CN113567430B - 一种芥子气检测用纳米探针及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种芥子气检测用纳米探针，是表面修饰有G四聚体的抗污磁性微珠，表示为MB@P(C‑H)‑G4，其中MB为磁性微珠，P(C‑H)为具有抗污能力的高分子刷，G4为链状的G四聚体前体。本发明提供了利用富含鸟嘌呤的G四聚体催化体系为信号识别和输出元件，选择抗污的磁性纳米颗粒为载体，将G四聚体‑血红素核酸酶催化体系引入到分子刷型磁性纳米颗粒界面，构建了适合于各种复杂基质中快速可视化检测芥子气的比色方法，不仅灵敏度均高于现有方法，且适合长期保存，自身具有的样品基质净化功能，能够避免光度法常见的基质干扰问题，显著克服假阳性和假阴性干扰，具有媲美实验室质谱分析的灵敏度和灵活应对不同场景的使用便捷性。

Description

一种芥子气检测用纳米探针及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于有毒物质检测领域，尤其涉及一种芥子气检测用纳米探针及其制备方法和用途。
背景技术
芥子气（Sulfur mustard, SM），即二(2-氯乙基)硫（dichlorodiethyl sulfide），属于化学武器中的糜烂性毒剂，中毒后无特效药。芥子气经皮肤、呼吸道、消化道吸收后可致全身吸收中毒，因此芥子气中毒的临床表现呈多样性。鉴于其易于制造和储存，缺乏解毒剂或特殊治疗及合成、生产、储存、转让和使用方面的易用性，对民众安全造成巨大威胁。
截止目前为止，基于仪器的芥子气分析已经在离子迁移谱(IMS)，气相色谱-质谱(GC-MS)，以及液相色谱-质谱(LC-MS)的基础上有很好的发展。虽然这些方法定量准确、灵敏度高，但由于操作复合和需要使用大型的仪器，检测需要将样品送至专门的实验室才能操作，难以适用于突发事件中对芥子气的现场快速侦检。SM的有机分子探针被开发为光学检测。但一般荧光探针需要溶于有机溶剂中进行检测，会对待检测物质表面产生污染或者损坏，而且需要取样进行检测，无法做到快速现场检测。CN112812764A，公开了基于荧光探针的芥子气检测方法，其是芥子气荧光检测与标记的水基可喷射组合物，不含有机溶剂，在室温下实现鼻塞、荧光检测物体表面的芥子气。CN111892609A公开了一种检测芥子气的荧光探针和检测试纸，试纸对芥子气的“裸眼”检出限低于2.5ppm。但是上述基于荧光探针的检测芥子气方法需有机合成设计复杂有机探针分子，并且稳定性不好，需要现用现制备，长期存放检测结果可能存在较大偏差。此外，荧光探针分子不能避免光度法常见的基质干扰问题，可能出现假阳性或者假阴性的情况。
CN110514640A公开了一种基于无机敏感层的表面增强拉曼光谱检测，可以用于芥子气的检测。但是携带拉曼光谱仪，检测样品范围有限，需匹配样品前处理方法。整体使用不方便，无法做到快速检测。
此外，采用胆碱氧化酶或卤代烷烃脱卤酶的SM的生物传感器也已被开发出来，可以参考文献Biosens Bioelectron 2019, 129, 15-23.或者文献Anal Chem 2016, 88(11), 6044-9。但使用酶的方法在还不能满足高灵敏性，简单和经济的高校可视化的检测。而且酶通常价格昂贵、不易获得，容易失活。
因此，亟需开发一种操作方便，灵敏度高，稳定性好，可快速现场检测环境中暴露芥子气高灵敏、准确可靠的检测方法。
发明内容
为克服现有技术中检测芥子气技术的不足，本发明提供了一种基于芥子气对鸟嘌呤的烃化性质，利用富含鸟嘌呤（G）的G四聚体催化体系为信号识别和输出元件，选择抗污的磁性纳米颗粒为载体，将G四聚体-血红素核酸酶催化体系（G-quadruplex-heminDNAzymes）引入到分子刷型磁性纳米颗粒界面，构建了适合于各种复杂基质中快速可视化检测芥子气的比色方法，方法具有很好的灵敏度和基质适用性。本发明独特的设计不仅灵敏度均高于现有方法，且适合长期保存，自身具有的样品基质净化功能，能够避免光度法常见的基质干扰问题，显著克服假阳性和假阴性干扰，具有媲美实验室质谱分析的灵敏度和灵活应对不同场景的使用便捷性。
