CN113567413A - 一种基于低频拉曼散射技术检测单胺类神经递质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于低频拉曼散射技术检测单胺类神经递质的方法，属于拉曼检测技术领域。本发明根据拉曼检测实验提出了单胺类神经递质具有很强的低频拉曼信号，比高频拉曼信号强一个数量级，其检测限可以达到小于10‑6 g/L，满足多种疾病的临床检测需求。
Description
技术领域
本发明属于拉曼检测领域，具体涉及一种基于低频拉曼散射结合表面增强技术对单胺类神经递质浓度的检测方法及其检测衬底。
背景技术
人体中存在几十种功能各异的神经递质，在神经信号传递和诸多生理过程中起到了重要的作用。根据神经递质的大小可以分成两大类：小分子神经递质和神经肽类递质。其中小分子神经递质按照其化学性质又可分为胆碱类、单胺类、氨基酸类和嘌呤类。组胺、多巴胺、5-羟色胺、肾上腺素和去肾上腺素均属于单胺类神经递质。其中，组胺在人体中的含量与过敏症状直接相关，且有研究表明其在中枢神经系统中的含量与帕金森综合征、嗜睡症和认知障碍等疾病有关；多巴胺则与抑郁症、帕金森综合病、精神分裂症、Tourette综合症、注意力缺陷多动综合症和成瘾行为等疾病的发生有关；5-羟色胺又名血清素，在心血管系统的血管收缩和胃肠道内的平滑肌收缩中发挥作用，神经系统中5-羟色胺的缺乏会导致抑郁症的产生；肾上腺素会使心脏收缩力增加，皮肤、粘膜的血管收缩，其缺乏与多种心血管疾病与中枢神经系统疾病有关，是临床心脏复苏、过敏性休克、心脏骤停等的首选药物。因此，对于单胺类神经递质在人体体液中的含量及其变化的测定，在医学、神经学和生理学研究，多种疾病诊断及相关治疗药物量的控制等方面都具有重要意义。目前针对这类小分子的检测方法主要包括电化学检测法、高效液相色谱法和酶联免疫吸附法等。但由于单胺类神经递质在生物样品中含量较低，环境复杂，干扰分子较多，上述方法普遍存在灵敏度低、耗时长、成本高等缺点。因此开发出一种针对单胺类神经递质的高灵敏、快速、低成本的检测技术成为医学及神经学上亟待解决的一项重要任务。
拉曼光谱技术具有快速、简单、无损等优点，表面增强拉曼散射(SERS)利用贵金属表面的等离激元对拉曼信号进行了放大，使检测灵敏度大大提高，甚至可以达到单分子级。因此SERS技术受到了研究人员的极大关注，并在食品检测、疾病诊断、环境监测、化学分析等领域得到了广泛的应用。目前，对单胺类神经递质的拉曼散射检测仅针对高频部分(>200cm-1)，检测精度较低，不能满足医学检测上的需要。
发明内容
为了解决目前单胺类神经递质检测精度不够高的问题，本发明提供了基于低频拉曼散射结合表面增强技术对单胺类神经递质浓度的检测方法及其检测衬底。
实现本发明目的的技术解决方案是：该单胺类神经递质的表面增强拉曼检测衬底包括表面增强拉曼散射(SERS)纳米颗粒和超疏液聚集基底，其中，所述SERS纳米颗粒为金纳米颗粒与二氧化硅薄壳组成的核壳结构纳米粒子；所述超疏液聚集基底包括聚四氟乙烯滤膜和全氟聚醚油。
进一步的，所述的SERS纳米颗粒中，其内核为直径10～15nm的金纳米粒子，外壳为厚度1～2nm的二氧化硅薄壳。
进一步的，所述SERS纳米颗粒的紫外可见吸收峰在515～520nm处。
进一步的，超疏液聚集基底通过将0.5mL全氟聚醚油滴加在聚四氟乙烯滤膜上，在匀胶机上以1000rpm旋转1分钟，甩去多余的全氟聚醚油后得到。
进一步的，所述的全氟聚醚油其平均分子量在500～15000。
进一步的，所述的聚四氟乙烯滤膜的孔径为220nm，厚度为50μm。
本发明还提供了一种单胺类神经递质的表面增强拉曼检测方法，将所述的SERS纳米颗粒与含待测单胺类神经递质的血清样品混合后在所述的超疏液聚集基底上干燥形成一定直径的聚集点，对聚集点进行低频拉曼光谱的测量。
进一步的，单胺类神经递质包括组胺、多巴胺、5羟色胺和肾上腺素。
进一步的，将含待测单胺类神经递质的血清样品置于离心式超滤管中以8000rpm离心5分钟，去除大分子的杂质，取超滤管底部液体作为待测样品，其中，离心式超滤管的分子截留量≤3kDa。
进一步的，将所述的SERS纳米颗粒与含待测单胺类神经递质的血清样品按照体积比3∶1混合后在所述的超疏液聚集基底上蒸干。
进一步的，将所述的SERS纳米颗粒与含待测单胺类神经递质的血清样品按照体积比3∶1混合后，取40μL混合溶液滴加在所述的超疏液聚集基底上，在鼓风干燥箱中90℃下干燥10分钟直至形成直径500±10μm的聚集点。
