CN113584055A - 胡椒pnpal3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开了一种胡椒PNPAL3基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明还公开了上述胡椒PNPAL3基因在胡椒抗瘟病中的应用。本发明公开的胡椒PNPAL3基因能够提高热引1号抗瘟病能力；对PnPAL3基因进行烟草转化，得到木质素总含量升高、G型木质素含量升高、抗病性明显提高的转基因烟草植株。

Description

胡椒PNPAL3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种胡椒PNPAL3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用。

背景技术

胡椒(Piper nigrum L.)果实具有又香又辛辣的独特风味，素有“香料之王”的美誉，是世界最重要的香辛料作物，深受人们喜爱，与人类舌尖上的体验和生命健康密切相关。胡椒已有4000多年的栽培利用历史，原产于印度，目前广泛种植于热带、亚热带等30多个国家地区。从古代上流阶层的奢侈品到现在家喻户晓的重要调味品，胡椒演绎着各种传奇的故事，曾是受到世界广泛认可的“硬通货”，十字军东征、大航海时代等重要历史事件都或多或少与人类对胡椒的向往有关。

“热引1号”胡椒(P.nigrum c.v.Reyin-1)是由发明人单位选育的胡椒主栽品种，具有产量高、品质优的特点，商品白胡椒平均产量200千克/亩、胡椒碱含量4.50％，推广面积占全国90％以上，但该品种与国际现有主推品种一样高感胡椒瘟病-由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leon)引起的一种气候依赖型、传染力很强的土传性病害，可导致严重减产甚至死亡。胡椒主栽品种抗瘟病能力差，已成为限制包括我国在内的世界胡椒产业健康发展的“卡脖子”问题，胡椒抗瘟病品种的创制越来越受到国际育种学家的重视。有研究发现胡椒木质素积累可能是产生抗性的原因，并且差异表达基因均与木质素合成有关。

苯丙氨酸解氨酶(PAL,phenylalanine ammonia-lyase)是苯丙烷途径的入口酶和限速酶，是与植物抗病性相关的关键酶，与植物抗毒性及酚类化合物的形成密切相关。苯丙烷代谢途径参与胡椒抗瘟病反应，基于玉米和拟南芥等作物的研究显示：超表达PNPAL基因可以提高作物抵抗病原菌(Plant

August 2010,Vol.153,pp,1526-1538)，然而胡椒中苯丙氨酸解氨酶基因在胡椒抗瘟病中的作用还未见报道。

在植物体中，木质素不仅参与植物体内管状分子(如导管或管胞)的形成及细胞的分化，维持植株的机械组织(如纤维、厚壁组织)支撑力，而且作为屏障结构(如表皮)加强对细胞壁的保护，从而使植物体免受各种病原物的侵害。木质素与植物细胞壁中纤维素、半纤维素等相互交联形成复杂的网格结构，从而使植物的物理机械支撑能力变强；木质素疏水的特性所构成的植物细胞壁不易透水，这样有助于植物体维持自身的水分、矿物质和有机物的代谢稳定运输(Lee et al.,1997；李威,2018)。木质素是继纤维素之后植物次生细胞壁加厚形成的第二大天然有机化合物，主要沉积在维管束植物的次生细胞壁中，对植物细胞壁结构的完整性、加强植物机械支持和植物病原体防御中发挥重要作用(You和Mao,2013)。

木质素单体比例和单体间的键连接方式在不同植物物种中不尽相同，因此聚合形成的木质素化学结构高度可变而很难准确测定其结构。木质素是由多种芳香醇单体形成的一种复杂酚类聚合物，是苯丙烷类的衍生物，主要有芥子醇、香豆醇和松柏醇3种单体。这些木质素单体最终经过脱氢聚合成结构复杂的木质素复合物。杨向东(2006)发现油菜木质素含量与抗菌核病之间存在显著正相关性。木质素单体之间的相对比例及不同类型之间的化学键决定着木质素的复杂性和特异性。

