CN113559026A - 一种青钱柳抗氧化提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种青钱柳抗氧化提取物及其在美白产品中的应用。本发明针对青钱柳抗氧化提取物的现有应用研究并不充分，其在美白类产品中的应用尚未有相关报道等问题，以清除DPPH自由基为抗氧化活性评价依据，对提取溶剂、提取温度、提取时间和液料比等因素进行考察，并在单因素实验基础上，利用响应面法对实验因素进一步优化，建立青钱柳抗氧化提取物的制备工艺；同时进行细胞中黑色素含量测定法——黑色素生成抑制实验，明确制备的青钱柳抗氧化提取物具有较强的美白活性，可应用于美白类化妆品中。依据本发明制备的青钱柳抗氧化提取物，其美白活性显著提高，有利于青钱柳相关产品的开发和综合利用。

Description

一种青钱柳抗氧化提取物及其应用
技术领域
本发明属于天然药物领域，具体涉及一种青钱柳抗氧化提取物及其在美白产品中的应用。
背景技术
青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal)Iljinsk为胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)植物，其叶具有清热消肿、解毒、止痛功能，对抗氧化、高血压、糖尿病等疾病具有很好的防治作用(邹荣灿,吴少锦,张妮,余正文.青钱柳的分布、化学成分及药理作用研究进展[J].中国药房,2017,28(31):4449-4451.)。
目前发现，青钱柳中的多种成分或组分具有较强抗氧化活性，如多糖(李彦坡,邹盈,李群和,王罗其,郑晓杰.超高压提取青钱柳多糖条件优化及抗氧化活性[J].食品工业,2020,41(03):5-9；邹荣灿,吴少锦,焦思棋,冯淳,余正文.不同产地青钱柳多糖的体外抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性[J].食品工业科技,2018,39(22):25-29；邹荣灿.青钱柳多糖提取工艺优化及其体外抗氧化、降血糖活性研究[D].贵州师范大学,2018；吴菲菲,李化强,赵良忠,徐永平,李淑英.青钱柳多糖的体外抗氧化活性评价[J].食品安全质量检测学报,2017,8(08):3044-3049；葛霞,陈婷婷,蔡教英,黄明圈,许文凤,王文君.青钱柳多糖抗氧化活性的研究[J].中国食品学报,2011,11(05):59-64；葛霞.青钱柳多糖降血脂机制及抗氧化活性的研究[D].江西农业大学,2011.)和黄酮类化合物(应瑞峰,季苏杰,李婷婷,范龚健,方升佐,吴彩娥.青钱柳叶黄酮的分离纯化与抗氧化性研究[J].食品科技,2015,40(12):174-178；柳旭光.青钱柳黄酮的提取分离、抗氧化活性及其应用研究[D].广西大学,2012.)。但是，目前对青钱柳抗氧化提取物的应用研究并不充分。有研究表明，中药的美白祛斑活性可能与其抗氧化活性有关(李根林,孙静雅,吴宿慧,李竹,张颜语,李寒冰.常用美白祛斑中药抗氧化活性比较[J].中医学报,2015,30(10):1467-1469.)，但是目前却无任何青钱柳抗氧化提取物在美白类产品中的应用报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种青钱柳抗氧化提取物。本发明另一目的在于提供所述青钱柳抗氧化提取物在美白产品中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种青钱柳抗氧化提取物，所述青钱柳抗氧化提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将青钱柳的叶片，置25-55℃的烘箱内烘干，取出，粉碎，过10-100目筛，得到青钱柳粉末A；
(2)取步骤(1)所得的青钱柳粉末A，按液料比为0.1-0.5mL/mg加入提取溶剂，提取溶剂为0-100％甲醇水溶液；上述混合物在0-70℃的水浴超声提取15-75min，取出，冷却至室温，以3500rpm离心15min，得上清液B；
(3)取步骤(2)所得的上清液B，采用旋转蒸发仪，在25-55℃水浴浓缩至干，即得青钱柳抗氧化提取物C。
优选的，所述步骤(1)中烘干温度为40℃，粉碎后过50目筛。
优选的，所述步骤(2)中液料比为0.3-0.5mL/mg，提取溶剂为0-50％甲醇水溶液，水浴超声温度为25℃，水浴超声时间为15-45min；更优选的，液料比为0.40mL/mg，提取溶剂为32％甲醇水溶液，水浴超声温度为25℃，水浴超声提取时间为32min。