进一步的，将所述的SERS纳米颗粒与含待测单胺类神经递质的血清样品混合后在所述的超疏液聚集基底上干燥，干燥过程中混合溶液与基底的接触角始终大于90°。
进一步的，使用超疏液聚集基底对聚集点进行拉曼光谱的测量，检测波数限定在30～200cm-1之间，将获得的含待测单胺类神经递质血清样品的低频拉曼光谱与标准单胺类神经递质样品的低频拉曼光谱相对比，即可得出该待测单胺类神经递质的浓度，其中，拉曼激光波长与所述的SERS纳米颗粒的紫外可见吸收峰位相匹配。
与现有技术相比，本发明的主要优点如下：
1.本发明提出的表面增强拉曼检测衬底，制备简单，成本低廉，拉曼信号增强效果好，重复性高，且适用于不同生物样品的复杂环境。
2.本发明提出的基于表面增强低频拉曼散射检测单胺类神经递质的方法其检测限可以达到小于10-6g/L，满足多种疾病的临床检测需求，为这些疾病的诊断与相关治疗药物量的控制提供了一种快速、简单、高精度的测量方法。
应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。另外，所要求保护的主题的所有组合都被视为本公开的发明主题的一部分。
结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中的相应操作步骤均用文字在图中进行标注。为了清晰起见，在每个图中，并非每个步骤部分均被描述。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：
图1为4种单胺类神经递质粉末的拉曼光谱及理论计算结果。
图2为本发明实施例中SERS增强纳米颗粒的透射电子显微镜图。
图3为本发明实施例中SERS纳米颗粒的紫外可见吸收谱。
图4为本发明实施例中SERS纳米颗粒与待测样品混合物在超疏液聚集基底上90℃蒸干的过程的接触角图，及蒸干后聚集物的扫描电镜图。
图5为本发明含有不同浓度组胺的模拟人体体液环境样品的表面增强拉曼光谱。
图6为本发明含有不同浓度组胺的血清样品的表面增强拉曼光谱。
图7为本发明血清样品、SERS纳米颗粒和SERS纳米颗粒与血清样品混合物滴在超疏液聚集基底蒸干后的表面增强拉曼光谱。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所述附图说明如下。
在本发明中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本发明的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。
本发明利用低频拉曼识别单胺类神经递质(组胺、多巴胺、5羟色胺和肾上腺素等)的方法。本发明根据拉曼检测实验提出了单胺类神经递质具有很强的低频拉曼信号，比高频拉曼信号强一个数量级。结合理论计算，我们发现由于特殊的分子结构，4种单胺类神经递质存在很强的低频拉曼峰(＜200cm-1)，比高频拉曼峰(>200cm-1)强一个数量级左右。证明了所述的低频拉曼信号由单胺类神经递质分子侧链上的C-C键的扭转振动引起，为对应分子的本征信号，可用于识别对应单胺类神经递质的存在。而现有的基于拉曼光谱对单胺类神经递质的检测，均针对高频拉曼峰进行测量。
发明人首先对单胺类神经递质的低频拉曼的起源进行了探索。首先发明人用HORIBA公司的T64000拉曼光谱仪对组胺、多巴胺、5羟色胺和肾上腺素的粉末样品的拉曼光谱进行了检测，采用波长为514.5nm(绿光)的氩离子激光器为检测光源。其低频区(＜200cm-1)最强峰比高频区(>200cm-1)最强峰强一个数量级以上。其次发明人通过Gaussian09量子化学计算软件，采用密度泛函理论(DFT)中的B3LYP方法，在6-311G**基组水平上对4种单胺类神经递质的结构进行了优化，并根据入射光的频率、温度和拉曼活性计算了其拉曼振动强度。
拉曼振动强度计算公式：
计算结果表明，4种单胺类神经递质均存在很强的低频拉曼信号，该信号起源于环链结构分子尾链上的两个C-C键的扭转振动。这两个扭转振动引起了电子云密度分布的极大改变，进一步引起了分子极化率的改变，从而产生了很强的低频拉曼光谱。其中，图1给出了4种单胺类神经递质测试结果及理论计算结果。
本发明所述的单胺类神经递质的表面增强拉曼检测方法，包括如下步骤：