高等植物中会生成对-羟基苯基木质素(p-hydroxyphenyllignin，H-木质素)、愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G-木质素)和紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)三种木质素单体。S型木质素由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成，G型木质素由愈创木基丙烷结构单体聚合而成，H型木质素由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成。不同材料间木质素单体S/G/H有极显著差异。在病原体入侵等生物胁迫下，木质素单体比例会发生改变(Gayoso et al.,2010)。Eynck等(2012)以2个菌核病抗性不同的亚麻芥为材料，发现在抗病植株中木质素单体G/S高于感病植株。陈雪萍等(2017)发现在油菜中茎秆菌斑大小与木质素含量呈极显著相关，同时与单体G/S呈显著正相关。因此，木质素含量及其单体比例与作物抗病、抗逆有紧密的联系，可作为抗性的一个重要评价指标。

目前的研究表明苯丙氨酸解氨酶参与植物抗病反应，可能是木质素合成和单体组分调控机理研究的重要突破点。迄今为止，尚无通过病毒诱导的基因沉默(Virus-InducedGene Silencing,VIGS)技术编辑苯丙氨酸解氨酶基因来改良胡椒木质素及单体总量，提高胡椒抗病性的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够提高胡椒抗瘟病的胡椒PNPAL3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用。

为了达到上述目的，本发明的目的之一在于提供：胡椒PNPAL3基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明的目的之二在于提供：含有胡椒PNPAL3基因重组载体。

本发明的目的之三在于提供：胡椒PNPAL3基因编码的蛋白，氨基酸序列为SEQ IDNO:2。

本发明的目的之四在于提供：胡椒PNPAL3基因或胡椒PNPAL3基因编码的蛋白在胡椒抗瘟病中的应用。

本发明的目的之五在于提供：一种提高胡椒抗瘟病方法，对PnPAL3基因进行烟草转化，得到木质素总含量升高、G型木质素含量升高、抗病性明显提高的转基因烟草植株。

优选地，对PnPAL3基因进行胡椒VIGS转化，利用农杆菌转化获得沉默胡椒PnPALs植株，沉默胡椒PnPALs植株叶片侵染病原菌后的叶片病斑明显增大。

本发明的原理和有益效果在于：

本发明首次发现一个在胡椒中特异调控木质素合成的苯丙氨酸解氨酶基因PnPAL3。对胡椒中PnPAL3进行烟草转化，得到木质素总含量升高、G型木质素含量升高的转基因烟草植株，且转基因烟草植株的抗病性明显提高，从而为植物抗病提供新思路。

对PnPAL3基因进行胡椒VIGS转化，利用农杆菌转化获得沉默胡椒PnPALs植株，沉默胡椒PnPALs植株叶片侵染病原菌后的叶片病斑明显增大，说明沉默胡椒PnPALs植株可能具有抵抗辣椒疫霉菌的作用，在胡椒抗瘟病反应中发挥重要作用。

本发明为植物的木质素遗传改良和定向分子育种奠定了基础，为植物基因工程提供了新的基因资源，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为PnPAL3基因亚细胞定位结果图，其中Bright是明场，GFP是荧光蛋白，DAPI是细胞核染色，chlorophyⅡ是细胞质染色，merged是图片合并，35S-GFP是GFP荧光蛋白对照组，PnPAL3-GFP是PnPAL3-GFP荧光蛋白；

图2为转基因植株的PCR检测图，从左到右泳道内被检测样品株系编号依次是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，B代表空白对照，N代表阴性对照，P代表阳性对照；

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

以下实施例所用到的热引1号(P.nigrum c.v.Reyin-1，俗称印尼大叶种)为选育的胡椒主栽品种(Nature Communications volume 10,Article number:4702,2019)，该品种产量高、品质优，属于高感瘟病品种，制约着产业发展。本实施例所选用的“热引1号”采自海南省万宁市中国热带农业科学院香料饮料研究所。

一、本实施例提供了一种胡椒PNPAL3基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。胡椒PNPAL3基因编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

二、获得胡椒PnPAL3基因；

(1)具体步骤如下：

S1、提取RNA；

选择胡椒的根、茎、叶、花和授粉后2个、4个月、6个月和8个月的果实，置于液氮中，后保存在至超低温冰箱中。RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，RNA提取方法参照天根生化科技有限公司DP441多糖多酚植物总RNA提取方法。

①取50-100mg植物叶片或果实果肉在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μl裂解液SL，立即涡旋剧烈震荡混匀，12,000rpm离心2min。

②将上清液转移至过滤柱CS上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

③缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

④向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

⑤配制DNase I工作液，取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD缓冲液，轻柔混匀。

⑥向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。

⑦向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

⑧向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。重复一次。

⑨12,000rpm离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl RNase-Free dd H₂O，室温放置2min，12,000rpm离心1min，得到RNA溶液。

