CN113552259A - 一种快速检测产a/b类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒与检测方法 - Google Patents

一种快速检测产a/b类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒与检测方法 Download PDF

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Abstract

一种快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒，包括药物粉剂、药物溶解剂、细菌培养基、两种酶抑制剂、样本萃取液、流动相A/B，药物粉剂为10mg美罗培南，药物溶解剂为0.85%生理盐水，细菌培养基为MH培养基，两种酶抑制剂为300mg/ml的3‑氨基苯硼酸和292mg/ml的乙二胺四乙酸，样本萃取液为纯甲醇，流动相A为0.01%至0.1%体积比的甲酸水溶液，流动相B为0.01%至0.1%体积比的甲酸甲醇溶液。还提供了采用上述试剂盒的检测方法。本发明准确性高、耗时短，对于快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌、指导临床用药、减少抗生素滥用等具有重要意义。

Description

一种快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒与 检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于高效液相色谱串联质谱检测技术，具体来说是通过高效液相色谱串联质谱技术完成对耐碳青霉烯类肠杆科细菌以及区分其所产A类和B类酶型检测的试剂盒与方法。
背景技术
β内酰胺类抗生素是指化学结构中具有β内酰胺环的一大类抗生素(见附图1)，包括青霉素类、头孢菌素类、单环内酰胺类(氨曲南)以及碳青霉烯类等抗生素。碳青霉烯类药物是目前抗菌活性最强，抗菌谱最广的一类β-内酰胺类抗生素，曾被视为抗生素的“最后一道防线”，常用于治疗多重耐药肠杆菌科细菌引起的感染，代表药物有亚胺培南、美罗培南、厄他培南等。肠杆菌科细菌主要包括大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌等，是引起院内感染的常见病原菌。近些年来，随着抗生素的不合理使用，以肺炎克雷伯杆菌为主的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem resistant Enterobacteriaceae,CRE)的检出率在全球范围内呈逐年增高趋势。根据2019年中国细菌耐药监测网公布的结果显示，2005年至2019年期间，肺炎克雷伯杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率从3.0％和2.9％上升至25.3％和26.8％。2014年美国疾病预防与控制中心(Centers for DiseaseControl and Prevention,CDC)将18种多重耐药菌分为“紧急”、“严重”、“值得关注”3个威胁等级，CRE为“紧急”威胁级别中的首位多重耐药菌。CRE的传播速度之快，危害之大，严重威胁着全球人类生命健康以及公共卫生安全。
细菌对β内酰胺类抗生素耐药的主要方式是产生相应的β内酰胺酶，如青霉素酶、AmpC酶(AmpC enzymes)、超广谱β内酰胺酶(Extended Spectrumβ-Lactamases,ESBLs)和碳青霉烯酶等。肠杆菌科细菌针对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制有：①细菌产生碳青霉烯酶，水解药物的β内酰胺环，破坏其结构完整性，药物失效；②细菌膜孔蛋白的缺失，碳青霉烯类药物进入细菌体内的量减少，再合并其他β内酰胺酶，如AmpC酶或ESBLs酶时，导致细菌对碳青霉烯类药物不敏感(单一条件下不能导致细菌耐碳青霉烯类药物)；③细菌发生青霉素结合蛋白靶位结构改变，碳青霉烯类药物与细菌结合能力下降，无法发挥抗菌效果；④细菌通过高表达主动外排泵的方式，将碳青霉烯类药物从胞内向胞外泵出，降低药物在细菌体内的含量，形成耐药。