CN113546173B - Prmt5抑制剂在制备治疗冠状病毒感染所引起的疾病的药物中的应用 - Google Patents

Prmt5抑制剂在制备治疗冠状病毒感染所引起的疾病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及PRMT5特异性抑制剂在预防冠状病毒感染中的应用。更具体地，本发明提供了PRMT5抑制剂和/或ACE2蛋白的基因编辑试剂及其组成的药物组合物在制备预防冠状病毒感染/治疗冠状病毒感染所引起的疾病的产品中的应用。优选地，所述冠状病毒包括2019新型冠状病毒。

Description

PRMT5抑制剂在制备治疗冠状病毒感染所引起的疾病的药物 中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及PRMT5特异性抑制剂在预防冠状病毒感染中的应用。
背景技术
从2019年11月到现在，新冠疫情愈演愈烈，全球确诊病理已超过2亿，死亡病例已超过425万。SARS-CoV-2病毒主要通过和人的ACE2结合来感染人体。许多研究报道：SARS-CoV2通过Spike1（新冠棘突蛋白）的受体结合域（RBD）和ACE2结合，从而感染人体。
随着SARS-CoV2疫情传播，越来越多的SARS-CoV2病毒突变株被报道。例如南非变种（Beta变体）和印度变种（Delta变体）。这些突变病毒株一方面使病毒传播速度变得更快，另一方面使疫苗的防护能力不断降低。例如，印度变体以及被报道能够使传播速度增加几倍，使现有疫苗的防御能力降低多少倍。因此，开发出能够阻止新冠病毒感染人体的特效药，显得尤为重要。
精氨酸甲基转移酶（Protein Arginine Methyltransferases，PRMTs）是一类能够对组蛋白和非组蛋白精氨酸残基进行甲基化修饰的酶。蛋白的精氨酸甲基化修饰是一种非常重要的翻译后修饰类型。PRMTs能够催化来自S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基基团转移到精氨酸胍基的氮原子上，可以形成三种类型的精氨酸甲基化修饰：单甲基化（monomethyl-arginine，MMA）、非对称性二甲基化（asymmetricdimethyl-arginine，ADMA）和对称性二甲基化（symmetricdimethyl-arginine，SDMA）。根据PRMTs催化形成甲基化产物类型的不同，将目前在哺乳动物细胞中发现的9种PRMTs分成三类：第I类，PRMTs催化形成MMA和ADMA，包括PRMT1-4、PRMT6和PRMT8；第II类，PRMTs催化形成MMA和SDMA，包括PRMT5和PRMT9；第III类，PRMTs催化形成MMA，目前PRMT7是这一类的唯一成员。我们近期一系列的研究发现：组蛋白和非组蛋白的精氨酸甲基化修饰，能够影响基因的转录调控，底物蛋白的稳定性以及甲基转移酶的酶活性。在癌症发展和转移、细胞衰老和凋亡等多种过程中均有重要作用。
发明内容
本发明人通过实验证明：PRMT5介导的ACE2的对称性二精氨酸甲基化修饰（SDMA）在新冠病毒感染人体过程中发挥着至关重要的作用，PRMT5催化ACE2-R671-SDMA修饰，能够促进RBD-ACE2的结合；而且还发现PRMT5的特异性抑制剂GSK3326595能够明显抑制SARS-CoV-2印度变体（Delta）和南非变体（Beta）新冠突变病毒的S1蛋白与ACE2的结合，最后通过假病毒进行模拟感染实验也发现：ACE2-R671-SDMA修饰能够增强假病毒感染细胞；过表达PRMT5能够增强假病毒感染细胞；PRMT5特异性抑制剂GSK3326595能够明显抑制假病毒感染细胞。
由上述实验结果可以得出结论：PRMT5对ACE2-R671的SDMA修饰对新冠病毒感染人体是必须的。GSK3326595【Pemrametostat（GSK3326595，EPZ015938）】作为一种具有口服活性的PRMT5的特异抑制剂，非常有潜力成为抑制新冠病毒（特别是Delta突变株）感染人体的特效药。
产品-药物组合物