S1，测试标准单胺类神经递质样品的低频拉曼光谱
S11，将单胺类神经递质与血清配成标准浓度的混合液，在离心式超滤管中8000rpm离心5分钟，去除大分子的杂质，取超滤管底部的液体作为标准样品，其中，离心式超滤管的分子截留量≤3kDa。
S12，将标准样品与实施例中的SERS纳米颗粒溶胶按照体积比1∶3混合，取40μL混合溶液滴加在实施例中的超疏液聚集基底上，在鼓风干燥箱中90℃干燥10分钟，混合溶液逐渐浓缩直至形成直径500μm左右的聚集点，干燥过程中混合溶液接触角始终大于90°。
S13，以波长为514.5nm(绿光)的氩离子激光器为检测光源，检测波数限定在30～200cm-1之间，对上述聚集点进行低频拉曼光谱的测量，得到标准组胺样品的低频拉曼光谱。
S2测试含待测单胺类神经递质的血清样品的低频拉曼光谱
S21，将含待测单胺类神经递质的血清样品在离心式超滤管中8000rpm离心5分钟，去除大分子的杂质，取超滤管底部的液体作为待测样品，其中，离心式超滤管的分子截留量≤3kDa。
S22，将待测样品与实施例中的SERS纳米颗粒溶胶按照体积比1∶3混合，取40μL混合溶液滴加在实施例中的超疏液聚集基底上，在鼓风干燥箱中90℃干燥10分钟，混合溶液逐渐浓缩直至形成直径500μm左右的聚集点，干燥过程中混合溶液接触角始终大于90°。
S23，以波长为514.5nm(绿光)的氩离子激光器为检测光源，检测波数限定在30～200cm-1之间，对上述聚集点进行低频拉曼光谱的测量，得到待测样品的低频拉曼光谱。
S3，将S2得到的待测样品的低频拉曼光谱与S1得到的标准样品的低频拉曼光谱相对比，即可得出该待测样品中的单胺类神经递质实际浓度。
紫外可见吸收峰位由金颗粒尺寸决定，随金颗粒直径的增大而增大。本发明中，SERS纳米颗粒的内核为直径约10～15nm的金纳米粒子，外壳为厚度1～2nm的二氧化硅薄壳。SERS纳米颗粒的紫外可见吸收峰根据颗粒尺寸计算和光谱检测可确定在约515～520nm处。拉曼光谱测试时，拉曼激光波长选择514.5nm与SERS纳米颗粒的紫外可见吸收峰位515～520nm相匹配。
实施例
本实施例提供了一种核壳结果的表面增强拉曼检测衬底。该表面增强拉曼检测衬底包括两部分，SERS纳米颗粒和超疏液聚集基底。
SERS纳米颗粒制备：将100mL浓度为0.01wt％的氯金酸水溶液加热至110℃，然后将8mL浓度为1.00wt％的柠檬酸钠水溶液快速注入氯金酸溶液中，所得的混合溶液在110℃下继续加热30分钟，即可得到直径约15nm的金纳米颗粒溶胶。取30mL所述的金纳米颗粒溶胶，加入0.4mL浓度为1mM的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，磁子搅拌10分钟。浓度为0.54wt％的硅酸钠溶液用稀盐酸调节pH＝10.2，取3.2mL硅酸钠溶液加入上述溶液，磁子搅拌3分钟。将搅拌后的混合溶液90℃油浴15分钟，即可到二氧化硅包裹的金纳米颗粒。7000rpm离心15分钟去除杂质后，再用去离子水分散得到核壳结构纳米粒子溶胶。该溶胶为所述的SERS纳米颗粒。SERS增强纳米颗粒的透射电镜如图2所示，图2中，该SERS纳米颗粒的内核为规则的球体,其表面外壳厚度均匀无破损。相应的紫外可见吸收光谱如图3所示。
超疏液聚集基底的制备：0.5mL平均分子量在1800左右的全氟聚醚油，滴加在孔径为220nm、厚度为50μm的聚四氟乙烯滤膜上，在匀胶机上以1000rpm的速度旋转1分钟，甩去多余的全氟聚醚油，即可得到超疏液聚集基底。
应用例1：
本应用例基于表面增强低频拉曼散射对模拟人体体液环境中不同浓度的组胺进行检测，本应用例中的人体体液环境由PBS缓冲溶液(pH＝7.4)来模拟。
第一步，用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)和组胺粉末配置组胺浓度为10-4g/L，10-5g/L，10-6g/L，10-7g/L和10-8g/L的模拟体液组胺混合液作为标准待测样品。
第二步，将标准待测样品与实施例中的SERS纳米颗粒溶胶按照体积比1∶3混合。取40μL混合溶液滴加在实施例中的超疏液聚集基底上。在鼓风干燥箱中90℃干燥10分钟。混合溶液逐渐浓缩直至形成直径500μm左右的聚集点，干燥过程中混合溶液接触角始终大于90°。干燥过程的接触角变化及蒸干后聚集物的扫描电镜如图4所示。