β内酰胺酶根据Ambler分类原则即氨基酸序列的相似度可分为A～D酶4种，A、C和D类酶为丝氨酸酶，B类酶活性需要锌原子的参与，故又称之为金属酶。碳青霉烯酶的产生是CRE耐药的最主要方式，研究显示产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌数量大约占检出的所有CRE菌株总数的85％。碳青霉烯酶主要为A、B和D类酶三种，CRE菌株所产生的碳青霉烯酶主要为A和B类酶，分别占89％和9％，D类酶最少，仅为1.3％左右。碳青霉烯酶可以与碳青霉烯类抗生素中的β内酰胺环结合，使药物发生水解、化学结构发生破坏、导致药物失效，反应形成的水解产物分子相较于原先抗菌药物增加了“-H2O”，分子量增加18Da，随后水解产物会发生脱羧反应，终产物分子量相较于最初药物分子量又减少44Da(见附图2)。
CRE所产生的A类碳青霉烯酶属于丝氨酸酶，代表酶型是KPC(klebsiellapneumoniaecarbapenemase)酶，常见于肠杆菌科细菌中，可以水解青霉素类、氨曲南以及碳青霉烯类抗生素。A类碳青霉烯酶活性能被硼酸类化合物，如3-氨基苯硼酸所抑制。B类碳青霉烯酶因其自身酶活性需有金属离子，如Zn2+的参与，又被称为金属酶，代表酶型是NDM(NewDelhimetallo-β-lactamase)和IMP(imipenemase)酶，可以水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素，但对氨曲南水解能力不强。在体外环境中，金属酶活性可以被乙二胺四乙酸(Ethylene DiamineTetraacetic Acid,EDTA)抑制。在我国产碳青霉烯酶的肠杆菌中，产KPC酶的菌株大约占70％，产NDM酶和IMP酶的菌株约分别为10％和18％。临床中针对治疗产不同类型碳青霉烯酶的CRE感染，所使用的抗生素不同。产A类酶的CRE菌株通常可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类抗生素耐药，其碳青霉烯酶活性不被临床大部分β内酰胺酶抑制剂药物，如克拉维酸、他唑巴坦等抑制。目前新药头孢他啶-阿维巴坦已在我国开始使用，该药能有效抑制A类碳青霉烯酶活性，对产该类酶的CRE菌株具有良好的抗菌效果。对于产B类酶(金属酶)的CRE菌株，目前还没有可用于临床的金属酶抑制剂，临床多采用高剂量碳青霉烯类药物联合粘菌素或替加环素。该治疗方案中粘菌素具有较强的肾毒性和神经毒性，替加环素具有较强的消化道反应，且两种药物价格昂贵、治疗效果也因人而异，给患者治疗造成极大负担。因此，快速、准确检测CRE及其产酶类型，不仅可以帮助临床尽快制定有效的治疗方案，提高治疗效果，减少抗生素滥用，而且可以减少毒副作用、减轻患者经济负担。
目前，在临床微生物实验室中对于CRE的常规检测，主要为纸片扩散法以及全自动药敏检测仪器法。纸片扩散法基本过程：首先，将定量的待测肠杆科细菌涂抹于琼脂平板上，再把含有碳青霉烯类药物如亚胺培南、美罗培南等的纸片贴到平板上，经过18小时的培养后，根据纸片周围抑菌圈的大小，判断待测肠杆菌是否为CRE菌株。全自动药敏检测仪器法的基本过程：临床中应用最广的全自动药敏检测仪主要是梅里埃公司生产的VITEK2COMPACT仪器，首先按照仪器检测说明书的要求，将待测肠杆菌调成相应浓度的菌悬液，选择带有碳青霉烯类药物的药敏卡片，药敏卡上有多个数量的反应孔，不同孔内有不同类型、不同浓度的抗生素(包括碳青霉烯类抗生素)，再将药敏卡插入待测菌悬液中，并放入仪器内，通过压力作用，菌悬液流入每个反应孔内，经过18-24小时反应，最后根据碳青霉烯类药物反应孔内的细菌浊度变化，判断待测肠杆菌是否为CRE菌株。以上两种方法，操作简单，均可以有效检测出CRE菌株，但是检测周期太长，需要18小时左右，且不能区分CRE菌株的产酶型。
