CN113544117A - 大麻二酚衍生物的调配物和其作为2型大麻素受体（cb２）的调节剂的用途 - Google Patents

Abstract

描述了显示增加的生物利用度和溶解度的在药物调配物中包括式(I)大麻二酚衍生物的组合物。式(I)大麻二酚衍生物和包括其的组合物用于治疗各种病状和疾病，包含与脱髓鞘相关的疾病。

Description

大麻二酚衍生物的调配物和其作为2型大麻素受体(CB2)的调 节剂的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年2月6日提交的美国临时申请第62/801,756号和于2019年7月3日提交的美国临时申请第62/870,546号的优先权，所述美国临时申请在此通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明涉及组合物，所述组合物包括溶解于药物媒剂中的作为液体调配物或片剂、粉末、悬浮液、纳米悬浮液、乳剂的式(I)大麻二酚衍生物，其显示增加的生物利用度和溶解度。本发明还涉及式(I)这些大麻二酚醌衍生物用于治疗受益于2型大麻素受体(CB₂)活性调节的疾病的用途。此类化合物通过靶向减轻神经炎症并有利于神经保护、防止轴突损伤、保护并潜在地促进髓鞘结构并且支持血管生成的互补信号传导途径具有新型的作用机制(MOA)，其可用于治疗若干种自身免疫性和炎症相关病症，包含多发性硬化症(MS)和系统性硬化症(SSc)。

背景技术

多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)慢性自身免疫性脱髓鞘疾病，其代表年轻人中最常见的获得性神经系统疾病之一。疾病进展被认为由两个潜在过程组成：无法髓鞘再生的髓鞘破坏(脱髓鞘)以及几乎没有恢复能力的进行性轴突损伤。与MS相关的各种神经系统症状是由于细胞传导神经信号的能力减弱所致。MS可以随着时间推移逐渐导致残疾，包含行动不便和上肢功能困难、膀胱、肠道和性功能障碍、言语和吞咽困难以及视力和认知问题。目前，对于MS没有治愈性治疗，并且护理标准主要致力于减轻症状。由于加剧的先天性和适应性免疫应答有助于疾病的病理生理学，因此需要针对免疫应答的调节和旨在刺激轴突髓鞘再生的疗法。

系统性硬化症(SSc)或硬皮病是一组与早期和暂时性炎症和血管损伤，随后是影响皮肤和多个内脏器官的纤维化相关的罕见疾病。系统性硬化症分为两种形式：局部硬皮病(LoS)和SSc。虽然LoS局限于皮肤和/或下面的组织，并且通常是良性的，但SSc是严重的病状，其特征在于微血管损伤和SSc相关的过度纤维化，通常包含内脏器官受累。SSc可能会影响重要器官(心脏、肾脏和肺)、其它内脏器官(胃和肠)以及血管、肌肉和关节。因此，SSc可以导致慢性衰弱和预期寿命缩短。目前，无法治愈SSc。目前的疗法在临床上无效，并且可用的治疗选择是针对特定器官和症状的。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和2型大麻素受体(CB₂)是临床前验证的治疗靶标，得到科学文献的支持，用于开发治疗MS的新型药物(Docagne F.等人2008,《关于治疗靶标的专家意见(Expert Opin.Ther.Targets.)》,12:185-195；Drew P.D.等人2008,《PPAR研究(PPAR Res.)》,2008:627463；Szalardy L等人2013,《神经科学通讯快报(Neurosci Lett.)》,554:131-134)。另外，缺氧诱导因子(HIF)途径的活化剂可以对MS患者具有益作用，因为HIF途径调节有利于神经保护和轴突再生的免疫应答，并且负责产后髓鞘形成(Navarrete C等人2018,《神经炎症杂志(J Neuroinflammation)》,15:64)。存在活化这些途径中的一种或另一种途径的各类市售药物，包含活化PPARγ的格列酮(Glitazone)和活化CB₂的大麻素。

CB₂受体首先从分化的人HL-60骨髓细胞中克隆，并且在脾脏和如B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等免疫系统细胞中表达最高。在表皮(包含角质形成细胞、毛囊、皮脂细胞和汗腺)、成骨细胞、破骨细胞和骨细胞以及胃、肺、心脏和睾丸中也发现了较低水平的CB₂受体。已经在背根神经节(DRG)中报告了CB₂受体表达，并且如C和Aδ纤维等其它外周神经元中CB₂受体表达的证据已被报告。最近已经描述了在脊髓和脊髓上水平下的CNS内的CB₂受体表达。具体地，CB₂受体发现于腰椎(L3-L4)脊髓和小脑颗粒神经元、脑血管上皮、小胶质细胞和脑干神经元(纹状体、丘脑核、海马体、杏仁核、黑质、导水管周围灰质、三叉神经脊束核等)、皮层和小脑。

CB₂受体与许多生理过程有关，包含炎症和疼痛感知、免疫系统调节、神经发生和骨生理学。CB₂受体的上调与某些病理生理状态相关。已在脊髓背角以及慢性缩窄性损伤(CCI)、脊神经结扎(SNL)、坐骨神经完全切片和神经性疼痛的隐神经部分结扎模型中检测到CB₂受体表达增加。CB₂受体在阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)脑(Benito等人2003,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,23:11136-11141)中发现的神经炎性斑块的小胶质细胞和星形胶质细胞中，或通过干扰素γ(Carlisle等人2002,《国际免疫药理学(Int.Immunopharmacol.)》,2:69-82)或脂多糖(Cabral等人2005,《白细胞生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)》,78:192-197)以及在猴免疫缺陷病毒感染的猕猴(Benito等人2005,《神经科学杂志》,25:2530-2536)的T淋巴细胞中上调。在多发性硬化症斑块中的T淋巴细胞、星形胶质细胞和血管周围和反应性小胶质细胞中发现了CB₂受体(Benito等人2007,《神经科学杂志》,27:2396-2402)。

覆盖着许多神经纤维的髓鞘由生命早期形成的脂蛋白层组成。中枢神经系统(CNS)中少突胶质细胞形成的髓鞘与外周雪旺细胞(Schwann cell)形成的髓鞘在化学和免疫学上不同，但这两种类型具有相同的功能：促进神经冲动沿轴突的传递。许多先天性代谢病症(例如，苯丙酮尿症和其它氨基酸尿症；泰-萨二氏病(Tay-Sachs)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick)和戈谢病(Gaucher's disease)；赫尔勒氏综合症(Hurler's syndrome)；克拉伯氏病(Krabbe's disease)和其它脑白质营养不良)影响主要位于CNS的发育中的髓鞘。除非生化缺陷可以得到纠正或补偿，否则会导致永久性的、通常广泛存在的神经功能缺损。

晚年脱髓鞘是许多神经系统病症的特征；脱髓鞘可能是由于局部损伤、缺血、毒剂或代谢紊乱引起的神经或髓鞘损伤所致。广泛的髓鞘损失通常伴随着轴索变性并且通常伴随着细胞体变性，这两者都可能是不可逆的。然而，髓鞘再生在许多情况下都会发生，并且神经功能的修复、再生和完全恢复可以很快。恢复通常发生在节段性脱髓鞘之后，节段性脱髓鞘是许多周围神经病的特征；此过程可以解释MS的恶化和缓解。(即，脊髓、脑或视神经的)中枢脱髓鞘是病因不明的原发性脱髓鞘疾病的主要表现。最众所周知的是MS。其它疾病包含，例如，急性播散性脑脊髓炎(感染后脑脊髓炎)、肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、莱伯氏遗传性视神经萎缩(Leber's hereditary optic atrophy)以及相关线粒体病症和人T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV)感染相关脊髓病。

髓鞘再生通常被认为是MS病变的常规事件；然而，髓鞘再生不足以修复髓鞘，并且MS患者的轴突仍然脱髓鞘。对此的可能解释包含少突胶质祖细胞(OPC)的募集或存活失败、OPC的分化/成熟障碍以及髓鞘形成能力的丧失。因此，有效的MS干预措施不仅应防止疾病进展，还应促进髓鞘再生。

