CN113564155A

CN113564155A - 适配体筛选方法及其应用

Info

Publication number: CN113564155A
Application number: CN202110831036.4A
Authority: CN
Inventors: 李三暑; 段安琪
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-07-22
Also published as: CN113564155B

Abstract

本发明公开了适配体筛选方法及其应用。该方法可用于筛选与小分子结合的适配体。本发明的筛选方法可以解决目前SELEX技术所存在的实验设计困难、筛选流程复杂等问题，更重要的是，运用此方法可以筛选得到的RNA适配体一方面是适体酶，另一方面又是人工核糖开关，可以应用于基因的5’或3’端，直接调控基因的表达。总而言之，本发明的方法可以用于产生与小分子结合的适配体，从而用于各类检测、诊断辅助等，也可以作为人工核糖开关调控基因表达。

Description

适配体筛选方法及其应用

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及适配体及筛选方法。

背景技术

目前适配体主要是由一种名为“SELEX”的体外筛选技术而得到。传统的SELEX技术是以合成的随机DNA文库开始的，其筛选过程十分繁琐，耗时较长。随后，各种新的SELEX技术随之被开发出来，例如：对于大分子分离有效的硝酸纤维素膜过滤的SELEX、基因组SELEX(Genomic SELEX)、small RNA transcriptomic SELEX(smaRt-SELEX)、Capture-SELEX等，这些改良技术使SELEX的应用更为广泛。但遗憾的是目前存在的SELEX技术仍然存在实验设计困难、筛选流程复杂等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了适配体筛选方法及其应用。

本发明的目的一方面，是解决现有的SELEX技术存在的问题，提出一种全新的适配体筛选方法，将工具酶中不影响剪切位点的原始序列替换为随机序列，使得工具酶结构被破坏不能发生剪切，由此构建文库；加入目标分子后，目标分子与随机序列结合并发生构象改变，使工具酶恢复完整结构并发生自我剪切；以工具酶发生剪切作为过滤筛选条件，进而通过若干轮筛选富集，得到可与目标分子结合的适配体。

一实施例中，所述工具酶包括核酶或DNA酶中的至少一种。

优选地，所述核酶包括锤头状核酶(Hammerhead Ribozyme，HHR)。

一实施例中，所述目标分子包括L-别异亮氨酸。

进一步地，在以锤头状核酶HHR为工具酶、以L-别异亮氨酸为目标分子的情况下，本发明实质提供了一种新的RNA适配体筛选方法，此筛选方法将核酶发生剪切作为过滤筛选条件，将Hammerhead Ribozyme(HHR)的茎Ⅱ全部替换成70个随机碱基，此时核酶结构被打破不能发生剪切。通过将整个RNA文库固定于链霉亲和素磁珠(Beads)上，目标分子(L-别异亮氨酸)加入后，随机序列发生折叠，帮助核酶恢复完整结构，核酶可以发生自我剪切。经过几轮筛选富集得到与L-别异亮氨酸结合的适配体。

具体地，所述适配体筛选方法包括以下步骤：

步骤一，以锤头状核酶HHR的茎Ⅱ被随机序列替代后的序列作为模板建立DNA文库后，转录为所需要的RNA文库；

步骤二，固定RNA文库于磁珠上；

步骤三，加入目标分子并孵育，经过筛选富集得到与目标分子结合的适配体；

步骤四，测序得到适配体的序列。

更具体地，所述步骤一包括：

1)构建DNA文库：取锤头状核酶HHR的茎Ⅱ被随机序列替代后的序列SEQ ID No:01作为模板，以SEQ ID No:02为上游引物，以SEQ ID No:03为下游引物，以退火温度59～61℃，循环数为4～6进行DNA文库的构建；

2)转录为RNA文库：取部分步骤1)得到的DNA文库，在36～38℃转录反应1～3h得到RNA文库。

更具体地，所述步骤二包括：

1)RNA文库与Oligo连接：按RNA与如SEQ ID No:04所示的Oligo序列的比值为1:1.5～2.5的比例，将RNA文库与Oligo序列在64～66℃热激4～6min后，20～22℃结合28～32min，得到RNA-Oligo复合物；

2)链霉亲和素磁珠与Oligo连接：将RNA-Oligo复合物与链霉亲和素磁珠在22～24℃下孵育0.5～1.5h；

3)洗脱非特异性的序列：清洗与RNA-Oligo复合物孵育后的链霉亲和素磁珠，除去没有被Oligo抓住的序列以及在未加入目标分子之前即发生自我剪切的序列，得到固定于链霉亲和素磁珠的RNA文库。

