CN113563451A

CN113563451A - 用于治疗呼吸系统疾病的新型PI3Kγ抑制剂肽

Info

Publication number: CN113563451A
Application number: CN202110455414.3A
Authority: CN
Inventors: E·希尔施; A·吉戈
Original assignee: KITHER BIOTECH Srl
Current assignee: KITHER BIOTECH Srl
Priority date: 2014-12-24
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2021-10-29
Also published as: US20190367571A1; BR112017013453B1; ES2737227T3; EP3236983A1; EP3236983B1; IL253011A0; CN107406488A; RU2017124487A; AU2015370463A1; US20180086798A1; US10730921B2; US11352400B2; AU2015370463B2; RU2017124487A3; CA2971121A1; US10421794B2; IL253011B; BR112017013453A2; DK3236983T3; RU2704826C2

Abstract

融合肽，其包含：i)如SEQ ID No:1所限定的氨基酸序列或与SEQ ID No:1具有至少90％同一性且具有序列SEQ ID No:1抑制PI3Kγ的激酶非依赖性功能的能力的相关同源物，和ii)具有穿透细胞的能力的肽。

Description

用于治疗呼吸系统疾病的新型PI3Kγ抑制剂肽

本申请是申请日为2015年12月22日、申请号为201580071130.7、发明名称为“用于治疗呼吸系统疾病的新型PI3Kγ抑制剂肽”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本说明书涉及用于治疗呼吸器官病理的PI3Kγ的新型肽抑制剂。

背景技术

哮喘是特征为炎症、气道高反应性(AHR)和粘膜水肿的慢性呼吸道疾病，其共同导致气道偶发支气管收缩和阻塞。目前的抗哮喘治疗效果不令人满意，并且哮喘仍然是未解决的全球性问题。

气道的肌肉组织的健康状态由平滑肌细胞中促收缩和促松弛信号通路的激活之间的微妙平衡决定。收缩主要由乙酰胆碱(气道中的主要副交感神经递质)触发，其激活M3毒蕈碱受体，导致细胞内和细胞外的钙(Ca²⁺)的动员。相反，气道的松弛通过儿茶酚胺介导的 β₂-肾上腺素能受体(β₂-AR)的激活实现，其促进产生环AMP(cAMP) 并且因而调节Ca²⁺内稳态的关键效应物。根据cAMP的促松弛作用， β₂-AR的激动剂在哮喘患者中提供支气管痉挛的症状缓解。然而，它们的有效性在时间方面是受限的，主要是由于在反复暴露于激动剂后发生的β₂-AR的脱敏。类似地，通过磷酸二酯酶4(PDE4)(气道中负责cAMP水解的主要酶)的抑制剂抑制cAMP降解已经在临床上测试，但是由于中枢神经系统中PDE4的非选择性抑制而显示出不可接受的副作用，例如呕吐、恶心、腹泻和体重减轻。

因此。鉴定调节cAMP内稳态的新酶以及在平滑肌细胞中操纵 β₂-AR/cAMP信号转导途径的新型策略对于治疗呼吸系统疾病是期望的。此外，相同的方法也可以用于其他病理学环境中的治疗目的，例如囊性纤维化，其中有必要增加气道上皮细胞中cAMP的水平。

在呼吸系统上皮细胞中，β₂-AR下游cAMP的产生对于确保cAMP 依赖性氯离子通道(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白，CFTR)的开放是必要的。编码这种蛋白的基因中的突变是囊性纤维化(CF)的主要原因。在这些当中，苯丙氨酸508的缺失(ΔF508)构成CF患者中最常见的改变，并且导致膜表达和通道开放两者中的缺陷。已经开发了大量分别救助膜表达和cAMP介导的通道开放的CFTR校正剂和增效剂药物，但是它们的有效性不令人满意。特别是，CFTR增效剂需要高浓度细胞的内cAMP以起作用。因此。能够刺激cAMP水平的药物可以构成提高现有治疗的有效性的新策略，或直接纠正CF中CFTR 的功能缺陷。

以前的研究已经表明磷酸肌醇3-激酶γ(PI3Kγ)控制β₂-AR下游cAMP的分室化。在心肌细胞中，PI3Kγ作为锚定蛋白(AKAP) (1)，其将蛋白激酶A(PKA)结合到PDE3和PDE4的多种同种型。 PI3Kγ相关PKA进而磷酸化并促进PDE激活以及因而β₂-AR下游 cAMP减少，最终限制Ca²⁺的致心律失常性释放(2)。虽然已经开发了PI3Kγ的激酶活性的多种抑制剂，但是目前还没有选择性干扰 PI3Kγ的衔接体蛋白或锚定蛋白活性的方法。

发明内容

考虑到这些前提，因此需要与已知疗法相比改进的和更有效的治疗呼吸系统疾病的方法。

根据本发明，上述目的由于在所附权利要求中具体回顾的方案而得以实现，其构成了本说明书的组成部分。

本发明的一个实施方式涉及用作药物，特别是用于治疗呼吸系统疾病的融合肽，其包含：

i)如SEQ ID No:1所限定的氨基酸序列或与SEQ ID No:1具有至少90％同一性且具有序列SEQ ID No:1抑制PI3Kγ的激酶非依赖性功能的能力的相关同源物，和

ii)具有穿透细胞的能力的肽。

本发明的不同实施方式涉及产品，其包含i)如上文所限定的融合肽和ii)囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的增效剂和/或囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的矫正剂作为连续、同时或分开用于治疗呼吸系统疾病，优选囊性纤维化的组合制备物。

本说明书提供了通过施用包含人PI3Kγ(SEQ ID No:1)的残基 126-150或其同源物的融合肽治疗呼吸系统病理的功效的体外和体内实验证据。本说明书的融合肽实际上能够抑制PKA与PI3Kγ之间的相互作用，因而降低与PI3Kγ相关的PDE的活性，提高cAMP水平，并通过电压控制的钙通道(VOCC)减少Ca²⁺的进入。此外，本文描述的融合肽增加气道中的体内cAMP水平，并且当通过气管内途径施用于健康和哮喘小鼠时作为支气管扩张剂起作用。最后，融合肽实现 CFTR增效剂的功能，增加cAMP并从而在表达野生型或ΔF508突变 CFTR的支气管上皮细胞系中增强对CFTR的氯离子(Cl^-)的转导，该突变是囊性纤维化患者中最常见的突变。

本发明还涉及以下项目：

1.一种融合肽，其包含：

ii)具有穿透细胞的能力的肽。

2.根据项目1所述的融合肽，其中所述具有穿透细胞的能力的肽选自SEQ ID No:3至12规定的序列。

3.根据项目1或项目2所述的融合肽，其中所述具有穿透细胞的能力的肽与SEQID No:1或其同源物的C端或N端缀合。

4.根据前述项目中任一项所述的融合肽，其用作药物。

5.根据前述项目中任一项所述的融合肽，其用于治疗呼吸系统疾病，优选支气管阻塞性疾病。

6.根据项目5所述的融合肽，其中所述呼吸系统疾病选自过敏性哮喘、囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病。