一方面本发明提供了一种预防冠状病毒感染和/或治疗冠状病毒感染所引起的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含抑制ACE2蛋白发生修饰的试剂。
所述抑制ACE2蛋白发生修饰的试剂包括抑制ACE2蛋白发生甲基化修饰、糖基化修饰的试剂；
优选地，所述抑制ACE2蛋白发生甲基化修饰的试剂是抑制ACE2蛋白的R671位点发生甲基化修饰的试剂；
优选地，所述抑制ACE2蛋白的R671位点发生甲基化修饰的试剂包括甲基化酶抑制剂、ACE2蛋白的基因编辑试剂；
优选地，所述甲基化酶抑制剂是PRMT5抑制剂；
优选地，所述PRMT5抑制剂包括以下化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或其水合物：GSK3326595、EPZ015666（GSK3235025）、LLY-283、GSK591、HLCL-61HCL、Onametostat（JNJ-64619178）；
优选地，所述PRMT5抑制剂是GSK3326595或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或其水合物；
本发明所述“GSK3326595”是一种具有口服活性的PRMT5的特异抑制剂，其含义与“Pemrametostat”“EPZ015938”一致。其CAS#为1616392-22-3，其化学结构如下所示：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
本发明所述“药学上可接受盐”在被施用的量和浓度下是无毒的。在不阻止其发挥生理效应的情况下，通过改变化合物的物理特性，这样的盐的制备可以便于药理学应用。
优选地，所述药学上可接受的盐可以从酸中获得，所述酸可以是有机酸或无机酸；
优选地，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸；
优选地，所述有机酸如甲酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸（pyranosidyl acid）、α-羟基酸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸、芳香酸、磺酸。
优选地，所述药学上可接受的盐还包括碱加成盐，具体地包括碱金属盐（如钠盐、钾盐等）及碱土金属盐（如钙盐、镁盐等）等。
优选地，所述GSK3326595药学上可接受的盐，示例性地，包括但不限于Pemrametostat succinate，CAS# 1848944-46-6，其化学式如下所示：
Figure 323461DEST_PATH_IMAGE002
优选地，所述ACE2蛋白的基因编辑试剂是使ACE2蛋白发生R671K突变的基因编辑试剂；
本发明中术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如R671K表示第671位的精氨酸（R）变为赖氨酸（K）。
优选地，所述基因编辑包括使用以下任意一种方法所使用的试剂：同源重组、锌指核酸酶编辑、TALEN编辑、CRISPR-Cas编辑、RNA干扰。
优选地，所述药物组合物可以为片剂（包括糖衣片剂，膜包衣片剂，舌下片剂，口腔崩解片，口腔片剂等等），丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊剂（包括软胶囊，微胶囊），锭剂，糖浆剂，液体，乳剂，混悬剂，控制释放制剂（例如，瞬时释放制剂，缓释制剂，缓释微囊），气雾剂，膜剂（例如，口服崩解膜剂，口腔粘膜-粘附膜剂），注射剂（例如，皮下注射，静脉注射，肌内射，腹膜内注射），静脉滴注剂，透皮吸收制剂，软膏剂，洗剂，粘附制剂，栓剂（例如，直肠栓剂，阴道栓剂），小药丸，鼻制剂，肺制剂（吸入剂），眼睛滴剂等等，口服或胃肠外制剂（例如，静脉内，肌内，皮下，器官内，鼻内，皮内，滴注，脑内，直肠内等给药形式，给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处）。