芥子气是一种反应活性很强的烷基化试剂，优选在鸟嘌呤(G)的N7或者O6位置反应。最丰富的SM-G加成物(N7-HETEG，61%)已经被用作SM生物标记物质。基于上述N7-HETEG的免疫色谱条也已经被开发为体外诊断人体暴露芥子气情况的商品化产品。但是该方法灵敏度差，仅用于评价戒子气急性暴露，不能检测戒子气原型和环境暴露的芥子气分子。基于此，本发明提出了一种全新的芥子气可视化快速现场检测用纳米探针，性质稳定，使用简便，无需依赖仪器、成本低、响应快速，对样品种类限制少，无需样品前处理、裸眼可见检测结果、灵敏度高，方法选择性好。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种芥子气检测用纳米探针，其特征在于，是表面修饰有G四聚体的抗污磁性微珠，表示为MB@P(C-H)-G4，其中MB为磁性微珠，P(C-H)为具有抗污能力的高分子刷，G4为链状的G四聚体前体。
进一步地，所述磁性微珠MB是SiO2包覆的Fe3O4磁珠，接枝有抗污高分子刷的磁性微珠MB@P(C-H)是通过RAFT工艺合成，具体是在MB的分散液中，加入RAFT链转移剂，惰性气氛下回流反应得到接枝RAFT链转移剂的磁性微珠，加入引发剂和抗污高分子刷的单体，进行RAFT反应得到MB@P(C-H)。
优选地，所述RAFT链转移剂为含有硅氧烷基和三硫代碳酸酯的化合物，在本发明一个实施例中所述述RAFT链转移剂为三甲氧基硅三硫代碳酸乙酯(CTA)。
优选地，所述抗污高分子刷的单体为3-((3-甲基丙烯酸氨基丙基)二甲基铵)-丙酸盐(CBMAA)和羟丙基甲基丙烯酰胺(HEMA)按照摩尔比1-5：1-5的混合单体，优选为CBMAA和HEM按照摩尔比1-2:1-2的混合单体。所述引发剂没有特别的限定，能够引发单体发生RAFT聚合即可，比如本领域常见的AIBN，BPO等。
优选地，所述G四聚体前体是富含碱基为鸟嘌呤(G)的链状核酸序列，在合适的条件下(一般是pH7-8的缓冲溶液，K盐10-90mM，血红素5-10mM)可以形成G四聚体。在本发明一个具体实施方式中，所述G四聚体前体中碱基为G的脱氧核苷酸单元数量占核酸序列的50%以上，优选在60%以上。
更优选地，所述G四聚体的核酸序列为SEQ NO.1：5’-CTGGG AGGG AGGGA-3’，SEQNO.2: 5’-TTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’； SEQ NO.3：TTGGGTAGGGCGGGTTGGG3’； SEQ NO.4：5-TGGG TAGGG CGGG TTGGG AA-3’；SEQ NO.5：5’-GTGGG TAGGG CGGG TTGGG-3’；SEQ NO.6：5’-GTGGG TCATT GTGGG TGGG TGTGG-3’; SEQ NO.7： 5’- GGTTG GTGTG GTTGG-3’ 。
优选地，本发明表面修饰有G四聚体的抗污磁性微珠中，G四聚体的接枝密度为0.01-0.3mg/g，优选为0.10-0.13mg/g，合适的G四聚体接枝密度下对于检测稳定性，信噪比，灵敏度均为最佳。G4的接枝密度太小，灵敏度低, 达不到所需要的检测效果；接枝密度太高，抗污高分子刷的对G4的保护能力会下降,导致检测不准。
优选地，在抗污磁性微珠中，作为核的Fe3O4直径为80-150nm，中间层的SiO2厚度为5-20nm，外层的抗污高分子刷P(C-H)厚度为10-30nm；更优选地，作为核的Fe3O4直径为100-120nm，中间层的SiO2厚度为10-15nm，外层的抗污高分子刷P(C-H)厚度为15-20nm；进一步优选地，抗污磁性微珠的饱和磁化为30-50 emu g-1。
本发明还提供了所述芥子气检测用纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(S1)向磁性微珠的分散液中加入带有硅氧烷基的RAFT链转移剂，在惰性气氛下加热回流得到偶联RAFT链转移剂的磁性微珠；
(S2)加入引发剂和抗污高分子刷的单体，引发聚合，得到抗污高分子刷接枝的磁性微珠MB@P(C-H)；
(S3)MB@P(C-H)和端基为氨基的G4四聚体前驱体耦合反应后得到表面修饰有G四聚体的抗污磁性微珠MB@P(C-H)-G4，即所述芥子气可视化快速现场检测用纳米探针。
