CN113552256B

CN113552256B - 一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法

Info

Publication number: CN113552256B
Application number: CN202110817287.7A
Authority: CN
Inventors: 张永清; 黄文静; 张龙霏; 熊乐文
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113552256A

Abstract

本发明涉及中药材技术领域，具体涉及一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法，包括对照品溶液制备、供试品溶液制备、线性回归方程建立、供试品溶液检测和含量计算几个步骤，还得到了超声提取黄酮类成分的最优条件，包括：提取液为80％甲醇水溶液，每1g金银花加入30mL甲醇水溶液，超声提取温度为50℃，超声提取时间为80min；本发明提供了一种同时测定金银花中20种黄酮类成分的方法，重复性、稳定性好，为全面表征金银花黄酮类成分、评价金银花药材质量建立了实用、可行的技术平台，还优化了金银花中黄酮类成分的提取条件。

Description

一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法

技术领域

本发明涉及中药材技术领域，具体涉及一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法。

背景技术

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花；药用历史悠久，属大宗常用中药材。其味甘，性寒，可清热解毒、疏散风热，用于治疗痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。现代研究证明，金银花含有挥发油类、黄酮类、三萜类、有机酸类及无机元素等成分，具有解热、抗炎、抗肿瘤、保肝利胆、抗菌及抗病毒等药理活性，临床应用广泛，在防治常见病、多发病、传染性疾病等方面发挥着重要作用。黄酮类成分是金银花主要活性成分之一，具有抗呼吸道病毒感染、抗氧化、保肝等活性。《中华人民共和国药典》自2005年版起，就将木犀草苷含量作为评价金银花药材质量的指标。

金银花中包含多种活性物质，黄酮类化合物是其中重要的一类，黄酮类化合物属于多元酚类有机化合物，是一种以2-苯基色原酮结构为母核，含C6-C3-C6框架的天然活性物质，其在植物体内通常与糖类结合形成配基形式的苷类，少部分以游离态的苷元形式存在。黄酮类化合物分为：黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、查耳酮、橙酮、花青素、双黄酮等。金银花中所含有的黄酮类化合物主要隶属于黄酮和黄酮醇两类。

目前已经有很多针对金银花内成分测定的研究，但这些研究多数以有机酸类物质为主，能测定的黄酮类化合物的种类有限，因此找出一种能够专门测定金银花中黄酮类化合物的方法，为其进一步研究搭建新的平台是很有必要的。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提出了一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法，具体包括以下步骤：

S1：对照品溶液制备：将一定量的芦丁，圣草酚-7-O-葡萄糖苷，金丝桃苷，异槲皮苷，木犀草苷，忍冬苷，山奈酚-3-O-芸香糖苷，紫云英苷，水仙苷，野漆树苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，芹菜素-7-O-葡萄糖苷，Tricin-7-O-glucoside，木犀草素，槲皮素，金圣草黄素，香叶木素，芹菜素，苜蓿素，似梨木双黄酮混合并溶于甲醇水溶液得到对照品溶液，并将对照品溶液储存备用；

S2：供试品溶液制备：

S2-2：精密称定若干金银花粉末；

S2-3：根据所述金银花粉末的量精密加入甲醇水溶液；

S2-4：将混合溶液进行密塞，称重，并进行超声处理；

S2-5：将完成超声处理的金银花冷却至室温，补足失重；

S2-6：进行离心处理，取上清液；

S2-7：用有机滤膜进行过滤，取其中滤液得到供试品溶液；

S3：线性回归方程建立：

S3-1：将对照品溶液用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术检测并分析；

S3-2：以每一种黄酮类成分的对照品峰面积为纵坐标，黄酮类成分的含量为横坐标，建立线性回归方程；

S4：供试品溶液检测：采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术对供试品溶液中的20种黄酮类成分进行定量分析；

