,在37℃环境孵育20分钟,使用原位杂交用PBS洗4次,每次5分钟。
在本说明书的描述中,术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括以下至少三种试剂:
用于检测TGFA基因的表达程度的试剂;
用于检测HCFC1基因的表达程度的试剂;
用于检测KLF7基因的表达程度的试剂;
用于检测WARS1基因的表达程度的试剂;
用于检测WNT4基因的表达程度的试剂。
2.根据权利要求1所述的用于在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者适配度的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括以下试剂中的至少一种:
胃蛋白酶、组织固定液、预杂交液、寡核苷酸探针杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC-POD、生物素化过氧化物酶、DEPC、3%柠檬酸、2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC、原位杂交用PBS。
3.一种在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的试剂在制备试剂盒中的应用,所述试剂包括以下至少三种试剂:
用于检测TGFA基因的表达程度的试剂;
用于检测HCFC1基因的表达程度的试剂;
用于检测KLF7基因的表达程度的试剂;
用于检测WARS1基因的表达程度的试剂;
用于检测WNT4基因的表达程度的试剂;
判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的判断过程为:基于TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4中的至少三种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值。
4.根据权利要求3所述的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的试剂在制备试剂盒中的应用,其特征在于,
所述试剂包括以上五种试剂,在HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,每有一个基因在胃癌组织样品中的表达程度高于癌旁正常组织样品中的表达程度时,计1分,在胃癌组织样品中TGFA基因的表达强度低于癌旁正常组织样品中TGFA基因的表达程度时,计1分,统计出的总分即为所述适配度值,在所述适配度值大于等于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,在所述适配度值小于3分时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
5.一种在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,其特征在于,包括:
提取未辅助化疗的胃癌患者的胃癌组织样品和癌旁正常组织样品;
通过原位杂交实验分别测量所述胃癌组织样品中TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4五种基因中至少三种基因的表达程度;
通过原位杂交实验分别测量所述癌旁正常组织样品中TGFA、HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4五种基因中至少三种基因的表达程度;
基于至少三种基因中每种基因在胃癌组织样品中和癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值,在所述适配度值大于等于预设分值时,判定辅助化疗与胃癌患者适配度较高,适于接受辅助化疗,反之,则判定辅助化疗与胃癌患者适配度较低,不适于接受辅助化疗。
6.根据权利要求5所述的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,其特征在于,
从胃癌切除手术中切除下来的组织中提取出胃癌组织样品和癌旁正常组织样品。
7.根据权利要求5所述的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,其特征在于,所述预设分值为3分,基于上述五种基因中每种基因在所述胃癌组织样品中和所述癌旁正常组织样品中的表达程度,统计出辅助化疗与胃癌患者的适配度值,其步骤具体包括:
分别比较胃癌组织样品与癌旁正常组织样品中HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因的表达程度,在HCFC1、KLF7、WARS1、WNT4四种基因中,每有一个基因在胃癌组织样品中的表达程度高于癌旁正常组织样品中的表达程度时,计1分;
对比胃癌组织样品与癌旁正常组织样品中TGFA基因的表达程度,当胃癌组织样品中TGFA基因的表达强度低于癌旁正常组织样品中TGFA基因的表达程度时,计1分;
统计所计的总分,统计出的总分即为所述适配度值。
8.根据权利要求7所述的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,其特征在于,
通过原位杂交实验分别测量胃癌组织样品中或癌旁正常组织样品中任一种基因的表达程度的步骤具体包括:
对待测样品进行石蜡包埋,切片;
使用浓度梯度由高至低的酒精对待测样品脱蜡至水;
对待测样品中的内源性过氧化物酶进行灭活;
暴露待测样品核酸片段:对待测样品切片滴加柠檬酸稀释的胃蛋白酶,消化,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品,通过蒸馏水洗涤待测样品;
用含有多聚甲醛的固定液对待测样品进行固定;
对待测样品加预杂交液并孵育;
对待测样品滴加针对相应基因的原位杂交试剂,将盖玻片盖在切片上,杂交;
揭掉盖玻片,用2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC对杂交后的待测样品分别进行洗涤;
对待测样品滴加封闭液,孵育;
对待测样品滴加生物素化鼠抗地高辛,孵育,通过原位杂交用PBS对待测样品进行洗涤;
对待测样品滴加SABC,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品;
对待测样品滴加生物素化过氧化物酶,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品;
DAB显色:使用DAB显色专用试剂盒进行显色,在1ml蒸馏水中加入显色剂A,B,C各一滴,混匀,配置成DAB显色液,将显色液滴加至标本上,于显微镜下观察标本显色情况,据此控制显色时间,一般在30分钟内,DAB显色结束后充分水洗;
对待测样品使用苏木素进行二次染色,复染后水洗;
对待测样品使用盐酸酒精进行分化,洗掉样品中过染的蓝色;
对待测样品使用饱和碳酸锂溶液充分蓝化,蓝化后水洗;
使用浓度梯度由低至高的酒精对待测样品脱水,脱水后可使用二甲苯对待测样品进行透明,增加样品的透光率;
使用中性树胶封片;
根据待测样品的染色情况,确定待测样品的阴性、弱阳性、中阳性、强阳性的面积占比,对该待测样品进行组织化学评分,以确定对应基因的表达程度,其中,组织化学评分的公式为:H=(弱阳性面积占比×1)+(中阳性面积占比×2)+(强阳性面积占比×3)。
9.根据权利要求8所述的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,其特征在于,
所述对待测样品滴加生物素化过氧化物酶,孵育,通过原位杂交用PBS洗涤待测样品的步骤具体包括:对待测样品滴加滴加生物素化过氧化物酶,在37℃环境孵育20分钟,使用原位杂交用PBS洗4次,每次5分钟;和/或
所述对待测样品中的内源性过氧化物酶进行灭活的步骤具体包括:配置灭活用洗涤溶液:将蒸馏水与浓度为30%的H202按照10:1进行混合,室温5-10分钟;通过配置的灭活用洗涤溶液对待测样品洗涤3次;和/或
所述对待测样品加预杂交液并孵育的步骤具体包括:湿盒制备,在干杂交盒底部加浓度20%的甘油20ml,按每张切片20μl加预杂交液,恒温箱38-42℃孵育2-4小时,吸取多余液体,不做冲洗;在所述对待测样品滴加相应基因的杂交液,将盖玻片盖在切片上,杂交的步骤中,按每张切片20μl滴加杂交液,将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上,恒温箱38-42℃杂交过夜。
10.根据权利要求8所述的在辅助化疗前判断辅助化疗与胃癌患者的适配度的方法,其特征在于,
所述用2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC对杂交后的待测样品分别进行洗涤的步骤具体包括:使用37℃的2×SSC洗涤5分钟,重复2次;使用37℃的0.5×SSC洗涤15分钟;使用37℃的0.2×SSC洗涤15分钟,若在该过程中,出现非特异性染色,则使用37℃的0.2×SSC洗涤15分钟,洗涤次数1次或2次。
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