7.根据项目4至6中任一项所述的融合肽，其中所述融合肽适合通过吸入施用。

8.一种产品，其包含：

i)根据项目1至3中任一项所述的融合肽，和

ii)囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的增效剂和/或囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的矫正剂作为连续、同时或分开用于治疗呼吸系统疾病，优选支气管阻塞性疾病，更优选囊性纤维化的组合制备物。

9.根据项目8所述的产品，其中所述囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的增效剂选自VX-770(N-(2,4-二叔丁基-5-羟基苯基)-1,4- 二氢-4-氧代喹啉-3-甲酰胺)和VX-532(4-甲基-2-(5-苯基-1H-吡唑-3- 基)-苯酚)。

10.根据项目8或项目9所述的产品，其中所述囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的矫正剂选自VX-809(3-(6-(1-(2,2-二氟苯并 [d][1,3]二氧戊环-5-基)环丙烷甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸)和 VX-661((R)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)-N-(1-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-2-(1-羟基-2-二甲基丙-2-基)-1H-吲哚-5-基)-环丙烷甲酰胺)。

11.一种用于治疗呼吸系统疾病的方法，其包括以足以进行所述治疗的量向有需要的患者施用至少一种根据项目1至3中任一项所述的融合肽。

12.一种药物组合物，其包含至少一种根据项目1至3中任一项所述的融合肽或根据项目8至10中任一项所述的产品和药学上可接受的载体。

附图说明

纯粹是借助于说明性和非限制性实施例，结合随附附图，现将详细描述本发明，其中：

-图1.衍生自PI3Kγ的木马肽抑制PDE的活性并增强气道的平滑肌细胞中的β₂-AR/cAMP信号传导。A)可渗透细胞膜的PI3Kγ抑制肽的示意图。人PI3Kγ的126-150区域与触角控制基因 (Antennapedia)的穿透肽(Penetratin)1的序列融合。B)PI3Kγ抑制性木马肽的细胞内定位。将hBSMC与用荧光素(FITC，50μM) 标记的肽一起孵育，并在处理开始30分钟后分析细胞内荧光。呈现了丝状肌动蛋白染色(左图)和FITC荧光(中间图)，以及相对放大(右图)。C)从PI3Kγ^+/+和PI3Kγ^-/-动物分离，并用载体或PI3Kγ 抑制性木马肽处理(50μM，30分钟；n≥4个独立实验)的气管的平滑肌细胞中的抗PDE4B和抗PDE4D抗体沉淀的磷酸二酯酶活性。D) 在用异丙肾上腺素(ISO；100mM)和β₁-AR的选择性拮抗剂 (CGP-20712A(CGP，100nM))激活β₂-AR之前，用针对cAMP 的FRET探针(ICUE3)转染，并用载体、PI3Kγ抑制性肽或穿透肽 1对照肽(50μM，30分钟)预处理的hBSMC。给出了n≥3个独立实验的代表性FRET痕迹。E)在D中测量的曲线的FRET信号(％) 的最大变化。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，通过单因素方差分析，随后是Bonferroni检验。

-图2.PI3Kγ抑制性木马肽抑制钙通过L型通道进入气道的人平滑肌细胞。A)在使用毒蕈碱激动剂卡巴胆碱(Carb，10μM，上图) 和去极化溶液(40mM KCl，下图)刺激之前，用载体、PI3Kγ抑制性木马肽或P1对照肽预处理(50μM，30分钟)的hBSMC中记录的 Ca²⁺瞬变的代表性痕迹。B)A中所示的Ca²⁺瞬变的指示剂INDO-1 的荧光比的最大变化(AU)。C)用PI3Kγ抑制性木马肽或P1对照肽处理(50μM，30分钟)的hBSMC中L型钙通道(LTCC)的Ca_v1.2亚基(Ser-1928)的cAMP依赖性磷酸化。显示了n≥3个独立的 Western印迹实验的代表性图像和相对定量。**P<0.01和***P <0.001，通过单因素方差分析，随后是Bonferroni检验。

-图3.PI3Kγ抑制性木马肽增加体内气道中的cAMP水平，并减弱健康和哮喘小鼠的气道高反应性。A)PI3Kγ抑制性木马肽用FITC 标记，并经气管内途径施用于BALC/c种系的小鼠(1.5μg/小鼠)。处理后30分钟，通过共聚焦显微镜分析肺和气管中的荧光。用等体积的用于FITC标记的溶液滴注对照小鼠。给出了用载体(上图)或 PI3Kγ抑制性木马肽(下图)处理的动物的气管、肺、脑和心肌的切片的FITC荧光图像。B)如A中所述处理的小鼠的整个气管(左图) 和肺(右图)中的cAMP水平。*P<0.05和**P<0.01，通过单因素方差分析，随后是Bonferroni检验。C)气道高反应性测量为在暴露于渐增剂量的乙酰甲胆碱之前，被麻醉和换气的、用载体、PI3Kγ抑制性木马肽(1.5μg)或P1对照肽(等摩尔量)的喷雾处理的健康小鼠中的肺的平均耐受。与载体相比，*P<0.05和**P<0.01；相对于P1， #P＜0.05，通过双因素方差分析，随后是Bonferroni检验。D)气道高反应性测量为响应于乙酰甲胆碱(500mg/kg，静脉内施用)的、被麻醉和换气的哮喘小鼠中的潮气量变化。在施用乙酰甲胆碱之前，用载体、PI3Kγ抑制性木马肽(150μg)或P1对照肽(等摩尔量)处理对卵清蛋白敏感的动物30分钟。相对于载体和对照肽，**P<0.01；相对于基线，###P<0.001，采用双因素方差分析，随后是Bonferroni 检验。

-图4.衍生自PI3Kγ的木马肽增加野生型CFTR的cAMP依赖性磷酸化和氯离子转导。A)用载体(泳道1)、P1对照肽(25μM，泳道2)、PI3Kγ抑制性木马肽(25μM，泳道3)、单独的PDE4抑制剂咯利普兰(Rolipram)(PDE4i；10μM，泳道4)或与衍生自PI3Kγ 的木马肽一起(泳道5)处理30分钟的人气道上皮细胞(NuLi-1)中的cAMP介导的CFTR磷酸化。显示了n≥3个独立实验的CFTR免疫共沉淀和通过PKA进行的磷酸化的Western印迹检测的代表性图像。 B)在NuLi-1细胞的培养物中在尤斯灌流室(Ussing chamber)中测量的CFTR电流的代表性痕迹。在指定时间进行以下处理：阿米洛利 (ENAC通道抑制剂，10μM)、P1对照肽(30μM)、渐增浓度的衍生自PI3Kγ的木马肽(10μM、20μM和30μM)、PDE4抑制剂咯利普兰(PDE4i；10μM)、毛喉素(forskolin)(FSK，10μM)和 CFTR抑制剂172(CFTRi；20μM)。

-图5.衍生自PI3Kγ的木马肽增加了具有ΔF508突变的气道上皮细胞中的CFTR转导。A)在用矫正剂VX-809(20μM；24小时) 处理的具有ΔF508突变的气道上皮细胞(CuFi-1)的培养物中在尤斯灌流室中测量的CFTR电流的代表性痕迹。在指定时间进行以下处理：阿米洛利(ENAC通道抑制剂，10μM)、CFTR增效剂VX-770(10 μM)、P1对照肽(10μM)、PI3Kγ抑制性木马肽(10μM)、毛喉素(FSK，10μM)和CFTR抑制剂172(CFTRi；20μM)。B)响应于指定处理的平均电流变化。**P<0.01，通过单因素方差分析，随后是Bonferroni检验。