目前国内临床微生物实验室尚未常规开展CRE菌株的产酶型检测。2019年底全国细菌耐药监测网建议有能力的实验室逐步开展相关检测。目前常用的检测方法是Carba NP试验和酶抑制剂增强试验。Carba NP试验的原理：碳青霉烯酶水解碳青霉烯类药物的β内酰胺环后，溶液的PH下降，加入酸碱指示剂酚红，颜色由红色变黄色。Carba NP试验方法拥有良好灵敏度和特异性，且检测仅需4-6个小时。但是Carba NP试验方法所需的多种试剂，如10mM七水硫酸锌溶液、0.5％酚红溶液等配制过程繁琐、保质期短(仅为3天左右)、且仅能检测是否产碳青霉烯酶，但无法进一步区分该碳青霉烯酶属于A或B类酶，因此，难以在临床中广泛推广。酶抑制剂增强试验的原理：体外环境下，碳青霉烯酶活性可以被酶抑制剂抑制，水解药物能力下降，A类碳青霉烯酶活性可以被APB抑制，B类碳青霉烯酶活性可以被EDTA抑制(具体原理见附图3)。在涂有一定量待测肠杆菌科细菌的平板上，同时加贴亚胺培南纸片以及含有一定量APB或EDTA的亚胺培南纸片，过夜培养，若含有APB的亚胺培南(或EDTA的亚胺培南)纸片周围的抑菌圈比单纯亚胺培南纸片周围的抑菌圈至少增大5mm，则待测菌判断为产A类(或B类)碳青霉烯酶。酶抑制剂增强试验操作简单，成本低廉，准确性较高，目前多数实验室采用此方法检测，但试验耗时太长，需18个小时左右完成，仍难以满足临床需求。因此，开发一种可以简单、快速、全面筛查CRE的技术体系(包括确定CRE以及产酶类型)，对于CRE防治意义重大。。
高效液相色谱串联质谱技术(high-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)是一种将液相色谱良好的分离能力和质谱的高特异性检测能力结合起来，实现对复杂混合物成分准确定性和定量分析的技术。HPLC-MS/MS拥有诸多优点如：⑴分析范围广，几乎可以检测所有的化合物，能够有效解决分析热不稳定、强极性化合物的难题；⑵分离能力强，混合物能有效的分离开，并完成定性定量检测；⑶检测下限低，质谱具有高灵敏度，可以检测出ng甚至pg级别的物质成分；⑷分析速度快；⑸自动化程度高。HPLC-MS/MS凭借其出色的检测能力，已广泛应用于医药、食品、化工、环境等各个领域，尤其在医学检验方面，HPLC-MS/MS可以应用于新生儿遗传病筛查、激素水平检测、血药浓度监测以及微量元素检测等。
基于HPLC-MS/MS技术的优势，本发明通过HPLC-MS/MS检测待测肠杆菌科细菌与美罗培南以及不同酶抑制剂(APB和EDTA)共孵育后，美罗培南完整药物峰面积的变化来预测待测肠杆菌科细菌是否为CRE，以及CRE是否产A类酶或B类酶。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒与检测方法，所述的这种试剂盒与检测方法要解决的是现有技术中，CRE及其所产A类和B类酶区分检测的速度慢、成本高以及操作复杂的技术问题。
本发明提供了一种快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒，包括药物试剂、细菌培养基、两种酶抑制剂、以及样本萃取液、流动相A、流动相B，所述的药物试剂为50mg/ml的美罗培南药物溶液，所述的细菌培养基为MH液体培养基，所述的两种酶抑制剂分别为300mg/ml的3-氨基苯硼酸和292mg/ml的乙二胺四乙酸，所述的样本萃取液为无水甲醇，所述的流动相A为0.01％至0.1％体积比的甲酸水溶液，所述的流动相B为0.01％至0.1％体积比的甲酸甲醇溶液。
本发明还提供了上述的一种用于检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)一个制备药物试剂的步骤，称取美罗培南药物，加入到质量分数为0.85％的生理盐水中，加入后美罗培南的浓度为50mg/ml，完全溶解后，保存备用；
2)一个制备细菌培养基的步骤，称取MH肉汤干粉，加入到蒸馏水中，加入后MH肉汤干粉质量分数为21g/L，121℃高压灭菌15分钟，冷却后保存备用；