优选地，本发明化合物的药物组合物可采用下面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心内室、胸骨内或静脉内给药方式。
优选地，本发明的药物组合物可单独给药也可与其他抗病毒药物联合用药。
优选地，所述其他抗病毒药物包括更昔洛韦、阿昔洛韦、金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦、阿巴卡韦、醋孟南、阿昔洛韦钠、阿德福韦、阿洛夫定、阿韦舒托、盐酸三环癸胺、阿拉诺丁、阿立酮、阿替韦啶甲磺酸酯、阿夫立定、西多福韦、西潘茶碱、恩曲他滨、盐酸阿糖胞苷、甲磺酸地拉韦啶、地昔洛韦、去羟肌苷、二噁沙利、依度尿苷、乙米韦林、依曲西他平、恩韦拉登、恩韦肟、贺普丁、泛昔洛韦、盐酸氯苯氢异喹、非西他滨、非阿尿苷、磷利酯、膦甲酸钠、膦乙酸钠、甘西洛维钠、碘苷、茚地那韦、乙氧丁酮醛、拉米夫定、洛布卡韦、洛德腺苷、洛匹那韦、盐酸美莫汀、甲红硫脲、那非那韦、奈韦拉平、喷昔洛韦、吡罗达韦、利巴韦林、甲磺酸沙奎那韦、利托那韦、盐酸索金刚胺、索立夫定、匍枝青霉菌素、司他夫定、替诺福韦、盐酸梯络龙、曲氟尿苷、盐酸伐昔洛韦、阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿糖腺苷磷酸钠、替拉那韦、韦罗肟、扎西他滨、齐多夫定、净韦肟。
优选地，所述其他抗病毒药物还可以是中药成分。
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂、载体或辅料。
优选地，所述赋形剂包括粘合剂、填料、润滑剂和崩解剂。
优选地，所述载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，缓冲物质，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。
应用
另一方面本发明提供了前述药物组合物在制备预防冠状病毒感染/治疗冠状病毒感染所引起的疾病的产品中的应用。
另一方面本发明提供了前述抑制ACE2蛋白发生修饰的试剂在制备预防冠状病毒感染/治疗冠状病毒感染所引起的疾病的产品中的应用。
优选地，所述冠状病毒包括2019新型冠状病毒、HCoV-229E病毒、HCoV-NL63病毒、HCoV-OC43病毒、HCoV-HKU1病毒、SARS-CoV病毒、MERS-CoV病毒。
优选地，所述冠状病毒包括2019新型冠状病毒（2019-nCoV，世卫组织2020年1月命名；SARS-CoV-2，国际病毒分类委员会2020年2月11日命名）。
优选地，所述冠状病毒感染所引起的疾病包括呼吸系统疾病，例如单纯性感染、轻症肺炎、重症肺炎、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染（SARI）、低氧性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合症、脓毒症、脓毒症休克等。
优选地，所述单纯性感染包括但不限于发热、咳嗽、咽痛、鼻塞、乏力、头痛、肌肉疼痛或不适。
优选地，所述轻症肺炎包括但不限于咳嗽，呼吸困难和/或呼吸急促。
优选地，所述重症肺炎包括但不限于呼吸频率增加，严重的呼吸衰竭或呼吸困难，中心型发绀、嗜睡、意识不清或惊厥、抽气。
优选地，所述急性呼吸窘迫综合症包括但不限于肺水肿。
优选地，所述脓毒症包括但不限于器官功能障碍。
优选地，所述2019新型冠状病毒引起的疾病为新型冠状病毒肺炎（Corona VirusDisease 2019，COVID-19），简称“新冠肺炎”。
方法
另一方面本发明提供了一种预防冠状病毒感染/治疗冠状病毒感染所引起的疾病的方法，所述方法包括给予受试者有效量的前述抑制ACE2蛋白发生修饰的试剂或前述药物组合物；
优选地，所述受试者包括哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；
优选地，所述哺乳动物包括人、猫、狗、猪、牛、马。
