CN113583098A

CN113583098A - 一种来源于真菌的环状拟肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113583098A
Application number: CN202110778871.6A
Authority: CN
Inventors: 沈秉正; 姚朝辉; 孟兰霞; 王娜; 胡振夏; 熊远果; 张璐; 刘盈; 沈瑶; 陈坤林
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: CN113583098B

Abstract

本发明公开了一种来源于真菌的环状拟肽及其制备方法和应用，该环状拟肽的模板分子为条件致病真菌多肽中的一段，制备时使天然氨基酸和反应基团被保护的含巯基的氨基酸逐步偶联，形成环状拟肽的线性拟肽中间体；然后使线性拟肽中间体分子内巯基共价偶联，形成二硫键，进而形成环状拟肽。该环状拟肽在浓度高达1mg/mL时，其溶血率未超过5％，具有较好的安全性；葡聚糖硫酸钠诱导的炎症性肠病模型小鼠经过该环状拟肽治疗后，体重降低程度显著改善、疾病活动指数显著降低、结肠萎缩显著缓解，且结肠匀浆液中细胞因子IL‑1β和TNF‑α水平显著降低。该环状拟肽制备工艺简单、易于纯化，毒性低、药理活性明确、动物水平治疗效果明显。

Description

一种来源于真菌的环状拟肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种来源于真菌的环状拟肽及其制备方法和应用。

背景技术

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一类以非特异性肠道炎症为特征的慢性免疫性疾病，现已成为全世界第二大常见的慢性炎性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)，具有反复发作、迁延不愈的特点，临床主要表现为腹泻、腹痛、粘液血便等消化系统症状以及乏力、体重减轻、贫血等全身症状。该病原好发于北美、欧洲等经济发达地区，但近二十余年来随着我国经济高速发展、工业化水平不断提高，环境污染以及饮食结构的变化，使得该病在我国呈逐年上升趋势，已经成为消化系统的常见疾病。有关研究表明，我国炎症性肠病的发病率位于亚洲第一，约为13.2/10万(溃疡性结肠炎约11.6/10万；克罗恩病约1.6/10万)。我国炎症性肠病具有性别差异，其中男性发病率高于女性。溃疡性结肠炎病变部位可位于中直肠、左半结肠、全结肠；而克罗恩病的病变部位大多位于结肠，以炎症、狭窄型为主，穿透型较为少见。流行病学的调查研究结果表明，溃疡性结肠炎病与克罗恩病的临床表现的发病率约为14.0％及22.3％，其中9.6％左右的溃疡性结肠炎患者和68.2％的克罗恩病患者存在并发症。西方国家炎症性肠病约为3％～5％，我国则相对较低约为0.4％；我国溃疡性结肠炎和克罗恩病患者的死亡率各为0.6％和1.4％。(参考文献：王玉芳,欧阳钦,胡仁伟,等.炎症性肠病流行病学研究进展[J].胃肠病学,2013,18(1):48-51.)

当前，炎症性肠病的致病机制尚未完全明确，目前认为该疾病与自然环境、感染、免疫紊乱、肠道菌群平衡的丧失以及遗传易感等多因素有关。①环境因素：有关研究表明，吸烟、高脂肪高胆固醇饮食、维生素D缺乏等与炎症性肠病的发生相关；饮食上，高脂肪、高多不饱和脂肪酸(PUFA)、大量肉类摄入均与炎症性肠病的患病风险的增加有关；②免疫因素：免疫异常是公认的炎症性肠病的发病机制，肠黏膜的屏障功能为肠道免疫系统的重要部分，相关研究表明患者肠黏膜受损，可能会引起细胞因子、趋化因子的分泌异常、肠黏膜通透性改变、萎缩及肠道菌群的改变；③肠道微生物：炎症性肠病的发生与肠道菌群的多样性呈负相关；相关研究发现，炎症性肠病患者中变形杆菌、白假丝酵母菌、放线菌明显增多，而酿酒酵母、拟杆菌、厚壁菌数量明显减少；肠道寄生虫能够促进转化生长因子-β(TGF-β)和白细胞介素-10(IL-10)的分泌，调控由Th1细胞介导的免疫发育，进而负向调节免疫反应；④遗传因素：据文献报道，炎症性肠病发生与NOD2基因、ATG16L1基因以及TLRs基因相关。具体而言，NOD2基因的突变可能导致炎症性肠病患者自噬功能的缺陷，ATG16L1基因的突变可能导致潘氏细胞过大量分泌抗微生物肽而引起免疫失衡，TLRs基因所编码的TLRs蛋白为重要的模式识别受体，该受体的失调能导致炎症性肠病的持续迁延不愈。