3)一个制备两种酶抑制剂的步骤，称取APB和EDTA，分别加入到甲醇和蒸馏水中，加入后APB的浓度为300mg/ml，EDTA的浓度为292mg/ml，完全溶解后，保存备用；
4)一个制备样本萃取液的步骤，量取无水甲醇，所述的无水甲醇纯度≥99.9％，量取完成后保存备用；
5)一个制备流动相A的步骤，将甲酸加入超纯水中，加入后甲酸的体积比为0.01％-0.1％，混合均匀并超声脱气备用；
6)一个制备流动相B的步骤，将甲酸加入甲醇中，加入后甲酸的体积比为0.01％-0.1％，混合均匀并超声脱气备用。
本发明还提供了采用上述试剂盒检测CRE以及区分其所产A类酶和B类酶型的方法，包括如下步骤：
1)一个超高效液相色谱分析的步骤，色谱参数为：流动相A为纯水，添加甲酸至体积比为0.01％-0.1％；流动相B溶液为纯甲醇，添加甲酸至体积比为0.01％-0.1％；梯度洗脱，B相起始为15％，在0.7min内增加到45％，再在0.4min内增加到85％，保持0.4min，再在0.1min内降至起始比例15％，维持1.4min，总时间为3min,流速为500μl/min，进样体积为5μl；
2)一个质谱分析步骤，质谱参数为：自动进样器温度为4℃，柱温为40℃，使用电喷雾电离源阳离子模式和多反应监测模式分析，美罗培南药物和水解的美罗培南的离子质荷比为384.7/68.7、401.7/357.9，雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气范围可分别为50psi-60psi、50psi-60psi、32psi-38psi和7psi-9psi，雾化辅助加热气加热温度为500℃-600℃；去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为70V-74V、10V-12V、9V-11V和4800V-5200V；美罗培南药物碰撞能量为70V，水解的美罗培南的碰撞能量为8V；
3)一个制备样品的步骤，吸取5μl药物试剂，加入到2ml的细菌培养基中，均匀混合后，第一步制备比对管：吸取上述混合液200μl，转移至洁净的1.5ml离心管内，并加入40μl生理盐水作为比对管；第二步制备反应管：将待测肠杆科细菌或质控菌株重悬于剩余的混合液中，菌悬液的终浊度为0.5个麦氏浊度，随后分出3管(abc)菌悬液，每管200μl，分别向其中加入40μl生理盐水(a管)、20μl生理盐水+20μl酶抑制剂APB(b管)、20μl生理盐水+20μl酶抑制剂EDTA(c管)；第三步将上述4管同时置于37℃恒温条件下孵育1小时后，每管加入200μl样品萃取液，上下颠倒混匀数次，以15000rpm的转速离心5分钟，转移上层清液至液相色谱专用检测板，等待上样；
4)采用步骤1)和步骤2)的液相色谱串联质谱的方法分析步骤3)的待测样品和质控品，根据样本检测管a和比对管之间美罗培南药物分子峰图的变化，来判断待测样本是否为CRE，若CRE检出阳性，则再根据3个样本检测管之间的美罗培南药物峰面积的变化来判断待测菌产A类酶还是B类酶，具体判断依据如下：
首先，判断待测肠杆菌科细菌是否为CRE：
①样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积与比对管的美罗培南药物分子峰面积之比为大于0.6，则待测菌不是CRE；
②样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积比对管的美罗培南药物分子峰面积之比小于等于0.6，则待测菌为CRE；
最后，判断CRE菌株产A类或B类酶：
①若样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积与样本检测管b的美罗培南药物分子峰面积之比小于等于0.4，则该CRE菌株产A类酶；
②若样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积与样本检测管c的美罗培南药物分子峰面积之比小于等于0.4，则该CRE菌株产B类酶。
