CN113563250A - 一种苯甲酸色胺衍生物及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种苯甲酸色胺衍生物及其制备与应用。本发明苯甲酸色胺衍生物以水杨酸类化合物为起始原料，经过苄基保护、氨基甲酰化、脱保护、缩合四步反应合成得到。本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物具有乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶双重抑制作用，且其作为混合型可逆抑制剂可以减少细胞和动物水平上AChE的含量和表达。同时具备良好的抗神经炎症活性，可以抑制Aβ的聚集，降低BACE‑1的表达。可以显著改善AD模型鼠的学习记忆与抗抑郁能力，在细胞和动物水平上均无明显的毒性，且具有良好的药代动力学性能和血脑屏障通透能力，可应用于制备阿尔兹海默症治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种苯甲酸色胺衍生物的制备；本发明还同时涉及苯甲酸色胺衍生物在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。
背景技术
阿尔兹海默症（AD）作为最常见的神经退行性疾病，是全球人群痴呆症发生的主要原因，但其发病机制至今仍尚不清楚。最新研究资料显示，阿尔茨海默病（AD）的潜在病理机制包括β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、Tau蛋白过度磷酸化造成神经纤维缠结、神经递质水平失衡、能量代谢紊乱、表观遗传变异，血管异常以及过度的神经炎症等引起神经元损伤，最后导致认知和行为障碍。随着人口老龄化的增长，AD患病率和治疗费用预计将呈指数级增长，这给患者、家庭、社会和医疗体系都带来了沉重负担。目前已批准的AD治疗药物主要有胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏）、N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）拮抗剂（美金刚）和靶向脑-肠轴的国产原研药物甘露特钠（GV-971）。然而，这些药物大多只是针对单一靶点改善临床症状，难以从根本上逆转疾病的进展，且容易产生耐药性和严重的不良反应。截止目前，针对高发病率的AD仍然缺乏特异的治疗方法，甚至对于中晚期的患者基本是处于“无药可用”的困境。因此，临床上迫切需要研发具有新型作用特点的AD治疗药物。
截止至2021年6月21日，根据Alzforum上的统计，历史上共有258种AD药物进入过临床试验阶段，但因为种种原因，近一半已经终止了实验，目前全球抗AD在研新药有152个，在II-III期临床实验中75%表现出积极的作用，主要集中在Aβ级联（38%）、神经递质（27%）、神经炎症（16%）、Tau蛋白病理（5%）、神经元凋亡（9%）和神经营养（5%）等病理靶点。很多专家指出，未来抗AD药物的研发不能只针对单一靶点，需采用多种疗法、多种模式来阻止这种疾病的发生发展，因此，多靶点导向配体（MTDLs）被认为是目前有效的治疗策略。研究表明，AD与多种中枢神经递质如乙酰胆碱（ACh）、5-羟色胺、多巴胺、兴奋性氨基酸等的异常有关，其中胆碱能神经系统功能缺陷尤为突出。老年痴呆病人脑组织中胆碱能标志物降低，主要是胆碱乙酰酶活性降低导致ACh合成减少。中枢胆碱能系统损伤是造成AD患者记忆损伤和认知功能降低的关键。研究表明，随着AD症状的加深（轻度-中度-重度），丁酰胆碱酯酶（BChE）的活性调控作用明显高于乙酰胆碱酯酶（AChE），是晚期AD的潜在治疗靶点。此外，近年来随着临床医学和分子生物学的快速发展，对于AD的发病机制研究不断深入，很多潜在的AD治疗新靶点被发现。小胶质细胞作为中枢神经系统的先天免疫细胞，在神经退行性疾病进程中由于被长期激活会释放炎症介质、活性氧中间产物、NO、蛋白水解酶、互补因子或兴奋性氨基酸等毒性物质，进而会造成周边神经元的损伤。同时，反应性小胶质细胞是AD患者大脑中淀粉样蛋白斑块沉积、Tau蛋白病理磷酸化和聚集的桥梁。由此可见，抑制小胶质细胞激活，干预神经炎症对预防AD及早期治疗具有重大作用。因此，设计开发具有抗神经炎症活性的多功能胆碱酯酶抑制剂对治疗不同阶段的AD具有重大临床价值，有进步开发得到“治标又治本”的潜力。
基于经典药物设计原理，在前期研究中已经证实了苯甲酸色胺类化合物能同时抑制COX-2和小胶质细胞的激活，具有显著的抗神经炎症活性，且部分活性分子也具有Aβ聚集抑制作用，对开拓出预防及治疗AD的新型先导化合物提供一定的理论基础。进一步通过胆碱酯酶抑制活性实验发现，该类化合物本身不具备胆碱酯酶抑制活性。考虑到ACh对认知功能的关键作用，以及文献调研发现，氨基甲酸酯片段在常见胆碱酯酶抑制剂（如卡巴拉汀、毒扁豆碱等）中作为重要药效团在体内能结合丝氨酸残基上的羟基，对胆碱酯酶抑制活性有重要调节作用，鉴于此，我们以苯甲酸色胺类化合物作为基本骨架，通过合理融合氨基甲酸酯药效团，设计合成了一系列苯甲酸色胺衍生物，初步生物活性研究表明该类化合物的确具有良好的抗神经炎症活性及胆碱酯酶（AChE和BChE）抑制活性，此外，也具有良好的Aβ聚集抑制和抗氧化等多种活性，以期找到能有效预防及治疗AD的新型多功能胆碱酯酶抑制剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种苯甲酸色胺衍生物及其制备方法；
本发明的另一个目的是提供苯甲酸色胺衍生物在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。
本发明一种苯甲酸色胺衍生物，其结构式如下：
其中，R1为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪；R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种； R3为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢的一种。
本发明一种苯甲酸色胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以羟基苯甲酸类化合物和溴化苄为原料，以碳酸氢钠为碱，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在氩气保护下，30~50 ℃下反应2~6 h，反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去N,N-二甲基甲酰胺，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物1；
羟基苯甲酸类化合物的结构式为：
，R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种；
化合物1的结构式为：
，R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种；
溴化苄的用量为羟基苯甲酸类化合物摩尔量的0.8~1.0倍；碳酸氢钠的用量为羟基苯甲酸类化合物摩尔量的1.0~1.5倍。
（2）以化合物1和双(三氯甲基)碳酸酯为原料，以吡啶为碱，以二氯甲烷为溶剂，在氩气保护的条件下，于0~15 ℃反应0.5~2 h后，加入胺类化合物，转移至室温反应0.5~2 h，反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，用二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物2；
化合物2的结构式为：
，R1为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪； R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种；
双(三氯甲基)碳酸酯的用量为化合物1摩尔量的0.2~0.5倍；吡啶的用量为化合物1摩尔量的1~3倍；胺类化合物为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪；胺类化合物的用量为化合物1摩尔量的0.8~1.0倍。
（3）以化合物2为原料，以钯碳为催化剂，以甲醇为溶剂，在氢气条件下，反应5~40min，反应完成后，抽滤收集滤液旋干，柱层析分离得到化合物3；
化合物3的结构式为：
，R1为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪； R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种；钯碳的用量为化合物2摩尔量的0.2~0.5倍。
（4）以化合物3和色胺类化合物为原料，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，以1-羟基苯并三氮唑为催化剂，以三乙胺为碱，以二氯甲烷为溶剂，在氩气条件下，于室温反应1~4 h，反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物苯甲酸色胺衍生物；
色胺类化合物的结构式为：
，R3为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢的一种；色胺类化合物的用量为化合物3摩尔量的1.0倍；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的用量为化合物3摩尔量的1~1.2倍；1-羟基苯并三氮唑的用量为化合物3摩尔量的0.5~1.2倍；三乙胺的用量为化合物3摩尔量的1.5~2.5倍。
本发明所制备的苯甲酸色胺化合物的合成路线如下：
其中，R1为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪； R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种； R3为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢的一种。
本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物具备乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的双重抑制效果，且作为混合型可逆抑制剂，在体内也可以有效地减少乙酰胆碱酯酶的含量与表达。具有一定的抗神经炎症作用，同时可以减少Aβ的含量与表达。体内实验表明具有良好的药代动力学特征和血脑屏障通透能力，且能显著改善AD模型鼠的学习记忆和抗抑郁能力。
本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物通过Ellman光谱法显示，具有乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶双重抑制作用，且对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶均表现为混合型可逆抑制剂。
本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物通过MTT法测定发现在小鼠小胶质细胞和海马神经元细胞上没有明显的细胞毒性。
本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物通过ELISA试剂盒、Western blot实验发现可以抑制小胶质细胞中由LPS刺激引发的炎症因子IL-4、IL-6、TNF-α等的含量，同时能抑制iNOS、BACE-1的表达，促进神经营养因子的产生。
本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物可以抑制小胶质细胞中ROS的爆发，抑制海马神经元的调亡。
本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物经急性毒性实验结果显示，化合物没有明显的毒性。本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物对AD模型鼠通过行为学实验发现可以显著改善AD模型鼠的学习记忆和抗抑郁能力。
本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物经大鼠药代动力学实验发现其具有良好的药代动力学参数，且可以很好地通过血脑屏障。
本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物脑匀浆通过试剂盒和Western blot 实验发现，可以减少小鼠体内乙酰胆碱酯酶的含量与表达。
综上所述，本发明苯甲酸色胺衍生物以羟基苯甲酸类化合物为起始原料，经过苄基保护、氨基甲酰化、脱保护、缩合四步反应合成得到。本发明所制备的苯甲酸色胺衍生物具有乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶双重抑制作用，且其作为混合型可逆抑制剂可以减少细胞和动物水平上AChE的含量和表达。同时具备良好的抗神经炎症活性，可以抑制Aβ的聚集，降低BACE-1的表达。可以显著改善AD模型鼠的学习记忆与抗抑郁能力，在细胞和动物水平上均无明显的毒性，且具有良好的药代动力学性能和血脑屏障通透能力，可应用于制备阿尔兹海默症治疗药物。
附图说明
图1为本发明合成化合物对AChE的可逆性的检测、对AChE抑制类型的判断以及所选化合物对AChE动力学参数的检测。
图2 为本发明合成化合物对BChE的可逆性的检测、对BChE抑制类型的判断以及所选化合物对BChE动力学参数的检测。
图3 为本发明合成化合物对LPS刺激下的BV2细胞上清液中IL-4、IL-6、TNF-α的影响，以及对其中iNOS和NO含量的影响。
图4 为本发明合成化合物对LPS刺激下的BV2细胞中神经营养因子（BDNF），诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和β淀粉样前体蛋白（BACE-1）表达的影响。
图5 为本发明合成化合物对LPS刺激下的BV2细胞中ROS爆发的影响。
图6 为本发明合成化合物对LPS刺激下的HT22细胞凋亡情况的影响。
图7 为空白组与给药组（2000 mg/kg，灌胃，单次给药）的脾脏、肝脏、肾脏、心脏、脑的病理切片结果和14天内小鼠体重的变化。
图8 为空白组、模型组与不同剂量给药组的实验小鼠在Morris水迷宫实验中定位航行实验中的潜伏期变化。
图9 为空白组、模型组与不同剂量给药组的实验小鼠在Morris水迷宫实验中空间探索实验中的运动轨迹变化。
图10 为空白组、模型组与不同剂量给药组的实验小鼠开场实验中的运动距离与运动轨迹的变化。
图11 为空白组、模型组与不同剂量给药组的实验小鼠海马体中AChE蛋白的含量和表达的变化。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl dimethylcarbamate (化合物H-01)
化合物H-01的结构式为：
（1）将水杨酸（7.25mmol）和NaHCO3（8.7mmol）加入50 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入15 mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，滴加溴化苄（6.5mmol），加热到40 ℃反应4小时。经TLC监测反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去N,N-二甲基甲酰胺，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物benzyl 2-hydroxybenzoate (化合物1)，产率为88%。
（2）将双(三氯甲基)碳酸酯（0.26 mmol）加入50 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入3 mL干燥的二氯甲烷，之后将吡啶（1.76 mmol）用1.4mL二氯甲烷稀释后滴加到圆底烧瓶中,在0 ℃中反应30 min后，缓慢滴加溶于二氯甲烷中的benzyl 2-hydroxybenzoate (化合物1，0.88 mmol)，继续0 ℃中反应30 min。后缓慢滴加溶于二氯甲烷中的二甲胺（0.704mmol），0 ℃中反应40 min。经TLC监测反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，再加饱和碳酸氢钠水溶液中和反应体系，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物benzyl 2-((dimethylcarbamoyl)oxy)benzoate (化合物2, R1=N(CH3)2，R2=H)，产率为85%。
（3）将benzyl 2-((dimethylcarbamoyl)oxy)benzoate（0.8 mmol），钯碳（0.2-0.5mmol）加入25 mL圆底烧瓶中，以甲醇为溶剂，置换氢气。反应10分钟。经TLC监测反应完成后，用砂芯过滤，收集有机相旋干，得到粗产物2-((dimethylcarbamoyl)oxy)benzoic acid(化合物3, R1=N(CH3)2，R2=H)。