随着医疗水平的不断进步，治疗炎症性肠病的水平也不断提高，目前临床治疗该疾病的方式主要有：手术治疗和药物治疗。据统计，溃疡性结肠炎患者的手术率为17.9％，克罗恩病患者发病5年之后的手术率为52.0％，再次手术率为33.9％。因此，药物治疗仍然是主要的措施，临床用于治疗炎症性肠病代表药物见表1。

表1目前临床治疗炎症性肠病的代表药物

然而，上述临床使用的药物中激素和小分子药物(氨基水杨酸类、免疫抑制剂、抗代谢药)为已经使用多年的药物，且有一定的副作用。生物制剂(单克隆抗体)是近年来新研发上市的药物，具有副作用小、治疗作用明确等优势，但价格高昂。因此，为了能克服药物治疗中亟待解决的问题，突破临床工作的瓶颈，发现新型的具有良好的抗炎和治疗作用的候选生物药物分子刻不容缓，同时亦具有一定的经济价值及社会意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明以来源于病原真菌Trichophyton interdigitale中的多肽Triintsin为参考模板分子，经过对成熟肽的截短、末端半胱氨酸残基的修饰及二硫键的配对，制备出一种环状拟肽。该环状拟肽可抑制炎症性肠病模型小鼠结肠匀浆上清液中的炎症相关细胞因子IL-1β或/和TNF-α。同时，经该环状拟肽干预后，炎症性肠病小鼠的疾病活动指数显著降低、直肠萎缩显著缓解，小鼠生存率得到大幅度提升。

本发明提供的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供一种环状拟肽或其药学上可接受的盐，该环状拟肽的分子结构如式A所示：

第二方面，本发明提供一种环状拟肽或其药学上可接受的盐，该环状拟肽为式A中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入或添加而成的新分子。

第三方面，本发明提供一种环状拟肽或其药学上可接受的盐，该环状拟肽是与式A的氨基酸序列具有70％及以上同源性的多肽或/和拟肽。

第四方面，本发明提供一种生产上述环状拟肽或其药学上可接受的盐的方法，该方法使用天然氨基酸和反应性基团受保护且含巯基的氨基酸和/或氨基酸衍生物，通过非生物学肽合成方法实现，该非生物学肽合成方法包括：

使氨基酸和/或氨基酸衍生物逐步偶联，形成线性拟肽中间体；以及

使线性拟肽中间体分子内巯基共价偶联，形成二硫键。

具体地，反应性基团为氨基或羧基。

第五方面，本发明提供环状拟肽或其药学上可接受的盐在抑制炎症相关细胞因子中的应用：将环状拟肽或其药学上可接受的盐用于制备用于抑制炎症相关细胞因子IL-1β或/和TNF-α的工具试剂或/和药物。

第六方面，本发明提供一种用于抑制炎症相关细胞因子IL-1β或/和TNF-α的工具试剂或/和药物，其活性组分含有上述环状拟肽、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物中的至少一种。

第七方面，本发明提供一种药物组合物，其活性成分至少包括如下物质中的一种：

(Ⅰ)权利要求1所述的环状拟肽；

(Ⅱ)权利要求1所述的环状拟肽中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入或添加而成的新分子；

(Ⅲ)与权利要求1所述的环状拟肽氨基酸序列具有70％及以上同源性的多肽或/和拟肽；

(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)在药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物。

作为上述技术方案的进一步优选，该药物组合物还包括活性成分在药学上可接受的辅料，该辅料为填充剂、矫味剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水、抗氧化剂、渗透压调节剂中的至少一种。