进一步地，在上述制备方法中，步骤(S1)中将所述带有硅氧烷基的RAFT链转移剂为三甲氧基硅三硫代碳酸乙酯(CTA)；惰性气氛为氮气或氩气；反应温度为60-80℃，反应时间2-5小时。
步骤(S2)中，所述引发剂没有特别的限定，本领域常用语自由基引发聚合的引发剂即可，比如AIBN，BPO等。所述抗污高分子刷的单体为3-((3-甲基丙烯酸氨基丙基)二甲基铵)-丙酸盐(CBMAA)和羟丙基甲基丙烯酰胺(HEMA)按照摩尔比1-2:1-2的混合单体。步骤(2)中聚合反应温度为引发剂对应的引发聚合温度，比如对于AIBN，反应温度为70-100℃。反应时间1-4h。
步骤(S3)中，所述耦合反应是氨基和羧基的耦合反应，其反应条件为本领域所熟知。比如采用EDC和琥珀酰亚催化活化，在弱碱性条件反应20-30h，在本发明一个具体实施方式中，所述弱碱性条件是在pH为8-9的缓冲溶液中进行，比如10-50mM NaHCO3缓冲液。端基为氨基的G4四聚体前体物质的量和MB@P(C-H)质量的比例是5×10-5~15×10-5mmol:1g，以满足MB@P(C-H)-G4上G4前体的接枝密度。
所述端基为氨基的G四聚体前体结构表达为：5'-NH2-连接臂-富含G的脱氧核糖核苷酸链-3’。所述连接臂为5-12个碱基不含鸟嘌呤(G)的的脱氧核糖核苷酸链，优选为6-10个碱基为胸腺嘧啶(T)的脱氧核糖核苷酸链，比如d(T6)，d(T7)，d(T8)，d(T9)；所述富含G的脱氧核糖核苷酸链共含有10-30个脱氧核糖核苷单元，其中碱基为鸟嘌呤(G)的脱氧核糖核苷单元占50%以上；优选地，所述富含G的脱氧核糖核苷酸链共含有12-20个脱氧核糖核苷单元，其中碱基为鸟嘌呤(G)的脱氧核糖核苷单元占60%以上。
优选地，所述端基为氨基的G四聚体前驱体为5'-NH2 -TTTTTT CTGGG AGGG AGGGA-3’。
本发明还提供了所述纳米探针在检测环境中芥子气的用途。
进一步地，所述芥子气纳米探针在检测环境中芥子气的用途，包括以下步骤：
(T1)MB@P(C-H)-G4水溶液中加入不同浓度的标准芥子气(SM)的溶液，孵育后，MB@P(C-H)-G4经过外磁场洗涤收集，分散于含有金属离子的缓冲溶液中备用；
(T2)将血红素的碱性溶液加入到步骤(T1)所得缓冲溶液中，80-95℃条件下加热5-30min，冷却至室温，形成G -四聚体/Hemin DNA酶；加入双氧水和四甲基联苯胺，静置后测试372±20nm出吸光度(A372)。
(T3)以SM浓度和A372作图，得线性关系；根据线性关系，可以测试环境中SM的浓度。
步骤(T1)中，所述含有金属离子的缓冲溶液中，金属离子为Na+，K+中的至少一种，浓度为10-50mM。金属离子的存在，特别是K离子，能够稳定G四聚体。所述缓冲溶液中还含有缓冲试剂，比如Tris HCl Triton X-100，HEPES，MOPS，PIPES，柠檬酸钠，巴比妥钠-盐酸中的至少一种；其浓度为本领域所熟知，比如对于Tris HCl，适宜的浓度为10-30mM，对于Triton X-100，适宜的浓度为0.02-0.10wt%。
步骤(T1)中，体系中MB@P(C-H)-G4的浓度为10-100μg mL-1，标准SM溶液的浓度在0.1-30.0 μmol L-1。
步骤(T2)中，所述血红素的碱性溶液的浓度和加入量是使加入后，体系中血红素的浓度为10-50mM，体系pH为7-7.5；双氧水和四甲基联苯胺的加入量使加入后体系中的双氧水和四甲基联苯胺的浓度分别为0.5-2mM和0.2-1mM。
步骤(T3)中，所述线性关系是A372=1.41-1.11CSM，本领域技术人员应该清楚的是，由于试验误差等情况，上述线性关系中的数值，即1.41和1.11可能存在一定程度的变化。少量偏离上述线性关系的关系式，涵盖在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种芥子气可视化快速现场检测方法，包括以下步骤：过使用不同浓度标准SM溶液 得到的颜色变化和检测样品的颜色进行比对，通过目视观察颜色接近程度来预测可能的含量，实现裸眼可视化的芥子气定性或半定量的检测方法。
附图说明
图 1 是本发明检测芥子气的示意图；