本发明所述“有效量”是指在合理的医学判断范围内，足以治疗或预防患者疾病但足够低地避免严重副作用的量。化合物的治疗有效量将根据所选择的具体化合物（例如考虑化合物的效力、有效性和半衰期）、所选择的给药途径、所治疗的疾病、所治疗的疾病的严重性、所治疗的患者的年龄、大小、体重和身体疾病、所治疗的患者的医疗史、治疗持续时间、并行疗法的性质、所需的治疗效果等因素发生变化，但仍可以由本领域技术人员常规确定。
附图说明
图1为免疫共沉淀的实验结果图；A是证明GSK3326595对ACE2和RBD的结合的抑制效果的结果图，B是表明ACE2能够和PRMT5结合，并且ACE2会发生MMA和SDMA甲基化修饰，C是表明GSK3326595能够明显抑制ACE2的SDMA修饰，D是表明过表达PRMT5能够增加ACE2和PRMT5的结合，增强ACE2的MMA和SDMA修饰，并且还能够增强ACE2和RBD的结合。
图2为LC-MS质谱检测结果图，A是精氨酸甲基化修饰位点R644，B是精氨酸甲基化修饰位点R671。
图3为过表达突变质粒的免疫共沉淀实验结果图；A是过表达Flag-ACE2-WT/R644K/R671K，B是共转GFP-RBD和Flag-ACE2-WT/R671K质粒，C是共同过表达GFP-RBD和Flag-ACE2-WT/R671K/N322Q/（R671K+N322Q），D是共转GFP-RBD和Flag-ACE2-N322Q。
图4为CCK-8实验检测不同浓度GSK3326595对细胞增殖影响的结果图，A是在BEAS肺上皮细胞中，B是在HK2肾脏正常表皮细胞中，C在过表达GFP-RBD和Flag-ACE2的HEK-293T细胞中。
图5为检测ACE2野生型/突变型与Delta变体、Beta变体的Spike1蛋白结合能力的免疫共沉淀实验结果图；A是ACE2-R671K突变体与Delta变体的结合能力，B是ACE2-R671K突变体与Beta变体的结合能力，C是ACE2野生型与Delta变体的结合能力，D是ACE2野生型与Beta变体的结合能力，E是不同浓度GSK3326595下ACE2野生型与Delta变体的结合能力，F是不同浓度GSK3326595下ACE2野生型与Beta变体的结合能力。
图6是假病毒感染宿主后的感染能力检测结果图，A是对不同浓度GSK3326595（100nM，50nM，25nM）处理的HEK-293T-Flag-ACE2细胞，B是对表达ACE2野生型/突变型的HEK-293T细胞，C是过表达不同剂量的Myc-PRMT5质粒的HEK-293T细胞。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
通用实验
1、细胞培养和转染
HEK-293T、HK2和BEAS细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。所有细胞系均来自American Type Culture Collection或中国科学院细胞库。
2、质粒和SARS-CoV-2 Spike1蛋白（如表1所示）
表1. 本发明所使用的质粒和蛋白
产品 货号 厂家
Flag-ACE2-R644K 自行构建
Flag-ACE2-R671K 自行构建
Flag-ACE2-WT Cat：HG10108-NF 北京义翘神州公司
GFP-RBD Cat：VG40592-ACGLN 北京义翘神州公司
SARS-CoV-2 Spike S1-Delta mutant<sup>1</sup>His Tag Protein (His-S1-Delta) Cat：40591-V08H23 北京义翘神州公司
SARS-CoV-2 Spike S1-Beta mutant<sup>2</sup>His Tag Protein (His-S1-Beta) Cat：40591-V08H10 北京义翘神州公司
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Pseudovirus Cat：PSV001 北京义翘神州公司
注1. SARS-CoV-2 Spike S1-Delta mutant：B.1.617.2 variant：T19R，G142D，E156G，157-158 deletion，L452R，T478K，D614G，P681R