作为上述技术方案的进一步优选，工具试剂和/或药物和/或药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂、膏剂、霜剂；药物和/或药物组合物通过注射、口服、滴鼻、滴眼中至少一种方式导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。

本发明具有以下有益效果：

①用本发明提供的环状拟肽经尾静脉给药后可使得炎症性肠病模型小鼠疾病活动指数显著降低、直肠萎缩显著缓解，小鼠生存率得到大幅度提升；

②本发明提供的环状拟肽给药前后，模型小鼠结肠匀浆液中炎症相关细胞因子IL-1β及TNF-α的水平显著降低；

③本发明提供的环状拟肽具有低溶血活性的特点，在浓度高达1mg/mL时，其溶血率＜5％，毒性较低；

④本发明提供的环状拟肽先通过多肽固相合成技术制备线性拟肽中间体，再以两端修饰后的半胱氨酸中的巯基链接成二硫键，从而形成环状拟肽，具有合成制备便捷、质量稳定可靠、生产成本低廉的优点，能够满足中试放大以及后续大规模工业化量产的需要。

附图说明

图1是本发明制备的线性拟肽中间体的HPLC图。

图2是本发明制备的线性拟肽中间体的质谱图。

图3是本发明制备的环状拟肽的HPLC图。

图4是本发明制备的环状拟肽的质谱图。

图5展示了本发明制备的环状拟肽溶血性。

图6展示了正常组、模型组及拟肽干预组小鼠体重的变化。

图7展示了正常组、模型组及拟肽干预组小鼠疾病活动指数变化。

图8展示了正常组、模型组及拟肽干预组小鼠直肠长度(萎缩程度)变化。

图9展示了经实施例2所得环状拟肽治疗前后模型小鼠结肠匀浆液中细胞因子IL-1β含量变化。

图10展示了经实施例2所得环状拟肽治疗前后模型小鼠结肠匀浆液中细胞因子TNF-α含量变化。

图11是本发明合成环状拟肽的策略图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明合成环状拟肽的模板分子来源于条件致病真菌Trichophytoninterdigitale中的多肽Triintsin(Gene Bank ID：A0A059J5P2.1)，其完整的氨基酸序列(N端→C端)：

(下划线部分为成熟肽)

(参考文献：Shen B,Song J,Zhao Y,ZhangY,Liu G,Li X,Guo X,Li W,Cao Z*,WuY*.Triintsin,a human pathogenic fungus-derived defensin with broad-spectrumantimicrobial activity.Peptides.2018,107:61-67.)

将天然多肽Triintsin的成熟肽部分截短，取中间肽段CQSIGRKFGYC(方框中的部分)，并以中间肽段为模板，以氨基乙酰化修饰的半胱氨酸、羧基酰胺化修饰的半胱氨酸以及天然氨基酸为原料，先通过多肽固相合成技术制备线性拟肽中间体，再利用N端和C端的修饰后的半胱氨酸残基中的巯基基团形成分子内二硫共价键，得到环状拟肽。本发明所涉及的环状拟肽的具体分子结构如式A所示：

本发明提供的上述环状拟肽的制备方法，具体思路为：利用多肽固相合成技术，以N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine)为起始原料，以酰胺键依次链接谷氨酰胺(Gln,Q)、丝氨酸(Ser,S)、异亮氨酸(Ile,I)、甘氨酸(Gly,G)、精氨酸(Arg,R)、赖氨酸(Lys,K)、苯丙氨酸(Phe,F)、甘氨酸(Gly,G)、酪氨酸(Tyr,Y)以及羧基酰胺化修饰的半胱氨酸，得到线性拟肽中间体。将线性拟肽中间体从树脂载体上裂解下来后，于非离子型缓冲液Tris-HCl环境中常温摇育，使线性拟肽中间体两端修饰后的半胱氨酸残基中的巯基通过共价键链接为二硫键，从而成为环状拟肽。最后利用反向高效液相色谱(Reversed-phase HighPerformance Liquid Chromatography)进行终产物的纯化，经电喷雾质谱法(Electrospray ionisation tandem mass spectrometry,ESI-MS)测定分子量。