⑩所得RNA溶液取1ul用于琼脂糖凝胶检测完整度，另取1ul检测浓度，其余保存于-80℃冰箱中。

S2、合成第一链cDNA；

使用Thermo逆转录试剂盒合成第一链cDNA，所有操作在冰上进行，所用耗材应为RNase free。

①取1μg的RNA加入1μl的oligo dT和RNase free的无菌水至体积为12μl。将这个混合体系在65℃条件下孵育5min。

②在每一个体系中加入4μl 5×Reaction buffer、1μlRiboLock RNaseInhibitor、2μl 10mmol/L dNTP mix、1μl RevertAid M-MuLV RT，至总体积20μl，轻柔混匀后至于42℃60min，反应完成后用70℃放置5min。

③将所得cDNA模板稀释30倍，采用胡椒的内参基因pn17.1212检测模板质量，检测完成后置于-20℃保存。

S3、基因克隆；

①胡椒PNPAL3基因全长引物设计：利用primer primer 5.0设计特异性引物，正反引物分别位于5’UTR和3’UTR区，引物长度在19-24bp之间，Tm值约为60℃，GC％在40％-60％。引物合成于北京擎科新业生物技术公司。

具体引物如下：

正向引物序列(SEQ ID NO:3)：TCAGTGCAATTGTGAGCACAATTA；

反向引物序列(SEQ ID NO:4)：TGTTGCTTGAACACATGGATAACA；

②PCR反应体系：

基因扩增以逆转录所得8个组织的cDNA为模板，采用上述引物，总体系20μl，Reaction buffer 2μL，上下游引物各0.2μl(10mmol/L)，模板cDNA 2μl，用ddH₂O补至20μl，具体反应体系详见下表1，扩增程序为95℃ 3min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min 30s，35个循环，72℃5min，4℃保存。经电泳检测后，纯化回收PCR产物。

表1 PCR反应体系

③回收目的片段；

采用购买自赛默飞世尔公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收目的片段。

A、配制琼脂糖EB凝胶，电泳以分离DNA片段。任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。推荐使用新鲜的TAE/TBE电泳缓冲液，建议不要重复使用电泳缓冲液，旧的电泳缓冲液pH会增加而降低DNA的回收产量。

B、电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来，尽量去除多余凝胶。DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30s，同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜。

C、称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。一般情况下，凝胶的密度为1g/ml，凝胶体积与重量的关系换算：凝胶薄片重量为0.2g，则其体积为0.2ml；加入等倍凝胶体积的BindingBuffer，把混合物置于55℃～65℃水浴中温浴7min凝胶完全融化，其间每隔2-3min混匀一次。

D、在凝胶完全溶解之后,转移700μl至一个HiBindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干凈的2ml收集管内，室温下10,000×g离心1min，弃去液体。

E、将柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer HiBind DNA柱子中；室温下，10,000×g离心1min，去弃滤出液。

F、将柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下10,000×g离心1min，去弃滤出液。SPW Wash buffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释。

G、将柱子重新套回收集管中，重复加入700μl SPW Wash buffer HiBind DNA柱子中，室温下10,000×g离心1min，去弃滤出液。

H、弃去液体，将空柱子重新套回收集管中，10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体。

J、把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入30～50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10,000×g离心1min，离心管中的溶液就是纯化后的DNA片段，保存于-20℃。

④TA克隆：

TA克隆试剂盒购自北京全式金生物公司。

将纯化后的DNA片段与载体轻柔混匀后，4℃放置过夜。反应体系如下表2。表2中的克隆载体pEASY-T1 cloning vector购买自北京全式金生物。

表2 TA克隆载体构建体系

反应组份	体积
		克隆载体pEASY-T1 cloning vector	1μl
DNA纯化片段	3μl
		total	4μl

⑤菌落检测：

挑取单一白色圆润菌落，用通用引物M13进行PCR扩增，将获得的阳性克隆送至上海生工公司进行测序，将测序正确的菌落用80％甘油保菌，保存在-80℃冰箱中。

⑥质粒提取：

采用购买自购自赛默飞世尔公司的质粒提取试剂盒primer 5.0进行质粒提取。

A、柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

B、取1-5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

C、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

D、向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免破坏基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。