-图6.适合于产生本发明的融合肽的穿透性多肽的序列。

-图7.PI3Kγ衍生的木马肽减少哮喘小鼠的肺部炎症。A)在每次鼻内施用卵清蛋白前，天然小鼠或用卵清蛋白敏化并用衍生自 PI3Kγ的木马肽(25μg/小鼠/注射)或用P1对照肽(等摩尔量)预处理的小鼠的肺切片的苏木精-曙红(上图)和过碘酸-雪夫试剂(下图) 染色的代表性图像。切片用苏木精-曙红染色，用于分析组织形态和炎症水平，并用过碘酸-雪夫试剂染色以测定杯状细胞的存在。B)如 A)中所示的肺切片中支气管周炎症的程度的半定量分析。C)如A) 中所示的肺切片的上皮中对过碘酸-雪夫试剂染色为阳性的上皮细胞的百分比。D-G)在如A)所述的用衍生自PI3Kγ的木马肽或P1对照肽预处理的小鼠的支气管肺泡灌洗液中，嗜中性粒细胞(D)、巨噬细胞(E)、淋巴细胞(F)和嗜酸性粒细胞(G)的数量。*P<0.05、 **P<0.01和***P<0.001，通过单因素方差分析，随后是Bonferroni 检验。

具体实施方式

纯粹是借助于说明性和非限制性实施例，参考单一附图，其中示意性地示出了可以出于实施本文所述方法的目的而使用的在压力下的提取系统，现将详细描述本发明。

在下文的描述中，给出了许多具体细节以提供对实施方式的透彻理解。实施方式可以在所述具体细节中的一个或多个不存在的情况下，或者使用其他方法、组件、材料等在实践中实施。在其他情况下，没有详细示出或描述公知的结构、材料或操作以避免使实施方式的某些方面模糊。

在整个本说明书中，提到“一个实施方式”或“实施方式”是指在至少一个实施方式中包括结合实施方式描述的具体特征、结构或特性。因此，表述方式“在某个实施方式中”或“在实施方式中”在整个本说明书的各个地方的出现并不必然总是指同一实施方式。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方式中以任何合适的方式组合。

本文使用的标题仅仅是出于方便而使用，且不解释实施方式的目的或含义。

本说明书的一个实施方式涉及用作药物，特别是用于治疗呼吸系统疾病的融合肽，其包含：i)如SEQ ID No:1所限定的氨基酸序列或与SEQ ID No:1具有至少90％同一性且具有序列SEQ ID No:1抑制PI3Kγ的激酶非依赖性功能的能力的相关同源物，和ii)

具有穿透细胞的能力的肽。

本发明的不同实施方式涉及产品，其包含i)如上文所限定的融合肽和ii)囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的增效剂和/或囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的矫正剂作为连续、同时或分开用于治疗呼吸系统疾病，优选囊性纤维化的组合制备物。

包含如上文所限定的融合肽、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白 (CFTR)的矫正剂和囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的增效剂的产品作为连续、同时或分开使用的组合制备物的用途特别适合于治疗携带CFTR的ΔF508突变的囊性纤维化患者。

本说明书涉及可穿透细胞膜的融合肽的生产和治疗应用，其抑制 PI3Kγ与PED的激活剂(PKA)之间的相互作用。本说明书的融合肽在过敏性哮喘的临床前模型中，在人气道和体内的平滑肌细胞两者中降低特异性PDE的活性，增强β₂-AR/cAMP信号转导途径的信号传导，并且产生cAMP介导的促松弛作用。此外，具有PI3Kγ抑制性活性的融合肽增强呼吸道的上皮细胞中的相同信号传导途径并刺激野生型CFTR通道(其核苷酸和氨基酸序列在GenBank序列数据库中分别作为登录号NM_000492.3和NP_000483.3可得)和具有ΔF508突变(该突变的序列在GenBank序列数据库中作为登录号S64640.1可得)(其是囊性纤维化的主要原因)的CFTR的cAMP依赖性开放。

总体来说，本文显示的结果证实使用具有抑制PI3Kγ的能力的融合肽或其同源物作为通过吸入的局部治疗，用于治疗呼吸系统疾病如过敏性哮喘和囊性纤维化的可能性。

尽管在过去十年中已经开发了PI3Kγ的激酶活性的许多抑制剂，其中许多目前正在临床开发中用于治疗肿瘤疾病，但没有方法允许选择性干扰酶的激酶非依赖性活性，更确切地说是选择性干扰PKA-或 AKAP-锚定蛋白。

此前已经显示包含PI3Kγ结合至PKA的位点(由人PI3Kγ的残基126-150组成)的肽在体外相互作用研究中取代两种蛋白之间的相互作用，并降低PI3Kγ结合的PDE(PDE3B)的活性(1)。

本说明书以完全预料不到的方式显示与可穿透细胞膜的肽(例如触角控制基因的穿透肽1(SEQ ID No:3)(3))缀合的PI3Kγ126-150 肽(SEQ ID No:1-KATHRSPGQIHLVQRHPPSEESQAF)可用作体内PI3Kγ的激酶非依赖性功能的抑制剂。PI3Kγ抑制性融合肽穿透气道的平滑肌细胞并增强β₂-AR/cAMP信号传导途径。特别是，数据显示融合肽在过敏性哮喘的临床前模型中增加cAMP水平并限制气道高反应性，并且当通过气管内途径局部施用时，其有效地到达下呼吸道。因此这些数据证实PI3Kγ抑制性融合肽在用于治疗呼吸系统疾病的气雾疗法中的临床用途。

目前用于支气管阻塞性疾病的吸入治疗是基于β₂-AR激动剂例如沙丁胺醇和福莫特罗以及最近被批准用于治疗慢性阻塞性肺疾病 (COPD)的PDE4抑制剂例如罗氟司特(Roflumilast)的使用。

尽管使用β-AR激动剂的急性治疗产生明显的临床益处，但由于膜β-AR的激动剂依赖性脱敏，长期或反复暴露于这些药物可以导致其在哮喘患者中的有效性显著降低和/或完全丧失。

本说明书提供了该问题的解决方案并提出了抑制性肽的使用，其影响酶PI3Kγ的活性并因此不直接作用于β₂-AR的刺激，而是增强下游信号传导事件的级联反应。以这种方式，PI3Kγ抑制性肽提供独特机会以调节β₂-AR依赖性cAMP结构域，确保与由β₂-AR激动剂介导的那些相似的支气管松弛效果，而不引起受体失活。

本文提供的数据证实抑制PI3Kγ的PKA锚定功能仅在表达PI3Kγ (PI3Kγ^+/+)的细胞中，而不在缺乏酶(PI3Kγ^-/-)的细胞中降低PDE 活性，因此表明本说明书的融合肽抑制由PI3Kγ排他地调节的PDE。