实施例1：线性拟肽中间体的制备

在线性拟肽中间体的制备过程中，以N-乙酰-L-半胱氨酸(CAS：616-91-1，从市场购买)、2-氨基-3-巯基-丙酰胺(即L-半胱氨酸的羧基酰胺化衍生物，由杭州中肽生化有限公司提供)，以及天然L型氨基酸(谷氨酰胺Gln、丝氨酸Ser、异亮氨酸Ile、甘氨酸Gly、精氨酸Arg、赖氨酸Lys、苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、酪氨酸Tyr)为原料，按照设计的目标分子的结构依次在固相树脂载体上进行缩合链接。将9-芴甲氧羰基(FMOC)作为氨基端的保护基团，选用4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂(Rink amide MBHA resin)为拟肽分子合成的固相树脂载体，以1-羟基苯并三唑/二环己基碳二亚胺(HOBt/DCC)为缩合剂。以N-乙酰-L-半胱氨酸为起始物，由羧基端向氨基端方向延长肽链。通过质量百分比(m/m)为95％三氟乙酸(TFA)、2.5％的水和2.5％的三异丙甲硅烷(TIA)的混合液，将合成的线性拟肽中间体从固相树脂载体上裂解下来。用乙醚反复沉淀后，采用制备型RP-HPLC进行纯化。使用Bondapak C18(30mm×300mm,15μm)半制备柱，流动相：A相：乙腈；B相：水；流动相添加2‰(v/v)的三氟乙酸。梯度洗脱条件：0～60min，乙腈由0线性升高至70％(v/v)。流速为3.0mL/min。再通过分析型RP-HPLC进行检测，制备的线性拟肽中间体的保留时间为13.708min，将主峰按照面积归一化法计算，所制备的线性拟肽中间体的纯度为97.61％(图1)。冻干后存于-20℃冰箱备用。经电喷雾电离质谱(ElectrosprayIonization Mass Spectrometer,ESI/MS)测定，其分子量为m/z 1303.2[M+H]⁺，m/z 652.5[M+2H]²⁺，m/z 435.7[M+3H]³⁺(图2)，与拟制备的线性拟肽中间体理论分子量一致(线性拟肽中间体理论分子量为1302.48Da)。

实施例2：环状拟肽的合成

以实施例1中制备的线性拟肽中间体为原料，取10mg线性拟肽中间体于20mL塑料离心管中，用锡箔纸包裹离心管使其避光，加入10mL浓度为0.15M(pH＝8.0)的Tris-HCl缓冲液。将离心管管盖拧紧后用Pharfim封口膜密封，并确认无漏液。颠倒离心管，使线性拟肽中间体完全溶解，并立即将离心管置于恒温摇床中于(25±2)℃，转速50～60rpm孵育约30小时，以加速线性拟肽两端的巯基基团形成分子内二硫键，从而形成环状拟肽。

使用C18反向制备柱(300mm×30mm,10μm)，经制备型RP-HPLC纯化。流动相：A相：乙腈；B相：水；流动相添加2‰(v/v)的三氟乙酸。梯度洗脱条件：0～60min，乙腈由0线性升高至70％(v/v)。流速为3.0mL/min。收集主峰洗脱液，冻干后备用。经分析型RP-HPLC检测，环状拟肽的保留时间RT为14.185min，其纯度为98.91％(图3)。经ESI/MS测定，其分子量为m/z1301.3[M+H]⁺，m/z 651.1[M+2H]²⁺，m/z 434.8[M+3H]³⁺(图4)，与环状拟肽的理论分子量一致(环状拟肽理论分子量为1300.48Da)。线性拟肽中间体的m/z为1303.2[M+H]⁺，环状拟肽m/z为1301.3[M+H]⁺，相差1.9Da，与巯基形成二硫键时脱去的两个氢原子的分子量相符合。另外，线性拟肽的色谱保留时间为13.708min，而环状拟肽的色谱保留时间为14.185min，相差0.477min，说明线性拟肽成环后，分子的极性发生了变化(分析型HPLC色谱条件相同)，这可能是由于分子成环后极性基团被包在环内，从而使整个分子的极性降低。