（4）将2-((dimethylcarbamoyl)oxy)benzoic acid（1 mmol），2-(phenylamino)benzoic acid（1 mmol），1-羟基苯并三氮唑（1.2 mmol），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（1.2 mmol），三乙胺（2.5 mmol）加入25 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入5mL干燥的二氯甲烷，室温反应2小时。经TLC监测反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyldimethylcarbamate (化合物H-01, R1=N(CH3)2, R1所在基团在苯环上的取代位置为邻位,R2=H, R3=H) ，产率为70%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.88 (s, 1H), 7.66 (m, J =7.7, 1.4 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.38 (m, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H),7.29 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.23 – 7.14 (m, 2H), 7.12 – 7.06 (m, 2H), 6.91 (s,1H), 6.75 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 3.75 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 6.7 Hz,2H), 2.79 (s, 3H), 2.75 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.09, 154.45,148.42, 136.42, 131.32, 129.51, 129.19, 127.14, 125.66, 123.06, 122.20,121.80, 119.09, 118.37, 112.17, 111.27, 39.61, 36.51, 36.00, 25.13.
实施例2
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl diethylcarbamate (化合物H-02).
化合物H-02的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为二乙胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。(化合物H-02 , R1=N(CH2CH3)2, R1所在基团在苯环上的取代位置为邻位， R2=H,R3=H).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.35 (s, 1H), 7.63 (m, J = 7.7, 1.5 Hz, 1H),7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.40 (m, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.23 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.17 (m, J = 11.1, 4.0 Hz, 1H), 7.11 (d, J =7.1 Hz, 1H), 7.09 – 7.05 (m, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 3.73 (q, J =12.9, 6.8 Hz, 2H), 3.25 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 3.01 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.13(t, J = 7.0 Hz, 6H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.31, 154.19, 148.34, 136.40,131.25, 129.93, 129.44, 127.18, 125.72, 123.04, 122.20, 121.94, 119.23,118.52, 112.48, 111.22, 42.31, 41.89, 39.91, 25.29, 14.03, 13.29.
实施例3
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-03).
化合物H-03的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率64%。(化合物H-03 , R1=N(OCH3)CH3, R1所在基团在苯环上的取代位置为邻位 R2=H, R3=H).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.48 (s, 1H), 7.86 (d, J = 7.3 Hz, 1H),7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45 (m, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz,1H), 7.30 – 7.25 (m, 1H), 7.23 – 7.14 (m, 2H), 7.13 – 7.08 (m, 1H), 6.97 (d,J = 1.7 Hz, 2H), 3.76 (q, J = 12.8, 6.8 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.11 (s, 3H),3.04 (t, J = 6.9 Hz, 2H)13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.17, 154.16, 148.00,136.35, 131.66, 130.23, 127.77, 127.17, 126.08, 122.95, 122.18, 121.85,119.14, 118.46, 112.52, 111.25, 61.70, 40.11, 35.14, 25.13.
实施例4
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl dipropylcarbamate (化合物H-04).
化合物H-04的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为二丙胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。(化合物H-04, R1=N(CH2CH2CH3)2, R1所在基团在苯环上的取代位置为邻位, R2=H, R3=H).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.44 (s, 1H), 7.66 – 7.58 (m, 2H), 7.43 –7.37 (m, 1H), 7.31 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.18 (t, J= 7.5 Hz, 1H), 7.11 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.96 (d, J= 1.7 Hz, 1H), 6.65 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.73 (q, J = 13.0, 6.8 Hz, 2H), 3.21– 3.10 (m, 4H), 3.01 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.57 (m, J = 14.5, 7.2 Hz, 4H),0.88 (m, J = 7.3, 3.6 Hz, 6H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.28, 154.68,148.37, 136.41, 131.24, 129.97, 129.48, 127.18, 125.71, 122.98, 122.14,121.87, 119.16, 118.48, 112.41, 111.25, 49.53, 49.18, 39.91, 25.28, 21.80,21.09, 11.13.
实施例5
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl dibutylcarbamate (化合物H-05).
化合物H-05的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为二丁胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率72%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.56 (s, 1H), 7.65 (m, J = 7.7, 1.6 Hz, 1H),7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.40 (m, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.23 (m, J = 7.6, 0.9 Hz, 1H), 7.20 – 7.14 (m, 1H), 7.13 – 7.08 (m, 1H),7.08 – 7.04 (m, 1H), 6.94 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.68 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.73(q, J = 12.9, 6.9 Hz, 2H), 3.19 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 3.01 (t, J = 7.0 Hz,2H), 1.59 – 1.47 (m, 4H), 1.36 – 1.24 (m, 4H), 0.92 (t, J = 7.3 Hz, 6H).13CNMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.22, 154.57, 148.38, 136.40, 131.24, 129.87,129.48, 127.14, 125.67, 122.96, 122.14, 121.78, 119.07, 118.43, 112.26,111.25, 47.53, 47.15, 39.89, 30.66, 29.93, 25.24, 19.87, 19.85, 13.72.
实施例6
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl diphenylcarbamate (化合物H-06).
化合物H-06的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为二苯胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.00 (s, 1H), 7.79 (m, J = 7.7, 1.4 Hz, 1H),7.61 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.47 – 7.40 (m, 1H), 7.33 – 7.27 (m, 5H), 7.24 (d,J = 3.0 Hz, 3H), 7.22 (s, 2H), 7.20 – 7.17 (m, 2H), 7.13 (t, J = 7.4 Hz, 1H),6.91 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 3.63 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.98 (t, J= 6.7 Hz, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.46, 152.21, 148.28, 141.69,136.25, 131.55, 130.11, 129.16, 127.97, 127.25, 126.83, 126.70, 125.84,122.76, 122.28, 122.04, 119.35, 118.59, 112.81, 111.27, 40.23, 25.14.
实施例7
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl dibenzylcarbamate (化合物H-07).
化合物H-07的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为二苄胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率68%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.20 (s, 1H), 7.67 (m, J = 7.7, 1.6 Hz, 1H),7.53 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.42 (m, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.39 – 7.33 (m, 4H),7.33 – 7.28 (m, 4H), 7.24 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.23 – 7.18 (m, 2H), 7.18 –7.15 (m, 1H), 7.09 (m, J = 10.7, 4.0 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.54(t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.36 (s, 2H), 3.66 (q, J = 6.7 Hz, 2H),2.92 (t, J = 6.8 Hz, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.05, 155.09, 148.35,136.58, 136.52, 136.35, 131.39, 129.69, 129.56, 128.73, 128.71, 128.18,127.73, 127.65, 127.55, 127.17, 125.94, 123.00, 122.10, 121.93, 119.21,118.64, 112.49, 111.20, 49.96, 49.51, 39.81, 25.11.
实施例8
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methyl(phenyl)carbamate(化合物H-11).
化合物H-11的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲基苯胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率67%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.51 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.66 (d, J =7.5 Hz, 1H), 7.45 (m, J = 11.1, 4.4 Hz, 1H), 7.32 (m, J = 10.0, 7.9 Hz, 4H),7.25 – 7.15 (m, 4H), 7.11 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 3.63 (s, 2H),3.30 (s, 3H), 3.01 (t, J = 6.3 Hz, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.32,152.76, 148.41, 142.07, 136.31, 131.48, 130.16, 129.13, 127.19, 125.94,125.64, 122.82, 122.33, 121.83, 119.15, 118.45, 112.43, 111.28, 40.14, 38.16,25.03.
实施例9
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl azetidine-1-carboxylate(化合物H-14).
化合物H-14的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为杂氮环丁胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率76%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.46 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.76 (d, J =7.7 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34 (d, J =8.0 Hz, 1H), 7.25 – 7.16 (m, 2H), 7.11 (m, J = 14.2, 7.8 Hz, 2H), 7.01 (s,1H), 6.75 (s, 1H), 3.90 – 3.72 (m, 6H), 3.07 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.01 – 1.90(m, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.84, 153.39, 148.22, 136.54, 131.55,130.04, 128.51, 127.32, 125.71, 123.03, 122.37, 122.08, 119.36, 118.55,112.58, 111.31, 50.03, 49.19, 39.63, 25.27, 15.54.