S5：含量计算：结合步骤S3中得到的线性回归方程和步骤S4中供试品溶液定量分析的结果计算得到供试品溶液中20种黄酮类成分的含量。

所述步骤S2中，优选的20种黄酮类成分的提取条件为：所述甲醇水溶液的体积分数为70％～90％，每1g金银花加入20～40mL甲醇水溶液，超声处理的温度为45～55℃，超声处理的时间为70～90min。

所述步骤S2中，最优选的20种黄酮类成分的提取条件为：所述甲醇水溶液的体积分数为80％，每1g金银花加入30mL甲醇水溶液，超声处理的温度为50℃，超声处理的时间为80min。

优选的，所述步骤S2-6中，离心处理的转速为13500～14500r/min，离心处理的时间为9～11min。

优选的，所述步骤S3-1和S4中，所述高效液相色谱的条件为：Hola C18色谱柱，2.1mm×100mm，2.7μm；进样量2μL；流动相A为甲酸水溶液，其中甲酸的体积分数为0.08％，B为甲酸的乙腈溶液，其中甲酸的体积分数为0.08％；洗脱梯度为0～5min 10％→23％B，5～25min 23％→31％B，25～35min31％→80％B，35～40min 80％B；流速0.3mL/min；柱温30℃。

优选的，所述步骤S3-1和S4中，所述三重四极杆质谱仪的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI源)，采用MRM模式正、负离子模式切换检测；毛细管电压：正负离子模式均为4000V；干燥气温度为300℃；干燥气流速为11.0L/min；雾化气压力为15.0psi；扫描范围为100～1200m/z。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种利用HPLC-ESI-MS/MS对金银花药材中20种黄酮类成分进行定量检测的方法，本方法重复性、稳定性好，可用于检测金银花黄酮类成分含量，为全面表征金银花黄酮类成分、评价金银花药材质量建立了实用、可行的技术平台；(2)本发明对金银花黄酮类成分的超声提取条件进行了优化，确定了金银花黄酮类成分最佳提取条件为80％甲醇水溶液、金银花粉末与甲醇水溶液的物料比为1：30(mL/g)、温度50℃、时间80min超声提取。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是芦丁的MRM色谱图。

图2是圣草酚-7-O-葡萄糖苷的MRM色谱图。

图3是金丝桃苷的MRM色谱图。

图4是异槲皮苷的MRM色谱图。

图5是木犀草苷的MRM色谱图。

图6是忍冬苷的MRM色谱图。

图7是山奈酚-3-O-芸香糖苷的MRM色谱图。

图8是紫云英苷的MRM色谱图。

图9是水仙苷的MRM色谱图。

图10是野漆树苷的MRM色谱图。

图11是异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的MRM色谱图。

图12是芹菜素-7-O-葡萄糖苷的MRM色谱图。

图13是Tricin-7-O-glucoside的MRM色谱图。

图14是木犀草素的MRM色谱图。

图15是槲皮素的MRM色谱图。

图16是金圣草黄素的MRM色谱图。

图17是香叶木素的MRM色谱图。

图18是芹菜素的MRM色谱图。

图19是苜蓿素的MRM色谱图。

图20是似梨木双黄酮的MRM色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例一

实验仪器：Agilent 1260HPLC/6420串联四极杆质谱仪；LE204E型、XS105DU型电子分析天平；5810R型高速冷冻离心机；KQ-500DE型数控超声波清洗器；gLF-04密封型手提式粉碎机；BAg-9246A型电热鼓风干燥箱。

实验试剂：芦丁(≥98％)，圣草酚-7-O-葡萄糖苷(≥95％)，金丝桃苷(≥98％)，异槲皮苷(≥98％)，木犀草苷(≥98％)，忍冬苷(≥98％)，山奈酚-3-O-芸香糖苷(≥98％)，紫云英苷(≥98％)，水仙苷(批号≥98％)，野漆树苷(≥98％)，芹菜素-7-O-葡萄糖苷(≥98％)，Tricin-7-O-glucoside(≥92％)，木犀草素(≥98％)，槲皮素(≥98％)，金圣草黄素(批号≥98％)，香叶木素(≥98％)，芹菜素(≥98％)，苜蓿素(≥96％)，似梨木双黄酮(≥98％)，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷(≥98％)，乙腈，甲醇，甲酸。