因此PI3Kγ抑制性肽代表了一种独特的工具，其确保PDE的同种型选择性抑制并且允许限制与PDE4的非选择性抑制剂例如罗氟司特相关的主要副作用，主要由不在呼吸系统中表达的同种型的抑制引起。

尽管PDE4抑制剂的特征在于在分离的细胞中的重要促松弛剂作用，但它们不是最佳的体内支气管扩张剂，在此情况下它们主要发挥抗炎功能。

本文提供的结果证实具有抑制PI3Kγ的激酶非依赖性功能的能力的融合肽(本说明书的主题)在健康动物和在过敏性哮喘的临床前模型中具有强力的体内支气管扩张剂功能。这些效果可以通过肽干扰多种PDE同种型(不仅包括PDE4，而且包括PDE3)的催化活性的能力来解释。

与现有数据一致，已经显示抑制PDE3和PDE4可以是相加的或协同的。特别是，如果单独使用，PDE4和PDE3抑制剂是无效的，但协同地作用抑制平滑肌收缩。因此，抑制PI3Kγ的激酶非依赖性活性提供了同时抑制PDE3和PDE4的特定同种型的独特工具，特别是决定性地参与调节支气管平滑肌收缩性的那些。

由于PDE3和PDE4不仅在气道中表达，而且在心肌和中枢神经系统中表达，即使是选定同工酶的全身性抑制也可以引起主要副作用。特别是，体内PDE3和PDE4的抑制可以具有促致心律失常、促催吐和促厌食作用。

本说明书显示具有抑制PI3Kγ的激酶非依赖性活性的能力的融合肽是治疗有效的，以及PI3Kγ抑制性肽的气雾制剂有效地分布在下呼吸道中。此外，与可以迅速扩散到呼吸系统外部的其他组织的小分子(例如PDE抑制剂)相比，肽分子的使用提供了更宽的治疗效果/ 副作用分布(profile)。

本文提供的数据证实PI3Kγ抑制性肽的荧光版本在气管内施用后积累在气管和肺中，而不到达心肌和脑。

基于这些数据，因此可以得出以下结论：基于选择性抑制PI3Kγ 酶的激酶非依赖性活性的可穿透细胞膜的肽的吸入治疗是高度有效的。这种治疗方法可以用于治疗不同的呼吸系统疾病，从哮喘到囊性纤维化，其中能够增加β₂-AR的下游细胞内cAMP的药剂是必需的。

本文呈现的结果证实PI3Kγ抑制性肽不仅增加平滑肌中的cAMP 水平，而且增加气道的上皮区划中的cAMP水平，从而开启利用该化合物以同样刺激CFTR通道的cAMP介导的开放的可能性，该开放在囊性纤维化患者中是有缺陷的。

本文提供的数据还显示通过增加囊性纤维化中CFTR的最常见突变形式之一的传导，PI3Kγ的抑制与已知的临床上先进的CFTR增效剂VX-770协同地作用。这些数据首次证实PI3Kγ抑制分子增加已知 CFTR增效剂VX-770的活性的能力，其已知刺激CFTR的不同突变形式的传导，除了囊性纤维化中最常见的突变ΔF508。

因此本说明书的融合肽可与囊性纤维化跨膜传导调节蛋白 (CFTR)的增效剂和/或囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的矫正剂组合使用，作为连续、同时或分开用于治疗特征为CFTR的有缺陷的cAMP介导的开放的呼吸系统疾病的组合制备物，例如在囊性纤维化患者中。

囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的增效剂和囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的矫正剂与本说明书的融合肽一起的组合使用特别适合于治疗携带ΔF508 CFTR突变的囊性纤维化患者， CFTR矫正剂施用于其是允许在膜处表达突变CFTR所必需的。

可以有利地与本说明书的融合肽组合使用的囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的增效剂是例如依伐卡托(Ivacaftor)或VX-770 (N-(2,4-二叔丁基-5-羟基苯基)-1,4-二氢-4-氧代喹啉(ossoquinolin)-3- 甲酰胺)和VX-532(4-甲基-2-(5-苯基-1H-吡唑-3-基)-苯酚)。

可以有利地与本说明书的融合肽和与囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的增效剂组合使用的囊性纤维化跨膜传导调节蛋白 (CFTR)的矫正剂是例如VX-809(3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基(dioxol-5-yl))环丙烷甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸)和 VX-661((R)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)-N-(1-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-2-(1-羟基-2-二甲基丙-2-基)-1H-吲哚-5-基)-环丙烷甲酰胺)。

总而言之，本研究证实了选择性抑制PI3Kγ的激酶非依赖性活性的融合肽的治疗潜力。

该分子可用于治疗呼吸系统疾病，包括过敏性哮喘，在此情况下设计成增加cAMP的细胞内水平并促进支气管平滑肌松弛的药物是高度期望的。

此外，该化合物可以应用于囊性纤维化患者，在此情况下提高 cAMP浓度的试剂是刺激有缺陷的CFTR的cAMP介导的开放的关键工具。

此外，PI3Kγ的肽介导的抑制可以应用于特征为低功能性CFTR (包括COPD)的所有病理状况，在此情况下暴露于香烟烟雾已经被证明改变了CFTR的活性。

最后，通过PDE4的功能性阻塞，具有抑制PI3Kγ的能力的本说明书的融合肽能够发挥重要的抗炎作用。本文报道的实验证据证实肽确实限制了与过敏性哮喘相关的支气管周炎症。因此显而易见，抑制 PI3Kγ的激酶非依赖性活性可以在治疗呼吸系统疾病方面提供多种独立的治疗益处，同时作为支气管扩张剂、CFTR增效剂和抗炎剂起作用。

下文中将借助于非限制性实施例，参照具有SEQ ID No:2所示序列的融合肽(以下也称为“衍生自PI3Kγ的木马肽”)，其包含氨基酸序列SEQ ID No:1和对应于触角控制基因的穿膜肽1的穿透细胞的肽 (SEQ ID No:3，描述在(3)中)，详细说明本发明。

明显地，本说明书的范围不以任何方式受限于SEQ ID No:2的融合肽的具体序列，因为本说明书的融合肽可以包含i)与SEQ ID No:1 具有至少90％同一性且具有SEQ IDNo:1抑制PI3Kγ的激酶非依赖性功能的能力的序列以及ii)穿透细胞的肽的序列，其例如选自多肽 HIV-TAT、触角控制基因同源结构域肽(也称为穿透性肽或pAntp)、 R7肽、KALA肽、buforin 2、MAP、转运蛋白(transportan)、转运蛋白10、pVEC或MPG肽。对应于上文提到的穿透细胞的多肽的序列在图6中显示并在SEQ ID No:3至12中规定。

此外，在产生衍生自PI3Kγ的木马肽时，具有穿透细胞的能力的肽与SEQ ID No:1的N端融合。然而，通过产生具有穿透细胞的能力的肽在SEQ ID No:1的C端处的融合，可以产生落入本说明书范围内的融合肽。