实施例10
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate(化合物H-15).
化合物H-15的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为四氢吡咯，其余步骤同实施例1制备而得，收率78%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.45 (s, 1H), 7.74 (q, J = 7.7, 1.6 Hz,1H), 7.59 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.40 (m, J = 8.1, 1.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J =8.0 Hz, 1H), 7.23 (m, J = 10.9, 4.2 Hz, 1H), 7.17 (m, J = 11.1, 4.0 Hz, 1H),7.13 – 7.07 (m, 2H), 6.99 (s, 1H), 6.80 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.77 (q, J = 6.5Hz, 2H), 3.26 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.18 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.01 (t, J = 6.6Hz, 2H), 1.73 – 1.61 (m, 4H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.96, 152.54,148.34, 136.39, 131.38, 129.82, 128.86, 127.15, 125.62, 123.12, 122.23,121.94, 119.23, 118.41, 112.41, 111.24, 46.46, 46.13, 39.60, 25.44, 25.21,24.64.
实施例11
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl piperidine-1-carboxylate(化合物H-16).
化合物H-16的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为哌啶，其余步骤同实施例1制备而得，收率85%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.53 (s, 1H), 7.68 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.60(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.25– 7.04 (m, 4H), 6.97 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 3.74 (q, J = 12.7, 6.4 Hz, 2H),3.34 (s, 4H), 3.01 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.50 (s, 6H).13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ 166.22, 153.46, 148.56, 136.51, 131.42, 129.69, 129.46, 127.27, 125.77,123.19, 122.35, 121.94, 119.25, 118.55, 112.43, 111.40, 45.46, 45.21, 40.00,25.85, 25.47, 25.40, 24.06.
实施例12
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl azepane-1-carboxylate (化合物H-17).
化合物H-17的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为环己亚胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率86%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (s, 1H), 7.67 (m, J = 7.7, 1.7 Hz,1H), 7.61 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.40 (m, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.34 (d, J =8.1 Hz, 1H), 7.26 – 7.21 (m, 1H), 7.19 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.12 (m, J =11.0, 3.9 Hz, 1H), 7.06 (m, J = 6.1, 1.7 Hz, 2H), 6.68 (s, 1H), 3.75 (q J =12.8, 6.7 Hz, 2H), 3.38 – 3.28 (m, 4H), 3.03 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.70 – 1.59(m, 5H), 1.55 – 1.51 (m, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.22, 154.41,148.46, 136.41, 131.27, 129.63, 129.54, 127.20, 125.64, 123.04, 122.20,121.88, 119.17, 118.48, 112.43, 111.23, 47.31, 46.98, 39.82, 28.38, 27.87,27.16, 26.85, 25.25.
实施例13
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl morpholine-4-carboxylate(化合物H-18).
化合物H-18的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为吗啉，其余步骤同实施例1制备而得，收率81%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.53 (s, 1H), 7.63 – 7.55 (m, 2H), 7.45 – 7.38(m, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.25 – 7.14 (m, 2H), 7.10 (t, J = 8.8 Hz,2H), 6.96 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 3.72 (q, J = 12.7, 6.5 Hz, 2H), 3.56 (s,4H), 3.39 (s, 4H), 3.01 (t, J = 6.6 Hz, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.19,153.47, 148.38, 136.50, 131.48, 129.48, 129.30, 127.21, 125.95, 123.18,122.39, 122.09, 119.40, 118.55, 112.44, 111.38, 66.42, 44.83, 44.19, 40.07,25.37.
实施例14
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl thiomorpholine-4-carboxylate (化合物H-19).
化合物H-19的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为硫代吗啉，其余步骤同实施例1制备而得，收率64%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.43 (s, 1H), 7.61 (d, J = 7.7 Hz, 1H),7.55 (m, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.41 (m, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J =8.0 Hz, 1H), 7.20 (m, J = 9.1, 8.2, 1.1 Hz, 2H), 7.15 – 7.10 (m, 1H), 7.07(d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.43 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.79– 3.56 (m, 6H), 3.01 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.56 (s, 4H).13C NMR (75 MHz, CDCl3)δ 166.33, 153.37, 148.45, 136.51, 131.54, 129.63, 129.19, 127.26, 126.00,123.23, 122.44, 122.16, 119.47, 118.65, 112.52, 111.42, 47.29, 46.77, 40.07,27.42, 27.19, 25.43.
实施例15
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl 4-methylpiperazine-1-carboxylate (化合物H-20).
化合物H-20的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为N-甲基哌嗪，其余步骤同实施例1制备而得，收率68%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (s, 1H), 7.66 – 7.56 (m, 2H), 7.40(m, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.22 (t, J = 7.5 Hz, 1H),7.16 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.09 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 1.7 Hz, 1H),6.59 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.71 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 3.46 (s, 4H), 3.00 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.28 (d, J = 15.5 Hz, 4H), 2.24 (s, 3H).13C NMR (101 MHz,CDCl3) δ 166.02, 153.25, 148.23, 136.36, 131.32, 129.39, 127.09, 125.78,123.06, 122.24, 121.88, 119.19, 118.48, 112.33, 111.25, 54.46, 54.32, 45.91,44.34, 43.89, 40.02, 25.30.
实施例16
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl indoline-1-carboxylate(化合物H-21).
化合物H-21的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为吲哚啉，其余步骤同实施例1制备而得，收率72%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 6.4Hz, 2H), 7.46 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.20 – 7.16 (m, 2H), 7.14 (s, 1H), 7.10 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.07(s, 1H), 7.06 – 7.02 (m, 2H), 6.91 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 3.78 (q, J = 12.0,6.0 Hz, 2H), 3.65 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 2.98 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.78 (t, J =8.5 Hz, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.49, 150.48, 147.84, 141.74, 136.18,131.59, 131.46, 130.08, 128.42, 127.56, 126.90, 126.02, 124.96, 123.53,123.11, 122.14, 121.95, 119.25, 118.33, 114.82, 112.45, 111.19, 47.48, 39.52,27.27, 25.06.
实施例17
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-22).
化合物H-22的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料邻羟基苯甲酸替换为间羟基苯甲酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率70%。1H NMR (300 MHz,CDCl3) δ 8.64 (s, 1H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.47 (d, J =6.8 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 7.16 (t, J =7.4 Hz, 1H), 7.08 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 3.77 (s,3H), 3.69 (q, J = 4.9 Hz, 2H), 3.28 (s, 3H), 3.01 (t, J = 5.5 Hz, 2H).13C NMR(75 MHz, CDCl3) δ 166.39, 154.67, 150.77, 136.26, 136.04, 129.39, 127.12,124.50, 123.93, 122.24, 121.78, 120.45, 119.09, 118.43, 112.28, 111.31,61.68, 40.38, 35.43, 25.00.
实施例18
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-23).
化合物H-23的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料邻羟基苯甲酸替换为对羟基苯甲酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率75%。1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 8.41 (s, 1H), 7.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 7.8 Hz, 1H),7.35 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.19 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.13 (s,1H), 7.10 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.74(q, J = 12.3, 6.3 Hz, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.05 (t, J = 6.6 Hz, 2H).13C NMR (101MHz, CDCl3) δ 166.60, 154.48, 153.06, 136.34, 132.00, 128.26, 127.17, 122.22,122.04, 121.55, 119.32, 118.57, 112.59, 111.34, 61.80, 40.27, 35.51, 25.12.
实施例19
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-6-methoxyphenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-301).
化合物H-301的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为3-甲氧基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.58 (s, 1H), 7.60 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.15 (m,J = 19.3, 15.1, 7.5 Hz, 3H), 6.99 (d, J = 10.9 Hz, 2H), 6.79 (s, 1H), 3.80(s, 3H), 3.78 – 3.69 (m, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 3.02 (t, J = 6.5Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 165.29, 154.06, 151.62, 137.10, 136.34,130.05, 127.06, 126.64, 122.26, 121.74, 120.98, 119.02, 118.40, 114.12,112.16, 111.24, 61.45, 56.12, 39.87, 35.20, 25.10.
实施例20
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-6-methylphenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-302).
化合物H-302的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为3-甲基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率72%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.64 (s, 1H), 7.61 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.34 – 7.27(m, 2H), 7.20 – 7.14 (m, 2H), 7.13 – 7.08 (m, 1H), 6.98 (m, J = 12.8, 2.2 Hz,1H), 6.68 (s, 1H), 3.77 – 3.72 (m, 2H), 3.70 (d, J = 3.9 Hz, 3H), 3.15 (s,3H), 3.02 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.24 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.01,154.26, 153.31, 146.68, 146.23, 136.30, 133.17, 131.74, 127.05, 126.06,122.26, 121.71, 118.99, 118.37, 112.13, 111.28, 61.65, 55.68, 39.91, 35.26,25.12, 16.09.
实施例21
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-6-chlorophenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-303).
化合物H-303的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为3-氯水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率69%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.45 (s, 1H), 7.85 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.43 (t, J= 7.5 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.25 – 7.19 (m, 1H), 7.15 (d, J =8.2 Hz, 1H), 7.09 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 3.74 (q, J = 12.8, 6.5Hz, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 3.03 (t, J = 6.7 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz,CDCl3) δ 165.16, 154.14, 147.97, 136.31, 131.68, 130.24, 127.77, 127.14,126.09, 122.96, 122.18, 121.85, 119.14, 118.46, 112.50, 111.24, 61.72, 40.09,35.13, 25.12.
实施例22
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-6-bromophenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-304).
化合物H-304的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为3-溴水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率78%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.44 (s, 1H), 7.86 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.45 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 7.31 (m, J = 11.7, 7.9 Hz, 2H), 7.19 (m, J = 12.6, 5.9 Hz,2H), 7.10 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.98 (s, 1H), 3.75 (q, J = 12.8, 6.6 Hz, 2H),3.63 (s, 3H), 3.11 (s, 3H), 3.04 (t, J = 6.8 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ165.14, 154.13, 147.96, 136.32, 131.68, 130.24, 127.72, 127.15, 126.09,122.96, 122.18, 121.87, 119.15, 118.48, 112.53, 111.24, 61.73, 40.10, 35.16,25.14.
实施例23
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-5-methoxyphenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-305).