本发明试剂盒所使用的阴性质控为碳青霉烯类敏感的肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-1706，阳性质控A为产A类酶的肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-1705，阳性质控B为产B类酶的肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-2146，因为上述质控为活性菌株且阳性质控更为多重耐药菌株，涉及生物安全问题，不能置于试剂盒内。使用者可通过正规渠道购买上述质控菌株，也可将临床分离的已确定耐药类型的菌株作为相应的阴性质控和阳性质控。
本发明根据CRE耐碳青霉烯类药物的主要方式为产A类或B类碳青霉烯酶，同时，A类酶活性和B类酶活性分别可以被APB和EDTA所抑制的特点，再借助HPLC-MS/MS针对小分子物质具有极高的检测能力的优势，将两者联合用于检测碳青霉烯类药物分子，通过检测同一待测细菌样本在添加不同酶抑制剂后，检出的碳青霉烯类药物分子含量的变化，来判断待测样样本中是否产生了相应的碳青霉烯酶。该技术对产A类酶或B类酶的CRE具有良好的检出能力，可以有效弥补现有临床上针对CRE产生的碳青霉烯酶型鉴定能力不足的问题。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的：
(1)本发明可以在1小时15分钟左右完成样本检测。
(2)本发明既能同时检测待测肠杆菌科细菌是否为CRE，也能同时确定CRE产生的碳青霉烯酶为A类酶或B类酶。
(3)本发明检测准确度高，操作简单，所使用的耗材造价低廉，适合在拥有HPLC-MS/MS仪器的医院中推广使用。
附图说明
图1显示了β内酰胺类抗生素化学结构简图，虚线部分为该类抗生素共有的β内酰胺环。
图2显示了CRE菌株与碳青霉烯类药物(美罗培南)相互作用的简单示意图。
图3显示了CRE菌株和碳青霉烯类药物(美罗培南)在酶抑制剂作用下，CRE菌株水解药物的能力降低(呈虚线)，美罗培南药物分子结构保持完整。
图4显示了本发明的实验操作简易流程图。
图5显示了HPLC-MS/MS检测出的美罗培南药物峰图。
图6显示了HPLC-MS/MS检测出的水解美罗培南药物峰图。
图7显示了HPLC-MS/MS检测空白样本的峰图。
图8显示了本发明具体实施的检测结果图。
具体实施方式
实施例1
本发明还提供了上述的一种用于检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)一个制备药物试剂的步骤，称取美罗培南药物，加入到质量分数为0.85％的生理盐水中，加入后美罗培南的浓度为50mg/ml，完全溶解后，保存备用；
2)一个制备细菌培养基的步骤，称取MH肉汤干粉，加入到蒸馏水中，加入后MH肉汤干粉质量分数为21g/L，121℃高压灭菌15分钟，冷却后保存备用；
3)一个制备两种酶抑制剂的步骤，称取APB和EDTA，分别加入到甲醇和蒸馏水中，加入后APB的浓度为300mg/ml，EDTA的浓度为292mg/ml，完全溶解后，保存备用；
4)一个制备样本萃取液的步骤，量取无水甲醇，所述的无水甲醇纯度≥99.9％，量取完成后保存备用；
5)一个制备流动相A的步骤，将甲酸加入超纯水中，加入后甲酸的体积比为0.01％-0.1％(就是甲酸在超纯水中的体积百分比为0.01％-0.1％)，混合均匀并超声脱气备用；
6)一个制备流动相B的步骤，将甲酸加入甲醇中，加入后甲酸的体积比为0.01％-0.1％(就是甲酸在甲醇中的体积百分比为0.01％-0.1％)，混合均匀并超声脱气备用。
实施例2快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的HPLC-MS/MS检测方法的建立一、仪器：高效液相色谱仪岛津LC-20A(Shimadzu，JPN)、串联三重四极杆质谱仪AB API3200(AB sciex,USA)，METTLER TOLEDO天平(Max＝220g，d＝0.1mg)(METTLER，Germany)、Eclipse plus-C18快速分离高通量窄径柱(3.0mm*100mm*3.5μm)(Agilent，USA)，Eppendorf 5424R低温高速离心机(Eppendorf,Germany)。