本领域需要缓解疾病的药物以及其调配物，其具有增加的生物利用度和溶解度以实现更有效的药物递送。本领域还需要疾病缓解的药物以及其调配物，其具有新型的作用机制(MOA)，所述作用机制靶向减轻神经炎症并有利于神经保护和髓鞘再生的互补信号传导途径，用于管理和治疗各种自身免疫性疾病、脱髓鞘疾病、炎症相关病症和如MS和SSc等中枢神经系统(CNS)疾病。

发明内容

本发明提供了包括至少一种溶解于药物媒剂中的大麻二酚衍生物的组合物。一方面，所述组合物具有增加的生物利用度。另一方面，所述组合物具有增加的溶解度。

一方面，本发明所公开的大麻二酚衍生物是式(I)化合物。

在一个实施例中，R是独立地选自以下的基团的氮原子：直链或支链烷基胺、芳基胺、芳基烷基胺、杂芳基胺、杂芳基烷基胺、直链或支链烯基胺、直链或支链炔基胺或NH₂。

在一个实施例中，所述组合物是干粉调配物。在一个实施例中，所述组合物是片剂。在一个实施例中，所述组合物是悬浮液。在一个实施例中，所述组合物是纳米悬浮液。在一个实施例中，所述组合物是乳剂。在一个实施例中，所述组合物是溶液。

在一个实施例中，所述药物媒剂选自由以下组成的组：水性缓冲液、溶剂、共溶剂、环糊精复合物、脂质媒剂以及其任何组合，并且任选地进一步包括至少一种稳定剂、乳化剂、聚合物、抗氧化剂以及其任何组合。

一方面，包括至少一种本发明的大麻二酚衍生物的组合物溶解于油中。在一些实施例中，包括至少一种本发明的大麻二酚衍生物的组合物溶解于包括至少两种油的油混合物中。在一些实施例中，包括至少一种本发明的大麻二酚衍生物的组合物溶解于MaisineCC:栗米油混合物。

本发明还部分地涉及治疗在有需要的受试者的与脱髓鞘相关的病状或疾病的方法。本发明进一步提供了治疗响应于对受试者的CB₂活性的调节的病状或疾病的方法。在一个实施例中，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种大麻二酚衍生物或其调配物。

在一些方面，本发明涉及包括非反应性合成大麻二酚衍生物的组合物通过靶向缓解神经炎症和有利于神经保护、防止轴突损伤、保护髓鞘结构并潜在地促进髓鞘再生的互补信号传导途径而具有新型作用机制(MOA)。所述组合物包括调节CB₂受体信号传导的非反应性合成大麻二酚衍生物。在一些实例中，所述组合物包括调节PPARγ和CB₂受体信号传导的非反应性合成大麻二酚衍生物。在一些实施例中，所述组合物包括非反应性合成大麻二酚衍生物，其调节PPARγ和CB₂受体信号传导，并且使HIF-1α稳定，从而上调包含促红细胞生成素(EPO)和血管内皮生长因子A(VEGFA)的若干种相关因子的表达。因此，此类组合物在SSc中可以具有作为疾病调节剂的强大潜力。

本发明进一步部分地涉及在有需要的受试者中进行髓鞘再生的方法。在本发明的一方面，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，受试者患有与脱髓鞘相关的病状或疾病。在一个实施例中，受试者患有响应于对CB₂活性的调节的病状或疾病。在一个实施例中，受试者患有与脱髓鞘相关的病状或疾病或响应于对CB₂活性的调节的病状或疾病。

一方面，响应于对CB₂受体活性的调节的病状或疾病或与脱髓鞘相关的病状或疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、脱髓鞘疾病、炎症相关病症以及其任何组合。在一个实施例中，响应于对CB₂受体活性的调节的病状或疾病或与脱髓鞘相关的病状或疾病选自由以下组成的组：SSc、髓鞘破坏性病症、痛觉缺失、急性和慢性疼痛、炎性疼痛、术后疼痛、神经性疼痛、肌肉松弛、免疫抑制、过敏、青光眼、支气管扩张、骨质疏松症和骨骼系统病症、癌症、包含但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)和亨廷顿氏病(Huntington's disease)的神经退行性病症、MS、肌肉痉挛、震颤、纤维肌痛、狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力、其它自身免疫性疾病、肠道易激综合症、间质性膀胱炎、偏头痛、瘙痒、湿疹、皮脂溢、银屑病、带状疱疹、脑缺血、脑溢血、颅脑创伤、中风、脊髓损伤、肝硬化、动脉粥样硬化、咳嗽、哮喘、恶心、呕吐、胃溃疡、视神经脊髓炎、中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓病、脑白质病、脑白质营养不良、周围神经病、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、抗MAG周围神经病、夏柯-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、进行性炎性神经病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)以及其任何组合。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解对以下本发明的各个实施例的详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了说明性实施例。然而，应当理解，本发明不限于在附图中示出的实施例的精确布置以及手段。

图1包括图1A和图1B，描绘了用于生成大麻二酚衍生物的合成方案。图1A表示由CBD起始材料产生的氨基功能化大麻二酚衍生物产品的整体合成。图1B描绘了通过VCE-004的胺化生成VCE-004.8(式(VIII)化合物)。

图2描绘了用于生成大麻二酚衍生物的修订合成程序。

图3包括图3A和图3B，描绘了各种液体调配物混合物的优化研究。图3A描绘了不同的液体调配物混合物。图3B描绘了包括50:50v/v栗米油和Maisine CC混合物的液体调配物。

图4描绘了不同液体调配物的生物利用度。

图5包括图5A和5B，描绘了EHP-101液体和安慰剂的制造流程图。图5A描绘了EHP-101液体的制造流程图。图5B描绘了安慰剂的制造流程图。

图6描述了VCE-004.8的动力学溶解度筛选。

图7描绘了用于计算用作亲脂性度量的log D(分布系数)的等式。

图8描绘了VCE-004.8在磷脂复合化期间，在不同时间(45分钟、6小时和24小时)在乙酸乙酯中回流下的稳定性。

图9描绘了VCE-004.8对在pH 7.4的溶解度试验中获得的两种磷脂复合物的HPLC曲线的叠加。

图10描绘了使用Alitra的VCE-004.8的调配物A、B和C的溶出曲线。

图11描绘了模拟胃液中各种口服调配物的溶剂位移结果。

图12描绘了模拟肠液中各种口服调配物的溶剂位移结果。

图13描绘了无定形固体分散体筛选和稳定性结果的图形表示。

图14描述了VCE-004.8和EHP-101的特性。

图15包括图15A到图15H，描绘了表明EHP-101减弱EAE模型的临床严重程度和神经病理学的示例性结果。图15A描绘了EHP-101显著改善了EAE的临床体征和进展。结果表示为平均值±SEM(n＝每组6只动物)。**p<0.01，***p<0.001EAE+EHP-101对EAE+VEH(单向方差分析，然后是图基检验(Tukey's test))。图15B描绘了通过测量曲线下面积量化的临床活性结果。结果表示为±SEM(n＝每组6到11只动物)。**p<0.01，***p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂(单向方差分析，然后是图基检验)。图15C描绘了50μm厚的胸脊髓横截面的横截面图像，其中进行了具有抗Iba1的免疫荧光。图15D描绘了50μm厚的胸脊髓横截面的横截面图像，其中进行了具有GFAP的免疫荧光。图15E描绘了50μm厚的胸脊髓横截面的横截面图像，其中进行了具有髓鞘染色MBP的免疫荧光。图15F描绘了示出为平均值±SEM的Iba1标志物的量化结果，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性***p<0.001EAE+媒剂对CFA；##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。图15G描绘了示出为平均值±SEM的GFAP标志物的量化结果，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性***p<0.001EAE+媒剂对CFA；##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。图15H描绘了示出为平均值±SEM的MBP标志物的量化结果，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性***p<0.001EAE+媒剂对CFA；##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。