E、向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min，用移液器小心地将上清转移到过滤柱CS。P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

F、12,000rpm(～13,400×g)离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)。

G、12,000rpm(～13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

H、向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

J、所提质粒保存于-20℃冰箱中。

⑦构建VIGS载体：

A、将质粒pEASY-PnPAL与pTRV-Ve1分别用EcoR1、Kpn1酶切，并挖胶回收后，将pEASY-PnPAL回收的目的基因片段与pTRV-Ve1回收后的载体片段连接，生成pTRV-PnPAL。要保证酶切充分，但又不能让酶切时间太长。pTRV-Ve1酶切后除了载体片段还有一条100bp左右的带，如果没看到，可能是酶切不充分或跑胶时间太长。

B、挖胶回收：注意提高回收片段浓度，用20μl EB洗脱液洗脱，EB洗脱液加热到70℃可以显著提高洗脱率。连接前将回收后片段点样或测浓度，保证插入片段：载体片段质量比为3:1，连接体系为15μl(10Хbuffer 1.5μl，ligase 1μl，PCR product:vector＝3:1，加ddH₂O至15μl。

C、4℃连接过夜，热激转化大肠杆菌后挑取单克隆用基因特异引物检测。

D、阳性克隆扩繁后，提取质粒，转化农杆菌GV3101挑取单克隆进行检测。最后取三个阳性克隆摇菌，加入80％甘油，保存于-80℃备用。转化农杆菌GV3101购买自上海唯地生物技术有限公司。

⑧胡椒VIGS转化：

A、胡椒种子先进行催芽，长势一致的种子播于育苗盘中。

B、将育苗盘放在25℃光照培养箱中，湿度保持在70％，16h光照，8h黑暗。

C、等到幼苗长到子叶完全平展，可注射VIGS菌液。

D、接种前2天的晚上，把保存于-80℃的农杆菌菌株pTRV1、pTRV2、pTRVPDS、pTRVPnPAL3活化。20μl菌液加入1ml LB(50μg/m1 Kan,25ug/ml Rif)于2ml离心管中，28℃180-220rpm过夜。

E、接种前1天晚上，将活化后的菌株接种于LB培养液(100ml LB+100μl Kan+100μlRif+100μl MES+2μl AS)。28℃200rpm 16h左右。

F、第二天上午,农杆菌液OD 600＝1.0-1.2左右，将菌液收集于离心管中，6000rpm离心10min。把上清液倒掉，用重悬液调整浓度OD 600＝0.6-0.8。重悬液buffer:10mmol/LMgCl₂，10mmol/L MES，200μmol/L AS。将pTRV1分别与pTRV2、pTRVPDS、pTRVPnPAL3菌液等体积混合。

10mmol/L MgCl₂是称取MgCl₂·6H₂O于足量水中，定容至100mL，高压灭菌配得。配制后置于-20℃或-40℃进行保存。

MES为2-(N-吗琳代)乙磺酸。10mmol/L MES是称取MES溶于20mL灭菌蒸馏水中，过滤灭菌配得。配制后置于-20℃或-40℃保存

AS是乙酰丁香酮，200μmol/L AS是称取AS溶于10mL二甲基亚矾中，过滤灭菌配得。配制后置于-20℃或-40℃保存。

MgCl₂·6H₂O、MES和AS均购买自索莱宝。

G、将重悬后的菌液在室温放置3h。

H、将要注射的幼苗子叶背面用针头在叶脉间划几个小孔，用2ml注射器将混合后的菌液延着小孔注射入子叶。食指在叶片下面垫着，注射后的子叶呈浸水状，尽量保证两片子叶充分注入农杆菌。

J、注射完毕用黑塑料膜将植株盖住，避光培养12h，过夜。第二天上午将黑塑料膜揭开，放在25℃的光照培养箱，湿度保持在70％，16h光照，8h黑暗。

K、一般注射一个月后，植株可用于取样做基因干涉效率鉴定及抗病鉴定。

⑨qRT-PCR引物设计：

利用primer primer 5.0在胡椒PNPAL3基因家族ORF区设计特异性引物，引物长度在19-24bp之间，Tm值约为60℃，GC％在40％-60％，产物长度150bp-300bp。