图2是制备例2得到MB@P(C-H)的TEM照片；
图3是MBs，MB@P(C-H)，MB@P(C-H)-G4m的红外谱图；
图4是MBs，MB@P(C-H)，MB@P(C-H)-G4m的TGA图；
图5是MBs，MB@P(C-H)，MB@P(C-H)-G4m的饱和磁化率图；
图6是不同偶联密度的MB@P(C-H)-G4*和没有接枝P(C-H)的MB@G4*的荧光强度；
图7是EAD2，EAD2混合SM后的圆二色谱(CD)；
图8是EAD2缓冲溶液中逐渐加入0~50μmol L-1的SM体系颜色的变化情况；
图9是实施例1缓冲溶液中TMB的吸光度和SM浓度关系图；
图10是实施例1缓冲溶液中吸光度和SM浓度对数的线性关系图；
图11是本发明所得纳米探针在不同介质中裸眼可视化定性检测芥子气图像。
具体实施方式
以下以具体实施方式对本发明保护内容进行进一步地解释说明，但是应该理解，具体实施方式的内容并不应理解为是对本发明保护内容的限制。
EAD2（5'-CTGGG AGGG AGGGA-3'），5'端带有poly（dT6）pacer的NH2-EAD2（5'-NH2 - TTTTTT CTGGG AGGG AGGGA），用荧光染料标记的NH2-EAD2-FAM，5'-NH2- TTTTTT CTGGG AGGGAGGGA-FAM-3'），Sybr Gold均购自Invitrogen生物技术有限公司。S1核酸酶（100 U µL-1）采购自Thermo Scientific™。纯度超过95%的芥子气由中国人民解放军防化研究院提供，纯度超过95%。
CBMAA：3-((3-甲基丙烯酸氨基丙基)二甲基铵)-丙酸盐，参照文献Banerjee, I.,Pangule, R.C., Kane, R.S., Adv. Mater. 2011, 23, 690-718合成。
HEMA:羟丙基甲基丙烯酰胺。
吸收光谱是在Shimadzu UV 3600紫外-可见-近红外分光光度计上测量的。电镜照片在通过JEM-2100F透射电子显微镜（JEOL Ltd.，日本）得到。流体动力学直径和ζ-电位通过Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments）测试。磁性能是在物理性能测量设备（Cryogenic，12T Magnet）测试。热重分析（TGA）是在TGA Q500测试。衰减全反射-傅里叶变换红外光谱仪配备了ATR装置（ATR-FTIR，Bruker Invenio）。甲基溴用ICP-OES（IRISAdvantage，Thermo Scientific）测试。圆二色谱（CD）测量是在CD光谱仪（Chirascan，英国）上进行的。
制备例1 链转移剂(CTA)三甲氧基硅三硫代碳酸乙酯
CTA按文献(Qu, Z.; Hu, F.; Chen, K.; Duan, Z.; Gu, H.; Xu, H., J. Colloid and Interface Sci. 2013, 398, 82-87)报道的方法合成。具体是将1-丙硫醇(6.6 mmol)加入K3PO4 (1.02 g, 6.6 mmol)的无水丙酮(15 mL)的搅拌悬浮液中，搅拌约半小时。加入CS2 (1.1 mL, 18 mmol)，溶液变为亮黄色。再搅拌10 min后，加入(4-(氯甲基)苯基)-三甲氧基硅烷(1.43 mL, 6.6 mmol)，在常温氮气气氛下搅拌13 h，用二氯甲烷稀释后过滤。在减压下将溶剂从滤液中去除后，在硅胶上用石油醚/乙酸乙酯梯度柱层析纯化得到亮黄色的油，得到产物三甲氧基硅三硫代碳酸乙酯。
合成路线如下：
Figure 395376DEST_PATH_IMAGE001
。
制备例2 MB@P(C-H)-G4的制备
修饰G四聚体的抗污磁性微珠[MB@P(C-H)-G4]按照如下方法制备：
SiO2包覆的Fe3O4磁珠（MBs）的制备参考文献(Deng, Y.; Cai, Y.; Sun, Z.;Liu, J.; Liu, C.; Wei, J.; Li, W.; Liu, C.; Wang, Y.; Zhao, D. J. Am. Chem.Soc. 2010, 132, 8466–8473. )