实施例3：环状拟肽溶血活性的测定

从健康的人体抽取新鲜血液，分离出人红细胞，并将其制成红细胞悬液，灭菌生理盐水作为阴性对照、1％的Triton X-100作为阳性对照，测定实施例2所得环状拟肽的溶血活性。

具体步骤如下：抽取健康人的新鲜血液于EDTA抗凝管中，轻轻颠倒，使血液充分接触抗凝管底部和管内壁的抗凝剂。室温下1000rpm离心5min，将上层的血浆弃去，保留位于下层的红细胞。加入2～3倍体积的医用生理盐水注射液，轻柔颠倒使离心管底部的红细胞悬浮，重复上述步骤，直至上层清液变为无色；用医用生理盐水注射液将洗净的红细胞配成2％(v/v)浓度的红细胞悬液。将实施例2所得环状拟肽用医用生理盐水注射液溶解，分别配成2000μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL和62.5μg/mL的环状拟肽溶液。将100μL 2％(v/v)的红细胞悬液分别与100μL不同浓度的环状拟肽溶液混合，使环状拟肽的终浓度分别为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL和31.25μg/mL。阳性对照为含有1％TritonX-100的红细胞悬液，阴性对照为红细胞悬液。将上述样品在37℃恒温、50rpm转速下摇育1小时。待样品降至室温，将96孔板2000rpm离心8min；在每个样品孔中取100μL上清转移至另一个新开封的96孔板中；于490nm波长处用酶标仪测定样品的吸光度，通过以下公式计算环状拟肽的溶血百分率，(H为490nm波长处的吸光度值)：

如图5所示。

结果表明，实施例2所得环状拟肽在浓度高达1mg/mL时，溶血率＜5％，说明其具有极低的溶血性，安全性较高。

实施例4：炎症性肠病模型小鼠的构建及环状拟肽的干预

将6～8周龄重量为(19±0.5)g的SPF级C57BL/6小鼠18只，在温度为(22±2)℃、光照/黑暗12小时交替的环境中适应性饲养7天后随机分为三组，分别为正常组、模型组和拟肽干预组，每组各6只。正常组正常饮食、饮水；模型组给予用灭菌注射用水配制的分子量36000～50000Da的4％葡聚糖硫酸钠(Dextran Sodium Sulfate，DSS)；拟肽干预组给予4％DSS，同时尾静脉注射50μL浓度为100μg/mL的无菌环状拟肽溶液，无菌环状拟肽溶液通过将实施例2所得环状拟肽溶于医用生理盐水注射液中配制而成。持续给药7天，第8天颈椎脱臼处死小鼠。

实施例5：正常组、模型组和拟肽干预组小鼠体重、疾病活动指数、结肠长度的变化

每天固定时间称量实施例4正常组、模型组和拟肽干预组的小鼠体重。理论上正常组小鼠的体重应缓慢增加，模型组小鼠的体重应显著降低，而拟肽干预组小鼠的体重变化则可直观反应实施例2所得环状拟肽干预后的效果。

疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分是评估实验动物结肠损伤模型常见的指标，可以用于评估用DSS造模后小鼠发生的腹泻、体重下降、便血等症状，每天记录实验小鼠的体重、活动情况、排便的性状、是否便血等，具体的评分方法如下表所示：

表2疾病活动指数DAI评分表

实验小鼠结直肠的长度变化是以病灶部位反应疾病的重要定量指标之一。具体实验步骤如下：脱颈椎处死小鼠，小鼠死亡后，仰卧位固定四肢，将75％医用酒精喷于小鼠皮肤，重点区域为小鼠腹部。沿着腹部中线剖开小鼠腹腔至肛门处，用直头眼科剪在小鼠肛门皮肤与直肠连接处剪断，沿着刚猛部直肠向下逐渐向上剥离肠管周围组织及肠系膜，直至在右下腹附近找到小鼠回肠、盲肠处，剪断回肠与盲肠的连接处，最后取出回盲部到肛门处的结肠，自然伸展开，小心平铺于4℃层析柜的A4白纸上，按组测量每只小鼠的结直肠的长度。