优选的，所述步骤(3)中水浴浓缩温度为40℃。
优选的，所述室温为15-40℃。
本发明的另一目的是提供一种上述青钱柳提取物C在美白类化妆品中的应用。
优选的，所述美白类化妆品主要为美白面膜。
本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在：
(1)青钱柳抗氧化提取物的美白效果显著性提高；(2)将青钱柳的抗氧化提取物应用于美白产品中，有利于扩大青钱柳资源的应用范围。
附图说明
图1为甲醇浓度(a)、提取温度(b)、提取时间(c)和液料比(d)对青钱柳抗氧化活性成分提取率的影响。
具体实施方式
下面结合附图，并通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的具体说明。值得注意的是，实施例只是用以解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
实施例青钱柳抗氧化提取物的制备
以下实施例中所用的植物原料均于2017年9月，采集于浙江省遂昌县。青钱柳叶片在40℃烘箱烘干之后，采用粉碎机粉碎，过50目筛，备用。
青钱柳抗氧化提取物制备工艺优化过程中的影响因素评价指标为提取物清除DPPH自由基的能力。DPPH·(1,1-二苯基-2-苦基苯肼)是一种稳定的以氮为中心的自由基，其清除率高低反映了提取液抗氧化活性的强弱。本发明以水溶性维生素E(Trolox,TE)为标准品，首先建立了Trolox浓度与其对DPPH自由基清除率之间的关系曲线，然后依据青钱柳抗氧化提取物对DPPH自由基的清除率，将青钱柳抗氧化的抗氧化活性折算成μmol Trolox/g植物原料。标准品Trolox或青钱柳抗氧化提取液对DPPH自由基清除率测定方法如下：将3.5mL 0.07mM的DPPH溶液与0.4mL提取物溶液混合，在室温避光放置30分钟，然后用UV1800分光光度计测定其在517nm处的吸光度。清除率X的计算公式如下：
Figure BDA0003069610200000031
上式中，X为清除率，Ai为3.5mL DPPH溶液+0.4mL提取液的吸光度值，Aj为无水乙醇+0.4mL提取液的吸光度值；A0为3.5mL DPPH溶液+0.4mL无水乙醇溶液。
青钱柳抗氧化提取物抗氧化活性受到提取溶剂的浓度、提取温度、提取时间和液料比等多种因素的影响。本发明通过单因素实验和响应面实验对青钱柳抗氧化提取物的提取工艺进行了优化：
1.1提取流程
取青钱柳粉末约0.1g，加入不同体积的不同浓度的甲醇溶液，在不同温度的水浴中提取一定时间，在3500rpm下离心15min，取上清液检测其抗氧化活性。
1.2单因素考察结果
单因素的考察结果见表1，由表1可知，当甲醇浓度为25％-75％时候，其抗氧化活性均相对较强，而甲醇浓度0％和100％时，其抗氧化活性显著性下降；随着提取温度的升高，青钱柳提取物的抗氧化活性逐渐下降，说明温度对青钱柳抗氧化活性物质的提取是不利的，若操作方便，可在低于25℃下的温度下进行提取；随着提取时间由15min增加到30min，青钱柳抗氧化物质的得率逐渐增加，然后随着时间增长得率逐渐下降；随着液料比的增加，青钱柳抗氧化物质的得率逐渐增加，然后基本保持不变。
表1单因素考察结果
Figure BDA0003069610200000041
1.3响应面考察结果
本发明采用响应面法对甲醇浓度、提取时间和液料比进一步进行了优化，提取温度保持在25℃，结果见表2和表3。
表2 Box-Behnken响应面法实验分析结果
Figure BDA0003069610200000042
Figure BDA0003069610200000051
表3回归分析与方差分析
Figure BDA0003069610200000052
Figure BDA0003069610200000061
应用响应面软件分析发现，青钱柳抗氧化物质的得率(Y)与甲醇浓度(X1)、提取时间(X2)和液料比(X3)之间的关系曲线为：
Y＝508.14+44.22X1+12.4X2-4.61X3-1.57
X1X2-4.38X1X3+1.62X2X3-74.22X1 2-49.75X2 2-42.62X3 2，并计算出最佳工艺为：甲醇浓度为32.46％,提取时间为31.79min,液料比为0.393mL/mg和提取温度为25℃。为了操作方便，将提取参数修改为甲醇浓度为32％,提取时间为32min,液料比为0.40mL/mg和提取温度为25℃，在此条件下，通过实验验证，发现青钱柳抗氧化物质的得率为509.22±30.86μmol TE/g，与响应面分析软件预测的515.64μmol TE/g实验结果基本一致，证明回归模型良好的预测了青钱柳抗氧化物质的提取效果，优化后的工艺条件参数合理，适用于青钱柳的提取。