⑩实时荧光定量PCR：

以热引1号不同组织、接种病原菌不同时间的热引1号及黄花胡椒茎部为材料，抽提RNA合成第一链cDNA为模板，设置3个机械重复，以pn17.1212为内参，反应在ABIQuantStudio6Flex荧光定量PCR仪上按表3和表4条件进行，所得数据用2-ΔΔCt的方法计算表达量，表示为均值±标准误。引物合成于北京擎科新业生物技术公司。

正向引物序列(SEQ ID NO:5)：CGCCTACGTCGATGATCCA；

反向引物序列(SEQ ID NO:6)：TCCTCAAAGGCACCAATCG；

表3 荧光定量PCR反应体系

反应组份	体积
		TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)	5μl
PCR Forward Primer(10μM)	0.4μl
		PCR Reverse Primer(10μM)	0.4μl
ROX Reference Dye(50X)	0.2μl
		DNA模板	1μl
灭菌水	3μl

表4 荧光定量PCR反应程序

循环步骤	温度	时间	循环数
				预变性	95℃	5min	/
变性	95℃	30s	40
				退火/延伸	58℃	1min30s	/

(2)实验结果：

基于Nature Communications volume 10,Article number:4702(2019)公开的胡椒基因组数据，查找胡椒PNPAL基因家族成员得到PnPAL3，对PnPAL3开展初步的生物信息学分析：

染色体定位结果显示：PnPAL3位于2号染色体上。

理化性质结果显示：PnPAL3为酸性蛋白(pH<7)，具体理化性质如下表5所示：

表5 胡椒PnPAL3基因理化性质

Motif分析结果显示：PnPAL3含有15个motif。

NCBI-CDD分析结果显示：PnPAL3含有典型的苯丙氨酸解氨酶保守结构域PAL-HAL。

基因结构分析结果显示：PnPAL3含有两个外显子和一个内含子。

(3)PnPAL3基因克隆、表达模式及亚细胞定位分析：

①基因克隆：

以胡椒“热引1号”的根、茎、叶、花和授粉后2个月、4个月、6个月和8个月的cDNA为模板，设计特异性引物，通过PCR扩增获得PnPAL3基因全长序列。

正向引物序列(SEQ ID NO:3)：TCAGTGCAATTGTGAGCACAATTA；

反向引物序列(SEQ ID NO:4)：TGTTGCTTGAACACATGGATAACA；

经测序验证PnPAL3扩增产物大小为2397bp，包括2136bp的开放阅读框，97bp的5’非编码区，164bp的3’非编码区。起始密码子在98bp的核苷酸处，该基因的开放读码框编码711aa多肽，经保守结构域查找显示该基因含有典型的苯丙氨酸解氨酶保守结构域PAL-HAL。

②表达模式分析：

PnPAL3在8个组织中均有表达，其中在胡椒的茎中表达最高，授粉后8个月的果次之，在叶片和花中表达量相差不多，在授粉后2个月和4个月的果实中表达量相差不多，在根中的表达量最低。

③由于黄花胡椒是栽培种的野生近缘种，目前黄花胡椒的基因组序列还未见报道，以栽培种基因组为参考序列，设计的特异性引物无法与黄花胡椒cDNA模板匹配，因此推测，PnPAL3可能是热引1号的特有PnPAL序列。

④亚细胞定位分析；

参照S3中的④TA克隆，构建重组载体对PnPAL3进行亚细胞定位分析，结果显示PnPAL3定位于细胞质中，如图1所示，带有绿色荧光的目的基因定位在细胞质中与蓝色的细胞核信号不重合，发挥其生物学功能且细胞膜上有一定的信号。激光共聚焦显示该蛋白定位于细胞质中，同时在细胞膜上有一定的信号。结果表明该基因在细胞质和细胞膜中发挥其生物学功能。

(4)PnPAL3基因VIGS侵染和表达量分析；

叶片注射菌液后1个月，取样检测目的基因表达量及进行表型验证。

对PnPAL3基因进行胡椒VIGS转化，利用农杆菌转化获得沉默胡椒PnPALs植株。

与未沉默PnPAL3的植株(对照组)相比，PnPAL3所取的4个沉默样品中的表达量呈下调，推测认为PnPAL3所取的4个样品均发生了基因的沉默表达。

后期根据前面基因表达的结果，对PnPAL3的4个沉默植株表型进行叶片针刺接种，根据病斑大小及感病时间对沉默植株与对照植株继续鉴定。

结果显示：PnPAL3-1、2、4在接种病原菌48h出现了叶片病斑，而对照组在72h才出现叶片病斑，继续观察到96h，PnPAL3-1、2、4植株的水质斑面积与对照组相比明显增大，因此，本实验初步断定PnPAL3对辣椒疫霉菌具有一定的抵抗作用，具体的分析有待于转化体系的优化以及更深入的研究。