通过典型的RAFT工艺合成了抗污聚合物刷接枝MBs[MB@P(C-H)]：50mgCTA 加入到100mL分散有MBs的无水乙醇悬浮液中，MBs浓度为1.0mg/mL。在氮气中回流5 h，收集得到CTA-MBs，用乙醇洗涤3次。CTA-MBs悬浮在乙醇中，加入AIBN(20mg)和HEMA(2mmol )和CBMAA(1mmol)溶于10mL无水DMF得到的溶液，溶液体系充氮气鼓泡30min，在80℃下反应2h，产物用去离子水洗涤3次得到抗污聚合物刷接枝的MBs[MB@P(C-H)]。
NH2-EAD2通过典型的EDC催化的氨基-羧基耦合反应在MB@P(C-H)上共价连接：将上述得到的MB@P(C-H) (0.1 g 分散在10 mL纯水中)首先被N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)(10mg/mL)和EDC(20mg/mL)的10 mM的 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中活化，30 min后，除去上清液，平均分成三份，分别加入0.05 mL、0.1 mL和0.15 mL NH2-EAD2(0.1 mmol L-1)，在10 mmol L-1 NaHCO3缓冲液中室温下反应24 h，制备不同接枝密度的MB@P(C-H)-G4，分别是MB@P(C-H)-G4L(Low，低密度，0.034±0.04mg/g)、MB@P(C-H)-G4M(medium，中密度，0.12±0.038mg/g)和MB@P(C-H)-G4H(high，高密度，0.24±0.05mg/g)。
同时，荧光标记的EAD2 (NH2-EAD2- FAM)也以与NH2-EAD2相同的方法共价连接到MB@P(C-H)上，得到荧光标记的修饰G四聚体的抗污磁性微珠，MB@P(C-H)-G4*。具体方法是MB@P(C-H) (0.1 g 分散在10 mL纯水中)被磺基-NHS(10 mg mL-1)和EDC (20 mg mL-1)在1.0 mL 10 mM MES缓冲液中活化30 min，除去上清液，分成三等份，分别加入0.05 mL、0.1mL、0.15 mL的NH2-EAD2-FAM (0.1 mmol L-1)，在10 mmol L-1 NaHCO3缓冲液中室温反应24h，分别制备得到MB@P(C-H)-G4L*（0.03±0.006mg/g）、MB@P(C-H)-G4M*(0.13±0.035mg/g)、MB@P(C-H)-G4H* (0.25±0.06mg/g)。利用NH2-EAD2-FAM制备的标准曲线进行荧光定量分析，量化NH2-EAD2-FAM与MB@P(C-H)之间的连接比(linkage ratio)。
图2是制备例2得到MB@P(C-H)的TEM照片。图2A，图2B，图2C分别是不同放大倍数的TEM照片。可以看出MB@P(C-H)呈单分散的球形，图2C可以看出，作为核的Fe3O4直径约为110nm，中间层的SiO2厚度约为10nm，外层的抗污高分子刷P(C-H)厚度为15-20nm。
图3是MBs，MB@P(C-H)，MB@P(C-H)-G4m的红外谱图。可以看出，相对于MBs，MB@P(C-H)在1729、1650和1440-1390 cm-1附近出现的的峰分别对应P(C-H)的中的-C=O、-NH2和脂肪族C-H键的拉伸振动。修饰EAD2后，在1620、1548、1418、1387 cm-1处出现了新的峰，分别归属于-P=O拉伸、N-H弯曲、芳香环和C-N/O拉伸键，这表明EAD2已经成功共价偶联。
图4是MBs，MB@P(C-H)，MB@P(C-H)-G4m的TGA图。可以看出，与NH2-MBs的热失重约2%相比，接枝的P(C-H)占总重量的约13%，在与EAD2共轭后，MB@P(C-H)-G4M的重量损失进一步增加到17%。
图5是MBs，MB@P(C-H)，MB@P(C-H)-G4m的饱和磁化率图。可以看出，MB@P(C-H)-G4m的饱和磁化率为35.8emu g-1,而且磁化曲线表现出对称性并通过原点，保证了本发明制备得到的MB@P(C-H)-G4从样品基体中容易分离，使得随后的检测不收基质的干扰，并且可以方便的重复使用。
对比制备例1不接枝抗污高分子刷的磁性微珠(环氧-MBs)的制备