1.4对比例
取青钱柳粉末约2g，用滤纸包好后放入250mL索氏提取器，并用石油醚在70℃水浴锅中回流提取4h，以去除叶样品中极性较小的脂溶性成分。回收药渣，挥干后用70％甲醇水溶液在70℃条件下超声提取45min，即得，青钱柳抗氧化物质的得率为483.17.22±25.46μmol TE/g。
试验例1青钱柳抗氧化提取物的美白活性评价
1.1 B-16细胞的培养和传代，在无菌条件下，将B-16小鼠黑素瘤细胞接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的RPMI-1640培养基中，于37℃、5％CO2、相对湿度98％的CO2培养箱培养，每天更换新鲜培养液1次，当细胞生长至回合度为80-90％时，用0.25％胰蛋白酶(含0.05％EDTA)消化细胞，传代培养，收集复苏后传代培养3代以上的对数期细胞，用于后续试验。
1.2待细胞生长至80-90％融合状态，用0.25％胰蛋白酶消化，收集并制备单细胞悬液，用新鲜培养液调整细胞浓度为1*106个/ml，将细胞接种于6孔培养板中，每孔2ml，置于培养箱中培养过夜，细胞贴壁后弃上清液，用PBS漂洗1次，同时加入待测样组(青钱柳提取物，60μg/ml)、阳性对照组(熊果苷)、阴性对照组(水)；每一组设3个复孔，加入2ml含有受试样的新鲜培养液。将细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养，培养48h后弃去上清液，用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化，收集细胞于离心管中，1500r/min离心10min，弃去上清液，加入1ml含10％DMSO的1mol/L NaOH溶液，80℃水浴1h后，分别移入96孔培养板中，用酶标仪测定波长405nm处各孔的光密度值，计算细胞内黑色素的含量。黑色素相对含量＝(试验孔OD405nm-空白孔OD405nm)/(对照组OD405nm-空白孔OD405nm)。
将响应面提取优化实验中制备的青钱柳抗氧化提取物进行上述实验，实验结果表明，青钱柳抗氧化提取物的黑色素合成相对量见表4：
表4不同待测样的黑色素合成相对量
Figure BDA0003069610200000071
Figure BDA0003069610200000081
上述实验说明，当青钱柳提取物的抗氧化活性较强时，黑色素合成含量较低，因此其美白作用也较为明显，说明可以将青钱柳的抗氧化提取物应用于美白类的化妆品产品中，提升化妆品的美白性能，其产品形式可以是面膜、牙膏、喷雾等常见化妆品形式。

Claims (7)

1.一种青钱柳抗氧化提取物，其特征在于，所述青钱柳抗氧化提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将青钱柳的叶片，置25-55℃的烘箱内烘干，取出，粉碎，过10-100目筛，得到青钱柳粉末；
(2)将青钱柳粉末放置超声提取罐中，加入提取溶剂，配成一定液料比，在一定温度下超声提取一定时间，取出，冷却至室温，以3500rpm离心15min，得上清液；
(3)上清液采用旋转蒸发仪，在25-55℃水浴浓缩至干，得青钱柳抗氧化提取物。
2.根据权利要求1所述一种青钱柳抗氧化提取物，其特征在于，所述步骤(2)中提取溶剂为0-100％甲醇水溶液，液料比为0.1-0.5mL/mg，超声温度为0-70℃，超声时间为15-75min。
3.根据权利要求1所述一种青钱柳抗氧化提取物，其特征在于，所述步骤(2)中提取溶剂为0-50％甲醇水溶液，液料比为0.3-0.5mL/mg，超声温度为25℃，超声时间为15-45min。
4.根据权利要求1所述一种青钱柳抗氧化提取物，其特征在于，所述步骤(2)中提取溶剂为32％甲醇水溶液，液料比为0.40mL/mg，超声温度为25℃，超声时间为32min。
5.根据权利要求1所述一种青钱柳抗氧化提取物，其特征在于，所述步骤(3)中水浴浓缩温度为40℃。
6.一种权利要求1-5任意所述的青钱柳抗氧化提取物在美白类化妆品中的应用。
7.根据权利要求6所述一种青钱柳抗氧化提取物在美白类化妆品中的应用，其特征在于，所述美白类化妆品为美白面膜。
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