注2.SARS-CoV-2 Spike S1-Beta mutant：B.1.351 variant：K417N，E484K，N501Y，D614G
3、SARS-CoV-2 Spike假病毒感染实验
SARS-CoV-2（2019-nCoV）Spike假病毒（Cat：PSV001）购自北京义翘神州公司。
假病毒感染实验按规范进行。简单地说，将HEK-293T-Flag-ACE2细胞5×104接种于96孔板中，在37℃、5% CO2培养箱中培养12小时。首先，用含有相应浓度的试验物质（DMSO或GSK3326595）的100μl DMEM培养基预处理细胞12小时。然后每孔加入含SARS-CoV-2、刺突假病毒5μl的DMEM培养基100μl，孵育6小时。第三步，去除含病毒的DMEM培养基，用200μl新鲜DMEM培养基替换，37℃连续孵育48小时。第四，从96孔板吸出DMEM培养基。最后，每孔加入荧光素酶100检测体系（Promega，E1500）细胞裂解液20μl，吸取10μl细胞裂解液再加入荧光素酶发光液10μl，混匀后进行荧光素酶发光检测。
5、Western blot、免疫沉淀和共免疫沉淀试验
本发明所进行的Western blot、免疫沉淀（IP）和共免疫沉淀（Co-IP）按实验操作规范进行。
所使用的特异性一抗和beads如下表2所示：
表2.Western blot、免疫沉淀和共免疫沉淀所使用的的试剂
试剂 货号 厂家
GAPDH 60004-1-AP Proteintech
PRMT5 18436-1-AP Proteintech
Flag-Tag KM8002 SUNGENE BIOTECH
ACE2 92485S CST
His-Tag abs830002ss Absin
Myc-Tag GB12076 Servicebio
Anti-GFP Nanobeads KTSM1301 AlpaLife
Anti-Flag-beads P2271-2ml Beyotime，碧云天公司
6、质谱分析
LC-MS/MS分析（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis）在上海中科新生命公司。
7、统计分析
采用学生t检验确定组间差异的统计学意义。P<0.05为差异有统计学意义。数据以平均值±SEM表示。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。
实施例1、PRMT5介导ACE2发生SDMA修饰，促进ACE2-RBD结合
分别用DMSO、PRMT5抑制剂GSK3326595（100nM）、PRMT1抑制剂AMI-1（8.8μM）处理过表达Flag-ACE2和GFP-RBD的HEK-293T细胞，48小时后，通过免疫共沉淀实验（Co-IP），检测ACE2和RBD结合能力的变化。实验结果如图1A所示，只有GSK3326595能够明显抑制ACE2和RBD的结合。
在过表达Flag-ACE2的HEK-293T细胞中，Co-IP实验检测ACE2的单甲基化修饰（MMA）和对称性二甲基化修饰（SDMA）以及ACE2和PRMT5结合情况。图1B表明ACE2能够和PRMT5结合，并且ACE2会发生MMA和SDMA甲基化修饰。
在过表达Flag-ACE2的HEK-293T细胞中，分别用DMSO或者PRMT5抑制剂GSK3326595（100nM）处理48小时后，通过Co-IP实验检测ACE2的MMA和SDMA修饰以及ACE2-PRMT5结合能力的变化。图1C表明GSK3326595能够明显抑制ACE2的SDMA修饰。
在过表达Flag-ACE2和GFP-RBD的HEK-293T细胞中再过表达Myc-PRMT5，通过Co-IP实验检测ACE2的MMA和SDMA修饰的变化，以及ACE2和RBD，ACE2和PRMT5结合能力的变化。结果如图1D：过表达PRMT5能够增加ACE2和PRMT5的结合，以及增强ACE2的MMA和SDMA修饰，并且还能够增强ACE2和RBD的结合。