实施例

材料和方法

测定与SEQ ID No:1同源的肽抑制PI3Kγ的激酶非依赖性功能的能力

为了测定与SEQ ID No:1具有至少90％同一性的同源肽抑制 PI3Kγ的AKAP的功能的能力，使用了先前描述的竞争试验(1)。将同源肽重悬于磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中至终浓度为50μM或 250μM。使用磷酸钙法，用由表达载体pcDNA3.1(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA；产品编码V790-20)构成的构建体转染HEK293 细胞(ATCC编号：CRL-1573^TM)，其中使用限制酶BamHI和XbaI (New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)对人PI3KγcDNA(SEQ ID No:13)进行克隆。pcDNA3.1-PI3Kγ构建体可从意大利都灵的都灵大学的Emilio Hirsch博士处免费获得。

转染后48小时，将细胞在含有120mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、全蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science， Indianapolis，IN)和磷酸酶抑制剂(50mmol/L氟化钠、1mmol/L原钒酸钠和10mmol/L焦磷酸钠)的冷裂解缓冲液中裂解。在冰上孵育 30分钟后，将裂解物在4℃下以13000rpm离心10分钟，并将上清液与肽在室温下孵育30分钟。孵育后，通过在振荡下将蛋白提取物与30μL的蛋白A与琼脂糖(Amersham Biosciences，Buckinghamshire， UK)的1:1混合物和抗PKA RII C20抗体(Santa Cruz BiotechnologyInc.，Dallas，Texas，USA；产品编号：sc-908)在4℃下孵育2小时而使PKA(PKA RII)的调节亚基免疫沉淀。用裂解缓冲液充分洗涤免疫复合物，并使用单克隆抗PI3Kγ抗体(可从意大利都灵的都灵大学的Emilio Hirsch博士处免费获得)通过蛋白印迹分析分析PI3Kγ与PKA RII的缔合。

动物

如前所述产生针对PI3Kγ的敲除小鼠(PI3Kγ^-/-)和表达PI3Kγ 的无催化活性形式的敲入小鼠(PI3Kγ^KD/KD)(4、5)。将突变小鼠与具有C57Bl/6J遗传背景的动物杂交15代，并且使用C57Bl/6J小鼠作为对照(PI3Kγ^+/+)。对于哮喘和健康小鼠的气道高反应性的研究，使用BALB/C雌性小鼠。对于所有实验，使用8周龄至12周的动物。在一个提供12小时光照和12小时黑暗的循环的受控系统中，将小鼠保持成群，可以自由获得食物(标准饮食)和水分。根据当地动物伦理委员会批准的动物福利准则和制度规定使用动物。

细胞培养和转染

人支气管平滑肌细胞(hBSMC)购自Lonza(CC-2576，Lonza Walkersville,Inc.USA)，在杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM， Gibco，Carlsbad，CA)中生长，并补充有10％胎牛血清(FBS)和5 mM青霉素/链霉素(Gibco，Carlsbad，CA)。至多传代15次的细胞用于实验。

根据制造商的方案，通过用Nucleofector装置(AMAXA， Gaithersburg，MD)进行电穿孔，用编码cAMP的FRET探针(ICUE3) (描述于美国专利US 8236523 B2)的质粒转染人支气管平滑肌细胞 (hBSMC)(2)。简而言之，将1×10⁶个细胞重悬于100μL的核酸转染溶液(VPI-1004，AMAXA，Gaithersburg，MD)中，与1μg的 pcDNA3-ICUE3(描述于美国专利US8236523 B2)混合并在Amaxa Biosystems(Program A-033)的核酸转染装置中进行电穿孔。转染后 24小时进行活细胞成像实验。

表达野生型CFTR(NuLi-1)或具有ΔF508突变(CuFi-1)的人气道上皮细胞系购自ATCC(NuLi-1产品编号：

CRL-4011^TM； CuFi-1产品编号：

CRL-4013^TM)。细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、30μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素和300μg/mL潮霉素B(Gibco，Carlsbad，CA)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM， Gibco，Carlsbad，CA)中培养。

蛋白质提取和免疫沉淀

对于来自鼠气管平滑肌细胞(mTSMC)和人支气管平滑肌细胞 (hBSMC)的蛋白质提取，用指定的药物/肽处理细胞，并立即在含有120mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、全蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)和磷酸酶抑制剂(50mmol/L氟化钠、1mmol/L原钒酸钠和10mmol/L焦磷酸钠)的冷裂解缓冲液中裂解。在冰上孵育30分钟后，将裂解物在4℃下以13000 rpm离心10分钟，并用于蛋白印迹或进行免疫沉淀和磷酸二酯酶活性的测定。

对于免疫沉淀试验，将蛋白提取物与30μL的蛋白质A或G和琼脂糖凝胶(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)的1:1 混合物预孵育，随后与20μL的蛋白质A或G和琼脂糖凝胶的1:1混合物以及每mg蛋白质1mg的一抗在4℃下孵育2小时。免疫复合物用裂解缓冲液充分洗涤并用于蛋白印迹或进行磷酸二酯酶活性的测定。

FRET成像和分析

如前所述(2)，对表达FRET探针ICUE3的人支气管平滑肌细胞(hBSMC)进行cAMP水平的测定。简而言之，将细胞保持在pH 为7.4的含有(以mmol/L)121.6NaCl、5.4KCl、1.8MgCl₂、1.8CaCl₂、 4NaHCO₃、0.8NaH₂PO₄、5D-葡萄糖、5丙酮酸钠、10HEPES的 K⁺-Ringer溶液中。使用具有氩激光器和63x浸没透镜的SP5 Leica TCS系统(Leica MicrosystemsInc.，Buffalo Grove，IL，USA)，在加入100nmol/L异丙肾上腺素(Iso)和100nmol/L CGP-20712A(CGP) 之前和之后进行FRET记录。为了激发CFP和YFP，分别使用458 和514nm波长。每4秒获得一次图像，没有任何中间线(media line)，扫描速度为400MHz，且分辨率为512×512像素。使用Leica向导应用提供的用于FRET成像和敏化发射的“方法3”计算FRET效率，根据其：E_A(i)＝B/A，其中E_A(i)是表观FRET效率；A和B分别是CFP 通道和FRET的强度。对于用肽处理的hBSMC中的成像，在用Iso 和CGP处理之前，将表达FRET指示剂ICUE3的细胞与50μM的衍生自PI3Kγ的木马肽(SEQ ID No:2- RQIKIWFQNRRMKWKKGKATHRSPGQIHLVQRHPPSEESQAF)或 P1对照肽(SEQ ID No:3-RQIKIWFQNRRMKWKK)预孵育30分钟。

磷酸二酯酶活性试验

如前所述(2)，根据Thompson和Appleman的两步法测定免疫沉淀物中的磷酸二酯酶活性，并进行微小的修改。简而言之，在总体积为200μL的含有40mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L MgCl₂、 1.4mmol/L 2-巯基乙醇和0.1pCi的[³H]cAMP(AmershamBioscience， Buckinghamshire，UK)的反应混合物中在33℃分析免疫沉淀物40 分钟。为了停止反应，将样品在95℃煮沸3分钟。然后通过将混合物与50μg的来自西部菱斑响尾蛇的蛇毒(Sigma-Aldrich，St.Louis， MO)在37℃下孵育15分钟而使反应产物5'-AMP水解。所得腺苷通过具有Dowex树脂AG1-X8(Bio-Rad，Segrate，Milan，Italy)、等份的水和100％乙醇的400μL混悬液的阴离子交换色谱法分离。通过闪烁计数(来自Perkin Elmer，Waltham，MA的Ultima Gold液体闪烁)定量上清液中的放射性标记的腺苷的量。

