CN113564073B - 一种捕食爬管菌及其在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种捕食爬管菌及其在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。本发明的捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2‑13，其保藏编号为GDMCC No：61768。本发明采用粘细菌经典分离方法(大肠杆菌诱导法)从菜地池塘沉积物中分离纯化出一株绿弯菌门的捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2‑13，该菌株能够捕食耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，从而抑制MRSA的生长。此外，该菌株发酵上清液的粗浸膏溶液能够明显抑制MRSA的生长。上述结果表明，本发明所涉及的捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2‑13在防控和治疗MRSA方面具有巨大的应用潜力。

Description

一种捕食爬管菌及其在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 药物中的应用

技术领域：

本发明属于微生物领域，具体涉及一种捕食爬管菌及其在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。

背景技术：

随着抗生素的广泛使用，病原细菌在抗生素及环境的压力下，群体中的敏感株被杀灭，耐药株被选择或诱导出来并繁殖生长成优势菌株，通过多种形式获得了对抗生素的耐药性。多重耐药细菌(Multiple resistant bacteria,MDR)感染的形势越来越严重，尤其是“超级细菌”的出现引起国际社会广泛关注。病原菌耐药性的提高降低了抗菌药物的使用效果，导致患病率、死亡率和医药费用的增加，这已成为公共卫生领域的主要威胁之一。细菌耐药性，已经成为21世纪人类健康的主要威胁之一。

金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病在青霉素问世后得到了较好的控制，但由于抗生素的广泛使用，金黄色葡萄球菌产生耐药性，部分细菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，青霉素作为β-内酰胺类抗生素，用于金黄色葡萄球菌的抗菌作用下降。在这种情况下，甲氧西林作为耐青霉素酶的半合成青霉素问世，起到了抗菌作用，但耐药性的不断增强，使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)产生。MRSA具有广谱耐药性，不仅对所有β-内酰胺类抗生素耐药，还对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类等抗生素有不同程度的耐药。目前最常用、疗效较好的抗生素有万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁等。由于MRAS耐药性较强，一方面加大了临床上耐药菌感染治疗的难度，导致MRSA感染的患者在临床治疗上较棘手；另一方面也加大了新药物的开发难度，新开发药物在上市后不久容易因交叉耐药性的存在致使疗效大打折扣。近些年，新抗生素的开发速度大大降低。新抗生素的开发不得不寻求一些结构新颖、活性突出的化合物，从而避免交叉耐药性的产生。

MRSA感染为临床治疗带来新的挑战，因此相关药物的研发成为当前热点。研究开发具有新类型化学结构、新作用机制或新作用靶位的新抗生素与新抗菌药是克服细菌耐药性的最有效途径。目前，新抗生素的研究重点，已然从针对各种普通细菌转向耐药细菌。

微生物来源的天然产物一直以来都是新型药物最重要的来源之一。筛选新的化合物是药物开发的前提。然而，传统的抗生素产生菌正面临过度开发的境况，新药物难以在这些传统药源微生物中继续被发掘。至今已经有22500多种微生物次级代谢被发现，从传统的抗生素产生菌中筛选新的化合物已经越来越困难。而随着细菌耐药性的不断出现，细菌耐药途径的多样化以及交叉耐药性的流行，更需要一些结构新颖、作用方式独特的活性物质。目前，药源微生物的开发开始转向一些新型药源微生物。爬管菌属(Herpetosiphon)是绿弯菌门中目前唯一具有捕食性的类群，在进化中属于深度分支的细菌类群。鉴于爬管菌属具有杀死猎物细胞的能力，在捕食猎物细胞的过程中产生一些结构新颖的次级代谢产物，该类群有成为新型药源微生物的潜力，这对解决MRSA等耐药菌引起感染问题具有重要意义。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一株绿弯菌门细菌捕食爬管菌Herpetosiphongulosus 2-13，其于2021年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61768。

本发明的第二个目的是提供捕食爬管菌2-13或其培养物、菌液、发酵液或发酵液的萃取物在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。

所述的应用，优选将捕食爬管菌2-13进行培养，得到菌株培养物、菌液或发酵液，用所得到的菌株培养物、菌液或发酵液应用于抑制所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

本发明的第三个目的是提供一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物，其含有捕食爬管菌2-13或其培养物、菌液、发酵液或发酵液的萃取物作为活性成分