高效液相色谱条件为：Hola C18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)；进样量2μL；流动相A相为0.08％甲酸水，B相为0.08％甲酸乙腈；洗脱梯度为0～5min 10％→23％B，5～25min 23％→31％B，25～35min31％→80％B，35～40min 80％B；流速0.3mL/min；柱温30℃。

三重四极杆质谱仪的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI源)，采用MRM模式正、负离子模式切换检测；毛细管电压：正负离子模式均为4000V；干燥气温度为300℃；干燥气流速为11.0L/min；雾化气压力为15.0psi；扫描范围为100～1200m/z。

在此质谱条件下，针对20种黄酮类成分对照品的保留时间、质谱参数等特征详见表1：

表1

对照品溶液的制备：精密称取20种黄酮类成分对照品适量，混合在一起后采用甲醇作为溶剂配制成对照品溶液。各种成分浓度分别为：芦丁(P1)49μg/mL，圣草酚-7-O-葡萄糖苷(P2)5.3μg/mL，金丝桃苷(P3)7μg/mL，异槲皮苷(P4)25μg/mL，木犀草苷(P5)23.75μg/mL，忍冬苷(P6)43μg/mL，山奈酚-3-O-芸香糖苷(P7)11μg/mL，紫云英苷(P8)1.975μg/mL，水仙苷(P9)24.5μg/mL，野漆树苷(P10)21μg/mL，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷(P11)2μg/mL，芹菜素-7-O-葡萄糖苷(P12)7.2μg/mL，Tricin-7-O-glucoside(P13)2.75μg/mL，木犀草素(P14)20μg/mL，槲皮素(P15)0.9μg/mL，金圣草黄素(P16)1.375μg/mL，香叶木素(P17)0.35μg/mL，芹菜素(P18)1.275μg/mL，苜蓿素(P19)0.9μg/mL，似梨木双黄酮(P20)13.625μg/mL。将对照品溶液储存于4℃条件下，备用。

供试品溶液的制备：

药材预处理：将金银花药材晒干，充分干燥后，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于干燥器中备用。

供试品溶液制备：精密称定金银花药材粉末0.2g，精密加入80％甲醇水溶液6mL，密塞，称重，超声(温度50℃，功率250W，40kHz)处理80min，然后放置于工作台上冷却至室温，补足失重，14000r/min离心10min，取上清液，过0.22μm有机滤膜，将滤液进行HPLC-ESI-MS/MS检测。

线性关系确定：

精密吸取上述的对照品溶液，用甲醇连续稀释，最大稀释至200倍，以确定建立标准曲线所需的浓度，按上述条件分析计算得到对照品峰面积(y)和相对应浓度(x)的线性回归方程；并且以3倍信噪比(S/N)计算对照品的检测限(LOD)，以10倍信噪比(S/N)计算出对照品的定量限(LOQ)，结果见表2。

表2

具体的，为了验证本方法的合理性，还对实验数据进行了一下考察。

精密度考察：

取已知浓度混合对照品溶液，在1天内连续进样6次计算日内精密度，连续3天进样计算日间精密度，以RSD值评估精密度，结果见表2。20种黄酮类成分的精密度RSD≤3.26％，表明该方法精密度良好。

重复性考察：

配制同一样品的6个重复样本进行分析，以峰面积RSD评估重复性。结果见表2。20种黄酮类成分的重复性RSD≤3.71％，表明该方法重复性良好。

稳定性考察：

取同一样品溶液，分别在室温下放置0、2、4、8、12、24、48h后进行分析，以RSD值评估样品溶液的稳定性。结果见表2。待测成分稳定性RSD≤3.47％，表明样品溶液在48h内基本稳定。