环氧-MBs制备方法：将3-缩水甘油丙氧基三甲氧基硅烷50μL加入100mL乙醇分散的磁性颗粒（MBs，浓度1mg/mL）加热回流该溶液体系4小时后，外加磁场除去乙醇反应溶液，并反复用无水乙醇清洗，经真空干燥后获得环氧磁性颗粒(环氧-MBs)。
作为对照，环氧-MBs也分别与NH2-EAD2和NH2-EAD2- FAM偶联。具体是将环氧- MBs(0.1 g 分散在 10 mL 纯水中)分散在10 mmol L-1 NaHCO3水溶液中，加入0.1 mL NH2-EAD2(0.1 mmol L-1)或NH2-EAD2- FAM (0.1 mmol L-1)分别制备得到MB@G4或MB@G4*。
上述制备例2和对比例制备例1得到的磁性微珠MBs分散在S1核酸酶缓冲溶液中，配制为具有相同的铁浓度23ppm的溶液，铁浓度测试具体是磁性颗粒在王水中消解后，测试三价铁离子含量，铁浓度的测试按照电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)进行。
采用G4脱氧核糖核苷酸单链(ssODN)作为识别元件存在核酸酶降解的问题，会限制了检测的稳定和精确的信号转导。为了验证本发明MB@P(C-H)对ssODN免受S1核酸酶降解的保护能力，接枝在MBs上的ssODN都用荧光染料进行标记。将1 mL 1.0 mg mL-1的MB@P(C-H)-G4L* 、MB@P(C-H)-G4M* 和MB@P(C-H)-G4H*，分别分散在S1核酸酶工作缓冲液（1μg/mL）中，反应4 h后，离心收集上清液，测定其荧光强度。如图6所示，在没有S1核酸酶存在的PBS缓冲溶液中，MB@P(C-H)-G4*的上清液的荧光基本没有变化，荧光信号减少少于5%；添加S1核酸酶后，荧光强度都有一定增高，荧光强度越高，就说明核酸降解越严重， MB@G4*没有P(C-H)保护，最容易被降解，所以荧光强度最高，表示降解越严重。而MB@P(C-H)-G4 由于有抗污高分子刷的保护，所以荧光强度虽然升高了，但升高程度不高，其中高密度的MB@P(C-H)-G4H荧光强度升高的比较多，说明随着偶联核酸密度的增加，P(C-H)保护效力逐渐增弱，可能是因为空间位阻的作用，P(C-H)保护作为一个保护层，把核酸包裹住了防止核酸被降解，如果核酸密度特别大，P(C-H)包不住，就有部分的G4核酸会暴露出来，然后被降解。但即使发生一定程度降解，也并不阻碍本发明目的的实现。以上结果表明抗污界面可以有效地保护ssODN不被S1降解，但是P(C-H)保护效力是随着偶联核酸密度的增加而降低的。
对比制备例1得到的不接枝抗污高分子刷的荧光标记的修饰G四联体的磁性微珠(MB@G4*)，观察到上清液中S1核酸酶降解依赖性的荧光信号增强，估计MBs上约80%的EAD2被降解了。而对于接枝了抗污高分子刷的MB@P(C-H)-G4*，FL信号随着G4*密度的增加而提高，这表明在一定的共轭密度范围内，P(C-H)具有抗污能力，
根据上述结果，MB@P(C-H)-G4被选择用于进一步的传感应用。受益于P(C-H)的发丝状的纳米结构，1g的MB@P(C-H)-G4M含有约0.42mg EAD2，比对比制备例1的MB@G4高出约5倍。此外，冻干的MB@P(C-H)-G4M可以很好地分散在水溶液中，即使储存了6个月，也显示出稳定的感应能力。最重要的是，以具有抗污界面的P(C-H)作为高分子脚手架(scaffold )可以提供显著的抗核酸酶能力和配体装载能力，所有这些特征都确保了本发明纳米探针的出色感应性能。
实施例1
图7是EAD2和EAD2混合SM后的圆二色谱(CD)，其中EAD2浓度为1.0μmol L-1，SM浓度为25μmol L-1。可以看出，EAD2可以折叠成一个平行的G-四联体，但在用SM处理后，这种特定的结构就消失了，这从在265nm附近消失的CD吸收中可以看出。这一假设也通过监测EAD2DNA酶对TMB的抑制催化能力得到了验证。图8是基于TMB/H2O2比色法的EAD2/hemin DNA酶缓冲溶液中逐渐加入0~50μmol L-1的SM体系颜色的变化情况，可以看出随着SM浓度增大，体系的颜色逐渐变淡，说明SM与EAD2反应，从而抑制其DNA酶的活性，最后未能将TMB氧化成其绿色产物。说明本发明提供的方法可以做到快速，现场，可视化地检测芥子气是否存在，并且可以裸眼根据颜色的变化做到半定量的检测。