图16包括图16A到图16H，描绘了表明EHP-101处理阻止了伴随小胶质细胞持续活化和Olig2表达丧失的脱髓鞘的示例性结果。每种标志物的量化示出为平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性*p<0.05，***p<0.001EAE+媒剂对CFA；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。图16A描绘了针对Iba1免疫标记的大脑胼胝体的代表性共聚焦显微镜图像。图16B描绘了大脑皮层的代表性共聚焦显微镜图像，其示出通过EHP-101处理恢复了降低的MBP反应性。图16C描绘了代表性共聚焦显微镜图像，其示出在经EHP-101处理的小鼠中防止了Olig2阳性细胞的损失。图16D描绘了代表性共聚焦显微镜图像，其示出EHP-101处理增加了胼胝体中GSTpi的表达。图16E描绘了Iba1的量化，所述量化示出为平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性。*p<0.05，***p<0.001EAE+媒剂对CFA；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。图16F描绘了MBP的量化，所述量化示出为平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性。*p<0.05，***p<0.001EAE+媒剂对CFA；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。图16G描绘了Olig2的量化，所述量化示出为平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性。*p<0.05，***p<0.001EAE+媒剂对CFA；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。图16H描绘了GSTpi的量化，所述量化示出为平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性。*p<0.05，***p<0.001EAE+媒剂对CFA；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。

图17包括图17A到图17E，描绘了EHP-101在EAE模型中的作用的基因表达谱的示例性结果。图17A描绘了EAE或EAE+EHP-101对对照比较的MA图(MA图是布兰德-奥特曼图(Bland-Altman plot)的应用，用于基因组数据的可视化表示)。X轴表示作为归一化计数平均值的平均表达，而Y轴指示随着log2转换变化倍数的变化幅度。颜色指示超过调整后P<0.05和变化倍数<-2(蓝色)或>2(红色)的截止值的基因。图17B描述了在EAE对对照和EAE+EHP-101(20mg/kg)对EAE比较中超过先前提及的截止值的基因的功能分析结果。点的存在指示基因本体论(生物过程)术语(Y轴)在一组上调或下调基因(X轴)中显著过度呈现(调整后P<0.05)。图17C描绘了热图，所述热图描绘了“细胞因子介导的信号传导途径”中包含的所选基因的表达水平。图17D描绘了热图，所述热图示出了CFA、EAE+媒剂和EAE+EHP-101(20mg/kg)中细胞因子的蛋白质组谱。图17E描绘了通过qPCR量化并相对于GAPDH归一化的脊髓中炎性标志物的mRNA表达。数据表示平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性*p<0.05，**<0.01，***p<0.001EAE+媒剂对CFA；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。

图18包括图18A到图18E，描绘了表明EHP-101处理使与少突胶质细胞功能相关的基因表达归一化的示例性结果。图18A描绘了指示EAE对对照比较中下调基因组与EAE+EHP-101(20mg/kg)对EAE比较中上调基因组之间的重叠的维恩图(Venn Diagram)。图18B描绘了193个重叠基因组的功能分析结果。散点图表示作为-log10转换调整后P值的前15个过度呈现的基因本体论(生物过程)术语的富集显著性。图18C描绘了热图，所述热图描绘了用包含在193个重叠特征集中的“髓鞘形成”GO术语注释的基因的表达水平。图18D描绘了通过qPCR量化并相对于GAPDH归一化的髓鞘形成相关基因的mRNA表达。图18E描绘了Teneurin-4的脊髓免疫组织化学标记结果。Teneurin-4在白/灰质中表达的量化(下图)。数据表示平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性**<0.01，***p<0.001EAE+媒剂对CFA；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001EAE+EHP-101对EAE+媒剂。

图19包括图19A到图19E，描绘了治疗性EHP-101处理对铜宗(Cuprizone)(CPZ)诱导的脱髓鞘模型中的髓鞘再生的作用。图19A描绘了用于评价治疗性EHP-101处理对CPZ诱导的脱髓鞘模型中的髓鞘再生的作用的实验程序。图19B描绘了通过胼胝体中的冷冻髓鞘染色对髓鞘进行的组织学研究的结果。图19C描绘了表明髓鞘染色显著恢复的结果，这通过皮层中MBP的免疫荧光研究示出。图19D描绘了通过胼胝体中的冷冻髓鞘染色对髓鞘进行的平均强度量化结果(n＝每组5只动物)。图19E描绘了表明髓鞘染色显著恢复的MBP免疫反应性的量化，这通过皮层中MBP的免疫荧光研究示出。数据表示平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性***p<0.001CPZ 6W或CPZ 6W+1或CPZ6W+2对对照；###p<0.001CPZ 6W+1+EHP-101对CPZ 6W+1；$$$p<0.001CPZ 6W+2+EHP-101对CPZ 6W+2。

图20包括图20A到图20D，描绘了治疗性EHP-101处理对CPZ诱导的脱髓鞘模型中的小胶质细胞和星形胶质细胞活化的影响。图20A描绘了通过胼胝体中Iba1的免疫荧光研究检测到的铜宗诱导的小胶质细胞增生的减少。图20B描绘了通过胼胝体中GFAP的免疫荧光研究确定的星形胶质细胞增生。图20C描绘了通过胼胝体中Iba1的免疫荧光研究检测到的铜宗诱导的小胶质细胞增生的量化减少。图20D描绘了通过胼胝体中GFAP的免疫荧光研究确定的星形胶质细胞增生的量化强度。数据表示平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性***p<0.001CPZ 6W或CPZ 6W+1或CPZ 6W+2对对照；**p<0.01CPZ6W+2对对照；##p<0.01CPZ 6W+1+EHP-101对CPZ 6W+1。

图21描绘了用于实时PCR分析的代表性引物。

图22包括图22A和图22B，描绘了表明EHP-101降低神经丝轻链多肽(NEFL)的轴突变性和血浆水平的代表性结果。图22A描绘了不同动物组胼胝体中SMI-32+细胞的免疫染色的代表性图像。图22B描绘了在不同动物组中通过ELISA检测的NEFL血浆水平。值相对于对照组归一化，并且对应于平均值±SEM，并且通过单向方差分析，然后是图基检验确定显著性。*p<0.05CPZ 6W或CPZ 6W+1对对照；#p<0.05CPZ 6W+1+EHP-101对CPZ 6W+1。

图23描绘了用于评价治疗性口服EHP-101处理对CPZ诱导的脱髓鞘模型中的髓鞘再生的作用的实验程序。

图24包括图24A到图24D，描绘了灰质(海马体)髓鞘再生结果。图24A描绘了海马体中的PLP染色。图24B描绘了海马体中PLP的量化结果。与媒剂对照相比，经EHP-101处理的动物示出在海马体中的PLP染色区域中没有变化。图24C描绘了海马体中PLP的量化结果。使用肖维勒标准(Chauvenet's criterion)鉴定异常值。没有从统计分析中排除异常值。图24D描绘了PLP染色的海马体统计数据。

图25包括图25A到图25D，描绘了灰质(皮层)髓鞘再生结果。图25A描绘了皮层中的PLP染色。图25B描绘了皮层中PLP的量化结果。与媒剂对照相比，在所有剂量强度下经EHP-101处理的动物示出在皮层中的PLP染色区域中没有变化。图25C描绘了皮层中PLP的量化。使用肖维勒标准鉴定异常值。没有从统计分析中排除异常值。图25D描绘了PLP染色的统计数据。

图26包括图26A到图26D，描绘了白质(胼胝体)髓鞘再生结果。图26A描绘了胼胝体中的PPD染色。图26B描绘了胼胝体中PPD的量化结果(没有年龄匹配(AM)样品)；胼胝体中的有髓鞘轴突。尽管与对照相比，EHP-101处理未示出有髓鞘轴突显著增加，但与测试物品的最低测试组相比时，两个较高组之间存在显著差异。图26C描绘了胼胝体中PPD的量化。使用肖维勒标准鉴定异常值。没有从统计分析中排除样品44。图26D描绘了胼胝体统计数据中的有髓鞘轴突的数量(没有AM样品)。