小鼠气管平滑肌细胞的分离

使用具有修改的先前描述的方法，从气管的外植体培养鼠气管平滑肌细胞。将喉部与支气管之间的整个气管移除，并将其置于含有室温下的Hanks平衡盐溶液和2x浓度的抗生素-抗真菌剂(Gibco， Carlsbad，CA，产品编号：15240-062)的无菌培养皿中。使用解剖显微镜，除去附加的周围组织，将气管段纵向分开并切成2-3mm大小的正方形。然后放置单个气管的所有段，内表面朝向60mm无菌细胞培养板的底部。将外植体粘附到板上后，加入补充有20％胎牛血清的 2.5ml杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，Gibco，Carlsbad，CA)以覆盖外植体。将外植体在37℃下在具有95％空气和5％CO₂的潮湿气氛中孵育。平板接种三天后，FBS和抗生素-抗真菌剂的浓度分别降低至10％和1×。当细胞变得局部汇合时，移除气管段。一旦60mm 板变得汇合，通过胰蛋白酶消化将细胞分开并转移到单个60mm板中。将气管平滑肌细胞进一步细分，以1:2的比率多次传代。如通过用对平滑肌肌动蛋白具有特异性的抗体进行的免疫荧光法所测定的，这些细胞中的超过90％是平滑肌细胞。所有实验都是对第3次传代的汇合细胞进行。

钙瞬变的测量

在P1对照肽、衍生自PI3Kγ的木马肽或载体的存在下，在37℃ 下用钙指示剂Indo-1-AM(2μM，Invitrogen，Carlsbad，California) 加载hBSMC40分钟。用pH为7.35的含有(以mmol/L表示)：5HEPES， 154NaCl、4KCl、2CaCl₂、1MgCl₂、5.5D-葡萄糖的Tyrode溶液洗涤细胞，并置于倒置显微镜上。将细胞保存在Tyrode溶液中，并用 pH为7.35的含有(以mmol/L表示)：5HEPES，118NaCl、40KCl、 2CaCl₂、1MgCl₂、5.5D-葡萄糖的KCl去极化溶液处理。钙瞬变作为在350nm处激发Indo-1-AM负载细胞后在400nm和490nm处测量的荧光信号的比率进行分析。使用由Jason Rothman(Neuromatic， www.thinkrandom.com)添加的功能，用

软件记录和分析实验。

氯离子电流在尤斯灌流室中的测量

为了测量正常和ΔF508原代人支气管上皮细胞中的氯离子电流，将细胞在1.12cm²的Snapwell插入物上培养。将过滤器安装在尤斯灌流室中，并通过将细胞在pH为7.4的含有(以mmol/L表示)：140 NaCl、5KCl、0.36K₂HPO₄、0.44KH₂PO₄、1.3CaCl₂、0.5MgCl₂、4.2NaHCO₃、10HEPES和10葡萄糖的基底外侧高氯离子缓冲液和 pH为7.4的含有(以mmol/L表示)：133.3葡萄糖酸钠、5葡萄糖酸钾、2.5NaCl、0.36K₂HPO₄、0.44KH₂PO₄、5.7CaCl₂、0.5MgCl₂、 4.2NaHCO₃、10HEPES和10甘露醇的顶端低氯离子缓冲液中孵育而施加氯离子梯度。用95％O₂和5％CO₂的混合物对缓冲液进行充气，并且在实验期间将温度保持在37℃。使用EVC4000 MultiChannel V/I Clamp(World Precision Instruments，Sarasota，FL，USA)将培养物保持在0mV的电压。在30分钟的稳定期后，在特定时间加入药物，同时持续记录电流。

cAMP提取和定量

在安乐死后从动物移出肺和气管，在液氮中粉碎，并用于使用6％三氯乙酸冷提取cAMP。将样品超声处理10秒，并在4℃下以13000 rpm离心15分钟。将上清液用五倍体积的用水饱和的乙醚洗涤四次并冻干。根据制造商方案，使用Amersham cAMP BioTrak酶免疫分析系统(GE Healthcare Life Sciences，Pittsburgh，USA，产品编号： RPN225)检测cAMP含量。

衍生自PI3Kγ的木马肽的体内转导效率的分析

将hBSMC与缀合至荧光素(50μM)的衍生自PI3Kγ的木马肽 (SEQ ID No:2)或载体孵育30分钟，用4％多聚甲醛(PFA)固定 10分钟并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)+0.5％Triton(Sigma-Aldrich， St.Louis，MO)在室温下透化5分钟。然后将细胞与含有3％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和鬼笔环肽-Alexa 488 (1:1000，Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)的PBS 孵育30分钟，并使用

Antifade试剂(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)安装在显微镜载玻片上。使用配有Apotome模块的Zeiss Observer-Z1(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany) 获得红色(肌动蛋白)和FITC(肽)荧光图像。

通过气管内途径给野生型BALB/C小鼠注射在70μL终体积的 PBS中的1.5μg与荧光素缀合的衍生自PI3Kγ的木马肽或载体。30 分钟后，使动物麻醉，将PBS吹入气管和肺中、提取并在OCT中冷冻。用Leica CM1850低温恒温器(Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany)获得10微米的冷冻切片，并用配有Apotome模块的Zeiss Observer-Z1(CarlZeiss，Oberkochen，Germany)获得荧光。

用卵清蛋白进行免疫

在第1天和第14天腹腔内(i.p.)施用，并在第14、25、26和 27天鼻内(i.n.)施用(50μl PBS中的50μg OVA)与硫酸铝钾(1mg，明矾)复合的卵清蛋白(100μg)(OVA，Sigma-Aldrich，St.Louis， MO)。对照小鼠仅接受明矾的i.p.注射和PBS的i.n.注射。在最终剂量的OVA后24小时(第28天)测量通过吸入的乙酰甲胆碱诱导的气道高反应性。

气道反应性的测量

方法1.将对卵清蛋白敏感的小鼠麻醉(戊巴比妥钠，70-90 mg/kg，i.p.)，切开气管，并连接到用于小动物的FlexiVent呼吸机 (SCIREQ，Montreal，Quebec，Canada)。为了诱导气道收缩，将小鼠暴露于渐增浓度的气雾化乙酰甲胆碱(10^-9至10^-4M，终浓度)。

方法2：通过用含有载体或150μg衍生自PI3Kγ的木马肽或等摩尔量的P1对照肽的70μL磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)进行气管内滴注，处理对卵清蛋白敏感的小鼠。根据先前公开的方案(6)，在处理后30分钟评估气道高反应性。简而言之，将小鼠麻醉(戊巴比妥钠，70-90mg/kg，i.p.)，切开气管并换气，吸气末正压为10cm H₂O，呼气末正压(PEEP)为3cm H₂O，呼吸频率为在环境空气中90次呼吸/min。使用压力传感器(SpecialInstruments，Digima Clic； Nordlingen，Germany)测量靠近气管内管的气道开启压力(Pao)和室内的压力。用呼吸速度描记器(Special Instruments，Digima Clic；Nordlingen，Germany)测量气流。潮气量计算为流量信号的积分。使用ICU-Lab软件(KleisTEK Advanced Electronic Systems，Bari，Italy) 记录机械换气的变量。气道高反应性被评估为在用静脉内施用的500 mg/kg乙酰甲胆碱处理后的潮气量变化。

