CN113546075A - 一种双黄芩素化合物在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双黄芩素化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于制药领域。该双黄芩素化合物的结构如式A所示。体外抗肿瘤活性实验表明，本发明化合物结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌细胞株均有很好的抑制作用；与黄芩素相比，本发明化合物对肿瘤细胞的抑制活性均明显提高。体内抗肿瘤活性实验表明，本发明化合物对H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖有明显的抑制作用；与相同剂量的黄芩素组相比，本发明双黄芩素化合物组的肿瘤增殖抑制效果更佳。本发明化合物能够用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物，其制备方法简单，成本较低，产品收率和纯度高，适合工业化大生产。

Description

一种双黄芩素化合物在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种双黄芩素化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

黄芩素(baicalin，5,6,7-三羟基黄酮)是从唇形科植物黄芩(Scutellariabaicalensis Georgi)根中分离出的黄酮类单体化合物，是黄芩的主要药效物质基础。据报道，黄芩素具有抗菌、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤、清除自由基、保护心脑血管及免疫调节作用。黄芩素具有一定的抗肿瘤活性，且抗瘤谱广，其作用机制与肿瘤发展的多个环节具有密切的关系。但是，研究发现黄芩素的抗肿瘤效果明显低于临床癌症用药，如5-FU、顺铂、阿霉素等。因此，黄芩素在临床上作为抗肿瘤药物的应用收到了限制。

开发出抗肿瘤活性更优的黄芩素衍生物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双黄芩素化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明提供了式A所示化合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途：

其中，M为0～2个亚甲基；

R₁选自氢、C_1～4烷基、C_1～4烷氧基、卤素；

R₂选自氢、C_1～4烷基、C_1～4烷氧基、卤素。

进一步地，式A所示化合物为化合物1：

进一步地，所述肿瘤为结肠癌。

进一步地，所述肿瘤为肺癌。

进一步地，所述肿瘤为乳腺癌。

进一步地，所述肿瘤为肝癌。

进一步地，所述药物是以所述化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。

进一步地，所述制剂为口服制剂或注射制剂。

进一步地，所述口服制剂为片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或口服溶液；

所述注射制剂为冻干粉针或注射液。

进一步地，所述片剂为普通压制片、咀嚼片、泡腾片、多层片、缓释片、控释片、包衣片、分散片、口含片或舌下片；

所述丸剂为滴丸、含化滴丸或微丸；

所述胶囊剂为硬胶囊剂、软胶囊剂、肠溶胶囊剂、缓释胶囊剂或微囊。

本发明还提供了制备化合物1的方法，所述方法包括以下步骤：以黄芩素和甲醛为原料，于无水乙醇中加热回流反应4～12小时，得到化合物1；

进一步地，所述反应是在酸的存在下进行的，所述酸为磷酸，所述黄芩素与磷酸的质量体积比为1：2g/mL；

或，所述反应是在碱的存在下进行的，所述碱为三乙胺，所述黄芩素与三乙胺的质量体积比为1：1g/mL。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀C_a～b烷基表示任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。例如，C_1～4烷基是指包含1～4个碳原子的直链或支链的烷基。C_1～4烷氧基是指包含1～4个碳原子的直链或支链的烷氧基。

卤素为氟、氯、溴或碘。

体外抗肿瘤活性实验表明，本发明化合物结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌细胞株均有很好的抑制作用，其IC₅₀均低于15mg/L；与黄芩素相比，本发明化合物对结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌细胞的抑制活性均明显提高。

体内抗肿瘤活性实验表明，本发明化合物对H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖有明显的抑制作用；与相同剂量的黄芩素组相比，本发明双黄芩素化合物组对H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖抑制效果更佳。

本发明化合物能够用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物，其制备方法简单，成本较低，产品收率和纯度高，适合工业化大生产。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为样品1的HPLC图。

图2为样品2的HPLC图。

图3为样品2的紫外光谱图。

图4为样品2的红外光谱图。

图5为样品2的质谱图。

图6为样品2的核磁氢谱图。

图7为样品2的核磁碳谱图。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

其中，黄芩素购于陕西绿清生物工程有限公司，含量>98％。

双黄芩素化合物含量测定方法(HPLC面积归一化法)：

色谱条件：色谱柱：Kromasil C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲腈(A)-0.02mol/L磷酸二氢钠缓冲液(B)，梯度洗脱(0min，30％A；30min，70％A)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：280nm；样品甲醇溶解，进样量10μL。