实验结果表明：

①正常组小鼠体重缓慢增加，由实验开始时的(18.96±0.10)g增加至实验结束时的(19.51±0.45)g；模型组小鼠体重由实验开始时的(18.99±0.12)g降低至实验结束时的(14.90±0.74)g；拟肽干预组小鼠体重由实验开始时的(18.94±0.09)g降低至实验结束时的(16.92±0.48)g。以上结果说明，经环状拟肽干预后，DSS诱导的炎症性肠病模型小鼠的体重降低程度明显好转，且较之于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

②实验疾病活动指数是评价实施例2所得环状拟肽治疗效果的关键指标之一，正常组小鼠的DAI评分为0，第七天模型组DAI评分为(8.67±0.82)，而第七天拟肽干预组小鼠的DAI的评分(5.17±0.75)。评分数据表明，DSS模型组评分明显高于正常组，而环状拟肽干预后各组的DAI得分有所降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

③结肠长度亦是反应疾病及治疗效果的重要指标，正常组小鼠结肠长度为(7.02±0.45)cm；造模七天后DSS模型组小鼠的结肠长度缩短明显，仅为(5.08±0.18)cm；经过实施例2所得环状拟肽干预七天后，拟肽干预组小鼠结肠萎缩情况较之于模型组有明显好转，结肠长度有所增加，长度为(6.39±0.27)cm，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。

综合以上实验结果，用DSS诱导后小鼠呈现出明显的疾病状态，经实施例2所得环状拟肽干预后，治疗组小鼠的体重降低(图6)、疾病活动指数(图7)、结肠萎缩程度(图8)均有明显的改善。因此，实施例2所得环状拟肽对炎症性肠病具有较好的治疗与改善作用。

实施例6：环状拟肽治疗前后模型小鼠结肠匀浆液中细胞因子IL-1β及TNF-α变化

有研究表明IL-1β能调控NF-κB信号通路，从而减少咬合蛋白的表达，同时促进肌球链蛋白的分泌。TNF-α是炎症性肠病在发生和进展过程中由巨噬细胞表达分泌的关键炎症相关细胞因子，它能够改变紧密连接的组织结构和功能来减弱上皮细胞的屏障功能，肠道上皮屏障变化(通透性增加)可促进肠道炎症的发生。因此，抑制血清IL-1β及TNF-α炎症相关细胞因子有助于该病的发展，对于治疗炎症性肠病具有积极的意义。

按照以下步骤制备小鼠结肠组织匀浆液，首先将结肠组织剪碎，与PBS缓冲液(pH＝7.35)以1:(8～10)的比例混匀。然后用匀浆机以8～10秒/次，间隙8秒的频率进行匀浆。最后于4℃12500rmp离心8分钟。丢弃沉淀，收集上清。分装后存储于-80℃冰箱中保存备用。用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，测定实施例4正常组、模型组、拟肽干预组小鼠结肠匀浆液上清中细胞因子IL-1β及TNF-α水平的变化。

正常小鼠(阴性对照组)结肠匀浆液上清中炎症相关细胞因子IL-1β及TNF-α均处于较低水平，上清液每毫克总蛋白中的含量分别为(154.12±20.36)pg和(205.76±28.06)pg。而模型组小鼠结肠匀浆液上清，每毫克总蛋白中上述两种细胞因子水平均呈现出较大幅度的升高，分别为(446.68±39.45)pg和(789.28±89.69)pg，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。经实施例2所得环状拟肽治疗两周后，以上两种小鼠结肠匀浆液上清中每毫克总蛋白中上述两种细胞因子含量分别为(230.65±26.51)pg和(335.39±61.34)pg，较之于模型组，血清细胞因子水平均有显著的降低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。因此，实施例2所得环状拟肽具有明显抑制病灶部位炎症相关细胞因子IL-1β及TNF-α的作用，结果如图9和图10所示。

实施例7：片剂

取实施例2所得环状拟肽0.5g、淀粉5.0g、糊精9.5g充分混合均匀，加入质量浓度为50％～55％(m/m)的药用级聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为粘合剂，制粒、整粒、压片，即得片剂。