化合物H-305的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-甲氧基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率75%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 8.48 (s, 1H), 7.91 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.33 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 7.19 – 7.06 (m, 3H), 6.98 (s, 1H), 6.81 (m, J = 8.8, 2.4 Hz,1H), 6.74 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.76 – 3.71 (m, 2H), 3.59 (s,3H), 3.08 (d, J = 2.2 Hz, 3H), 3.04 (t, J = 6.9 Hz, 2H).13C NMR (101 MHz,CDCl3) δ 164.89, 162.22, 153.93, 149.47, 136.42, 131.95, 127.31, 122.29,121.94, 119.23, 118.62, 112.81, 111.96, 111.35, 108.49, 61.89, 55.68, 40.21,35.20, 25.29.
实施例24
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-5-methylphenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-306).
化合物H-306的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-甲基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率80%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.45 (s, 1H), 7.80 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.33 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 7.17 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.10 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.00 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 3.75 (q, J = 12.7, 6.6 Hz, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.09 (s, 3H),3.04 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 165.09,154.19, 147.90, 142.65, 136.30, 130.30, 127.17, 126.93, 123.39, 122.17,121.84, 119.13, 118.49, 112.61, 111.22, 61.73, 40.06, 35.12, 25.14, 21.19.
实施例25
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-5-fluorophenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-307).
化合物H-307的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-氟水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率71%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.38 (s, 1H), 7.87 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.45 (m, J= 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.21(s, 1H), 7.17 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.11 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H),3.76 (q, J = 12.8, 6.7 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.11 (s, 3H), 3.05 (t, J = 6.8Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 165.14, 154.14, 147.97, 136.31, 131.70,130.28, 127.16, 126.11, 122.96, 122.17, 121.90, 119.19, 118.51, 112.59,111.23, 61.75, 40.09, 35.15, 25.14.
实施例26
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-5-chlorophenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-308).
化合物H-308的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-氯水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.32 (s, 1H), 7.87 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.32 (m, J = 12.6, 7.8 Hz, 2H), 7.18 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 7.10(t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.01 (s, 1H), 3.76 (q, J = 12.8, 6.4 Hz, 2H), 3.63 (s,3H), 3.11 (s, 3H), 3.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 165.12,154.14, 147.98, 136.31, 131.69, 130.30, 127.18, 126.11, 122.96, 122.15,121.94, 119.22, 118.53, 112.66, 111.22, 61.76, 40.10, 35.19, 25.17.
实施例27
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-5-bromophenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-309).
化合物H-309的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-溴水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率77%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.27 (s, 1H), 7.87 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 7.67 – 7.57 (m, 1H), 7.45 (t, J = 7.4Hz, 1H), 7.39 – 7.27 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 7.19 (m, J = 14.0, 6.6 Hz, 2H),7.14 – 7.08 (m, 1H), 7.02 (s, 1H), 3.76 (q, J = 11.7, 5.6 Hz, 2H), 3.63 (s,3H), 3.11 (s, 3H), 3.05 (t, J = 6.2 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 164.60,153.63, 147.47, 135.79, 131.18, 129.81, 126.68, 125.60, 122.44, 121.63,121.46, 118.74, 118.04, 112.21, 110.69, 61.25, 39.56, 34.66, 24.65.
实施例28
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)naphthalen-1-yl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-310).
化合物H-310的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为1-羟基-2-萘甲酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率68%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 8.66 (s, 1H), 7.97 – 7.91 (m, 1H), 7.86 – 7.80 (m, 1H), 7.73 (m, J = 18.6,5.8 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.59 – 7.52 (m, 2H), 7.29 (d, J = 7.9Hz, 1H), 7.19 – 7.09 (m, 2H), 6.94 (s, 1H), 3.80 (q, J = 12.8, 6.7 Hz, 2H),3.74 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.05 (t, J = 6.9 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ165.89, 154.61, 144.04, 136.26, 135.22, 127.83, 127.61, 127.15, 127.13,127.02, 126.29, 125.08, 125.00, 122.22, 121.77, 121.67, 118.95, 118.33,112.04, 111.26, 61.82, 39.96, 35.28, 25.14.
实施例29
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-4-methoxyphenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-311).
化合物H-311的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为5-甲氧基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 8.70 (s, 1H), 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.19 – 7.14 (m, 1H), 7.09 (m, J = 10.9, 4.8 Hz, 2H), 6.98 – 6.94 (m,2H), 3.78 – 3.71 (m, 5H), 3.60 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.04 (t, J = 7.0 Hz,2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 164.93, 157.15, 154.59, 141.39, 136.36, 128.26,127.15, 124.09, 122.27, 121.76, 119.07, 118.41, 117.92, 113.98, 112.32,111.34, 61.70, 55.61, 40.27, 35.13, 25.13.
实施例30
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-4-methylphenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-312).
化合物H-312的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为5-甲基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率77%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.75 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.61 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.24 (m, J = 8.3, 1.8 Hz, 1H), 7.19 – 7.14 (m, 1H), 7.13 – 7.07 (m, 2H),6.95 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.75 (q, J = 12.8, 6.9 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.11(s, 3H), 3.04 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.33 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ165.31, 154.35, 145.65, 136.26, 135.87, 132.20, 130.43, 127.06, 122.67,122.21, 121.64, 118.94, 118.32, 112.19, 111.26, 61.58, 40.11, 35.04, 25.04,20.58.
实施例31
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-4-fluorophenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-313).
化合物H-313的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为5-氟水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率72%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.46 (s, 1H), 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.21 – 7.16(m, 2H), 7.12 (m, J = 15.2, 9.3, 5.8 Hz, 2H), 6.98 (s, 1H), 3.74 (dd, J =12.8, 6.8 Hz, 2H), 3.60 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.04 (t, J = 6.9 Hz, 2H).13CNMR (101 MHz, CDCl3) δ 163.73, 161.07, 158.62, 153.92, 143.79 (d, J = 2.9Hz), 136.28, 127.09, 124.68 (d, J = 8.2 Hz), 122.12, 121.89, 119.17, 118.455(d, J = 23.23 Hz), 118.42,, 116.91 (d, J = 25.0 Hz)., 112.40, 111.24, 61.73,40.22, 35.04, 25.03.
实施例32
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-4-chlorophenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-314).
化合物H-314的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为5-氯水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.55 (s, 1H), 7.86 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45 (m, J= 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.23– 7.15 (m, 2H), 7.11 (m, J = 11.0, 3.9 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 1.7 Hz, 1H),3.75 (q, J = 12.8, 6.8 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.11 (s, 3H), 3.04 (t, J = 6.9Hz, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.33, 154.28, 148.11, 136.46, 131.84,130.34, 127.26, 126.24, 123.12, 122.36, 121.96, 119.24, 118.58, 112.56,111.41, 61.85, 40.25, 35.26, 25.25.
实施例33
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-4-bromophenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-315).
化合物H-315的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为5-溴水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率70%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.20 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.46 (t, J= 7.8 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.24 –7.16 (m, 2H), 7.11 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 3.76 (q, J = 12.7, 6.8Hz, 2H), 3.63 (s, 3H), 3.11 (s, 3H), 3.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H).13C NMR (101MHz, CDCl3) δ 165.12, 154.16, 148.00, 136.31, 131.72, 130.37, 127.21, 126.14,122.97, 122.15, 122.01, 119.30, 118.59, 112.78, 111.20, 61.79, 40.07, 35.18,25.17.
实施例34
3-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)naphthalen-2-yl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-316).
化合物H-316的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为2-羟基-3-萘甲酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率69%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.50 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.80 (m, J = 16.3, 7.9 Hz, 2H), 7.68 – 7.59 (m,2H), 7.57 – 7.44 (m, 2H), 7.32 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.14 (m, J = 14.4, 6.9Hz, 2H), 6.97 (s, 1H), 3.78 (q, J = 12.7, 6.6 Hz, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.18 (s,3H), 3.11 – 3.03 (m, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 165.39, 154.47, 145.05,136.28, 134.33, 130.95, 130.66, 128.54, 127.97, 127.18, 127.13, 126.85,126.35, 122.25, 121.82, 120.38, 119.13, 118.47, 112.49, 111.26, 61.71, 40.28,35.21, 25.09.
实施例35
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-3-methoxyphenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-317).
化合物H-317的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为6-甲氧基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率71%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.47 (s, 1H), 7.61 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.31 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 7.17 (t,J = 6.9 Hz, 1H), 7.10 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.77 (m, J = 8.2,4.0 Hz, 2H), 6.26 (s, 1H), 3.74 (m, J = 13.5, 3.6 Hz, 8H), 3.19 (s, 3H), 3.01(t, J = 6.8 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 164.02, 157.13, 154.93, 148.65,136.32, 130.55, 127.09, 122.37, 121.81, 120.27, 119.11, 118.49, 115.26,112.33, 111.24, 108.74, 61.60, 55.94, 39.85, 35.43, 25.17.
实施例36
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-3-methylphenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-318).
化合物H-318的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为6-甲基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率75%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.32 (s, 1H), 7.61 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.28 (s,1H), 7.19 (m, J = 11.0, 4.0 Hz, 1H), 7.14 – 7.09 (m, 1H), 7.08 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.17 (t, J = 5.5Hz, 1H), 3.77 – 3.71 (m, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.16 (s, 3H), 3.02 (t, J = 7.0Hz, 2H), 2.30 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.53, 155.51, 147.09,137.22, 136.45, 131.30, 129.80, 128.11, 127.12, 122.31, 122.12, 120.03,119.38, 118.61, 112.34, 111.35, 61.77, 39.69, 35.51, 25.49, 19.06.
实施例37
2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-3-fluorophenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-319).
化合物H-319的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为6-氟水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.61 (s, 1H), 7.60 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.39 – 7.29 (m, 2H), 7.21 – 7.07 (m,2H), 7.01 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.30 (s, 1H), 3.71 (t, J = 5.9Hz, 5H), 3.19 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 3.01 (t, J = 6.3 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz,CDCl3) δ 160.92, 160.34, 157.03, 153.69, 148.07 (d, J = 6.7 Hz), 135.66,130.28 (d, J = 9.8 Hz), 126.28, 121.73, 121.14, 118.42, 118.27 (d, J = 3.3Hz), 117.70, 112.88 (d, J = 22.1 Hz), 111.25, 110.64, 60.90, 39.33, 34.61,24.44.
实施例38
1-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)naphthalen-2-yl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-320).