磷酸二氢钠缓冲液制备：称取3.12g NaH₂PO₄.2H₂O于1000mL容量瓶中，加水适量，超声至完全溶解，加水至刻度，摇匀，H₃PO₄调PH至3.0，摇匀即得。

实施例1：双黄芩素化合物的制备方法1(不加催化剂的方法)

步骤1.1：取黄芩素50.0g，加无水乙醇2500ml，加热溶解，再加甲醛溶液800ml，混匀，过滤，加热回流12小时(硅胶GF₂₅₄TLC跟踪反应，展开系统为氯仿-甲醇-甲酸10:2:0.1)。放置过夜，析出淡黄色沉淀，过滤，用100ml无水乙醇洗涤沉淀，60℃减压干燥，即得双黄芩素化合物。为淡黄色干燥疏松粉末，得量46.2g，得率为90％，样品HPLC面积归一化法含量为96.54％。

步骤1.2：取步骤1.1制备的双黄芩素化合物40.0g(含量96.54％)，加100ml无水乙醇于三角瓶中，超声处理30分钟，过滤；再同法处理2次，过滤，60℃减压干燥，即得双黄芩素化合物样品1，得量35.6g，得率89％，样品HPLC面积归一化法含量为98.12％。样品1的HPLC图谱见图1。

实施例2：双黄芩素化合物的制备方法2(加酸做催化剂的方法)

步骤2.1：取黄芩素50.0g，加无水乙醇2500ml，加热溶解，再加甲醛溶液800ml，再加磷酸100ml，混匀，过滤，加热回流6小时(硅胶GF₂₅₄TLC跟踪反应，展开系统为氯仿-甲醇-甲酸10:2:0.1)。放置过夜，析出淡黄色沉淀，过滤，用100ml无水乙醇洗涤沉淀，60℃减压干燥，即得双黄芩素化合物。为淡黄色干燥疏松粉末，得量46.1g，得率为90％，样品HPLC面积归一化法含量为96.43％。

步骤2.2：取步骤2.1制备的双黄芩素化合物40.0g(含量96.43％)，加200ml无水乙醇加热回流2小时，放置过夜，过滤，再用50ml无水乙醇洗涤，60℃减压干燥，即得双黄芩素化合物样品2，得量37.1g，得率92.75％，样品HPLC面积归一化法含量为98.94％。样品2的HPLC图谱见图2。

双黄芩素化合物的结构鉴定：

以实施例2步骤2.2所得双黄芩素化合物(即样品2，含量98.94％)为测试样品，分别进行UV、IR、MS，¹H NMR、¹C NMR测试，结果如下：

UVλ_maxnm:280nm；ESI-MS m/z553.11224[M+H]⁺(理论值552.48)，UV、IR、MS，¹H NMR、¹C NMR分别见图3～7，经鉴定该双黄芩素化合物为8,8″-亚甲基-双黄芩素，结构式如下：

实施例3：双黄芩素化合物的制备方法3(加碱做催化剂的方法)

取黄芩素50.0g，加无水乙醇2500ml，加热溶解，再加甲醛溶液800ml，再加三乙醇胺50ml，另加亚硫酸氢钠5.0g做抗氧剂，混匀，溶解，过滤，加热回流4小时(硅胶GF₂₅₄TLC跟踪反应，展开系统为氯仿-甲醇-甲酸10:2:0.1)。放置过夜，析出淡黄色沉淀，过滤，用100ml无水乙醇洗涤沉淀，60℃减压干燥，即得。为淡黄色干燥疏松粉末，得量43.1g，得率为84％，样品HPLC面积归一化法含量为95.16％。

实施例4：本发明双黄芩素化合物药物制剂的制备

本发明双黄芩素化合物加上药学上可接受的载体可以制成不同的药物制剂，如注射剂、冻干粉针、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服溶液等，其中片剂包括：普通压制片、咀嚼片、泡腾片、多层片、缓释片、控释片、包衣片、分散片、口含片、舌下片等；丸剂包括滴丸、含化滴丸、微丸等。胶囊剂包括：硬胶囊剂、软胶囊剂、肠溶胶囊剂、缓释胶囊剂、微囊等。