图27包括图27A和图27B，描绘了白质(胼胝体)髓鞘再生结果(有AM样品)。图27A描绘了胼胝体中PPD的量化结果；胼胝体中的有髓鞘轴突(有AM样品)。尽管与对照相比，EHP-101处理未示出有髓鞘轴突显著增加，但与测试物品的最低测试组相比时，两个较高组之间存在显著差异。图27B描绘了胼胝体统计数据中的有髓鞘轴突的数量(有AM样品)。

图28包括图28A和图28B，描绘了白质(胼胝体)髓鞘再生结果(没有AM样品)。图28A描绘了胼胝体(没有AM样品)中的有髓鞘轴突的密度(PPD密度)。EHP-101处理的测试的较高剂量示出有髓鞘轴突的密度显著增加，但与测试物品的最低测试组相比时，两个较高组之间也存在显著差异。图28B描绘了胼胝体中的有髓鞘轴突的密度的统计数据(没有AM样品)。

图29包括图29A和29B，描绘了白质(胼胝体)髓鞘再生结果(有AM样品)。图29A描绘了胼胝体(有AM样品)中的有髓鞘轴突的密度(PPD密度)。EHP-101处理的测试的较高剂量示出有髓鞘轴突的密度显著增加，但与测试物品的最低测试组相比时，两个较高组之间也存在显著差异。图29B描绘了胼胝体中的有髓鞘轴突的密度的统计数据(有AM样品)。

具体实施方式

应当理解，本发明的附图和描述已被简化以说明与清楚理解本发明相关的要素，同时为了清楚的目的，消除在使用式(I)化合物治疗响应于对CB₂活性的调节的病状或疾病或与脱髓鞘相关的病状或疾病的方法以及制备和使用此类化合物、药物组合物和其液体调配物的方法中发现的许多其它要素。本领域普通技术人员可以认识到，其它元件和/或步骤是实施本发明所期望的和/或要求的。然而，因为此类元件和步骤是本领域中众所周知的，并且因为此类元件不利于更好地理解本发明，所以本文未提供对此类元件和步骤的讨论。本文中的本公开涉及本领域技术人员已知的对此类元件和方法的所有此类变型和修改。

定义

如本文所使用的，以下术语中的每个术语在此部分中具有与其相关联的含义。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但描述优选的方法和材料。

在本文中使用的冠词“一个和一种(a/an)”指代所述冠词的语法宾语的一个或多于一个(即至少一个)。举例来说，“要素”意指一个要素或多于一个要素。

术语“约”将被本领域普通技术人员理解并且将根据使用其的上下文在一定程度上有所不同。当提及如量、持续时间等可测量的值时，如本文所使用的术语“约”意指涵盖与指定值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，以及还更优选±0.1％的偏差，因为此类偏差适合于执行所公开的方法。

如果疾病或病症的体征或症状的严重程度、患者经历此类体征或症状的频率或两者都降低，则疾病或病症“缓解”。

“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。与之相反，动物的“病症”是健康状态，其中受试者能够维持体内平衡但其中动物的健康状况比不存在病症时不太有利。如果不进行治疗，病症不一定会导致动物的健康状态进一步下降。

如本文所使用的，术语“抑制”意指相对于对照值抑制或阻断活性或功能至少约百分之十。优选地，与对照值相比，活性被抑制或阻断50％，更优选地75％，并且甚至更优选地95％。

在本公开的上下文中，“调节剂”被定义为CB₂的激动剂、部分激动剂、反向激动剂或拮抗剂的化合物。调节剂可以增加CB₂受体的活性或可以降低CB₂受体的活性。在本公开的上下文中，“激动剂”被定义为增加受体基础活性(即，由受体介导的信号转导)的化合物。“拮抗剂”被定义为阻断激动剂对受体作用的化合物。“部分激动剂”被定义为显示有限或不完全活性使得所述部分激动剂不能在体外活化受体，在体内作为拮抗剂起作用的激动剂。“反向激动剂”被定义为降低受体基础活性的化合物。

术语“治疗(treatment、treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的副作用而言可以是治疗性的。如本文所用，术语“治疗”涵盖对受试者疾病的任何治疗，并且包含：(a)预防与不期望的免疫应答相关的疾病发生在可能易患所述疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发展：或者(c)缓解疾病，即使疾病消退。

术语“衍生物”是指在结构上与参考分子不同但可以保留或增强参考分子的基本性质并且可以具有另外的性质的小分子。相对于参考分子，衍生物可以改变其与某些其它分子的相互作用。衍生分子还可以包含参考分子的盐、加合物、互变异构体、异构体或其它变体。

术语“互变异构体”是有机化合物的结构异构体，它们很容易通过化学过程相互转化(互变异构)。

术语“异构体”或“立体异构体”是指具有相同化学组成，但原子或基团在空间中的排列不同的化合物。

如本文所使用的，“多晶型物”是指具有相同化学组合物但形成晶体的分子、原子和/或离子的不同空间排列的结晶形式。

如本文所使用的，“烷基”是指完全饱和(无双键或三键)的直链或支链烃(全碳)基团。本发明的烷基可以包括1-20个碳原子，即“m”＝1且“n”＝20，指定为“C₁到C₂₀烷基”。在一个实施例中，“m”＝1且“n”＝12(C₁到C₁₂烷基)。在其它实施例中，“m”＝1且“n”＝6(C₁到C₆烷基)。烷基的实例包含但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。

本发明的烷基可以被取代或未被取代。当被取代时，取代基是一个或多个独立地选自环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、氧代、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰胺基、N-磺酰胺基、C-羧基、O-羧基、异氰酸基、氰硫基、异硫氰基、硝基、甲硅烷基、三卤代甲磺酰基、-NRaRb、受保护的羟基、受保护的氨基、受保护的羧基和受保护的酰胺基的基团。

经取代的烷基的实例包含但不限于2-氧代-丙-1-基、3-氧代-丁-1-基、氰甲基、硝基甲基、氯甲基、羟甲基、四氢吡喃氧基甲基、间三苯甲基氧基甲基、丙酰基氧基甲基、氨基甲基、羧甲基、烯丙氧基羰基甲基、烯丙氧基羰基氨基甲基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、叔丁氧基甲基、乙酰氧基甲基、氯甲基、溴甲基、碘甲基、三氟甲基、6-羟基己基、2,4-二氯丁基、2-氨基丙基、1-氯乙基、2-氯乙基、1-溴甲基、2-氯乙基、1-氟乙基、2-氟乙基、1-碘乙基、2-碘乙基、1-氯丙基、2-氯丙基、3-氯丙基、1-溴丙基、2-溴丙基、3-溴丙基、1-氟丙基、2-氟丙基、3-氟丙基、1-碘丙基、2-碘丙基、3-碘丙基、2-氨基乙基、1-氨基乙基、N-苯甲酰基-2-氨基乙基、N乙酰基-2-氨基乙基、N-苯甲酰基-1-氨基乙基和N-乙酰基-1-氨基乙基。

如本文所使用的，“烯基”是指在直链或支链烃链中含有一个或多个双键的烷基。烯基的实例包含但不限于乙烯基(CH₂＝CH-)、烯丙基(CH₃CH＝CH₂-)、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基；1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基，以及己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基和十二碳烯基的各种异构体。

本发明的烯基可以未被取代或被取代。当被取代时，取代基可以选自上文关于烷基取代所公开的相同基团。经取代的烯基的实例包含但不限于苯乙烯基、3-氯-丙烯-1-基、3-氯-丁烯-1-基、3-甲氧基-丙烯-2-基、3-苯基-丁烯-2-基和1-氰基-丁烯3-基。