更具体地，所述步骤三包括：

1)加入目标分子L-别异亮氨酸：向步骤二得到的固定于链霉亲和素磁珠的RNA文库中加入目标分子并进行孵育，通过逐轮缩短孵育时间得到具有高结合效率的适配体；可以与目标分子结合的序列从链霉亲和素磁珠上断裂下来，而不与目标分子结合的序列留在链霉亲和素磁珠上；

2)RT-PCR和转录：将可以与目标分子结合的序列经RT-PCR和转录后，得到新一轮筛选所需要的RNA文库；随后重复步骤二和步骤三，从而实现适配体序列的富集。

更具体地，所述步骤四包括：

1)以步骤三的产物作为模板，以SEQ ID No:05为上游引物、以SEQ ID No:06为下游引物进行建库，建库的下游引物还包括索引序列SEQ ID No:07；

2)纯化步骤1)的产物后进行Illumina二代测序，得到具体的适配体序列信息。

本发明的一个具体技术方案是：采用Hammerhead Ribozyme(锤头状核酶，简称HHR)，将HHR的茎Ⅱ全部替换成70个随机碱基N(记为N₇₀)，用以产生与特定Ligand(配体)结合的适配体。人为的在HHR的3'段延伸19nt长度的碱基，其作用是后续加上一段与其互补的Oligo，此Oligo用生物素修饰(以下称为Oligo)，生物素修饰的目的是为后续整个文库被链霉亲和素化的磁珠(以下称为Beads)所固定。当核酶的茎被破坏后，其稳定性降低，不能发生剪切；而当小分子加入后，与随机序列结合后发生构象改变，核酶恢复完整结构发生剪切，导致核酶3'端剪切位点的几个碱基留在Beads上，而能与目标小分子结合的序列被留在上清中，通过RT-PCR&Transcription反应得到新的RNA文库，即可进行新一轮的筛选。

本发明的目的另一方面，是提出了一种能与L-别异亮氨酸结合的适配体，所述适配体的序列如SEQ ID No:08或SEQ ID No:09所示。

本次筛选所用的目标小分子L-别异亮氨酸是枫糖尿病的特异性产物，在正常人血液中别异亮氨酸的量极少，而在枫糖尿病中则明显升高，因此测定血液中别异亮氨酸水平对于枫糖尿病来说具有临床诊断参考意义。由于枫糖尿病是一种遗传性疾病，出生后即可发病，而婴幼儿无法沟通病情，再加上目前前期的诊断十分困难，所以需要一种快速有效的诊断方法。本发明发现的一种能与L-别异亮氨酸结合的适配体非常适合用于此病的发现和辅助诊断，该适配体可以探测极少量的配体，所以本发明发现了能与L-别异亮氨酸结合效率高的适配体，能够为枫糖尿病的临床诊断参考提供新的方案。

本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。

本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。

本发明的技术方案作为一种全新的筛选方法，与背景技术相比，它具有如下优点：

1.设计巧妙：没有类似于Capture SELEX设计时需要刻意的考虑DS的选择会影响后续筛选过程是否能顺利进行的问题。本发明直接采用一个已知的核酶结构，将其不影响剪切位点的一条茎替换为随机的序列，用于引物结合的序列不需要特别的人为考虑，只需将核酶的5'与3'端作为引物的结合位点。此外，只需一段自己设计的GC含量合适，其互补序列能够固定整个文库的序列，由于此序列的唯一目的即固定文库，不需要考虑是否影响后续小分子结合后构象的改变，是否过于稳定或过于松散。核酶的选择也较于自由，本发明采用的是HHR，也可以选择其他的核酶，也可以使用DNA酶进行DNA适配体的筛选，实验设计中的选择较为灵活。

2.产物特殊：由于采用核酶作为筛选过滤条件，所以得到的产物既是适配体又是人工核糖开关。与此产物类似的是glmS核酶，它是目前发现的唯一一个既是核酶，又是核糖开关的调控元件。作为适配体，本发明获得的序列可以感应L-别异亮氨酸的含量变化，可以采用与纳米金结合的方法检测血液中L-别异亮氨酸含量；作为人工核糖开关，可以将序列插入基因的5'或3'端直接调控基因的表达。