二、商购试剂：美罗培南购自美国Sigma公司，纯度为98.0％；EDTA购自中国国药基团公司；APB购自中国西亚试剂公司；MH培养基购自中国杭州微生物试剂有限公司；0.85％生理盐水购自中国湖南科伦制药公司；甲醇(LC//MS/MS级)、甲酸(LC//MS/MS级)均购自美国Fisher公司。试验用水由Milli-Q integral超纯水机(德国，默克密理博，MERCKMILLIPORE)制备。
三、本次实施方案中的流动相配制：
1.流动相A：体积比为0.1％的甲酸水溶液
2.流动相B：体积比为0.1％的甲酸甲醇溶液
四、实验步骤：
1.检测样本的制备
吸取5μl美罗培南药物试剂，加入到2ml的细菌培养基中，均匀混合后，首先制备比对管：吸取200μl混合后的培养基，转移至洁净的1.5ml离心管内，加入40μl生理盐水作为比对管；其次制备反应管：将待测肠杆科细菌或质控菌株重悬于混合后的培养基，菌悬液的终浊度为0.5个麦氏浊度，随后分出3管(abc)菌悬液，每管200μl，分别向其中加入40μl生理盐水(a管)、20μl生理盐水+20μl酶抑制剂APB(b管)、20μl生理盐水+20μl酶抑制剂EDTA(c管)；最后将3支反应管和1支比对管同时置于37℃恒温条件下孵育1小时，孵育完成后，分别向上述的4管内加入200μl样品萃取液，上下颠倒混匀数次，以15000rpm的转速离心5分钟，转移上层清液至液相色谱专用检测板。
2.本次实施方案中的色谱条件
流动相A为纯水，添加甲酸至甲酸体积比为0.1％；流动相B溶液为纯甲醇，添加甲酸至甲酸体积比为0.1％；梯度洗脱，B相起始为15％，在0.7min内增加到45％，再在0.4min内增加到85％，保持0.4min，再在0.1min内降至起始比例15％，维持1.4min，总时间为3min,流速为500μl/min，进样体积为5μl。
3.本次实施方案中的质谱条件
自动进样器温度为4℃，柱温为40℃，使用电喷雾电离源阳离子模式和多反应监测模式分析，美罗培南药物和水解的美罗培南的离子质荷比为384.7/68.7、401.7/357.9，雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、35psi和8psi，雾化辅助加热气加热温度为550℃；去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为72V、11V、10V和5000V；美罗培南药物碰撞能量为70V，水解的美罗培南的碰撞能量为8V；
五、实验结果：
检测美罗培南时，选择母离子的质荷比为384.7、子离子的质荷比为68.7，检测水解的美罗培南时，母离子质荷比选定为401.7、子离子质荷比选定为357.9。
利用体积比为0.1％的甲酸水溶液和体积比为0.1％的甲酸甲醇溶液为流动相，美罗培南的保留时间为2.03min，分析时间为3min(见图5)，而水解美罗培南在1.83min左右出现(见图6)。图7为空白样本检测图，可见在美罗培南和水解美罗培南通道均无干扰峰存在。
实施例3快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒与检测方法在临床的初步应用
一、研究对象
肠杆菌科菌株均采集于上海市东方医院。
菌株的选择标准：临床分离培养的新鲜菌株经过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry,MALDI-TOF)检测后确定为肠杆菌科细菌(鉴定置信度≥2.0)
CRE的确定标准：肠杆菌科细菌对任一碳青霉烯类药物耐药(如美罗培南抑菌圈直径≤19，亚胺培南抑菌圈直径≤19等)
产A类酶CRE的确定标准：CRE菌株经过酶抑制剂增强试验检测，含有APB的亚胺培南纸片相对单一的亚胺培南纸片抑菌圈直径增大5mm及以上，视为产A类酶CRE菌株。