如本文所使用的，“炔基”是指在直链或支链烃链中含有一个或多个三键的烷基。

本发明的炔基可以未被取代或被取代。当被取代时，取代基可以选自上文关于烷基取代所公开的相同基团。

如本文所使用的，“芳基”是指具有完全离域的π电子系统的碳环(全碳)环或两个或更多个稠环(共享两个相邻碳原子的环)。芳基的实例包含但不限于如甲苯、苯胺、二甲苯等苯和经取代的苯、萘和经取代的萘，以及芴。

术语“药学上可接受的盐”是指在施用于患者时能够(直接或间接)提供如本文所描述的化合物的任何药学上可接受的盐。此类盐优选地是与生理学上可接受的有机或无机酸的酸加成盐。酸加成盐的实例包含无机酸加成盐例如，盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和有机酸加成盐例如，乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的实例包含无机盐例如，钠盐、钾盐、钙盐和铵盐和有机碱盐例如，乙二胺、乙醇胺、N,N-二烷基烯乙醇胺、三乙醇胺和碱性氨基酸盐。然而，应理解非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内，因为那些可以用于制备药学上可接受的盐。用于盐形成的程序在本领域中是常规的。

根据本发明的术语“溶剂化物”应理解为是指根据本发明的活性化合物的任何形式，其中所述化合物通过非共价键与另一分子(通常为极性溶剂)结合，尤其包含水合物和醇化物。

术语“有效量”和“药学有效量”是指足以提供期望生物学结果的药剂量。结果可以是减少和/或缓解疾病或病症的体征、症状或原因，或生物系统的任何其它期望的改变。本领域普通技术人员可以使用常规实验确定任何个别情况下的适当有效量。

“治疗有效量”是指对给定病状和施用方案提供治疗效果的量。具体地，“治疗有效量”意指有效预防、缓解或改善疾病的症状或延长被治疗的受试者的存活率的量，所述受试者可以是人或非人动物。治疗有效量的确定在本领域技术人员的技能范围内。

如本文所使用的，术语“药物组合物”是指本发明内的至少一种化合物与如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂等其它化学组分和实体的混合物。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。施用本领域中存在的化合物的多种技术包含但不限于静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。

“药学上可接受的”是指从药理学/毒理学的角度患者可接受的以及从物理/化学的角度关于组合物、调配物、稳定性、患者接受度和/或生物利用度的药物制造化学家可接受的那些性质和/或物质。“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物学活性的效力并且对所施用的宿主无毒的介质。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”意指如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料等药学上可接受的材料、组合物或载体，涉及在患者内载运或输送在本发明内有用的化合物或向患者载运或输送在本发明内有用的化合物，使得所述化合物可以执行其预期功能。通常，此类构建体从一个器官或身体的一部分载运或输送到另一个器官或身体的另一部分。在与包含在本发明内有用的化合物的调配物的其它成分相容并且对患者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包含：如乳糖、葡萄糖和蔗糖等糖；如玉米淀粉和马铃薯淀粉等淀粉；纤维素和如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素等其衍生物；粉状黄蓍；麦芽；明胶；滑石粉；如可可脂和栓剂蜡等赋形剂；如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、以及大豆油等油；如丙二醇等二醇；如甘油、山梨醇、甘露醇、以及聚乙二醇等多元醇；如油酸乙酯和月桂酸乙酯等酯；琼脂；如氢氧化镁和氢氧化铝等缓冲剂；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及在药物调配物中采用的其它无毒相容的物质。如本文所使用的，“药学上可接受的载体”还包含与在本发明内有用的化合物的活性相容并且对于患者来说生理学可接受的任何和所有包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以掺入组合物中。“药学上可接受的载体”还可以进一步包含在本发明内有用的化合物的药学上可接受的盐。可以包含在本发明实践中使用的药物组合物中的其它另外的成分是本领域已知的并且描述于例如《雷明顿氏药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》(Genaro编辑,宾夕法尼亚州伊斯顿市麦克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA),1985)中，其通过引用并入本文。

术语“营养组合物”可以是旨在用于人消耗的食物产品，例如，饮品、饮料、棒、小吃、冰淇淋、乳制品，例如，冷藏或储藏稳定的乳制品、发酵乳制品、饮料，例如，牛奶饮料、婴儿配方奶粉、成长奶、糖果产品、巧克力、如早餐麦片等谷物产品、酱汁、汤、速溶饮料、旨在用于在微波炉或烤箱中加热后消耗的冷冻产品、即食产品、快餐或营养配方。

术语“患者”“受试者”“个体”等在本文中可互换使用，并指任何动物或其细胞，无论是在体外还是原位，均可适用于本文所描述的方法。在某些非限制性实施例中，患者、受试者或个体是人。

贯穿本公开，可以以范围格式呈现本发明的各个方面。应当了解，呈范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁起见并且不应该被解释为是对本发明的范围的固定限制。因此，对范围的描述应当被认为已经明确地公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，对1到6的范围的描述应被视为具有具体公开的子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范围内的单独数量，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的有多广，此均适用。

说明书

调配物/药物

本发明提供了一种包括至少一种溶解于药物媒剂中的大麻二酚衍生物的组合物。在一个实施例中，所述组合物具有增加的生物利用度。在一个实施例中，与非调配混合物中相同大麻二酚衍生物的生物利用度相比时所述组合物具有增加的生物利用度。在一个实施例中，所述组合物具有增加的溶解度。在一个实施例中，与非调配混合物中相同大麻二酚衍生物的溶解度相比时所述组合物具有改进的溶解度。

在一个实施例中，所述组合物是干粉调配物。在一个实施例中，所述组合物是片剂，其中包括所述大麻二酚衍生物的所述片剂通过两个制造步骤制备：造粒步骤和片剂制备步骤。

在一个实施例中，所述造粒步骤是制备中间产品(IP)。在一个实施例中，所述造粒步骤包括在乙醇中含有赋形剂的造粒流体，将其添加到初级粉末颗粒中，然后进行溶剂蒸发。在一个实施例中，所得材料的粒度通过研磨减小。在一个实施例中，片剂制备步骤是制备药物产品(DP)。在一个实施例中，将中间产品(IP)与赋形剂混合，其中中间产品(IP)是从造粒步骤获得的。在一个实施例中，药物产品(DP)是通过在压片机上直接压缩而被压缩的片剂。

在一个实施例中，所述组合物是悬浮液。在一个实施例中，所述组合物是纳米悬浮液。在一个实施例中，所述组合物是乳剂。在一个实施例中，所述组合物是溶液。在一个实施例中，所述组合物是液体调配物。在一个实施例中，所述组合物是乳膏。在一个实施例中，所述组合物是凝胶。在一个实施例中，所述组合物是洗剂。在一个实施例中，所述组合物是糊剂。在一个实施例中，所述组合物是软膏。在一个实施例中，所述组合物是润肤剂。在一个实施例中，所述组合物是脂质体。在一个实施例中，所述组合物是纳米球。在一个实施例中，所述组合物是皮肤滋补剂。在一个实施例中，所述组合物是漱口水。在一个实施例中，所述组合物是口腔冲洗剂。在一个实施例中，所述组合物是摩丝。在一个实施例中，所述组合物是喷雾剂。在一个实施例中，所述组合物是包装剂。在一个实施例中，所述组合物是胶囊剂。在一个实施例中，所述组合物是片剂。在一个实施例中，所述组合物是粉末。在一个实施例中，所述组合物是颗粒剂。在一个实施例中，所述组合物是贴剂。在一个实施例中，所述组合物是闭塞皮肤剂。