附图说明

图1为本发明实施例的实验设计示意图。

图2为本发明实施例的筛选流程示意图。

图3为本发明实施例中经筛选得到的DNA文库。

图4为本发明实施例得到的Aptamer 1的二级结构示意图。

图5为本发明实施例得到的Aptamer 2的二级结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例

本实施例的RNA适配体筛选方法的具体步骤如下：

①构建DNA文库。将HHR核酶的茎Ⅱ用N₇₀代替后的HHR序列100ng作为模板，具体序列信息为：

SEQ ID No:01：GGGCGTAGCCTGATGAGN70CGAAACGTGGTGAAAGCC

作为上游引物，为T₇序列加上HHR核酶5'端序列；作为下游引物，为与Oligo互补的序列加上HHR核酶3'端序列，具体序列信息为：

上游引物(SEQ ID No:02)：TAATACGACTCACTATAGGGCGTAGCCTGATGAG

下游引物(SEQ ID No:03)：GGAATCAACCCACAGCTGCGGCGCAGCGACGTGGCTTTCACCACGTTTCG

建库时至少需要达到1×10¹⁵数量级别的分子丰度，以保障筛选的序列的多样性，按以下反应程序和体系进行建库：

表1构建筛选DNA文库的反应体系

表2构建筛选DNA文库的反应程序

②转录为RNA文库。根据DNA浓度，将所有的纯化后的DNA取1/5按如下反应体系进行转录：

表3筛选时所需构建RNA文库的反应体系

于PCR仪上经37℃反应2h后，得到的RNA文库按上述去除未反应的DNA的反应加入DNaseⅠ和DNaseⅠBuffer，用于除去未反应完全的DNA模板，然后将得到的所有的全长RNA进行切胶纯化，

②RNA文库与Oligo连接。生物素修饰的Oligo具体序列信息为：

SEQ ID No:04：Biotin-GGAATCAACCCACAGCTGC

为了将所有的RNA文库固定，将RNA文库与Oligo比值设为：1:2。经计算，第一轮筛选RNA文库与Oligo连接所用程序与用量如下：

表4 RNA文库与Oligo连接的反应体系与程序

④链霉亲和素磁珠与Oligo连接。使用Dynabeads M-270 Streptavidin beads进行文库固定，第一轮所需beads量为300μL(以后每轮所用Beads量为50μL)。在连接Oligo之前，为了使beads具有更好的连接活性，按说明书事先处理beads，将Beads重悬于与RNA等体积的2×B/W buffer中，经以上准备，beads可用于与Oligo相连，将RNA文库与Oligo连接后的混合物全部转移至重悬后的Beads中，放入事先调好温度为23℃、转速为30rpm的振荡培养箱内，轻柔搅拌1h。至此，整个RNA文库将被固定于Beads上。

⑤洗脱非特异性的序列。将上述得到的混合液在磁性条件下去除上清，加入500μL1×SELEX buffer清洗beads，放置在23℃的培养箱内5min后，同样在磁性条件下去除上清。此步骤的目的是去除没有被Oligo抓住的序列以及在未加入目标Ligand之前即发生自我剪切的序列，为了洗脱的彻底性，以上步骤重复三次。最后将带有RNA文库的Beads重悬于300μL 1×SELEX buffer中(第二轮开始重悬于30μL 1×SELEX buffer中)，以备下一步反应。

⑥加入目标Ligand(L-别异亮氨酸)。向上述得到的混悬液中加入10mM目标Ligand(L-别异亮氨酸)33μL(第二轮开始加入3.3μL Ligand)(即目标Ligand的终浓度为1mM)，在第一轮筛选中，23℃孵育10min，当PAGE胶图上出现剪切条带后，以后筛选轮数的孵育时间依次减为5min、1min。严格实验条件的目的是筛选出具有高结合力与高剪切效率的与目标Ligand特异性结合并发生剪切的序列。在筛选最后两轮加入目标Ligand的类似物L-异亮氨酸进行反筛以去除假阳性序列。

⑦RT-PCR&transcription。在磁性条件下，将上述孵育后的上清取出，加入相同体积的2×RNA loading buffer(第一轮上清体积较大，须先进行RNA的乙醇沉淀纯化后再上样)全部上样至PAGE胶，上样时加入全长137nt和剪切条带110nt的marker，将样品对应的110nt处切下。按上述的RNA切胶纯化方法进行纯化，用30μL DEPC H₂O溶解，得到的RNA溶液按下述反应体系与程序进行逆转录实验：