注射剂的制备：采用常规注射剂的制备工艺制成，辅料可为聚乙二醇400、抗氧剂(亚硫酸氢钠)等。每支2mL，含100mg本发明双黄芩素化合物。

散剂的制备：将本发明的双黄芩素化合物加入适量辅料硬脂酸镁增加其流动性，分装，即得。

颗粒剂的制备：将本发明的双黄芩素化合物与辅料粉碎后进行充分的混合，然后加入适当的粘合剂、润湿剂等进行制粒，干燥，整粒，分装，即得。

胶囊剂的制备：胶囊剂分为软胶囊和硬胶囊，硬胶囊是将药物的粉末或者是颗粒进行装胶囊制得，软胶囊是把药液密封于球形或软质胶囊材料中。按干增塑剂(增塑剂为甘油、山梨醇或两者的混合物)：干明胶：水＝0.4～0.6：1.0：1.0，混合均匀，调配好作为软胶囊的囊壁，药物溶于聚乙二醇400、聚乙二醇6000按适当比例制成的溶媒中，然后采用滴制法或压制法制备本发明抗肿瘤药物软胶囊。同时，可以制成肠溶胶囊。此外，按照常规缓释胶囊的制备方法，选用不同的辅料如：乙基纤维素(EC)，醋酸纤维素(CA)，聚丙烯酸树脂等，作为缓控释成膜材料，制成缓、释控释的制剂骨架。将本发明双黄芩素化合物制成微囊，然后装入普通空胶囊中，即制成缓释/控释胶囊。

滴丸或微丸的制备：取药物基质，如：聚乙二醇类、硬脂酸等加热后，将药液与基质混合均匀，置于滴丸机中保温，然后滴制到适当的冷凝剂中盛碗，洗除冷凝剂干燥整理，质检、包装，即得。

片剂的制备：包括普通压制片、咀嚼片、泡腾片、多层片、缓释片、控释片，包衣片(糖衣片、薄膜衣片、肠溶衣片)、分散片、口含片、舌下片等。将本发明的药物与辅料粉碎后进行充分的混合，然后加入适当的粘合剂、润湿剂等进行制粒，压片，即得普通压制片。将本发明的药物与分散片用辅料混匀后制粒，压片，即得分散片。将制得的素片包衣，根据需要可包糖衣、薄膜衣、肠溶衣等，制得包衣片。用常规方法还可制得咀嚼片、泡腾片、多层片、口含片、舌下片等。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1：化合物的体外抗肿瘤活性测试

1试验材料

1.1细胞株

HCT116、A549肿瘤细胞株购自中科院细胞保存库。以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)培养于37℃、5％CO₂、饱和湿度细胞培养箱内。每隔2-3d，以0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化传代。

MCF-7、HepG2肿瘤细胞株购自中科院细胞保存库。以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，重组人胰岛素0.4U/ml)培养于37℃、5％CO₂、饱和湿度细胞培养箱内。每隔4-5d，以0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化传代。

1.2样品

实施例2步骤2.2所得双黄芩素化合物(即样品2，含量98.94％)。以DMSO溶解配制成100mg/ml溶液/混悬液，-20℃保藏备用。

以市售黄芩素和5-FU为对照。

1.3试剂

胎牛血清购自Bovogen公司，RPMI-1640培养基、MTT、胰蛋白酶、EDTA、DMSO购自Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯。

2试验方法

分别取对数生长期的肿瘤细胞开展试验，HCT-116、A549、MCF-7、HepG2细胞按6×10³个细胞加入96孔板，每孔180μl，培养过夜。在96孔板中分别加入设计浓度的各样品，培养72h。培养结束前4h，吸去培养液，加入Earle’s BSS 100μl。加入MTT溶液(5mg/ml)10μl，孵育4h后，每孔加入10％SDS溶液(0.01M HCl配制)100μl，置细胞培养箱中孵育过夜，采用酶标仪570nm处测定OD值。计算各样品浓度的抑制率，采用Curve Expert计算半抑制浓度(IC₅₀)值。试验结果见表1。