化合物H-320的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为2-羟基-1-萘甲酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.44 (s, 1H), 7.62 (m, J = 15.6, 6.0 Hz, 3H), 7.39 (d, J = 7.0 Hz, 1H),7.08 – 7.00 (m, 3H), 6.90 (m, J = 7.0 Hz, 2H), 6.64 (s, 1H), 6.20 (s, 1H),3.63 – 3.54 (m, 2H), 3.47 (s, 3H), 2.94 (s, 3H), 2.80 (t, J = 6.2 Hz, 2H).13CNMR (75 MHz, CDCl3) δ 165.82, 155.02, 144.41, 136.25, 131.33, 130.59, 130.53,127.90, 127.38, 126.87, 126.07, 124.85, 122.22, 121.69, 121.16, 118.99,118.29, 111.70, 111.25, 61.52, 39.79, 35.21, 25.24.
实施例39
2-((2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-321).
化合物H-321的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲氧基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率72%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.57 (s, 1H), 7.83 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.42 (m, J = 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.24(d, J = 0.5 Hz, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 7.01 (d, J = 2.2 Hz, 1H),6.92 (s, 1H), 6.80 (m, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.71 (q, J = 12.8,6.7 Hz, 2H), 3.59 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 2.98 (t, J = 6.8 Hz, 2H).13C NMR (75MHz, CDCl3) δ 165.15, 154.06, 153.66, 147.95, 131.65, 131.45, 130.09, 127.47,126.02, 122.95, 112.14, 111.97, 100.12, 61.60, 55.64, 40.16, 35.06, 25.10.
实施例40
2-((2-(5-methyl-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-322).
化合物H-322的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.48 (s, 1H), 7.81 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.45 – 7.38 (m, 1H), 7.35 (s, 1H),7.23 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 1.6 Hz, 1H),6.97 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 3.72 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 3.61 (s,3H), 3.10 (s, 3H), 2.98 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.40 (s, 3H).13C NMR (75 MHz,CDCl3) δ 165.23, 154.08, 147.92, 134.62, 131.62, 130.03, 128.17, 127.71,127.32, 126.01, 123.33, 122.92, 122.33, 118.05, 111.82, 110.90, 61.61, 40.28,35.10, 25.08, 21.36.
实施例41
2-((2-(5-chloro-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-323).
化合物H-323的结构式为：
将实施例1步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-氯色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率83%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.98(s, 1H), 7.73 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.35 (t, J = 7.8 Hz, 1H),7.20 – 7.10 (m, 4H), 7.00 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 3.65 – 3.59 (m,2H), 3.58 (s, 3H), 3.05 (s, 3H), 2.88 (t, J = 6.8 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz,CDCl3) δ 165.44, 154.10, 147.92, 134.65, 131.78, 129.98, 128.19, 127.45,126.10, 124.59, 123.72, 122.99, 121.84, 117.76, 112.37, 111.92, 61.67, 40.13,35.09, 24.86.
实施例42
2-((2-(5-chloro-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-3-methoxyphenylmethoxy(methyl)carbamate (化合物H-324).
化合物H-324的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为6-甲氧基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-氯色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率76%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.87 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.31 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.00 (s,1H), 6.76 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 6.29 (s, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.69 (s, 5H), 3.19(s, 3H), 2.93 (t, J = 6.3 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 164.16, 157.12,154.94, 148.71, 134.67, 130.69, 128.18, 124.70, 123.88, 121.92, 120.01,117.85, 115.30, 112.39, 111.93, 108.79, 61.58, 55.98, 39.86, 35.42, 24.99.
实施例43
3-methoxy-2-((2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenylmethoxy(methyl)carbamate (化合物H-325).
化合物H-325的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为6-甲氧基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲氧基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率80%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.31(t, J = 8.3 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 6.82– 6.73 (m, 2H), 6.26 (s, 1H), 3.73 (d, J = 7.4 Hz, 8H), 3.21 (s, 3H), 2.98(t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 164.03, 157.16,154.94, 153.82, 148.69, 131.46, 130.58, 127.48, 123.13, 120.28, 115.29,112.18, 112.10, 111.97, 108.78, 100.28, 61.61, 55.99, 55.85, 39.77, 35.48,25.23.
实施例44
4-methoxy-2-((2-(5-methyl-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenylmethoxy(methyl)carbamate (化合物H-326).
化合物H-326的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为6-甲氧基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率78%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.39 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.31 (t,J = 8.3 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 6.83 –6.72 (m, 2H), 6.26 (s, 1H), 3.73 (d, J = 7.4 Hz, 8H), 3.21 (s, 3H), 2.98 (t,J = 6.7 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 163.99, 157.13,154.92, 148.66, 134.66, 130.52, 128.27, 127.30, 123.39, 122.54, 120.28,118.12, 115.26, 111.76, 110.91, 108.73, 61.57, 55.92, 39.87, 35.41, 25.17,21.42.
实施例45
2-((2-(5-chloro-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-3-fluorophenyl methoxy(methyl)carbamate (化合物H-327).
化合物H-327的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为6-氟水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-氯色胺其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.75 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.32 (m, J =14.4, 7.7 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.02(s, 1H), 6.95 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 6.34 (s, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.67 (d, J =5.9 Hz, 2H), 3.19 (s, 3H), 2.94 (t, J = 6.6 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ161.78, 160.99, 157.69, 154.39, 148.79, 134.68, 131.07 (d, J = 9.5 Hz),126.45 (d, J = 248.3 Hz), 123.85, 122.05, 119.28 (d, J = 19.3 Hz), 118.94,117.83, 113.58 (d, J = 22.5 Hz), 112.36, 111.75, 61.59, 39.97, 35.33, 24.93.
实施例46
3-fluoro-2-((2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenylmethoxy (methyl) carbamate (化合物H-328).
化合物H-328的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为6-氟水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲氧基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率80%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.28 (s, 1H), 7.35 (m, J = 8.3, 6.3 Hz,1H), 7.22 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.03 – 6.96 (m, 3H),6.84 (m, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.27 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.75 – 3.69 (m,5H), 3.20 (s, 3H), 2.99 (t, J = 6.9 Hz, 2H).13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 161.56,154.36, 153.81, 148.85, 131.47, 131.00, 130.87, 127.36, 123.10, 119.52 (d, J= 20.3 Hz), 118.92, 113.55 (d, J = 22.2 Hz), 112.06 (d, J = 8.9 Hz), 111.86,109.80, 100.18, 61.60, 55.80, 39.92, 35.34, 25.17.
实施例47
4-((2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-330).
化合物H-330的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-羟基苯甲酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲氧基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率79%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.59 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz,2H), 7.18 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.02 (s, 1H), 6.88(s, 1H), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.57 (s, 1H), 3.77 (d, J = 11.2 Hz, 6H),3.70 (q, J = 5.3 Hz, 2H), 3.29 (s, 3H), 2.99 (t, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ 166.58, 154.40, 153.74, 153.00, 131.91, 131.45, 128.23, 127.51, 122.97,121.46, 112.18, 112.08, 100.15, 61.67, 55.67, 40.34, 35.41, 25.04.
实施例48
4-((2-(5-methyl-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-331).
化合物H-331的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-羟基苯甲酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率78%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.50 (s, 1H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 2H),7.39 (s, 1H), 7.20 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.00 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.71 (d, J = 5.6 Hz,2H), 3.30 (s, 3H), 3.01 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H).13C NMR (75 MHz,CDCl3) δ 166.53, 154.38, 152.93, 134.60, 131.93, 128.30, 128.19, 127.35,123.43, 122.34, 121.41, 118.09, 111.89, 110.96, 61.65, 40.44, 35.40, 24.99,21.32.
实施例49
4-((2-(5-chloro-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl)carbamate(化合物H-332).
化合物H-332的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-羟基苯甲酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-氯色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率74%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.98 (s, 1H), 7.66 (d, J = 7.9 Hz, 2H),7.52 (s, 1H), 7.16 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.08 (m, J = 13.5, 8.5 Hz, 3H), 6.85(s, 1H), 6.71 (s, 1H), 3.78 (q, 3H), 3.63 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.29 (s, 3H),2.92 (t, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166.80, 154.46, 152.98, 134.63,131.85, 128.26, 124.62, 123.71, 121.86, 121.50, 117.82, 112.41, 112.11,61.65, 40.38, 35.41, 24.86.
实施例50
2-((2-(5-chloro-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-5-methylphenyl methoxy(methyl) carbamate (化合物H-333).
化合物H-333的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-甲基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-氯色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率86%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.44 (s, 1H), 7.81 (d, J = 7.8 Hz, 1H),7.55 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.10 (t, J = 8.5 Hz, 2H),7.01 (s, 2H), 3.71 (q, J = 12.8, 6.8 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 3.11 (s, 3H),2.98 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.16,154.25, 147.98, 142.78, 134.69, 130.39, 128.42, 127.01, 124.98, 123.62,123.44, 122.19, 118.07, 112.64, 112.26, 61.84, 40.00, 35.22, 25.03, 21.21.
实施例51
2-((2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)-5-methylphenylmethoxy(methyl) carbamate (化合物H-334).
化合物H-334的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-甲基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲氧基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率80%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.36 (d, J = 22.7 Hz, 1H), 7.79 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.04 –7.00 (m, 2H), 6.96 (s, 1H), 6.82 (m, J = 8.8, 2.3 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.73(q, J = 13.0, 6.9 Hz, 2H), 3.60 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 3.00 (t, J = 6.8 Hz,2H), 2.35 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.20, 154.29, 153.96, 148.08,142.72, 131.62, 130.37, 127.75, 126.98, 123.47, 123.03, 112.65, 112.61,112.20, 112.02, 100.46, 61.78, 55.85, 40.24, 35.26, 25.31, 21.24.
实施例52
5-methyl-2-((2-(5-methyl-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl) carbamate (化合物H-335).
化合物H-335的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为4-甲基水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-甲氧基色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率79%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.13 (s, 1H), 7.80 (d, J = 7.7 Hz,1H), 7.38 (s, 1H), 7.23 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.03 –6.96 (m, 3H), 3.74 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.11 (s, 3H), 3.01 (t,J = 6.9 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H), 2.37 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 165.09,154.24, 147.96, 142.60, 134.66, 130.33, 128.46, 127.50, 126.92, 123.56,123.38, 122.28, 118.29, 112.40, 110.84, 61.75, 40.19, 35.20, 25.20, 21.43,21.22.
实施例53
4-chloro-2-((2-(5-chloro-1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyl methoxy(methyl) carbamate (化合物H-339).