所述的发酵液的萃取物是发酵液的甲醇萃取物。

优选，所述的捕食爬管菌2-13的培养物、菌液、发酵液是以发酵培养基进行发酵获得，所述的发酵培养基的配方为：酵母1g/L，CaCl₂·2H₂O 1g/L，VB₁₂ 0.5mg/L，pH 7.2。

本发明采用粘细菌经典分离方法(大肠杆菌诱导法)从菜地池塘沉积物中分离纯化出一株绿弯菌门的捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2-13，该菌株能够捕食耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，从而抑制MRSA的生长。此外，该菌株发酵上清液的粗浸膏溶液能够明显抑制MRSA的生长。上述结果表明，本发明所涉及的捕食爬管菌Herpetosiphongulosus 2-13在防控和治疗MRSA方面具有巨大的应用潜力。

捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2-13于2021年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61768。

附图说明

图1是捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2-13对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus GDMCC 1.1263的捕食，A：平铺直接捕食、B：平铺直接捕食、C：未接种捕食爬管菌的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对照。

图2是捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2-13发酵上清液粗浸膏溶液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus GDMCC 1.1263的抑制。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1菌株的分离、纯化与鉴定

从汕头市澄海区东里镇塘西村苋菜地池塘采集底泥沉积物，于室温下自然风干。采用捕食性细菌粘细菌的经典分离方法(大肠杆菌诱导法)分离样品中的捕食性细菌。取风干的沉积物样品5g，加入10mL 100μg ml^-1过滤除菌的放线菌酮，浸泡过夜后离心弃去上清。用WCX培养基(CaCl₂·2H₂O 1g/L和琼脂15g/L，pH 7.2；待琼脂凝固后以划线的方式接种大肠杆菌菌悬液)分离样品中的捕食性细菌，将浸泡过放线菌酮的样品接种于WCX培养基划线的大肠杆菌处，置于30℃培养。在体视显微镜下观察，挑取能裂解大肠杆菌的颗粒状菌团接种于VY/2培养基(酵母5g/L，CaCl₂·2H₂O 1g/L，VB₁₂ 0.5mg/L和琼脂15g/L，pH 7.2)进行纯化，获得菌株2-13。纯化菌株2-13分别保存甘油种和冻干种。

菌株2-13在VY/2固体培养基上表现为滑动扩展的透明状浅橙色菌落，整体菌落呈放射状；在VY/2固体培养基上生长3天左右开始观察到聚集体和由于聚集而形成的网状结构。

取菌株2-13的新鲜菌体用CTAB法提取基因组DNA，以通用引物27F/1492R扩增16SrRNA基因，PCR产物交由金唯智生物科技有限公司测序。测序序列进行BLAST比对，结果显示与模式菌株Herpetosiphon gulosus Hp g472^T具有最高相似性(99.25％)，基因序列如SEQ ID NO.1所示。因此，将该菌株鉴定为捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus，编号为2-13。

捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2-13于2021年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61768。

实施例2捕食爬管菌2-13对MRSA的捕食

接种新鲜的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus GDMCC 1.1263于NA液体培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，NaCl 5g/L,pH 7.2)，30℃、180rpm震荡培养过夜。8000rpm离心5min收集菌体，并用无菌去离子水清洗2遍，再用TPM缓冲液(Tris-HCl10mM,KH₂PO₄ 1mM,MgSO₄·7H₂O 8mM，pH 7.6)重悬菌体使OD₆₀₀＝1.0。分别采用平铺直接捕食法和对峙培养捕食法，评价捕食爬管菌2-13对MRSA的捕食能力。平铺直接捕食法：接种50μl重悬菌液于TPM固体平板(TPM缓冲液中加入1.5％琼脂)，晾干备用；接种捕食爬管菌2-13新鲜菌体于VY/2固体培养基培养3d，用打孔器获得直径为5mm的带菌琼脂块，接种于TPM平板MRSA菌斑中央，置于30℃培养，观察捕食透明圈的有无。对峙培养捕食法：接种50μl重悬菌液于TPM固体平板(TPM缓冲液中加入1.5％琼脂)，晾干备用；接种捕食爬管菌2-13新鲜菌体于VY/2固体培养基培养3d，用打孔器获得直径为5mm的带菌琼脂块，在TPM平板MRSA菌斑5mm处接种2-13琼脂块，置于30℃培养，观察MRSA菌斑的消失与2-13的生长。