表5 Reverse transcription(RT)反应体系和程序

经逆转录实验得到cDNA，按下述反应体系与程序进行PCR实验：

表6 RT后进行PCR反应体系

表7 RT后进行PCR反应程序

将得到的PCR产物按上述的柱纯化方式进行纯化，得到的DNA溶液经测浓度后按上述的转录实验步骤进行转录，得到RNA溶液后进行切胶纯化得到新一轮筛选所需的RNA文库。

⑧Illumina二代测序。

以RT-PCR纯化后的产物2μL作为模板，以上游引物、下游引物序列分别为SEQ IDNo:05和SEQ ID No:06，具体序列信息为：

SEQ ID No:05：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAATACGACTCACTATAGGGCGTAG

SEQ ID No:06：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCATATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCGGAATCAACCCACAGCTGC

建库的下游引物包括索引序列SEQ ID No:07：GCATAT进行建库，将PCR产物纯化后进行Illumina二代测序。

实验结果

应用此方法，筛选得到两条可以与Ligand结合并发生剪切的序列，Aptamer 1和Apatamer 2，具体序列信息(下划线对应的是N₇₀序列部分)如下，其二级结构分别如图4和图5：

Aptamer 1(SEQ ID No:08)：GGGCGTAGCCTGATGAGTTGTCAGCTCTTTGCTGAGCTCTCTTC CTTCAGACTGAGCCATGGGTATCCGTTTCGTTGGAATTGATAACGAAACGTGGTGAAAGCC

Apatamer 2(SEQ ID No:09)：GGGCGTAGCCTGATGAGTCTGCCTACTAAAGACAGCGTTTTAG CTTCTTTTGGTTCCGTTCTCCTTCCACGTCGAACTACTCGGTAGCGAAACGTGGTGAAAGCC

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 适配体筛选方法及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggcgtagcc tgatgagnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnncga aacgtggtga aagcc 105

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg cgtagcctga tgag 34

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaatcaacc cacagctgcg gcgcagcgac gtggctttca ccacgtttcg 50

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaatcaacc cacagctgc 19

<210> 5

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctta 60

atacgactca ctatagggcg tag 83

<210> 6

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agatgcatat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atcggaatca acccacagct gc 82

<210> 7

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcatat 6

<210> 8

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggcgtagcc tgatgagttg tcagctcttt gctgagctct cttccttcag actgagccat 60

gggtatccgt ttcgttggaa ttgataacga aacgtggtga aagcc 105

<210> 9

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggcgtagcc tgatgagtct gcctactaaa gacagcgttt tagcttcttt tggttccgtt 60

ctccttccac gtcgaactac tcggtagcga aacgtggtga aagcc 105

Claims

1.一种适配体筛选方法，其特征在于：将工具酶中不影响剪切位点的原始序列替换为随机序列，使得工具酶结构被破坏不能发生剪切，由此构建文库；加入目标分子后，目标分子与随机序列结合并发生构象改变，使工具酶恢复完整结构并发生自我剪切；以工具酶发生剪切作为过滤筛选条件，进而通过若干轮筛选富集，得到可与目标分子结合的适配体。

2.根据权利要求1所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述工具酶包括核酶或DNA酶中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述核酶包括锤头状核酶。

4.根据权利要求3所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述目标分子包括L-别异亮氨酸。

5.根据权利要求4所述的适配体筛选方法，其特征在于：包括：

步骤一，以锤头状核酶的茎Ⅱ被随机序列替代后的序列作为模板建立DNA文库后，转录为所需要的RNA文库；

步骤二，固定RNA文库于磁珠上；

步骤四，测序得到适配体的序列。

6.根据权利要求5所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述步骤一包括：

1)构建DNA文库：取锤头状核酶的茎Ⅱ被随机序列替代后的序列SEQ ID No:01作为模板，以SEQ ID No:02为上游引物，以SEQ ID No:03为下游引物，以退火温度59～61℃，循环数为4～6进行DNA文库的构建；

7.根据权利要求5所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述步骤二包括：

8.根据权利要求5所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述步骤三包括：

9.根据权利要求5所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述步骤四包括：

10.一种能与L-别异亮氨酸结合的适配体，其特征在于：所述适配体的序列如SEQ IDNo:08或SEQ ID No:09所示。