第三步，以波长为514.5nm(绿光)的氩离子激光器为检测光源，对上述聚集点进行低频拉曼光谱的测量，测试结果如图5所示。由图5可知，不同组胺浓度的样品低频段信号均强于高频段，低频段的检测限(信噪比＜3)可以达到10-8g/L，该精度比常用于检测生物分子的电化学法高一个数量级以上。
应用例2：
本应用例基于表面增强低频拉曼散射对血清中不同浓度的组胺进行检测，本应用例中的血清为购买于ThermoFisher公司的马血清。
第一步，用血清和组胺粉末配置组胺浓度为10-2g/L，10-3g/L，10-4g/L，10-5g/L和10-6g/L的血清组胺混合液。在离心式超滤管中分别加入1mL的上述混合液，8000rpm离心5分钟，去除大分子的杂质。取超滤管底部的液体作为标准待测样品。
第二步，将标准待测样品与实施例中的SERS纳米颗粒溶胶按照体积比1∶3混合。取40μL混合溶液滴加在实施例中的超疏液聚集基底上。在鼓风干燥箱中90℃干燥10分钟。混合溶液逐渐浓缩直至形成直径500μm左右的聚集点，干燥过程中混合溶液接触角始终大于90°。
第三步，以波长为514.5nm(绿光)的氩离子激光器为检测光源，对上述聚集点进行低频拉曼光谱的测量，测试结果如图6所示。由图6可知，不同组胺浓度的样品低频段信号均强于高频段，低频段的检测限(信噪比＜3)可以达到10-6g/L，该精度已经达到临床上对于过敏的诊断的要求。图7展示了血清样品，SERS纳米颗粒以及SERS纳米颗粒与血清样品混合物滴在超疏液聚集基底蒸干后的表面增强拉曼光谱，结果表明这三者均没有明显的低频拉曼信号，不会对测量结果产生影响。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。
Claims (10)
1.一种单胺类神经递质的表面增强拉曼检测衬底，其特征在于，包括SERS纳米颗粒和超疏液聚集基底，其中，所述SERS纳米颗粒为金纳米颗粒与二氧化硅薄壳组成的核壳结构纳米粒子；所述超疏液聚集基底包括聚四氟乙烯滤膜和全氟聚醚油。
2. 如权利要求1所述的检测衬底，其特征在于，所述的SERS纳米颗粒中，其内核为直径10~15 nm的金纳米粒子，外壳为厚度1~2 nm的二氧化硅薄壳。
3. 如权利要求1所述的检测衬底，其特征在于，所述SERS纳米颗粒的紫外可见吸收峰在 515~520 nm处。
4. 如权利要求1所述的检测衬底，其特征在于，超疏液聚集基底通过将0.5 mL全氟聚醚油滴加在聚四氟乙烯滤膜上，在匀胶机上以1000 rpm旋转1分钟，甩去多余的全氟聚醚油后得到。
5.如权利要求1所述的检测衬底，其特征在于，所述的全氟聚醚油其平均分子量在500~15000。
6.一种单胺类神经递质的表面增强拉曼检测方法，其特征在于，将如权利要求1-5所述的SERS纳米颗粒与含待测单胺类神经递质的血清样品混合后在如权利要求1-5所述的超疏液聚集基底上干燥形成一定直径的聚集点，对聚集点进行低频拉曼光谱的测量。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，单胺类神经递质包括组胺、多巴胺、5羟色胺和肾上腺素。
8. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，将含待测单胺类神经递质的血清样品置于离心式超滤管中以8000 rpm离心5分钟，去除大分子的杂质，取超滤管底部液体作为待测样品，其中，离心式超滤管的分子截留量 ≤ 3 kDa。
9.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，将所述的SERS增强纳米颗粒与含待测单胺类神经递质的血清样品按照体积比3:1混合后在所述的超疏液聚集基底上蒸干。
10. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，使用超疏液聚集基底对聚集点进行拉曼光谱的测量，检测波数限定在30~200 cm-1之间，将获得的含待测单胺类神经递质的血清样品的低频拉曼光谱与标准单胺类神经递质样品的低频拉曼光谱相对比，即可得出该待测单胺类神经递质的浓度，其中，拉曼激光波长与所述的SERS纳米颗粒的紫外可见吸收峰位相匹配。
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