在一个实施例中，所述组合物包括新的候选药物，所述候选药物包括通过氧化和胺化从合成或天然大麻二酚(CBD)化学衍生的化学稳定的、非精神作用的氨基醌。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物是合成大麻二酚衍生物。在一个实施例中，所述合成大麻二酚衍生物包括通过氧化和胺化从合成大麻二酚(CBD)化学衍生的化学稳定的、非精神作用的氨基醌。在一个实施例中，所述合成大麻二酚衍生物包括通过氧化和胺化从天然大麻二酚(CBD)化学衍生的化学稳定的、非精神作用的氨基醌。在一个实施例中，所述合成大麻二酚衍生物是非反应性合成大麻二酚衍生物。在一个实施例中，所述非反应性合成大麻二酚衍生物是化学稳定的合成大麻二酚衍生物。在一个实施例中，所述非反应性合成大麻二酚衍生物是对CB1受体没有可检测亲和力的合成大麻二酚衍生物。

在一个实施例中，包括非反应性合成大麻二酚衍生物的组合物通过靶向缓解神经炎症和有利于神经保护、防止轴突损伤、保护髓鞘结构并潜在地促进髓鞘再生的互补信号传导途径而具有新型作用机制(MOA)。在一个实施例中，包括非反应性合成大麻二酚衍生物的组合物是CB₂受体信号传导的调节剂。在一个实施例中，包括非反应性合成大麻二酚衍生物的组合物是PPARγ和CB₂受体信号传导的调节剂。在一个实施例中，包括非反应性合成大麻二酚衍生物的组合物是PPARγ和CB₂受体信号传导的调节剂，并且使HIF-1α稳定，从而上调包含促红细胞生成素(EPO)和血管内皮生长因子A(VEGFA)的若干种相关因子的表达。在一个实施例中，包括非反应性合成大麻二酚衍生物的组合物可能通过作用于PPARγ/CB₂受体，连同通过HIF途径增强的神经保护和潜在的髓鞘再生来减少神经炎症。

在一个实施例中，包括非反应性合成大麻二酚衍生物的组合物结合CB₂。在一个实施例中，与1型大麻素受体(CB₁)相比，非反应性合成大麻二酚衍生物优先地与CB₂受体结合。因此，在这些实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物对CB₂具有选择性。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物的胺基团结合CB₂。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物的胺基团选择性地结合CB₂受体而不是CB₁受体。在一个实施例中，在体外调节CB₂受体活性，而在其它实施例中，在体内调节CB₂受体活性。

在一个实施例中，大麻二酚衍生物是式(I)化合物。

在一个实施例中，R是独立地选自以下的基团的氮原子：直链或支链烷基胺、芳基胺、芳基烷基胺、杂芳基胺、杂芳基烷基胺、直链或支链烯基胺、直链或支链炔基胺或NH₂。

在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物选自由以下组成的组：

(1'R,6'R)-3-(乙胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮，

(1'R,6'R)-3-(戊胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮，

(1'R,6'R)-3-(异丁胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮，

(1'R,6'R)-3-(丁胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮，

(1'R,6'R)-3-(甲胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮，

(1'R,6'R)-3-(异丙胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮，

(1'R,6'R)-3-(苄胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮，

(1'R,6'R)-3-(新戊胺)-6-羟基-3'-甲基-)-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2基)-[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮，以及

(1'R,6'R)3-(异戊胺)-6-羟基-氨基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'-双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮。

在一个实施例中，所述药物媒剂选自由以下组成的组：水性缓冲液、溶剂、共溶剂、环糊精复合物、脂质媒剂以及其任何组合，并且任选地进一步包括至少一种稳定剂、乳化剂、聚合物、抗氧化剂以及其任何组合。

在一个实施例中，所述水性缓冲液选自由以下组成的组：HCl水溶液、水性柠檬酸盐-HCl缓冲液、NaOH水溶液、水性柠檬酸盐-NaOH缓冲液、水性磷酸盐缓冲液、KCl水溶液、水性硼酸盐-KCl-NaOH缓冲液、PBS缓冲液以及其任何组合。

在一个实施例中，水性缓冲液的pH范围为pH＝0.5-10。在一个实施例中，水性缓冲液的pH范围为pH＝0.5。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝1.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝2.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝3.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝4.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝5.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝5.5。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝6.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝7.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝7.4。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝8.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝9.0。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝9.5。在一个实施例中，水性缓冲液的pH＝10.0。

在一个实施例中，水性缓冲液的浓度范围为0.05N-1.0N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.05N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.1N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.15N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.2N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.3N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.4N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.5N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.6N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.7N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.8N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为0.9N。在一个实施例中，水性缓冲液的浓度为1.0N。

在一个实施例中，所述溶剂选自由以下组成的组：丙酮、乙酸乙酯、乙腈、戊烷、己烷、庚烷、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲亚砜(DMSO)、水、氯仿、二氯甲烷、二乙醚、PEG400、Transcutol(二乙二醇单乙醚)、MCT 70、Labrasol(PEG-8辛酸/癸酸甘油酯)、LabrafilM1944CS(PEG 5油酸酯)、丙二醇、Transcutol P、PEG400、丙二醇、甘油、Captex 300、Tween85、Cremophor EL、Maisine 35-1、Maisine CC、Capmul MCM、栗米油以及其任何组合。

在一个实施例中，所述共溶剂选自由以下组成的组：丙酮、乙酸乙酯、乙腈、戊烷、己烷、庚烷、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲亚砜(DMSO)、水、氯仿、二氯甲烷、二乙醚、PEG400、Transcutol(二乙二醇单乙醚)、MCT 70、Labrasol(PEG-8辛酸/癸酸甘油酯)、LabrafilM1944CS(PEG 5油酸酯)、丙二醇、Transcutol P、PEG400、丙二醇、甘油、Captex 300、Tween85、Cremophor EL、Maisine 35-1、Maisine CC、Capmul MCM、栗米油以及其任何组合。

在一个实施例中，所述环糊精复合物选自由以下组成的组：甲基-β-环糊精、甲基-γ-环糊精、HP-β-环糊精、HP-γ-环糊精、SBE-β-环糊精、α-环糊精、γ-环糊精、6-O-葡糖基-β-环糊精以及其任何组合。

在一个实施例中，所述脂质媒剂选自由以下组成的组：Captex 300、Tween 85、Cremophor EL、Maisine 35-1、Maisine CC、Capmul MCM、栗米油以及其任何组合。在一个实施例中，所述脂质媒剂是油。在一个实施例中，所述脂质媒剂是油混合物。在一个实施例中，所述油混合物包括至少两种油。在一个实施例中，所述油选自由以下组成的组：Captex300、Tween85、Cremophor EL、Maisine 35-1、Maisine CC、Capmul MCM、栗米油以及其任何组合。

在一个实施例中，所述油混合物是10:90v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是20:80v/v混合物。在一个实施例中，所述油混合物是30:70v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是40:60v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是42:58v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是50:50v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是55:45v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是60:40v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是70:30v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是80:20v/v油混合物。在一个实施例中，所述油混合物是90:10v/v油混合物。

在一个实施例中，所述稳定剂选自由以下组成的组：Pharmacoat 603、SLS、NissoHPC-SSL、Kolliphor、PVP K30、PVP VA64以及其任何组合。在一个实施例中，所述稳定剂是水溶液。

在一个实施例中，所述聚合物选自由以下组成的组：HPMC-AS-MG、HPMC-AS-LG、HPMC-AS-HG、HPMC、HPMC-P-55S、HPMC-P-50、甲基纤维素、HEC、HPC、Eudragit L100、Eudragit E100、PEO 100K、PEG 6000、PVP VA64、PVP K30、TPGS、Kollicoat IR、Carbopol980NF、Povocoat MP、Soluplus、Sureteric、Pluronic F-68和其任何组合。