化合物H-339的结构式为：
将实施例1步骤（1）中的原料水杨酸替换为5-氯水杨酸，步骤（2）中的原料二甲胺替换为甲氧基甲胺，步骤（4）中的原料色胺替换为5-氯色胺，其余步骤同实施例1制备而得，收率73%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.50 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.55(d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.45 (m, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.29 (m, J = 7.7, 1.0 Hz,1H), 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.11 (m, J = 8.6,1.9 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 3.72 (q, J = 12.8, 6.9 Hz, 2H), 3.66(s, 3H), 3.12 (s, 3H), 2.98 (t, J = 6.9 Hz, 2H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ165.18, 154.17, 148.02, 134.67, 131.81, 130.34, 128.36, 126.18, 124.95,123.63, 123.02, 122.18, 118.04, 112.49, 112.28, 61.83, 40.04, 35.21, 25.00.
实施例54 Ellman法测试化合物的胆碱酯酶抑制活性
试验方法：
采用改良的Ellman方法评价化合物对AChE和BChE的抑制作用，其操作如下：碘化硫代乙酰胆碱 (ATCI)、碘化硫代丁酰胆碱(BTCI) 和5,5-二硫代(2-硝基苯甲酸) (DTNB)均购买自Sigma Aldrich公司。乙酰胆碱酯酶 (E.C. 3.1.1.7, V-S型，从电鳗中提取)和丁酰胆碱酯酶 (E.C.3.1.1.8，从马血清中提取) 用pH=7.2-7.4的20mM HEPES缓冲液稀释成500 units/mL的母液，-20 ℃ 冷冻储存，实验前用pH=7.4磷酸盐缓冲液稀释成所需浓度，比如0.25 units/mL酶溶液。反应在96孔板中进行，先加入10 μL酶溶液（终浓度为0.01-0.05 units/mL），空白孔加入65 μL 磷酸盐缓冲液 (pH=7.2-7.4)，再加入25 μL待测化合物溶液（5×）或者65 μL (pH=7.2-7.4) 磷酸盐缓冲液（空白孔和100%酶孔）。37 ℃ 孵育10min后，加入100 μL 0.3 mM的DTNB （用pH=7.2-7.4磷酸盐缓冲液稀释），快速加入50 μL底物（ATCI或者BTCI，用pH=7.2-7.4磷酸盐缓冲液稀释成所需浓度，反应终浓度为1 mM），室温反应2-3 min后，立刻置于酶标仪中在37℃，412 nm下测定0min和15min时的吸光值。所有实验至少重复三次。选取多奈哌齐作为阳性对照药物。待测化合物采用DMSO配制成100 mM母液，测试时将化合物母液用磷酸盐缓冲液配成浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol·L-1，DMSO终浓度 < 0.4% 且不影响试验结果。
最后，计算酶促反应速率及抑制率：
酶促反应速率v（OD/min）=（△A 15 -△A0）/15
抑制率（%）=（1-vi /v 0）*100
其中，在酶促反应速率ｖ的计算中，△A 15指的是15min时对照组或实验组除去相应本底值后的吸光值，△A0指的是0min时对照组或实验组除去相应本底值后的吸光值。在抑制率的计算中，vi指实验组的酶促反应速率，v 0指对照组的酶促反应速率。IC50 为半抑制浓度（或称半抑制率），是用SPSS 20.0软件计算得出。所得结果如下表1所示（上述平行实验均独立重复三次）
试验结果：
实验结果发现部分化合物的乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶抑制活性均表现较好，表现出了乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶双重抑制作用，且有部分化合物的丁酰胆碱酯酶抑制活性比目前的上市药物多奈哌齐更好。
表1.所合成的化合物H01-H23，23、阳性药对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性
所有的数据均通过三组独立的实验得到；IC50值由IBM SPSS Statistics 软件计算得到。
母体化合物23的结构式为
。
实施例55 MTT法测定细胞毒性
试验方法：
将小鼠小胶质细胞（BV2）和小鼠海马神经元细胞（HT22）分别用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2条件下放置在细胞培养箱中培养，待细胞处于对数期时，以每孔1х10^5个细胞接种于96孔板中，培养24 h后移去旧培养基，加入含有待测样品的培养基（将100mmol·L-1目标化合物DMSO母液配制成实验浓度100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol·L-1），每个实验浓度设置3个复孔，同时设置空白对照组。待实验细胞与药物作用24 h后，加入10 μL MTT 溶液，孵育4 h 后将96 孔板内的上清液吸出，每孔中加入150 μL的DMSO，振荡20 min。在570 nm 波长下利用酶标仪测定实验中96 孔板各孔的吸光值（OD值），计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)，细胞增殖抑制率%=（对照孔平均OD值-实验孔平均OD值）/（对照孔平均OD值-空白OD值），并用SPSS 20.0计算半数抑制浓度IC50值(means ± SD, n=3)，具体数据见表2。（上述平行实验均独立重复三次）
试验结果：
上述试验结果显示，本发明的化合物H01-H23对小鼠的小胶质细胞（BV2）和小鼠海马神经元细胞（HT22）基本没有细胞毒性。
表2.所合成的化合物H01-H23，23，阳性药对BV2和HT22细胞的细胞毒性
所有的数据均通过三组独立的实验得到；IC50值由IBM SPSS Statistics 软件计算得到。
综合化合物H01-H23对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性和其对小鼠小胶质细胞（BV2）和小鼠海马神经元细胞（HT22）细胞毒性数据，化合物H03不仅具有较好的胆碱酯酶抑制活性，而且对两株细胞的毒性均较小，故选择H03做进一步的深入研究。
实施例56 所选化合物胆碱酯酶的可逆性测试实验
试验方法：
我们采用稀释法进行可逆性胆碱酯酶抑制活性研究，使用改进的Ellman方法测定稀释液的残余酶活性。具体操作如下：将AChE/BChE (0.5 U/mL)、ATCI/BTCI (0.01 M)和DTNB (0.01 M)用pH=7.4的磷酸盐缓冲液稀释。之后将10×IC50和100×IC50浓度的这些化合物与40μL酶稀释液加入96孔培养板中置于37 °C孵育30分钟，然后加入DTNB溶液20μL。孵育期结束后，用底物溶液将反应液稀释100倍，使测试化合物的最终浓度各自为0.1×IC50和1×IC50。在对照研究中，用多奈哌齐或缓冲液代替抑制剂。之后在37℃下继续孵育15 min，测定酶活残留量，并构建柱状图。所有测量结果均为三份，用平均值±SEM表示。结果如下表3所示。
试验结果：
结果显示，不管是阳性对照药还是我们的化合物H-03，对AChE和BuChE的抑制类型均属于可逆性抑制。
所有数据均通过三组重复的独立实验获得；IC50值由IBM SPSS Statistics 软件计算得到。
实施例57所选化合物胆碱酯酶抑制类型等动力学分析实验
试验方法：
固定反应体系中ATCI/BTCI(1mM)的浓度，改变化合物H03的质量浓度（0、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5μM），改变AChE/BChE的浓度（0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16U/ml），以酶促反应速率v为纵坐标，以AChE/BChE的浓度为横坐标，绘制曲线，判断所选化合物对AChE/BChE的可逆性。
固定反应体系中AChE/BChE浓度（0.04U/ml），改变化合物H03的质量浓度（0、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5μM），改变底物ATCI/BTCI的浓度（0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/ml），测定其酶促反应速率，以酶促反应速率的倒数（1/V）为纵坐标，以底物ATCI浓度的倒数（1/S）为横坐标，绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，确定化合物H03对AChE/BChE的抑制类型及抑制常数（上述平行实验均独立重复三次）
图1和图2为所选的化合物对AChE与BChE的酶动力学分析的实验结果，由图可知化合物对AChE和BChE的抑制类型均为混合型可逆抑制。
实施例58所选化合物对体外Aβ42聚集的抑制作用
试验方法：
将1mg蛋白溶解到冷却的0.22mlHFIP中，室温孵育60min，使Aβ42单体化,-80 ℃冰箱冷冻1.5 h,使用真空冷冻机除去痕量残留的HFIP。将Aβ42肽加到44.4μL新鲜无水100％DMSO中使肽膜形成,使用蒸馏水稀释制备Aβ42蛋白单体。实验分为四组:①Aβ42（20μmol/L）蛋白组;②酚红（20μmol／L）＋Aβ42（20μmol/ L）蛋白组 ；③姜黄素（20μmol／L）＋Aβ42（20μmol/ L）；④多奈哌齐（20μmol／L）＋Aβ42（20μmol/ L）；⑤H03（20μmol／L）＋Aβ42（20μmol/L）;⑥23（20μmol／L）＋Aβ42（20μmol/ L）。将六组样本置于37 ℃、5％CO2培养箱中孵育24h，用于荧光检测。酚红是由粉末溶解在100％DMSO中配制而成，取各组孵育液20 μL和新鲜配制的10μmol/LThT 180 μL于 96 孔板中充分混合。于96孔不透光板中,在激发波（excitation,Ex）450 nm和发射波（emission ,Em）492 nm 波 长 下 使 用酶 标 仪 检测 。以 3 次独立实验的平均值作为该组的荧光强度。结果如下表4所示：
试验结果：
实验结果显示，所合成的化合物H03在20μmol/L的浓度下对体外Aβ42聚集有较好的抑制作用，比常见的抑制剂酚红还要更好，且在相同的浓度条件下可以比目前的上市药多奈哌齐发挥更好的抑制作用。
所有数据均通过三组重复的独立实验获得；IC50值由IBM SPSS Statistics 软件计算得到
实施例59所合成的化合物对LPS诱导的BV2炎症细胞分泌一氧化氮、细胞炎症因子TNF-α、IL-10和IL-4的影响
试验方法：