实施例8：凝胶剂

取20mL蒸馏水，于液面上均匀撒入药用级卡波姆940，立即搅拌使其充分溶胀。加入丙二醇后混合均匀，搅拌状态下滴加三乙胺制得凝胶基质。将0.5g实施例2所得环状拟肽溶于10mLPBS溶液中(0.15M，pH＝7.3)，在不断搅拌下将其缓慢加入凝胶基质中。最后补加灭菌蒸馏水，即得约30g环状拟肽凝胶。

实施例9：注射用冻干粉

将实施例2所得环状拟肽5g、甘露醇50g，置于容器中，加适量PBS缓冲液(0.15M，pH7.4)溶解，加灭菌注射用水至750mL，充分混匀，加20～30g针用活性炭，室温搅拌1小时，粗滤后立即用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装，每瓶2.5mL。采用速冻的方式降温，每分钟降温10～20℃，降温至﹣55～﹣60℃，保持低温3小时后抽真空，在真空状态下以(3～5)℃/小时的速率开始缓慢升温，待温度慢慢升至(24±2)℃时停止升温，待温度接近室温后将样品从冻干机中取出，加盖密封，即得环状拟肽冻干粉针剂。

综上所述，经过本发明提供的环状拟肽干预后，急性炎症性肠病模型小鼠的疾病活动指数显著降低、直肠萎缩显著缓解，小鼠生存率得到大幅度提升，同时该环状拟肽具有抑制小鼠病灶部位炎症相关细胞因子IL-1β和TNF-α表达的作用。因此，本发明提供的环状拟肽或/和其药物组合物可为抑制炎症因子和/或治疗炎症性肠病的新药及其制剂的研发提供新的参考。

以上实施例为本发明实施较佳的方式，但本发明的实施并不受上述实施例的限制，所有未背离本发明技术原理和精神实质前提下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，均包括在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种环状拟肽或其药学上可接受的盐，其特征在于，该环状拟肽的分子结构如式A所示：

2.一种环状拟肽或其药学上可接受的盐，其特征在于：该环状拟肽为式A中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入或添加而成的新分子。

3.一种环状拟肽或其药学上可接受的盐，其特征在于：该环状拟肽是与式A的氨基酸序列具有70％及以上同源性的多肽或/和拟肽。

4.一种生产权利要求1～3任一项所述的环状拟肽或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于：该方法使用天然氨基酸和反应性基团受保护且含巯基的氨基酸和/或氨基酸衍生物，通过非生物学肽合成方法实现，该非生物学肽合成方法包括：

使氨基酸和/或氨基酸衍生物逐步偶联，形成权利要求1～3所述的环状拟肽的线性拟肽中间体；以及

使线性拟肽中间体分子内巯基共价偶联，形成二硫键。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述反应性基团为氨基或羧基。

6.权利要求1～3任一项所述的环状拟肽或其药学上可接受的盐在抑制炎症相关细胞因子中的应用，其特征在于：将所述环状拟肽或其药学上可接受的盐用于制备用于抑制炎症相关细胞因子IL-1β或/和TNF-α的工具试剂或/和药物。

7.一种用于抑制炎症相关细胞因子IL-1β或/和TNF-α的工具试剂或/和药物，其特征在于：其活性成分含有权利要求1～3任一项所述的环状拟肽、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物中的至少一种。

8.一种药物组合物，其特征在于：其活性成分至少包括如下物质中的一种：

(Ⅰ)权利要求1所述的环状拟肽；

(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)在药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物。

9.根据权利要求7所述的用于抑制炎症相关细胞因子IL-1β或/和TNF-α的工具试剂或/和药物、权利要求8或9所述的药物组合物，其特征在于：还包括所述活性成分在药学上可接受的辅料，所述辅料为填充剂、矫味剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水、抗氧化剂、渗透压调节剂中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的用于抑制炎症相关细胞因子IL-1β或/和TNF-α的工具试剂或/和药物、权利要求8或9所述的药物组合物，其特征在于：所述的工具试剂和/或药物和/或药物组合物为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂、膏剂、霜剂；所述药物和/或药物组合物通过注射、口服、滴鼻、滴眼中至少一种方式导入肌肉、内皮、皮下、静脉或粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。