哮喘小鼠中的气道炎症的分析

在每次鼻内施用卵清蛋白之前(用卵清蛋白进行免疫的方案的第 14、25、26和27天)，通过气管内滴注，用在70μL终体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的25μg衍生自PI3Kγ的木马肽或等摩尔量的 P1对照肽处理野生型BALB/C小鼠。在最终注射后24小时(第28 天)，将小鼠麻醉(戊巴比妥钠，70-90mg/kg，i.p.)，切开气管并插管。用2.5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤气道。用Neubauer血细胞计数器测定支气管肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数。将50μL体积的BAL在室温下以400rpm离心5分钟至细胞离心涂片器 (cytospin)玻璃载玻片上，并用Diff-Quick系统(LabAids， Ronkonkoma，USA)染色。计数每个载玻片总共100个细胞，并基于形态学标准分类为嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。忽略红细胞和上皮细胞，并将结果以细胞/ml表达。

为了评估支气管周炎症，移出尚未进行支气管肺泡灌洗的一组动物的肺，在4℃下在4％多聚甲醛(PFA)溶液中固定24小时，并包埋在石蜡中。将5μm厚的切片脱蜡，用苏木精-曙红溶液(Bio-Optica， Milano，Italy)染色，脱水并用玻璃盖玻片固定。支气管周炎症的程度分类如下：0-正常；1-很少的炎症细胞；3-炎症细胞的厚环。

为了评估杯状细胞的存在，肺切片用过碘酸-雪夫试剂(PAS) (Bio-Optica，Milano，Italy)染色，并通过计数PAS阳性上皮细胞和总上皮细胞的数量计算PAS阳性细胞的百分比。

抗体、试剂和质粒

使用可从美国加利福尼亚旧金山的加州大学旧金山分校的Marco Conti博士处免费获得的多克隆兔抗体，如先前所述(2)使PDE4B 和PDE4D免疫沉淀。对PDE4B和PDE4D具有特异性的商业抗体可从Abcam购买(Abcam，Cambridge，MA，USA)：抗PDE4B产品编号：ab14611；抗PDE4D产品编号：ab14614。抗Ca_v1.2和磷-Ca_v1.2 的兔多克隆抗体可从美国华盛顿州西雅图的华盛顿大学的William A. Catterall博士处免费获得。

识别由PKA磷酸化的底物(P-PKA底物)的抗体购自Cell Signaling Technology(Danvers，MA，USA；产品编号：#9621)，并且抗CFTR克隆体M3A7的抗体购自Millipore(Billerica，MA， USA；产品编号：05-583)。

ICUE3-pcDNA3如前所述(2)。

异丙肾上腺素、CGP-20712A、卡巴胆碱、咯利普兰、阿米洛利和毛喉素均购自Sigma(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。CFTR矫正剂VX-809、CFTR增效剂VX-770和CFTR抑制剂172均购自 Selleckchem(Houston，TX，USA)。

P1对照肽(SEQ ID No:3-RQIKIWFQNRRMKWKK)和衍生自 PI3Kγ的木马肽(SEQ IDNo:2- RQIKIWFQNRRMKWKKGKATHRSPGQIHLVQRHPPSEESQAF)由 GenScript(GenScript，Piscataway，NJ，USA)和Chinapeptides (Chinapeptides Co.Ltd.，Shanghai，China)合成。

统计分析

Prism软件(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA)用于统计分析。视情况而定，使用Student’s t检验，单因素或双因素方差分析，随后是Bonferroni检验，计算P值。在所有附图中，图表代表至少3次独立实验的平均值±标准差。

结果

衍生自PI3Kγ的木马肽增强了支气管平滑肌细胞中的 β₂-AR/cAMP信号传导

提高支气管平滑肌中的β₂-AR的下游cAMP水平的策略用于治疗呼吸系统疾病是很令人感兴趣的。为了探索抑制PI3Kγ依赖性 β₂-AR-cAMP信号传导的治疗潜力，设计了PI3Kγ的激酶非依赖性活性的肽抑制剂，其序列显示在SEQ ID No:2中。以前的研究表明包含人PI3Kγ(SEQ ID No:1)的126-150残基的肽体外抑制PKA锚定并降低PI3Kγ结合的磷酸二酯酶3B的活性(1)。为了体内抑制PI3Kγ 的PKA锚定活性，通过将人PI3Kγ(SEQ IDNo:1)的126-150结构域与触角控制基因穿透肽1的木马肽(SEQ ID No:3-图1A)结合而获得可穿透细胞膜的抑制性融合肽。在孵育后30分钟，用荧光素 (FITC)标记的一个版本的PI3Kγ抑制性木马肽在人支气管平滑肌细胞(hBSMC)的细胞质中积累，表明抑制剂在分离的细胞中有效地体内转导(图1B)。此外，PI3Kγ抑制性肽在野生型小鼠(PI3Kγ^+/+) 的气管平滑肌细胞中，但不在缺乏酶的动物(PI3Kγ^-/-)的气管平滑肌细胞中(图1C)显著降低PDE4B和PDE4D的催化活性，证实肽选择性地干扰PKA的PI3Kγ依赖性锚定的能力。根据这些数据，用PI3Kγ 抑制性木马肽预处理的hBSMC在刺激β₂-AR后增加35％的cAMP积累，而在用P1对照肽处理的细胞中cAMP水平不变(图1D和E)。

由于已知cAMP诱导Ca²⁺的细胞内水平降低并从而促进平滑肌松弛，分析了PI3Kγ抑制性木马肽在hBSMC中改变Ca²⁺浓度的能力。与暴露于载体或P1对照肽的细胞相比，在用PI3Kγ抑制剂预处理的 hBSMC中，由毒蕈碱激动剂卡巴胆碱诱导的Ca²⁺瞬变的最大峰值显著更低(图2A-B)。环状核苷酸限制平滑肌细胞中的细胞内Ca²⁺的主要机制是电压依赖性Ca²⁺通道(VOCC)的抑制。此外，以前已经证明PI3Kγ是这些Ca²⁺通道附近的cAMP的关键调节者(2)。为了验证抑制PI3Kγ的锚定活性是否减少Ca²⁺通过VOCC流入，将hBSMC 暴露于含有KCl的溶液，其能够使膜去极化并因此激活VOCC。KCl 诱导的Ca²⁺的流入被PI3Kγ抑制性木马肽完全消除，而其在用P1对照肽或载体处理的hBSMC中没有变化(图2A-B)。为了进一步支持这些结果，与用载体或P1肽处理的对照细胞相比，在用PI3Kγ的抑制剂处理的hBSMC中发现Ca²⁺通道的孔形成亚基Ca_v1.2的cAMP介导的磷酸化显著更高(图2C)。