二、烟草转化

S1、培育烟草；

(1)无菌条件下，将烟草种子(受体品种烟草K326)放入EP管中用无菌水冲洗2-3次，然后在75％的酒精中浸泡30-60sec；再用0.1％的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次。

(2)将处理后的烟草种子播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天，25℃光照培养20-30天后得到烟草苗。

(3)待烟草苗长至3-5cm时(20-30天)，取顶芽放于MS+BA 0.2mg/l培养基上壮芽，使其快速成长，继代培养14天后(有小叶片即可)。

(4)取叶片，大小1cm×1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+BA 1.0mg/l pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。

(5)取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。

侵染前一天晚上，摇菌农杆菌(EHA105)2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。将农杆菌以1:10比例(10ml悬菌液放1管1.5ml菌体)放入悬菌液，然后加入As 25mg/l(40ml悬菌液中加入40μl As)。

不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；

(6)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+BA 1.0mg/l+Hyg 25mg/l pH5.8。

(7)每两周更换一次培养基，直至长出不定芽(一般情况为2周)。切下再生的小苗(1cm左右)，转入继代培养基MS+BA 0.2-0.1mg/l+Hyg 25mg/l pH5.8；至小苗长至2cm长时(有小芽即可)，转接入生根培养基MS+NAA 0.2-0.1mg/l上，24±1℃、12h光照、1500lx培养三周左右即可长出粗壮根系。

上述实验所用到的MS为MS培养基，BA为6-苄氨基嘌呤；Hyg为潮霉素B；NAA为1-萘乙酸，均购买自美国Sigma-Aldrich。

(8)对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥炭：蛭石＝7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观察、记录。

(9)剪取T1代转化植株叶片，利用CTAB法抽提DNA，利用NPTII特异引物进行PCR检测。

(10)PCR反应体系，具体如下表6所示，PCR反应体系具体如表7所示：

表6 PCR反应体系

DNA样品	1μl
		10×PCR buffer	2μl
dNTP mixture(2mmol/L each)	0.4μl
		F Primer(10μmol/L)	0.2μl
R Primer(10μmol/L)	0.2μl
		rTaq DNA polymerase(1U/μl)	0.2μl
ddH<sub>2</sub>O	up to 20μl

表7 PCR反应程序

实验结果：

(1)烟草转基因植株统计：通过培养烟草无菌苗、外植体叶盘的预培养、农杆菌介导的遗传转化、筛选培养、抗性组织再生等过程获得的转化再生植株情况如下表8所示。

表8 转基因植株统计

载体(质粒)	受体品种	阴性植株数	阳性植株数
				PG132-71	K326	20	18

(2)如图2所示，用hpt引物对20株烟草转基因植株进行PCR检测，其中18株为阳性植株，株系号分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20。图2中从左到右泳道内被检测样品株系编号依次是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，图中B代表空白对照，N代表阴性对照，P代表阳性对照。PCR检测的引物序列如下表9所示。

表9 PCR检测的引物序列

S2、测定木质素：

(1)称取一定量烟草叶片(转基因与非转基因)样品于反应瓶中，加入1ml新鲜配制的反应液(将2.5％BF₃和10％EtSH溶于二氧杂环乙烷配制而成)，置于100℃恒温烘箱中反应4h，并每隔1h摇动反应瓶。然后将反应瓶置于-20℃，5min停止反应，加入0.2ml浓度为0.1mg/ml的二十四烷(溶于二氯甲烷CH₂Cl₂中)，用0.4mol/l NaHCO₃调pH＝3-4，加2ml超纯水和1ml CH₂Cl₂，涡旋，静置分层。吸取下层有机相，用无水Na₂SO₄干燥，干燥后的有机相于45℃自然挥干，得到的挥干物重新溶于0.4ml CH₂Cl₂，加入50μl嘧啶和100μl BSA，25℃静置4h，上机。