在一个实施例中，抗氧化剂选自由以下组成的组：维生素A、维生素C、维生素E、辅酶Q10、锰、碘化物、褪黑素、α-胡萝卜素、虾青素、β-胡萝卜素、角黄素、隐黄素、叶黄素、番茄红素、玉米黄素、多酚抗氧化剂、类黄酮、黄酮、芹菜素、木犀草素、柑橘黄酮、黄酮醇、异鼠李素、山奈酚、杨梅酮、原花色素、槲皮素、黄烷酮、圣草酚、橙皮素、柚皮素、黄烷醇、儿茶素、没食子儿茶素、没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、茶黄素、茶红素、异黄酮植物雌激素、黄豆苷元、染料木素、黄豆黄素、芪类、白藜芦醇、紫檀芪、花青素、矢车菊素、花翠素、锦葵色素、花葵素、芍药花青素、牵牛花色素、菊苣酸、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、肉桂酸、鞣花酸、鞣酐、没食子酸、没食子丹宁、迷迭香酸、水杨酸、姜黄素、黄酮木脂素、水飞蓟素、氧杂蒽酮、丁子香酚、辣椒素、胆红素、柠檬酸、草酸、植酸、n-乙酰半胱氨酸、R-α-硫辛酸以及其任何组合。

在一个实施例中，溶解于药物媒剂中的所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度范围为0.001mg/mL-10.0g/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为0.001mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为0.005mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为0.006mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为0.008mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为0.01mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为0.03mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为0.06mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为1.0mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为2.0mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为2.5mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为6.1mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为10.0mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为10.2mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为100.0mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为250.0mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为500.0mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为750.0mg/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为1.0g/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为1.5g/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为5.0g/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为8.0g/mL。在一个实施例中，所述大麻二酚衍生物或其调配物的溶解度为10.0g/mL。

虽然式I-X化合物是CB₂受体配体，但所述化合物也具有神经保护性质。因此，包括式I-X化合物的组合物和调配物可用于治疗包含但不限于中风、偏头痛、丛集性头痛的神经病症。本文所公开的组合物和调配物还可有效治疗某些表征为逐渐选择性神经元丧失的慢性变性疾病。就此而言，本发明的组合物和调配物可有效治疗帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏舞蹈病和监狱相关的神经退行性变。CB₂受体激动剂赋予的神经保护作用还可以有效地保护和/或治疗如神经毒气等神经毒剂，以及通过化学或生物剂对脑或神经组织的其它损伤。

由于根据本发明的组合物和调配物的镇痛性质，将认识到它们将可用于治疗包含外周痛、内脏痛、神经性痛、炎性痛和牵涉痛的疼痛。本文所公开的组合物和调配物在治疗肌肉痉挛和震颤方面也是有效的。

本文所描述的药物组合物和调配物可以以其本身或以如在组合疗法中与其它活性成分或合适的载体或赋形剂混合的药物组合物施用于受试者。用于调配和施用本申请的化合物的技术可以在“雷明顿氏药物科学”宾夕法尼亚州伊斯顿市麦克出版公司,第18版,1990中找到。

合适的施用途径可以例如包含局部、口服、直肠、经粘膜或肠道施用；肠胃外递送，包含肌肉内、皮下、静脉内、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

可替代地，可以以局部而非全身的方式施用化合物，例如，通过通常在长效或缓释调配物中直接将化合物注射到疼痛区域中。另外，能以靶向药物递送系统进行所述药物的施用，例如，在用组织特异性抗体包衣的脂质体中。所述脂质体靶向于所述器官并由所述器官选择性地吸收。

本文所公开的药物组合物和调配物可以以本身已知的方式进行制造，例如，借助于常规混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨细、乳化、包封、包埋或压片工艺。

因此，可以使用包括赋形剂和助剂的一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式调配根据本公开使用的药物组合物和调配物，所述赋形剂和助剂有助于将活性化合物加工成药学上可以使用的制剂。适当的调配物取决于所选的施用途径。众所周知的技术、载体和赋形剂中的任何一种都可以在本领域合适和理解的情况下使用；例如，在上文的《雷明顿氏药物科学》中。

对于注射，本文所公开的药剂可以在水溶液中，优选地在如汉克氏溶液(Hank'ssolution)、林格氏溶液或生理盐水缓冲液等生理相容的缓冲液中调配。对于经粘膜施用，在调配物中使用适于待被渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中是已知的。

对于口服施用，可以制备固体或液体单位剂型。为了制备如片剂等固体组合物，将本文上文所公开的式(I)化合物或其衍生物与如滑石粉、硬脂酸镁、磷酸二钙、硅酸铝镁、硫酸钙、淀粉、乳糖、阿拉伯胶、甲基纤维素等常规成分和与药物稀释剂或载体功能类似的材料混合到调配物中。对于口服施用，所述化合物还可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合容易地调配。此类载体使得本文所公开的化合物能够调配成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬浮液等，用于待治疗患者的口服摄入。口服使用的药物制剂可以通过以下获得：将一种或多种固体赋形剂与本文所公开的药物组合混合，任选地研磨所得混合物，并且在需要时添加合适的助剂之后加工颗粒剂混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂具体地是如糖等填充剂，包含乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以添加如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸等崩解剂或如海藻酸钠等其盐。

通过将化合物与惰性药物稀释剂混合并且将混合物填充到适当大小的硬明胶胶囊中来制备胶囊。通过用可接受的植物油、轻质液体凡士林或其它惰性油对化合物的浆料进行机器封装来制备软明胶胶囊。可以制备用于口服施用的如糖浆剂、酏剂和悬浮液等流体单位剂型。水溶性形式可以与糖、芳香调味剂和防腐剂一起溶解于水性媒剂中以形成糖浆剂。通过使用水醇(例如，乙醇)媒剂与合适的甜味剂如糖和糖精，以及芳香调味剂来制备酏剂。悬浮液可以在如阿拉伯胶、黄蓍胶、甲基纤维素等悬浮剂的帮助下用水性媒剂制备。

为糖衣丸芯提供了合适的涂层。出于此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及适当的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中以便于识别或表征活性化合物剂的不同组合。

可以在搅拌下通过将温热的淀粉水溶液，例如马铃薯淀粉的水溶液添加到聚乙二醇于水中的加热溶液中，以形成乳剂来制备淀粉微球。当两相系统形成时(以淀粉溶液为内相)，然后在持续搅拌下将混合物冷却到室温，从而将内相转化为凝胶颗粒。然后在室温下过滤掉这些颗粒并且在如乙醇等溶剂中成浆，之后再次过滤掉颗粒并且放置在空气中干燥。可以通过众所周知的交联程序如热处理或通过使用化学交联剂来硬化微球。合适的药剂包含二醛，包含乙二醛、丙二醛、丁二醛、己二醛、戊二醛和苯二醛、如丁二酮等二酮、表氯醇、聚磷酸盐和硼酸盐。二醛用于通过与氨基相互作用来交联如白蛋白等蛋白质，并且二酮与氨基形成席夫碱(Schiff base)。表氯醇将带有如氨基或羟基等亲核试剂的化合物活化成环氧化物衍生物。

可以口服使用的药物制剂包含由明胶制成的压配合胶囊，以及由明胶和如甘油或山梨醇等增塑剂制成的软的密封胶囊。这种推合式胶囊可以含有活性成分，这些活性成分与如乳糖等填充剂、如淀粉等粘合剂和/或如滑石或硬脂酸镁等润滑剂以及任选地稳定剂混合。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮于如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇等合适的液体中。另外，可以添加稳定剂和/或抗氧化剂。所有口服施用的调配物都应该是适合此类施用的剂量。

对于经颊施用，组合物可以采用以常规方式调配的片剂或锭剂的形式。

可以将化合物调配为通过注射，例如通过团注或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的调配物可以以单位剂型存在，例如在安瓿或在多剂量容器中，并添加有防腐剂。这些组合物可以采用以下形式：在油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液剂、或乳剂，并且可以含有如助悬剂、稳定剂和/或分散剂等调配剂。

缓慢或延长释放递送系统，包含多个生物聚合物(基于生物的系统)、使用脂质体、胶体、树脂和其它聚合物递送系统或分隔储库的系统中的任一种，可以与本文所描述的组合物一起使用以提供治疗性化合物的连续或长期来源。此类缓慢释放系统适用于通过局部、眼内、口服和肠胃外途径递送的调配物。