实施例2、ACE2甲基化位点和糖基化位点对与RBD结合的影响
LC-MS质谱检测Flag-ACE2蛋白的精氨酸甲基化修饰情况。R644和R671是质谱鉴定的精氨酸甲基化修饰位点，结果如图2A和2B所示。
构建Flag-ACE2-R644K和Flag-ACE2-R671K点突变质粒，分别在HEK-293T细胞中过表达Flag-ACE2-WT/R644K/R671K质粒，IP-Flag-ACE2检测ACE2的SDMA以及ACE2-PRMT5结合情况的变化。结果如图3A所示：只有R671位点突变后SDMA修饰明显减弱，说明R671是ACE2发生对称性二甲基化（SDMA）的主要甲基化位点。
分别在HEK-293T细胞中共转GFP-RBD和Flag-ACE2-WT/R671K质粒，分别IF-Flag或者IP-GFP检测Flag-ACE2和GFP-RBD的结合。结果如图3B，ACE2-R671K位点突变后，明显抑制ACE2-RBD结合。表明ACE2-R671的SDMA修饰对于ACE2-RBD结合起关键作用。
最近的研究报道发现：ACE2蛋白的糖基化修饰对ACE2-RBD结合起关键作用。我们最近的研究报道：精氨酸甲基化修饰经常会和磷酸化泛素化等翻译后修饰发生crosstalk。因此我们推测：是否ACE2-R671的甲基化修饰通过增强ACE2-N322的糖基化修饰从而增强了ACE2-RBD的结合。我们在HEK-293T细胞中分别依次共同过表达GFP-RBD和Flag-ACE2-WT/R671K/N322Q/（R671K+N322Q），然后通过Co-IP实验检测ACE2-RBD以及ACE2-PRMT5的结合变化情况，结果如图3C所示。发现R671K单突变和N322Q单突变导致ACE2-RBD结合的降低程度基本一样，而且（R671K+N322Q）双突变也没有进一步导致ACE2-RBD结合降低。这说明ACE2-R671的甲基化修饰和ACE2-N322的糖基化修饰来增强ACE2-RBD的结合可能是通过同一途径来介导实现的。即ACE2-R671的甲基化修饰很可能是通过增强了ACE2-N322的糖基化修饰来影响ACE2-RBD的结合。
此外，在共转GFP-RBD和Flag-ACE2-N322Q的HEK-293T细胞中，我们用GSK3326595（100nM）处理48小时后，IP-Flag-ACE2检测ACE2-RBD以及ACE2-PRMT5的结合能力变化，结果如图3D所示。发现ACE2-N322Q突变后，GSK3326595处理后，不能使ACE2-RBD结合进一步降低，这也进一步证实我们的猜想。即ACE2-R671是通过影响ACE2-N322糖基化来增强ACE2-RBD结合的。当ACE2-N322位点发生突变后（ACE2-N322Q），用GSK3326595来抑制ACE2-R671甲基化修饰，也不能进一步导致ACE2-RBD结合降低。
图3CD表明ACE2-N322糖基化修饰对于ACE2-RBD结合起关键作用，并且ACE2-R671位点甲基化修饰，是通过促进ACE2-N322位点的糖基化修饰来促进ACE2-RBD的结合。
实施例3、GSK3326595浓度对ACE2-RBD的结合以及细胞增殖的影响
分别在BEAS肺上皮细胞和HK2肾脏正常表皮细胞中，在不同浓度GSK3326595（100nM，50nM，25nM，10nM）处理下，通过CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果如图4A和4B所示，GSK3326595浓度为25nM或者更低的10nM时，对细胞增殖基本没有影响。
在过表达GFP-RBD和Flag-ACE2的HEK-293T细胞中，用不同浓度的GSK3326595（100nM，50nM，25nM，10nM）处理48小时后，IP-GFP-RBD检测ACE2-RBD结合情况。结果如图4C所示，GSK3326595浓度为25nM时，还能明显抑制ACE2-RBD的结合。
上述实验表明：GSK3326595浓度为25nM的时候，对细胞增殖基本没有太大影响，但是还能明显抑制ACE2-RBD的结合。因此我们推测：低剂量的GSK3326595（如25nM浓度）可能是一个理想的不影响细胞增殖还能够很好的抑制ACE2-RBD结合的浓度。