在EAD2 (100 μL, 1.0 μmol L-1)中加入一系列5 ~ 50 μmol L-1(5， 10 ，20，30，40，50 μmol L-1)标准SM溶液，孵育2 h后分析。用CD光谱和比色法检测SM处理前后EAD2的构象，该定性试验目的是为了验证二者能反应。具体机制为：EAD2 在形成G4之后，会在CD光谱的263nm处形成一个明显的吸收峰，如果加了芥子气烷基化EAD2后，EAD2 不能形成G4，也就没有出现CD峰。这个260nm附近的CD吸收峰的是一个形成G4的三级结构指认峰。
SM测定:在MB@P(C-H)-G4M水溶液(50 μg mL-1)中加入标准SM溶液(分别为0.5，1，2，3，5，6，8，10 μmol L-1)0.2 mL溶液；孵育2 h后，MB@P(C-H)-G4M经外磁场洗涤收集，再分散于缓冲溶液(10 mmol L-1 Tris HCl, 40 mmol L-1 KCl, 0.05% Triton X-100)中。然后将血红素（25 mmol L-1在 0.01 mol L-1 NaOH中）加入上述缓冲溶液中，在90℃加热10 min后，逐渐冷却至室温，生成G -四联体/Hemin DNA酶。缓冲液用水洗涤后，磁性颗粒通过磁场吸附回收，加入H2O2 (1.0 mmol L-1)和四甲基联苯胺（TMB ，0.5 mmol L-1)，室温静置30min，选择372 nm处的吸收强度进行定量分析。
测试MB@P(C-H)-G4M的对SM的检测能力。TMBox(氧化价态的TMB，即蓝色比色物质)的吸光度信号以SM剂量依赖的方式下降（图9）。通过将372nm处的峰强度与SM的浓度进行拟合，得到线性关系式（图10）：A372=1.41-1.11CSM，R2=0.983，其中A372代表372nm处吸光度，CSM代表SM的浓度，单位μmol L-1。线性范围确定为0.5-10 μmol L-1，计算出检测限为0.32 μmol L-1，监测的日间(intra-day)和日内(inter-day)精密差值度分别为18.2%和15.4%。
实施例2
我们还检查了常见的金属离子对本发明SM传感纳米探针可能存在的干扰。所测试的金属离子（Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+, Co2+, Fe3+）都没有引起吸光度的变化，除了Ag+，因为其可以螯合鸟嘌呤中的N7和C6O基团，从而抑制G4/Hemin DNA酶的形成。为了解决这个问题，可以使用诸如EDTA等螯合剂被用来作为Ag+的掩蔽剂，但注意不能使用含巯基的掩蔽剂，否则SM会与巯基化合物发生反应。
实施例3
采用不同的基质的样品用来评估本发明SM传感纳米探针的适用性。所有样品都添加了0.05至10μmol L-1SM，然后用优化的方法进行测定。为了研究该方法的选择性，使用了不同的离子和典型的有机干扰物。结果如下表1所示，数据为3次测量的平均值。
表1：
Figure 852902DEST_PATH_IMAGE002
。
本发明提供的芥子气检测用纳米探针性质稳定，使用简便，无需依赖仪器、成本低、响应快速，对样品种类限制少，无需样品前处理、裸眼可见检测结果(见图11，在水，油，织物的不同介质检测芥子气定性判断情况)、灵敏度高，方法选择性好。通过磁场吸附可以排除基质干扰，并且可以做到回收利用。经过测试，回收利用10次后，线性关系，检测限，准确度基本没有变化。
序列表
<110> 北京市疾病预防控制中心
<120> 一种芥子气检测用纳米探针及其制备方法和用途
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgggaggga ggga 14