Griess法测定细胞上清液中的一氧化氮的产生：取对数生长期的BV2细胞消化后，按照5×10^5个/mL的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分为空白对照组，LPS组，LPS+化合物H03处理组(3.125、6.25、12.5、25、50、100μM终浓度)，LPS+化合物23和多奈哌齐处理组(3.125、6.25、12.5、25、50、100μM终浓度)。LPS组和LPS+化合物处理组加药后，空白和LPS组加入等体积溶媒，除了空白组以外采用LPS1μg/mL刺激BV2细胞。孵育24 h后，收集上清，用Griess法（将上清液加到空的96孔板中，再向孔中加入A液（0.5%磺胺）50 μL，随后加入B液[0.05% (N-1-萘基)乙二胺二盐酸盐，2.5% H3PO4]50 μL，孵育15 min。540 nm处测定OD值。抑制率% = (LPS组平均OD值-待测化合物OD值)/(LPS组平均OD值-Control组平均OD值)；IC50值通过IBM SPSS Statistics 25.0计算）测定上清液中一氧化氮的产生。
iNOS荧光检测试剂盒法：BV2细胞混悬液的制备操作同上。将其接种于96孔板，待细胞贴壁后，分为空白组、LPS组和LPS+化合物组。其中，LPS组和LPS+化合物组用1 μg/mLLPS处理，同时LPS+化合物组加入不同浓度化合物（H03： 6.25、12.5、25μM, 多奈哌齐：25Μm,化合物23：25μM）。而空白组加入等体积的DMSO。待细胞培养6 h后，取100 μL上清液置于新的96孔板中，每孔加入100 μL 1×NOS缓冲液混匀。然后每孔再加入100 μL 1×NOS反应液（包括50 μL 2×NOS缓冲液, 39.8 μL Milli-Q 超纯水, 5 μL-L-精氨酸溶液, 5 μL0.1mM NADPH, 0.2 μL DAF-FM DA）。在培养箱中孵育2 h后，用荧光酶标仪（激发波长（AW）为495 nm和发射波长（EW）为515 nm）读出每个孔的吸光度值，计算出每个化合物的IC50。抑制率(%)=[LPS组(AW495, EW515)–LPS+化合物组(AW495, EW515)]/[LPS组(AW495, EW515)-空白组(AW495, EW515)]×100。
ELISA法检测细胞上清液中TNF-α，IL-6，IL-4的含量：BV2细胞接种于6孔板中，37°C、 5% CO2培养箱中培养过夜后用LPS（1 µg/mL）刺激24 h，同时用25, 12.5,6.25 μM的化合物H03和23以及多奈哌齐作用24 h后，收集细胞上清液并离心，取上清液用ELISA法检测TNF-α，IL-6，IL-4的含量，在450nm的波长下读出每个孔的吸光值。
统计方法
采用SPSS软件对数据进行分析，所有结果均为平均值 ± 标准差表示；采用方差分析(ANOVA)确定两组间的显著性，然后采用Fisher PLSD程序进行事后比较，以验证两组均数之间的显著性。P值小于0.05为显著性。
结果见图3，由图3可以看出，在LPS刺激的BV2细胞中，不同浓度的H03处理明显降低了细胞内NO水平和iNOS的水平，另外，对细胞炎症因子TNF-α、IL-10和IL-4也均有较明显的影响。
实施例60 Western blot 法测定神经营养因子（BDNF），诱导型一氧化氮合酶（iNOs）蛋白和β淀粉样前体蛋白（BACE-1）的表达
试验方法
（1）制样： BV2细胞接种于6孔板中，37 °C、 5% CO2培养箱中培养过夜后用LPS（1µg/mL）刺激24 h，同时用25, 12.5,6.25 μM的化合物H03作用24 h，之后用PBS洗细胞2次，使用索莱宝高效RIPA裂解液200 μL于冰上裂解30min, 收集样品，并用索莱宝BCA蛋白定量试剂盒定量，样品液加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(4×)，涡旋混匀后于95 °C 水浴中变性15min，冷却后置于-20 ℃待测。
（2）制胶：用保鲜膜密封凝胶玻璃板，根据待测蛋白分子量大小配制相应浓度的SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶，之后插入梳子，向上垂直放置并静置数分钟，充分凝固后拆去保鲜膜和梳子。
（3）上样：将制好的胶板插入电泳槽，每个上样孔加入等体积的样品和marker。在梯度电泳条件下跑电泳。
（4）转印：电泳结束后，剥离凝胶，将0.45 μM PVDF 膜于甲醇中活化5 min，使用湿转转印法电泳槽将分离后的蛋白样品转印至活化后的PVDF 膜上。
（5）封闭：待转印结束，将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉的TBST 封闭液中室温封闭1.5h。用TBST 缓冲液洗膜3 次，各10 min。
（6）一抗孵育：将PVDF 膜置于适当比例稀释的相应一抗中，于4 °C 孵育过夜。
（7）二抗孵育：用TBST 缓冲液洗膜3 次，各10 min。加入适当比例稀释的HRP标记的IgG 二抗，室温摇床孵育1.5 h。
（8）化学发光：抗体孵育结束后，再次用TBST 缓冲液洗膜3次，各10 min。加入ECL化学发光液，采用天能多功能成像仪化学发光模块成像（上述平行实验均独立重复三次）
结果见图4，化合物对LPS诱导BV2细胞表达的BDNF，iNOS和BACE-1的影响，由图可以看出，所合成的化合物H03对由LPS刺激的BV2细胞中，在不同的浓度梯度下可以明显的促进神经营养因子BDNF的表达，抑制iNOS的表达，同时也可以在不同浓度梯度下抑制BACE-1的表达，且所有结果均呈浓度依赖性。
实施例61对LPS 诱导的BV2细胞ROS产生的影响
试验方法：
BV2 小胶质细胞接种于6孔板中，37℃、5% CO2培养箱中培养，过夜后加入25,12.5,6.25 μM的化合物H03作用6h, 同时用LPS（1 µg/mL）刺激6 h后弃去培养基，用PBS洗细胞2次，之后加入荧光探针DCFH-DA 于不含血清的培养基使其终浓度为20μM。37℃避光反应30 min，无菌PBS 洗涤2 次后，用激光共聚焦显微镜观察发现化合物 H03对ROS的作用，实验结果如图5，由图5可以看出化合物H03对LPS刺激BV2细胞产生的ROS有比较明显的抑制作用，且在不同浓度梯度下呈现浓度依赖性。
实施例62本发明化合物对海马神经元细胞（HT22）凋亡的影响
试验方法：
Hoechs染色：取培养至对数生长期的HT22细胞，胰酶消化，收集细胞，加到6孔板中，每孔5×10^4，37 ℃、5%CO2培养24 h。细胞用25, 12.5,6.25 μM化合物H03处理24 h。结束培养，弃去培养基，4%多聚甲醛固定5 min，采用Hoechs染色观察记录细胞形态变化。
结果如图6所示，化合物H03对由LPS刺激诱发的HT22细胞的凋亡有一定的抑制效果。
实施例63 所合成的化合物的急毒测试
试验方法：
14只8周龄、体重20 ~ 25 g的昆明小鼠被随机分为2组（n=10），雌雄各5只，空白组给予相同体积溶媒，化合物H03组单剂量灌胃给予2000 mg/kg的化合物溶液。给药后的动物先连续观察4 h，然后定期观察20 h，之后每天观察1次，连续观察14 d并记录体重。14 d后所有动物执行安乐死，采用HE染色法进行脑、肝、肾、心、胃的组织学研究。HE 染色实验步骤：
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ8min-二甲苯Ⅱ8min-无水乙醇Ⅰ6min-无水乙醇Ⅱ6min-95%酒精 6min-85%酒精 6min-75%酒精 5min-流水冲洗。
2、苏木素染细胞核：切片入 Harris 苏木素染 3-8min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水返蓝。
3、伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色 1-3min。
4、脱水封片：将切片依次放入75%酒精 30s-85%酒精 30s- 95%酒精 I 1min -95%酒精 II 2min-无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ7min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干， 中性树胶封片。
5、显微镜镜检，图像采集分析。
染色结果如图7所示，图7显示化合物H03对小鼠在高剂量（2000mg/kg）的条件下没有明显的毒副作用，且小鼠在14天内的体重也没有明显的异常出现。
实施例64 体内药代动力学研究
试验方法：
12只8周龄雄性SD大鼠，体重250 ~ 280 g。将大鼠随机分为三组(n = 6)，给药前禁水，禁食一晚。化合物H03以100 mg/kg剂量灌胃。单次给予化合物H03后，分别于化合物H03口服后的5 min、10 min、20 min、30min、45 min、1 h、2.5 h、5 h、7.5 h、10h、12 h、24 h在心脏采集血液样品于肝素钠管中，离心分离(2500 rpm，6 min，4 ℃)血浆，-80℃保存血浆，LC-MS分析。检测时，在每个血清样品中加入2倍甲醇并充分混合。4℃，1600 rpm离心10min后，经0.22 μm滤膜过滤后进行分析。在液相色谱和质谱条件下，色谱分析采用EclipsePlus C18柱(4.6×150 mm, 4 μm)。HPLC流动相为水(0.1%甲酸)和甲醇，以0.5 mL/min梯度色谱分离。色谱条件：流动相：0 ~ 7 min，甲醇：H2O = 20：80；7 ~ 16 min MeOH：H2O = 95 :5，16~25 min，MeOH：H2O=20：80；波长：254 nm；柱温：25℃。柱洗脱液直接引入ES-API。最后，利用Pk Solver 2.0对得到的数据进行处理，计算6个独立实验的平均值和参数。结果见下表5。
试验结果：如表5所示，所选化合物H03进入体内后释放得到母体化合物23，其药代动力学特性良好，半衰期可达到5.34小时，有进一步用于抗AD药物制备的价值。
实施例65 体内血脑屏障的研究
试验方法：
12只8周龄雄性SD大鼠，体重250 ~ 280 g。将大鼠随机分为三组(n = 3)，给药前禁水，禁食一晚。对于血脑屏障的研究，采集了血浆样本和大脑样本，化合物H03以100mg/kg灌胃给药， 在每个指定的给药后时间点选取3只动物(5、10分钟和1 小时)测定血浆和脑组织中化合物。取血样于肝素钠管中，离心分离(2500 rpm，6 min，4 ℃)血浆，-80℃保存，取脑子-80℃保存，LC-MS分析。检测时，在每个血浆和脑组织匀浆样品中加入2倍甲醇并充分混合。4℃，1600 rpm离心10 min后，经0.22 μm滤膜过滤后进行分析。在液相色谱和质谱条件下，色谱分析采用Eclipse Plus C18柱(4.6×150 mm, 4 μm)。HPLC流动相为水(0.1%甲酸)和甲醇，以0.5 mL/min梯度色谱分离。色谱条件：流动相：0 ~ 7 min，甲醇：H2O = 20：80；7 ~ 16 min MeOH：H2O = 95 : 5，16~25 min，MeOH：H2O=20：80；波长：254 nm；柱温：25℃。柱洗脱液直接引入ES-API。最后，利用Pk Solver 2.0对得到的数据进行处理，计算6个独立实验的平均值和参数。并以脑/血浆浓度比来计算化合物通过血脑屏障的程度。
试验结果：
实验结果发现，在10min的时候，所合成的化合物H03在大鼠体内的脑子与血浆的比值达到最大，高达15.78013，故我们所合成的化合物H03可以很好地通过血脑屏障，进而发挥作用。