如图1所示，平铺直接捕食法和对峙培养捕食法两种捕食体系中均观察到捕食爬管菌2-13对MRSA的捕食。在平铺直接捕食法中，捕食爬管菌2-13以“狼群捕食”策略捕食MRSA，菌膜先扩展至MRSA菌斑范围之外，然后从捕食爬管菌2-13接种处开始出现由于MRSA菌体裂解而出现的空斑和捕食爬管菌2-13菌体的生长。在对峙培养捕食法中，捕食爬管菌2-13先通过菌落的滑动逐渐靠近MRSA菌斑，菌落接触到MRSA菌斑后观察到由于MRSA菌体裂解而出现的空斑和捕食爬管菌2-13菌体的生长。

实施例3捕食爬管菌液体发酵和发酵上清液粗浸膏的制备

发酵培养基为VY/4液体(酵母1g/L，CaCl₂·2H₂O 1g/L，VB₁₂ 0.5mg/L，pH 7.2)，接种前加入体积比2％的大孔树脂XAD-16，按照体积比2％的接种量接种Herpetosiphongulosus2-13种子液。140rpm，30℃震荡培养3d，用纱布过滤收集树脂，加入2倍体积的甲醇置于30℃震荡浸提1h，过滤收集甲醇；重复浸提过程3-4次直至甲醇无色。合并收集的甲醇于旋转蒸发仪上35℃，40r min^-1减压蒸干。发酵2L该菌株共获得粗浸膏0.96g。用少量二甲基亚砜(DSMO)：水(v/v 1:1)溶解上述粗浸膏，并用无菌去离子水稀释成浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125mg ml^-1和1.5625mg ml^-1的粗浸膏溶液。

刮取在营养肉汤固体培养基上过夜培养的S.aureus GDMCC 1.1263菌体，加入无菌去离子水制成菌悬液，用棉签蘸取菌悬液涂布于新鲜的营养肉汤固体培养基上。待平板晾干后铺上3张直径为5mm的无菌滤纸片，在每张滤纸片上加入20μl各浓度的粗浸膏溶液。同时分别设置万古霉素和DSMO水溶液作为阳性和阴性对照。待滤纸晾干后置于30℃培养，12h后观察并测量抑菌圈大小。每个处理3个重复。

结果如表1和图2所示，结果表明较高浓度的捕食爬管菌2-13发酵液提取物明显抑制测试MRSA菌的生长，且抑制作用具有剂量效应。当发酵液浸膏浓度为100、50、25、12.5和6.25mg ml^-1时，抑菌圈直径分别为15.8mm、13.1mm、12.6mm、10.8mm和10.3mm，浓度为3.125和1.5625mg ml^-1时无明显抑菌圈出现。

表1捕食爬管菌菌株2-13粗浸膏溶液对MRSA生长的抑制

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序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种捕食爬管菌及其在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 捕食爬管菌2-13(Herpetosiphon gulosus)

<400> 1

aaagccttac ggcgcactgg gcgggggtcg cgtcccatta gatggttggt gtggtaatgg 60

cgcaccaagt cgatgatggg tctctggtct gagaggacga ccagacagat tgggactgag 120

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cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca tggaagtggg aaacacctga agtccgtggg 1200

ctaacc 1206

Claims (5)

1.捕食爬管菌Herpetosiphon gulosus 2-13，保藏编号：GDMCC No：61768。

2.权利要求1所述的捕食爬管菌2-13或其培养物或其菌液在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是将捕食爬管菌2-13进行培养，得到菌株培养物或其菌液，用所得到的菌株培养物或其菌液应用于抑制所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

4.一种抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物，其特征在于，含有权利要求1所述的捕食爬管菌2-13或其培养物或其菌液作为活性成分。

5.根据权利要求4所述的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物，其特征在于，所述的捕食爬管菌2-13的培养物或其菌液是以发酵培养基进行发酵获得，所述的发酵培养基的配方为：酵母1g/L，CaCl₂·2H₂O 1g/L，VB₁₂ 0.5mg/L，pH 7.2。

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