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgggtaggg cgggttggg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgggtaggg cgggttggg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgggtagggc gggttgggaa 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgggtaggg cgggttggg 19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgggtcatt gtgggtgggt gtgg 24
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggttggtgtg gttgg 15

Claims (7)

1.一种芥子气检测用纳米探针，其特征在于，是表面修饰有G四聚体前体的抗污磁性微珠，表示为MB@P(C-H)-G4，其中MB为磁性微珠，P(C-H)为具有抗污能力的高分子刷，G4为链状的G四聚体前体；所述磁性微珠MB是SiO2包覆的Fe3O4磁珠，接枝有抗污高分子刷的磁性微珠MB@P(C-H)是在MB的分散液中，加入RAFT链转移剂，惰性气氛下回流反应得到接枝RAFT链转移剂的磁性微珠，加入引发剂和抗污高分子刷的单体，进行RAFT反应得到MB@P(C-H)；
所述抗污高分子刷的单体为3-((3-甲基丙烯酸氨基丙基)二甲基铵)-丙酸盐(CBMAA)和羟丙基甲基丙烯酰胺(HEMA)按照摩尔比1-5:1-5的混合单体；
所述G四聚体前体是富含碱基为鸟嘌呤(G)的链状核酸序列，G四聚体前体中碱基为G的脱氧核苷酸单元数量占核酸序列的50%以上；
表面修饰有G四聚体的抗污磁性微珠中，G四聚体前体的接枝密度为0.10-0.13mg/g。
2.根据权利要求1所述的芥子气检测用纳米探针，其特征在于，所述RAFT链转移剂为含有硅氧烷基和三硫代碳酸酯的化合物。
3.根据权利要求1所述的芥子气检测用纳米探针，其特征在于，所述G四聚体前体的核酸序列为以下序列之一：
SEQ NO.1：5’-CTGGG AGGG AGGGA-3’；
SEQ NO.2: 5’-TTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；
SEQ NO.3：TTGGGTAGGGCGGGTTGGG3’；
SEQ NO.4：5-TGGG TAGGG CGGG TTGGG AA-3’；
SEQ NO.5：5’-GTGGG TAGGG CGGG TTGGG-3’；
SEQ NO.6： 5’-GTGGG TCATT GTGGG TGGG TGTGG-3’；
SEQ NO.7： 5’- GGTTG GTGTG GTTGG-3’ 。
4.根据权利要求1所述的芥子气检测用纳米探针，其特征在于，在抗污磁性微珠中，作为核的Fe3O4直径为100-120nm，中间层的SiO2厚度为10-15nm，外层的抗污高分子刷P(C-H)厚度为15-20nm；抗污磁性微珠的饱和磁化为30-50 emu g-1。
5.权利要求1-4任一项所述芥子气检测用纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(S1)向磁性微珠的分散液中加入带有硅氧烷基的RAFT链转移剂，在惰性气氛下加热回流得到偶联RAFT链转移剂的磁性微珠；
(S2)加入引发剂和抗污高分子刷的单体，引发聚合，得到抗污高分子刷接枝的磁性微珠MB@P(C-H)；
(S3)MB@P(C-H)和端基为氨基的G4四聚体前体耦合反应后得到表面修饰有G四聚体前体的抗污磁性微珠MB@P(C-H)-G4，即所述芥子气可视化快速现场检测用纳米探针。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述端基为氨基的G四聚体前体结构表达为：5'-NH2-连接臂-富含G的脱氧核糖核苷酸链-3’，所述连接臂为5-12个碱基不含鸟嘌呤(G)的脱氧核糖核苷酸链；所述富含G的脱氧核糖核苷酸链共含有12-20个脱氧核糖核苷单元，其中碱基为鸟嘌呤(G)的脱氧核糖核苷单元占60%以上。
7.权利要求1-4任一项所述芥子气检测用纳米探针在检测环境中芥子气的用途。
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