产B类酶CRE的确定标准：CRE菌株经过酶抑制剂增强试验检测，含有EDTA的亚胺培南纸片相对单一的亚胺培南纸片抑菌圈直径增大5mm及以上，视为产B类酶CRE菌株。
非CRE的确定标准：肠杆菌科细菌对所有碳青霉烯类药物敏感(如美罗培南抑菌圈≥23，亚胺培南抑菌圈≥23等)
本实验共收纳菌株9例，其中非CRE肠杆菌科菌株3例，CRE菌株6例(包括产A类酶CRE菌株3例和产B类酶CRE菌株3例)。
二、研究方法
1、仪器与材料
同实施例1
2、样本检测
上述所有菌株样本按照实施例1所示操作步骤集中进行检验，每批次检测均设空白样本、质控样本。
三、结果分析
根据实验的判断依据：当样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积与比对管的美罗培南药物分子峰面积之比大于0.6，为非CRE菌株，反之为CRE菌株。当CRE菌株的检测管a美罗培南药物分子峰面积与检测管b美罗培南药物分子峰面积之比小于等于0.4，则该CRE菌株产A类酶；当CRE菌株的检测管a美罗培南药物分子峰面积与样本检测管c美罗培南药物分子峰面积之比小于等于0.4，则该CRE菌株产B类酶。
本次实验HPLC-MS/MS检测所有样本的质谱峰图可见图7。依据上述的判断原则，该试剂盒在检测CRE菌株时，检测管a与比对管之间的美罗培南峰面积之比均小于等于0.6；检测产A类酶CRE菌株时，检测管a与检测管b之间的美罗培南峰面积之比均小于等于0.4；检测产B类酶CRE菌株时，检测管a与检测管c之间的美罗培南峰面积之比均小于等于0.4，通过与酶抑制剂检测法比较，本发明所得到的结果与现有常规检测方法结果完全一致，表明该试剂盒具有较好的检测能力，具体结果参见表1。
表1：HPLC-MS/MS检测临床菌株结果分析表
Figure BDA0003173547340000111

Claims (4)

1.一种快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒，其特征在于：包括药物试剂、细菌培养基、两种酶抑制剂、以及样本萃取液、流动相A、流动相B，所述的药物试剂为50mg/ml的美罗培南药物溶液，所述的细菌培养基为MH液体培养基，所述的两种酶抑制剂分别为300mg/ml的3-氨基苯硼酸和292mg/ml的乙二胺四乙酸，所述的样本萃取液为无水甲醇，所述的流动相A为0.01%至0.1%体积比的甲酸水溶液，所述的流动相B为0.01%至0.1%体积比的甲酸甲醇溶液。
2.根据权利要求1所述的快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒，其特征在于：试剂盒所使用的阴性质控为碳青霉烯类敏感的肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-1706，阳性质控A为产A类酶的肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-1705，阳性质控B为产B类酶的肺炎克雷伯菌株ATCC BAA-2146。
3.权利要求书1所述的一种快速检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)一个制备药物试剂的步骤，称取美罗培南药物，加入到质量分数为0.85%的生理盐水中，加入后美罗培南的浓度为50mg/ml，完全溶解后，保存备用；
2)一个制备细菌培养基的步骤，称取MH肉汤干粉，加入到蒸馏水中，加入后MH肉汤干粉质量分数为21g/L，121℃高压灭菌15分钟，冷却后保存备用；
3)一个制备两种酶抑制剂的步骤，称取3-氨基苯硼酸和乙二胺四乙酸，分别加入到甲醇和蒸馏水中，加入后3-氨基苯硼酸的浓度为300mg/ml，乙二胺四乙酸的浓度为292mg/ml，完全溶解后，保存备用；
4)一个制备样本萃取液的步骤，量取无水甲醇，所述的无水甲醇纯度≥99.9%，量取完成后保存备用；
5)一个制备流动相A的步骤，将甲酸加入超纯水中，加入后甲酸的体积比0.01%至0.1%，混合均匀并超声脱气备用；