实施例4、GSK3326595和ACE2-R671K甲基化位点突变在SARS-CoV-2 Delta变体和Beta变体中的功能验证
分别把SARS-CoV-2 Delta变体（A）和Beta变体（B）的Spike1蛋白与Flag-ACE2-WT/R671K HEK-293T细胞的裂解液孵育，随后IP-Flag-ACE2检测S1蛋白与ACE2结合情况。
结果如图5AB所示，ACE2-R671K甲基化位点突变后，明显抑制Delta变体（印度突变株）和Beta变体（南非突变株）与ACE2的结合。
分别把SARS-CoV-2 Delta变体（C）和Beta变体（D）的Spike1蛋白与DMSO或者GSK3326595（100nM）处理过的Flag-ACE2-WTHEK-293T细胞裂解液孵育，然后IP-Flag-ACE2检测S1蛋白与ACE2结合情况。
结果如图5CD所示，GSK3326595明显抑制Delta变体（印度突变株）和Beta变体（南非突变株）与ACE2的结合。
为探索GSK3326595的起效浓度，分别把SARS-CoV-2 Delta变体（E）和Beta变体（F）的Spike1蛋白与不同浓度的GSK3326595（100nM，50nM，25nM）处理过的Flag-ACE2-WT HEK-293T细胞裂解液孵育，然后IP-Flag-ACE2检测S1蛋白与ACE2结合情况。
结果如图5EF所示GSK3326595明显抑制印度突变株和南非突变株，其抑制作用是剂量依赖的。并且在25nM低剂量的情况下，还能够明显抑制两种变体和ACE2的结合。
实施例5、SARS-CoV-2 Spike假病毒感染宿主实验
实验：先使用不同浓度的GSK3326595（100nM，50nM，25nM）处理HEK-293T-Flag-ACE2细胞，后用SARS-CoV-2 Spike假病毒感染上述细胞，通过检测的荧光强度来计算假病毒感染细胞的能力变化。
结果：如图6A所示，GSK3326595能够明显抑制新冠病毒对人体的感染，并且是剂量依赖的。在25nM低剂量处理后还能够明显的新冠病毒对人体的感染。
实验：分别用SARS-CoV-2 Spike假病毒感染HEK-293T-Flag-ACE2-WT和HEK-293T-Flag-ACE2-R671K细胞，检测假病毒感染能力的差异。
结果：如图6B所示，ACE2-R671K甲基化位点突变后，明显降低新冠病毒对人的感染能力。
实验：在HEK-293T-Flag-ACE2细胞中过表达不同剂量的Myc-PRMT5质粒，随后分别用SARS-CoV-2 Spike假病毒感染上述细胞并计算病毒感染宿主细胞的能力。
结果：如图6C所示，PRMT5催化ACE2-R671位点的甲基化修饰，对于新冠病毒感染人体有关键作用，且PRMT5转染量越大，感染能力越强。

Claims (7)

1.PRMT5抑制剂在制备治疗冠状病毒感染所引起的疾病的药物中的应用，所述PRMT5抑制剂是GSK3326595，所述冠状病毒是2019-nCoV，所述GSK3326595化学结构如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求1所述的应用，所述冠状病毒感染所引起的疾病为呼吸系统疾病。
3.如权利要求2所述的应用，所述呼吸系统疾病为单纯性感染、轻症肺炎、重症肺炎、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合症、脓毒症。
4.如权利要求3所述的应用，所述单纯性感染为发热、咳嗽、咽痛、鼻塞、乏力、头痛或肌肉疼痛。
5.如权利要求3所述的应用，所述轻症肺炎为咳嗽，呼吸困难和/或呼吸急促。
6.如权利要求3所述的应用，所述重症肺炎为呼吸频率增加，严重的呼吸衰竭或呼吸困难，中心型发绀、嗜睡、意识不清或惊厥、抽气。
7.如权利要求3所述的应用，所述急性呼吸窘迫综合症为肺水肿。
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