3试验结果

表1化合物对多种人癌细胞的体外抗肿瘤活性

从上表可以看出，本发明双黄芩素化合物对4种癌细胞，即结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌细胞株均有很好的抑制作用，其IC₅₀均低于15mg/L；与黄芩素相比，本发明双黄芩素化合物对结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌细胞的抑制活性明显提高。

实验例2：化合物的体内抗肿瘤活性测试

1试验材料

1.1实验动物

KM小鼠，18-22g，雌雄各半，70只，购于四川省中医药科学院实验动物中心，饲养于四川省中医药科学院实验动物中心SPF屏障内。

1.2细胞株

H22肿瘤细胞株购自中科院细胞保存库。以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)培养于37℃、5％CO₂、饱和湿度细胞培养箱内。每隔2-3d，以0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化传代。

实验前，取5×10⁶个细胞接种于KM小鼠腹腔内，约7d形成腹水。每周前一代小鼠取腹水0.5ml与生理盐水0.5ml混合，接种于下一代小鼠腹腔内，保存转种。

1.3样品

实施例2步骤2.2所得双黄芩素化合物(即样品2，含量98.94％)。每日临用前，以5％DMSO、15％吐温-80、80％生理盐水配制为5mg/ml和2.5mg/ml溶液。

以市售黄芩素为对照。

1.4试剂

胎牛血清购自Bovogen公司，RPMI-1640培养基、MTT、胰蛋白酶、EDTA、DMSO购自Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯。

2试验方法

取转种7d后的H22腹水细胞，以生理盐水稀释至1×10⁷个细胞/ml，接种于小鼠右侧腋下皮下，每只0.2ml。24h后，小鼠随机分为5组，每组10只。对照组，每日腹腔注射溶剂(5％DMSO、15％吐温-80、80％生理盐水)，注射体积0.1ml/10g。分别设置双黄芩素化合物和黄芩素样品的高、低剂量组，高剂量组剂量为50mg/kg，低剂量组剂量为25mg/kg。各给药组每日腹腔注射相应药物溶液，注射体积0.1ml/10g。每日给药一次，连续给药9d。末次给药1h后，小鼠脱颈处死，解剖肿瘤组织并称重。实验数据采用平均数±标准差表示，采用单因素方差分析试验差异，组间差异比较采用LSD法。试验结果见表2。

3试验结果

表2样品对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的作用

注：与对照组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01

试验结果表明，与对照组相比，本发明双黄芩素化合物高剂量组的瘤重具有显著性差异(p<0.05)，证实本发明双黄芩素化合物对H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖有明显的抑制作用。此外，与相同剂量的黄芩素组相比，本发明双黄芩素化合物组对H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖抑制效果更佳。

Claims (10)

1.式A所示化合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途：

其中，M为0～2个亚甲基；

R₁选自氢、C_1～4烷基、C_1～4烷氧基、卤素；

R₂选自氢、C_1～4烷基、C_1～4烷氧基、卤素。

2.根据权利要求1所示的用途，其特征在于：式A所示化合物为化合物1：

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为肺癌。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为乳腺癌。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为肝癌。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物是以所述化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述制剂为口服制剂或注射制剂。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述口服制剂为片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或口服溶液；

所述注射制剂为冻干粉针或注射液；

优选地，所述片剂为普通压制片、咀嚼片、泡腾片、多层片、缓释片、控释片、包衣片、分散片、口含片或舌下片；

所述丸剂为滴丸、含化滴丸或微丸；

所述胶囊剂为硬胶囊剂、软胶囊剂、肠溶胶囊剂、缓释胶囊剂或微囊。

10.制备化合物1的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：以黄芩素和甲醛为原料，于无水乙醇中加热回流反应4～12小时，得到化合物1；

优选地，所述反应是在酸的存在下进行的，所述酸为磷酸，所述黄芩素与磷酸的质量体积比为1：2g/mL；

或，所述反应是在碱的存在下进行的，所述碱为三乙胺，所述黄芩素与三乙胺的质量体积比为1：1g/mL。

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