BF₃为三氟化硼，EtSH为乙硫醇，BSA为乙酰胺；三氟化硼、EtSH和NaHCO₃均购买自国药集团化学试剂有限公司。二十四烷和乙酰胺均购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

(2)仪器方法：

色谱柱：TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；

升温程序：初始温度50℃，以35℃/min的速率升温至220℃，继续以0.5℃/min的速率升温至230℃，最后以50℃/min的速率升到280℃，保持7min。

进样口温度：250℃；载气流速：1.2ml/min；

分流比：20:1；进样量：2μl；

质谱条件：离子源温度：280℃；

传输线温度：280℃；

溶剂延迟时间：5.00min；

扫描范围：40-650amu；

离子源：EI源 70eV；

表10 木质素实验结果图

实验结果：

本实验对胡椒中PnPAL3基因进行烟草转化，得到木质素总含量升高、G型木质素含量升高的转基因烟草植株，且转基因烟草植株的抗病性明显提高，从而为植物抗病提供新思路。

序列表

<110> 中国热带农业科学院香料饮料研究所

<120> 胡椒PNPAL3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用

<160> 8

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 2240

<212> DNA

<213> Piper nigrum L.

<400> 1

ggagagaaca cgggggacga gctcggtacc atggaacaaa cagccattca acagattaat 60

agtaatgggt tgtgtcttgg cggcggcggc ggcgatccgt tgaattgggg tgcagtggcg 120

gagtcgctga agggaagcca cctcgacgag gttaagcgta tggtggagga gtttaggaag 180

ccggaggtga ggctaggcgg gtcgacattg accatagccc aggttgcggc agtggcccat 240

gagggcgggg ttacggtgga gctggcggag gcggcgaggc cgcgggtgaa ggcgagcagc 300

gactgggtga tggaagggat gagcaaaggg acagacagtt atggggtcac cactggtttt 360

ggtgcaactt cccaccgtcg gaccaagcaa ggtgctgccc ttcaaaggga gctcataagg 420

ttcttgaatg caggaatctt cggaggaggg ccggagtgtg gccacacgtt gccggtcaca 480

gcaacaaggg cggccatgct cgttcggatc aacaccctcc ttcaaggcta ttctggcatc 540

cgattcgaga tcatgggggc catagccagc ctgcttaacc acaacatcac cccatgcctc 600

cccctccggg gcacaatcac tgcctccggc gacctcgtgc cactctccta cattgccggg 660

ctcctcattg gccgtcccaa ctcccgagcc gtcactcccg acggaaatcg cgtcgacgcc 720

aaagaggcct tccggctggc tggcattccc aatttctttg agctacagcc caaagaagga 780

cttgcactag tgaatggcac tgcagtaggg tcaggcttgg cctccatggt cctatttgag 840

gtcaacatcc tcgccgtcct cgccgaggtc ctctccgccg tcttctgtga ggtaatgcaa 900

ggaaagcccg aattcgccga ccacttgacc cataagctga agcaccatcc cggccagatt 960

gaggcagcgg ccatcatgga acatgtgctg gaagggagct cctacgtgaa aatggcacaa 1020

atgacacatg agatggaccc gctccaaaag cccaagcaag atcgatatgc tcttaggact 1080

tcgccacaat ggctaggccc actcatagaa gtgattagaa catcgaccaa gtcaattgag 1140

agggagatca attctgtgaa cgacaatcct ctaatcgatg tgtctaggaa caaggccttg 1200

catggtggca acttccaagg gacccccatt ggtgtgtcca tggacaacac taggttggcc 1260

attgcttcta ttgggaagct catgtttgag cagttctctg agcttgttaa tgatttttac 1320

aacaatggtt taccttctaa tctatctggg ggcagaaacc ccagcttgga ttatggattt 1380

aagggtgcag aggttgccat ggcagcctac tgctcggaat tgcaattctt gggcaatccg 1440

gtgaccaacc acgtccagag cgcggagcag cacaaccagg acgtgaactc cttagggcta 1500

atatcctcaa ggaagacggt ggaggcggtg gacattctga agctcatgtc ggccacctac 1560

attgtggcat tgtgccaggc tatcgacctg aggcacttgg aggagaacct gaaggcaaca 1620