加样回收率考察：

称取已知各黄酮类成分含量的金银花样品粉末6份，分别加入已知浓度的对照品进行分析，计算各种黄酮类的平均回收率及RSD值。结果见表2。20种黄酮类成分的加样回收率在92.8％～107.37％，回收率RSD在0.46％～3.05％。

考察结果验证了本方法实验和计算所得的相关数据的合理性，下面对供试品溶液中的20种黄酮类成分进行定量计算。

精密称取金银花样品粉末0.2g，按照实施中的方法制备供试品溶液，进样2μL，得到20种黄酮类化合物的MRM图谱及其各自的峰面积，根据求得的线性回归方程，可以利用MRM图谱中的峰面积计算出含量(浓度)。

最终实验结果为芦丁1214.72μg/g，圣草酚-7-O-葡萄糖苷139.66μg/g，金丝桃苷33.33μg/g，异槲皮苷538.14μg/g，木犀草苷885.42μg/g，忍冬苷401.54μg/g，山奈酚-3-O-芸香糖苷152.59μg/g，紫云英苷3.93μg/g，水仙苷224.04μg/g，野漆树苷29.02μg/g，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷30.83μg/g，芹菜素-7-O-葡萄糖苷83.12μg/g，Tricin-7-O-glucoside3.28μg/g，木犀草素49.34μg/g，槲皮素6.45μg/g，金圣草黄素1.34μg/g，香叶木素0.14μg/g，芹菜素1.49μg/g，苜蓿素0.52μg/g，似梨木双黄酮14.23μg/g。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S2：供试品溶液制备：

S2-2：精密称定若干金银花粉末；

S2-3：根据所述金银花粉末的量精密加入甲醇水溶液；

S2-4：将混合溶液进行密塞，称重，并进行超声处理；

S2-5：将完成超声处理的金银花冷却至室温，补足失重；

S2-6：进行离心处理，取上清液；

S2-7：用有机滤膜进行过滤，取其中滤液得到供试品溶液；

S3：线性回归方程建立：

S5：含量计算：结合步骤S3中得到的线性回归方程和步骤S4中供试品溶液定量分析的结果计算得到供试品溶液中20种黄酮类成分的含量；

所述步骤S3-1和S4中，所述高效液相色谱的条件为：Hola C18色谱柱，2.1mm×100mm，2.7μm；进样量2μL；流动相A为甲酸水溶液，其中甲酸的体积分数为0.08％，B为甲酸的乙腈溶液，其中甲酸的体积分数为0.08％；洗脱梯度为0～5min 10％→23％B，5～25min23％→31％B，25～35min31％→80％B，35～40min 80％B；流速0.3mL/min；柱温30℃。

2.根据权利要求1所述的一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法，其特征在于，还包括以下步骤：S2-1：药材预处理：将金银花充分干燥，用粉碎机粉碎，过筛，置于干燥器中备用。

3.根据权利要求1所述的一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述甲醇水溶液的体积分数为70％～90％，每1g金银花加入20～40mL甲醇水溶液，超声处理的温度为45～55℃，超声处理的时间为70～90min。

4.根据权利要求3所述的一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述甲醇水溶液的体积分数为80％，每1g金银花加入30mL甲醇水溶液，超声处理的温度为50℃，超声处理的时间为80min。

5.根据权利要求1所述的一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法，其特征在于，所述步骤S2-6中，离心处理的转速为13500～14500r/min，离心处理的时间为9～11min。

6.根据权利要求1所述的一种同时测定金银花中20种黄酮类成分含量的方法，其特征在于，所述步骤S3-1和S4中，三重四极杆质谱仪的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI源)，采用MRM模式正、负离子模式切换检测；毛细管电压：正负离子模式均为4000V；干燥气温度为300℃；干燥气流速为11.0L/min；雾化气压力为15.0psi；扫描范围为100～1200m/z。