6)一个制备流动相B的步骤，将甲酸加入甲醇中，加入后甲酸的体积比为0.01%至0.1%，混合均匀并超声脱气备用。
4.采用权利要求书1所述的试剂盒检测产A/B类碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)一个超高效液相色谱分析的步骤，色谱参数为：流动相A为纯水，添加甲酸至体积比为0.01%至0.1%；流动相B溶液为纯甲醇，添加甲酸至体积比为0.01%至0.1%；梯度洗脱，B相起始为15%，在0.7 min内增加到45%，再在0.4min 内增加到85%，保持0.4 min，再在0.1 min内降至起始比例15%，维持1.4 min，总时间为3 min,流速为500μl/min，进样体积为5μl；
2)一个质谱分析步骤，质谱参数为：自动进样器温度为4℃，柱温为40℃，使用电喷雾电离源阳离子模式和多反应监测模式分析，美罗培南药物和水解的美罗培南的离子质荷比为384.7/68.7、401.7/357.9，雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气范围分别为50psi-60 psi、50 psi-60 psi、32 psi-38 psi和7 psi-9 psi，雾化辅助加热气加热温度范围为500℃-600℃；去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压范围分别为70 V-74 V、10 V-12 V、9 V-11 V 和4800 V-5200 V；美罗培南药物碰撞能量为70 V，水解的美罗培南的碰撞能量为8 V；
3)一个制备样品的步骤，吸取5μl药物试剂，加入到2ml的细菌培养基中，均匀混合后，首先制备比对管：吸取上述混合液200μl，转移至洁净的1.5ml离心管内，并加入40μl生理盐水作为比对管；其次制备反应管：将待测肠杆科细菌或质控菌株重悬于剩余的混合液中，菌悬液的终浊度为0.5个麦氏浊度，随后分出3管菌悬液，每管200μl，分别向其中加入40μl生理盐水、20μl生理盐水+20μl酶抑制剂3-氨基苯硼酸、20μl生理盐水+20μl酶抑制剂乙二胺四乙酸；最后将上述4管同时置于37℃恒温条件下孵育1小时后，每管加入200μl样品萃取液，上下颠倒混匀数次，以15000rpm的转速离心5分钟，转移上层清液至液相色谱专用检测板，等待上样；
4)采用步骤1）和步骤2）的液相色谱串联质谱的方法分析步骤3）的待测样品和质控品，根据样本检测管a和比对管之间美罗培南药物分子峰图的变化，来判断待测样本是否为CRE，若CRE检出阳性，则根据3个样本检测管之间的美罗培南药物分子峰面积的变化来判断待测菌产A类酶还是B类酶，具体判断依据如下：
首先，判断待测肠杆菌科细菌是否为CRE：
Figure 644288DEST_PATH_IMAGE001
样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积与比对管的美罗培南药物分子峰面积之比为大于0.6，则待测菌不是CRE；
Figure 636515DEST_PATH_IMAGE002
样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积比对管的美罗培南药物分子峰面积之比小于等于0.6，则待测菌为CRE；
最后，判断CRE菌株产A类或B类酶：
Figure 659834DEST_PATH_IMAGE001
若样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积与样本检测管b的美罗培南药物分子峰面积之比小于等于0.4，则该CRE菌株产A类酶；
Figure 635881DEST_PATH_IMAGE002
若样本检测管a的美罗培南药物分子峰面积与样本检测管c的美罗培南药物分子峰面积之比小于等于0.4，则该CRE菌株产B类酶。
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