总而言之，这些数据表明在平滑肌细胞中，抑制PI3Kγ的PKA 锚定功能的木马肽构成了用于抑制选定的PDE并增强β₂-AR的下游 cAMP信号传导的新型方法。

衍生自PI3Kγ的木马肽限制健康和哮喘小鼠中的气道高反应性

为了测定PI3Kγ抑制性肽在气道中的体内转导效率，在BALB/C野生型小鼠中通过气管内途径滴注肽的荧光素(FITC)标记形式。在施用后30分钟，在气管和肺中，但不在脑或心肌中检测到FITC荧光(图3A)；这证实肽有效地分布在动物的呼吸道中。此外，与用磷酸缓冲盐水溶液 (PBS)或P1对照肽处理的对照动物相比，在用PI3Kγ抑制性木马肽注射的小鼠的气管和肺中的cAMP水平高30％(图3B)。与呼吸道中增强的cAMP积累一致，在健康小鼠中，由毒蕈碱激动剂乙酰甲胆碱诱导的气道高反应性被PI3Kγ抑制性肽，但不被P1对照肽显著减弱(图3C)。为了验证衍生自PI3Kγ的木马肽的气管内施用是否抑制与过敏性哮喘相关的气道高反应性，产生了卵清蛋白(OVA)诱导的哮喘的临床前模型。与接收PBS或P1肽的对照小鼠相比，在用PI3Kγ抑制性肽处理的动物中，由乙酰甲胆碱诱导的潮气量的减少被显著减弱(图3D)。

总体来看，这些数据证实了衍生自PI3Kγ的木马肽在气道中体内增加cAMP水平并作为支气管扩张剂起作用的能力。

衍生自PI3Kγ的木马肽在表达野生型或ΔF508突变CFTR的支气管上皮细胞中提高cAMP水平并增强CFTR的传导

随后，检查了PI3Kγ抑制性木马肽不仅在气道的平滑肌细胞中而且在上皮细胞中增加cAMP水平的能力。为此目的，我们分析了囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)(呼吸道的上皮中的主要氯离子(Cl^-) 通道)的cAMP介导的磷酸化，该CFTR的激活是cAMP依赖性的。与暴露于载体或P1对照肽的对照细胞相比，在用衍生自PI3Kγ的木马肽处理的正常人支气管上皮细胞(Nuli-1)中的CFTR磷酸化显著更高(图 4A)。特别是，PI3Kγ的锚定功能的抑制进一步增强由PDE4的已知抑制剂诱导的cAMP依赖性CFTR磷酸化(图4A)，表明PI3Kγ抑制性肽不仅抑制PDE4，而且抑制已知与PI3Kγ相关的其他PDE同种型，例如PDE3(2)。

为了检验增加的CFTR磷酸化是否与更高的Cl^-传导相关，在表达野生型CFTR的NuLi-1细胞中在尤斯灌流室中进行Cl^-电流的测量。在施用衍生自PI3Kγ的木马肽后，CFTR依赖性电流显著增加，而P1对照肽不改变传导(图4B)。因此这些数据揭示了PI3Kγ抑制性肽作为CFTR 增效剂的新型作用。

需要具有CFTR增效剂活性的分子在囊性纤维化(CF)的治疗中刺激有缺陷的CFTR的开放。为了确定衍生自PI3Kγ的木马肽是否能够矫正突变CFTR的有缺陷的Cl^-传导，在表达突变CFTR ΔF508-CFTR(CuFi-1)的支气管上皮细胞中测量CFTR依赖性电流。 PI3Kγ抑制协同地增加已知CFTR增效剂VX-770的活性，导致CFTR 电流比基础活性增加约5倍(图4A和B)。相比之下，在VX-770 的存在下，P1对照肽没有改变CFTR活性(图4A和B)。

总而言之，这些数据揭示了PI3Kγ抑制性肽作为CFTR增效剂的新型功能，其促进野生型通道和突变CFTR(ΔF508-CFTR)的cAMP 依赖性开放。

PI3Kγ衍生的木马肽限制哮喘小鼠的肺部炎症

众所周知，白细胞中的cAMP的增加促进炎症反应。因此，评估了PI3Kγ衍生的木马肽在该细胞类型中增加cAMP浓度并从而限制与慢性呼吸系统疾病相关的炎症的能力。与不对卵清蛋白敏感的对照动物(天然)相比，在每次鼻内注射卵清蛋白前用P1对照肽预处理的小鼠显示出支气管周炎症增加(图7A和B)，并且含有粘液且对过碘酸-雪夫试剂(PAS)染色为阳性的杯状细胞的数量增加(图7A和 C)。衍生自PI3Kγ的木马肽显著降低了支气管周围炎性浸润(图7A 和B)和杯状细胞数量(图7A和C)两者。与这些结果一致，与接受P1肽的对照相比，在用PI3Kγ抑制性木马肽处理的动物中，存在于支气管肺泡灌洗液中的嗜中性粒细胞的数量显著更低(图7D)。相比之下，其他白细胞群体例如巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞不变(图7E-F-G)。

总而言之，本实验证据证实了衍生自PI3Kγ的木马肽选择性抑制与慢性呼吸系统疾病相关的嗜中性粒细胞，并从而作为抗炎药起作用的能力。

参考文献

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6.V.Fanelli等,Intensive Care Med 36,1935(2010年10月).

Claims

1.融合肽在制备适合于治疗支气管阻塞性疾病的药物中的用途，所述融合肽包含：

i)与SEQ ID No:1具有至少90％同一性且具有序列SEQ ID No:1抑制PI3Kγ的激酶非依赖性功能的能力的氨基酸序列，和

ii)具有穿透细胞的能力的肽。

2.根据权利要求1所述的融合肽的用途，其中所述支气管阻塞性疾病选自过敏性哮喘、囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病。

3.根据权利要求1或2所述的融合肽的用途，其中所述融合肽适合通过吸入施用。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合肽的用途，其中所述具有穿透细胞的能力的肽选自SEQ ID No:3至12规定的序列。

5.一种产品，其包含：

i)融合肽，所述融合肽包含：

a)与SEQ ID No:1具有至少90％同一性且具有序列SEQ ID No:1抑制PI3Kγ的激酶非依赖性功能的能力的氨基酸序列，和

b)具有穿透细胞的能力的肽，和

ii)囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的至少一种增效剂和/或囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的至少一种矫正剂，作为连续、同时或分开用于治疗呼吸系统疾病的组合制备物。

6.根据权利要求5所述的产品，其中所述具有穿透细胞的能力的肽选自SEQ ID No:3至12规定的序列。

7.根据权利要求5或6所述的产品，其中所述呼吸系统疾病是支气管阻塞性疾病。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的产品，其中所述呼吸系统疾病是囊性纤维化。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的产品，其中所述囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的增效剂选自VX-770(N-(2,4-二叔丁基-5-羟基苯基)-1,4-二氢-4-氧代喹啉-3-甲酰胺)和VX-532(4-甲基-2-(5-苯基-1H-吡唑-3-基)-苯酚)。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的产品，其中所述囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的矫正剂选自VX-809(3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)环丙烷甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸)和VX-661((R)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)-N-(1-(2,3-二羟基丙基)-6-氟-2-(1-羟基-2-二甲基丙-2-基)-1H-吲哚-5-基)-环丙烷甲酰胺)。