实施例66 实验老鼠的造模与给药治疗
试验方法：
动物分组：昆明小鼠共56只，雄性，体质量20～25 g 左右，兰州大学实验动物中心提供。动物饲养在室温(22 ± 2)℃，湿度( 45%～65%) 和明暗交替( 12 h∶12 h)环境中，自由摄食和饮水。动物分组、造模和给药小鼠按随机数字表法分为7组：①空白组（不进行造模n=8）、②模型组(腹腔注射东莨菪碱组，3mg/kg，n = 8)、③东莨菪碱（3mg/kg腹腔注射）+多奈哌齐组（5mg/kg），④东莨菪碱（3mg/kg腹腔注射）+H03低剂量给药组(50mg/kg,n=8) ，⑤ 东莨菪碱（3mg/kg腹腔注射）+H03高剂量给药组(100mg/kg,n=8)⑥东莨菪碱（3mg/kg腹腔注射）+23号化合物低剂量给药组(50mg/kg,n=8)，⑦东莨菪碱（3mg/kg腹腔注射）+23号化合物高剂量给药组(100mg/kg,n=8)，化合物23和H03，以及多奈哌齐都是采用灌胃给药的方式连续注射10天后展开行为学实验。
实施例67 行为学实验
试验方法：
Morris水迷宫（WMT）:本实验使用的水迷宫购自成都泰盟软件有限公司，逃逸平台：直径65mm；高度可调范围：140-170mm,水迷宫尺寸：直径1200mm，高度500mm的不锈钢圆形水池，分为4个象限：SW (southwest)、NW(northwest)、NE(northeast)和 SE(southeast)。 在池水中加入无毒钛白粉混匀呈乳白色以使动物利用视觉无法辨认池内平台位置。维持池内水温恒定为 22±2 ℃。使用遮光帘围起水池的四周及顶部，遮光帘顶部中央安放摄影系统并连接电脑主机用于监测小鼠在水池中的游泳情况。实验期间保持周围环境固定不变，避免噪音。
本研究的水迷宫实验方案为：将实验鼠在定位航行试验系统中训练 5d，在第 5d训练结束后隔一天进行空间探索试验检测。
具体方案如下：在定位航行实验阶段，将平台放在水池的 SW 象限并隐藏于水面下 1 cm 处。将小鼠面朝池壁放入水中，入水点按照 SW、NW、NE 和 SE 顺序依次进行，每天训练四次。每次训练过程中，平台位置保持不变。分别将逃避潜伏期阈值设定为60 s，记录每次实验中60 s 内小鼠寻找到平台所用的时间即为逃避潜伏期实际测定值。若小鼠在相应的逃避潜伏期阈值时间内未能找到平台，便缓慢引导小鼠至平台并停留15 s。然后将动物移开、擦干，并用吹风机吹干，放回笼内。每只动物每天训练4次，连续训练5天，间隔一天后进入空间探索实验阶段，实验中，首先撤去平台，继而将小鼠从水迷宫 NE 方向放入水中，检测小鼠凭记忆寻找原平台位置的能力。分别记录实验鼠在60 s内的运动轨迹和目的象限停留时间占比，通过上述指标可充分反映动物的空间记忆能力。
OFT开场活动实验（Open field test）
OFT-100小鼠开场活动实验视频分析系统购自成都泰盟软件有限公司， 实验箱外形尺寸：625mm(L)×740 mm(W)×510 mm(H) ，可用于评价抑郁模型、黑质损伤、下丘脑垂体肾上腺轴的研究、中医的电针疗法研究等。
开场试验的具体操作步骤为：首先让小鼠在行为学仪器间适应环境，随后仪器敞箱设定中央区域和边缘区域，随后每次一只老鼠，时间设定为5min。让其在敞箱内自由活动，直至5min结束，记录小鼠的运动轨迹和小鼠在中央区域和边缘区域的运动距离的占比，注意：每只小鼠放置位置要一样，放在同一格、同一方向，且每只小鼠做完实验后要擦拭场地，避免留有气味和脏物以干扰实验结果。
图8为空白鼠、模型鼠以及不同剂量给药鼠在Morris水迷宫定位航行实验中的运动轨迹，实验5天期间潜伏期的变化趋势，以及训练最后一天的潜伏期情况。有图片可以看出，给药组相对于模型鼠而言其潜伏期明显缩短。图9为空白鼠、模型鼠以及不同剂量给药鼠在Morris水迷宫空间探索实验中运动轨迹的表现与变化。可以看出给药组在不同程度上其在前期训练中放平台的目标象限停留的时间明显变长，模型鼠的记忆与学习能力明显的到了改善。
图10为空白鼠、模型鼠以及不同剂量给药鼠在开场实验中的运动轨迹和运动距离，由图可以看出给药组中实验鼠在中央区域/边缘区域的比值明显要增大，且老鼠的运动距离也明显增多，模型鼠的抗抑郁能力也得到了明显的改善。
所以，综上行为学，我们所合成的化合物对由东莨菪碱造模的AD模型小鼠的学习、记忆与抗抑郁能力有显著的改善作用。
实施例68 模型鼠接受治疗后海马体内AChE的变化测试
试验方法：
行为学后，对老鼠安乐死，随后取其脑，分离出小鼠海马组织，立即放入-80℃冰箱，随后将海马组织分别称重，取一部分海马体用用索莱宝高效RIPA裂解液按照脑组织：裂解液=1：9的比例于冰上裂解10min, 收集样品，用索莱宝BCA蛋白定量试剂盒定量，样品液加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(4×)，涡旋混匀后于95 °C 水浴中变性15 min，冷却后置于-20 ℃用于Western blot 法测定实验鼠海马组织中AChE表达的变化。
另一部分脑匀浆海马体蛋白按照脑组织：生理盐水=1:9的比例在冰上裂解，随后用BCA蛋白定量试剂盒定量，用于试剂盒测脑内AChE相对含量的变化。
试验结果：
结果如图11A，Western blot 法测定了给药后AD模型小鼠海马组织中AChE蛋白的变化，由图可以看出，东莨菪碱造模后，小鼠海马组织中的AChE表达升高，分别给予不同剂量的化合物后，海马中AChE的表达有明显的下降。图11B为实验小鼠海马体匀浆后测定AChE试剂盒的结果，由柱状图可以看出，模型鼠在所选化合物的作用下，AChE的含量有明显的下降。
综合所选化合物的体外胆碱酯酶抑制活性与实验鼠体内乙酰胆碱酯酶抑制作用的结果，发现我们所选的化合物H03确实有对体内外对AChE表达与含量的抑制作用。
综上实验结果表明：本发明所制备化合物体外可以发挥AChE与BChE的双重抑制作用，且抑制类型均为混合型可逆抑制剂；在小胶质与海马神经元细胞实验中，没有明显的细胞毒性，且可以降低LPS刺激下细胞中NO、IL-4、IL-6、TNF-α等一系列炎症因子的含量，能降低ROS的爆发和抑制细胞凋亡；同时可以很好地通过血脑屏障，在行为学实验中可以显著改善小鼠学习、记忆与抗抑郁的行为，可用于制备抗阿尔兹海默症药物。
Claims (9)
1.一种苯甲酸色胺衍生物，其结构式如下：
其中，R1为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪； R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种； R3为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢的一种。
2.根据权利要求1所述一种苯甲酸色胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以羟基苯甲酸类化合物和溴化苄为原料，以碳酸氢钠为碱，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，在氩气保护下，30~50 ℃下反应2~6 h，反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去N,N-二甲基甲酰胺，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物1；
羟基苯甲酸类化合物的结构式为：
，R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种；
化合物1的结构式为：
，R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种；
（2）以化合物1和双(三氯甲基)碳酸酯为原料，以吡啶为碱，以二氯甲烷为溶剂，在氩气保护的条件下，于0~15 ℃反应0.5~2 h后，加入胺类化合物，转移至室温反应0.5~2 h，反应完成后，缓慢滴加冰水淬灭，用二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物2；
化合物2的结构式为：
，R1为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪； R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种；
（3）以化合物2为原料，以钯碳为催化剂，以甲醇为溶剂，在氢气条件下，反应5~40min，反应完成后，抽滤收集滤液旋干，柱层析分离得到化合物3；
化合物3的结构式为：
，R1为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪； R2为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢、苯基的一种；
（4）以化合物3和色胺类化合物为原料，以1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，以1-羟基苯并三氮唑为催化剂，以三乙胺为碱，以二氯甲烷为溶剂，在氩气条件下，于室温反应1~4 h，反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物苯甲酸色胺衍生物；
色胺类化合物的结构式为：
，R3为F、Cl、Br、甲基、甲氧基、氢的一种。
3.根据权利要求2所述一种苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，溴化苄的用量为羟基苯甲酸类化合物摩尔量的0.8~1.0倍；碳酸氢钠的用量为羟基苯甲酸类化合物摩尔量的1.0~1.5倍。
4.根据权利要求2所述一种苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，双(三氯甲基)碳酸酯的用量为化合物1摩尔量的0.2~0.5倍；吡啶的用量为化合物1摩尔量的1~3倍。
5.根据权利要求2所述一种苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，胺类化合物为二甲胺，二乙胺，甲氧基甲胺，二丙胺，二丁胺，二苯胺，二苄胺，甲基乙胺，甲基丙胺，甲基丁胺，甲基苯胺，甲基苄胺，甲基环己胺，吲哚啉，杂氮环丁胺，四氢吡咯，哌啶，环己亚胺，吗啉，硫代吗啉或N-甲基哌嗪；胺类化合物的用量为化合物1摩尔量的0.8~1.0倍。
6.根据权利要求2所述一种苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，钯碳的用量为化合物2摩尔量的0.2~0.5倍。
7.根据权利要求2所述一种苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，色胺类化合物的用量为化合物3摩尔量的1.0倍。
8.根据权利要求2所述一种苯甲酸色胺衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的用量为化合物3摩尔量的1~1.2倍；1-羟基苯并三氮唑的用量为化合物3摩尔量的0.5~1.2倍；三乙胺的用量为化合物3摩尔量的1.5~2.5倍。
9.根据权利要求1所述一种苯甲酸色胺衍生物在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。
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