gtgaaaaaca gtgtgattca agtgtccagg agggtactca ccatgggctt gaatggtgag 1680

ccccatccgg ccaggttttc ggagaaggat ctgatcaagg tggtggagag ggaacaagtg 1740

ttcgcctacg tcgatgatcc atgcagctct acttatcctc taatgctgaa gctaaggaat 1800

gtgctggtag agcatgccat ggccaatggg gagaaggaga gggatgccag cacttccatc 1860

tttcaaacga ttggtgcctt tgaggaggag atcaagaccc aactccccaa tgaggttgag 1920

aatgcgagaa ttgagtttga gaatgggaaa tcgtccatcc ctaacaggat caaggagtgc 1980

agatcatacc cattgtataa gtttgtaagg gaggagctca agaccagttt cctgaccggc 2040

gagaaggtgc tatcgccggg agaggagtgc gataaggtgt ttgtagcatt gtcggagctg 2100

cgaatgattg atcctctcct tgaatgctta caatcttggg atggagcccc tcttccgttc 2160

tgctaatcta gagtcgacga agatcttcca tgccatggca tgcgacgcgt cgctgcagag 2220

ctttcgttcg tatcatcgtc 2240

<210> 2

<211> 711

<212> DNA

<213> Piper nigrum L.

<400> 2

MEQTAIQQIN SNGLCLGGGG GDPLNWGAVA ESLKGSHLDE VKRMVEEFRK PEVRLGGSTL 60

TIAQVAAVAH EGGVTVELAE AARPRVKASS DWVMEGMSKG TDSYGVTTGF GATSHRRTKQ 120

GAALQRELIR FLNAGIFGGG PECGHTLPVT ATRAAMLVRI NTLLQGYSGI RFEIMGAIAS 180

LLNHNITPCL PLRGTITASG DLVPLSYIAG LLIGRPNSRA VTPDGNRVDA KEAFRLAGIP 240

NFFELQPKEG LALVNGTAVG SGLASMVLFE VNILAVLAEV LSAVFCEVMQ GKPEFADHLT 300

HKLKHHPGQI EAAAIMEHVL EGSSYVKMAQ MTHEMDPLQK PKQDRYALRT SPQWLGPLIE 360

VIRTSTKSIE REINSVNDNP LIDVSRNKAL HGGNFQGTPI GVSMDNTRLA IASIGKLMFE 420

QFSELVNDFY NNGLPSNLSG GRNPSLDYGF KGAEVAMAAY CSELQFLGNP VTNHVQSAEQ 480

HNQDVNSLGL ISSRKTVEAV DILKLMSATY IVALCQAIDL RHLEENLKAT VKNSVIQVSR 540

RVLTMGLNGE PHPARFSEKD LIKVVEREQV FAYVDDPCSS TYPLMLKLRN VLVEHAMANG 600

EKERDASTSI FQTIGAFEEE IKTQLPNEVE NARIEFENGK SSIPNRIKEC RSYPLYKFVR 660

EELKTSFLTG EKVLSPGEEC DKVFVALSEL RMIDPLLECL QSWDGAPLPF C 711

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Piper nigrum L.

<400> 3

tcagtgcaat tgtgagcaca atta 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Piper nigrum L.

<400> 4

tgttgcttga acacatggat aaca 24

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Piper nigrum L.

<400> 5

cgcctacgtc gatgatcca 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Piper nigrum L.

<400> 6

tcctcaaagg caccaatcg 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Piper nigrum L.

<400> 7

acactacatg gcgtgatttc at 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Piper nigrum L.

<400> 8

tccactatcg gcgagtactt ct 22

Claims (6)

1.胡椒PNPAL3基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.含有权利要求1所述胡椒PNPAL3基因的重组载体。

3.根据权利要求1所述的胡椒PNPAL3基因编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列为SEQID NO:2。

4.胡椒PNPAL3基因或胡椒PNPAL3基因编码的蛋白在胡椒抗瘟病中的应用。

5.一种提高胡椒抗瘟病方法，其特征在于，对PNPAL3基因进行烟草转化，得到木质素总含量升高、G型木质素含量升高、抗病性明显提高的转基因烟草植株。

6.根据权利要求5所述的提高胡椒抗瘟病方法，其特征在于，对PnPAL3基因进行胡椒VIGS转化，利用农杆菌转化获得沉默胡椒PnPALs植株，沉默胡椒PnPALs植株叶片侵染病原菌后的叶片病斑明显增大。

Images