肠胃外施用的药物调配物包含水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒剂包含如芝麻油等脂肪油或如油酸乙酯或甘油三酯等合成脂肪酸酯或脂质体。水性注射悬浮液可能含有如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖等增加悬浮液粘度的物质。任选地，悬浮液还可以含有合适的增加化合物的溶解度的稳定剂或药剂，以允许制备高浓度溶液。

可替代地，活性成分可以呈粉末形式，以便在使用前与合适的媒剂例如，无菌无热原水，一起构成。

除了先前所描述的调配物之外，所述化合物也可以调配成贮库制剂。此类长效调配物可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如，化合物可以用以下进行调配：合适的聚合或疏水性材料(例如，作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂或作为微溶衍生物，例如，作为微溶盐。

用于本文所公开的疏水性化合物的药物载体是包括苯甲醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相的共溶剂系统。常用的共溶剂系统是共溶剂系统，所述共溶剂系统包括3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80和65％w/v聚乙二醇300的溶液，用无水乙醇补足体积。自然地，共溶剂系统的比例可以显著变化而不破坏其溶解度和毒性特性。此外，共溶剂组分的特性可以变化：例如，可以使用其它低毒性非极性表面活性剂代替聚山梨酯80；聚乙二醇的分数大小可以变化；其它生物相容性聚合物可以替代聚乙二醇，例如，聚乙烯吡咯烷酮；并且可以使用其它糖或多糖。

可替代地，可以采用用于疏水性药物化合物的其它递送系统。脂质体和乳剂是众所周知的疏水性药物递送媒剂或载体的实例。也可以采用如二甲亚砜等某些有机溶剂，但通常以更大的毒性为代价。另外，可以使用如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质等缓释系统递送化合物。各种缓释材料已经建立并且是本领域技术人员众所周知的。根据缓释胶囊的化学性质，缓释胶囊可以释放化合物数周至多超过100天。根据治疗试剂的化学性质和生物稳定性，可以采用另外的稳定化策略。

本文所公开的药物组合中所使用的化合物中的许多化合物可以以具有药学上相容的反离子的盐的形式提供。可以与许多酸形成药学相容的盐，包含但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与对应的游离酸或碱形式相比，盐往往更易溶于水性或其它质子溶剂。

适合于在本文所公开的方法中使用的药物组合物包含其中含有有效量的活性成分以实现其预期目的的组合物。更具体地，治疗有效量意指有效预防、缓解或改善疾病的症状或延长被治疗的受试者的存活率的化合物的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开。

本文所公开的药物组合物的精确的调配、施用途径和剂量可以由个体医师根据患者的病状来选择。(参见例如，Fingl等人1975,“治疗学的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)”,第1章第1页中)。通常，施用于患者的组合物的剂量可以是患者体重的约0.5到1000mg/kg或患者体重的1到500mg/kg或10到500mg/kg或50到100mg/kg。根据患者的需要，剂量可以是在一天或多天的过程中给予的单个或一系列两个或更多个。注意，对于本公开中提到的几乎所有特定化合物，已经确立了用于治疗至少某个病状的人用剂量。因此，在大多数情况下，本文所公开的方法将使用那些相同的剂量，或介于约0.1％与500％之间，或介于约25％与250％之间，或介于50％与100％之间的既定人用剂量的剂量。在没有确立人用剂量的情况下，如新发现的药物化合物的情况将会如此，可以根据ED50或ID50值或从体外或体内研究得到的其它适当的值推断出合适的人用剂量，如通过在动物体内的毒性研究和疗效研究验证合格的。

虽然确切的剂量将在不同药物的基础上确定，但在大多数情况下，关于剂量可以作一些概括。成人患者的每日剂量方案可以是例如每种成分的口服剂量介于0.1mg与2000mg之间，优选地介于1mg与250mg之间，例如，5mg到200mg或每种成分的静脉内、皮下或肌内剂量介于0.01mg与500mg之间，优选地介于0.1mg与60mg之间，例如，以游离碱计算0.1mg到40mg的本文所公开的药物组合物或其药学上可接受的盐的每种成分每天施用所述组合物1到4次。可替代地，本文所公开的组合物可以通过连续静脉内输注施用，优选地每种成分的剂量至多每天400mg。因此，每种成分口服施用的每日总剂量通常在1到2000mg的范围内，肠胃外施用的日总剂量通常在0.1至500mg的范围内。合适地，化合物将在连续疗法期间施用，例如一周或更长时间或数月或数年。

可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持调节效果或最小有效浓度(MEC)的血浆水平的活性部分。MEC将针对每种化合物而变化但是可以根据体外数据进行估计。实现MEC所需的剂量将取决于个体特性和施用途径。然而，HPLC测定或生物测定可以用于确定血浆浓度。

剂量间隔也可以使用MEC值来确定。应使用在10％-90％的时间内，优选地介于30％-90％之间并且最优选地介于50％-90％之间维持血浆水平高于MEC的方案来施用组合物。

在局部施用或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。

当然，施用的组合物的量将取决于被治疗的受试者、受试者的体重、病痛的严重程度、施用方式和处方医师的判断。

举例来说，药物组合物和调配物可以用药学上可接受的赋形剂制备，所述药学上可接受的赋形剂可以是载体或稀释剂。此类组合物可以呈胶囊、小药囊、纸或其它容器的形式。在制备组合物时，可以使用用于制备药物组合物的常规技术。例如，本文上文所公开的式(I)化合物通常将与载体混合或由载体稀释或封装在载体内，所述载体可以成安瓿、胶囊、小药囊、纸或其它容器的形式。当载体用作稀释剂时，载体可以是用作活性化合物的媒剂、赋形剂或介质的固体、半固体或液体材料。如上文所描述使用的式(I)化合物和包括其的组合物可以吸附在粒状固体容器上，例如在小药囊中。合适载体的一些实例是水、盐溶液、醇、聚乙二醇、聚羟基乙氧基化蓖麻油、花生油、橄榄油、乳糖、白土、蔗糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。类似地，载体或稀释剂可以包含如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等本领域已知的任何缓释材料，其单独或与蜡混合。所述组合物还可以包含润湿剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。本发明中描述的用于治疗响应于对CB₂受体活性的调节的病状或疾病的组合物可以被调配以在采用本领域众所周知的方法施用于患者后提供本文所公开的式(I)化合物的快速、持续或延迟释放。

如果需要，可以将药物组合物和调配物灭菌并且与助剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液和/或着色物质等混合，它们不会与本文上文所公开的化合物发生有害反应。

药物组合物和调配物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、封装或出售。这种悬浮液或溶液可以根据已知技术来调配，并且除了活性成分之外还可以包括其它成分，例如本文所描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。此类无菌可注射调配物可以使用例如水或1,3-丁二醇等无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂来制备。其它可接受的稀释剂和溶剂包含但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和如合成甘油单酯或甘油二酯等固定油。可用的其它可肠胃外施用的调配物包含呈微晶形式、呈脂质体制剂形式或作为可生物降解的聚合物系统的组分的包括活性成分的那些。用于持续释放或植入的组合物可以包括药学上可接受的聚合物或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。

如果需要，本发明的组合物可以呈现在包装或分配器装置中，所述包装或分配器装置可以含有一个或多个含有活性成分的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有施用说明书。包装或分配器还可以附有由管控药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的与容器相关联的公告，所述公告反映了机构对用于人用或兽用施用的药物的形式的批准。例如，此类公告可以是美国食品药品监督管理局批准的用于处方药的标记或批准的产品插页。还可以制备包括在相容药物载体中调配的本文所公开的化合物的组合物，将其置于适当的容器中，并且标记用于治疗指定病状。

治疗

本发明还部分地涉及治疗在有需要的受试者的与脱髓鞘相关的病状或疾病的方法。在一个实施例中，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的至少一种大麻二酚衍生物或其调配物。在本发明的一方面，治疗与脱髓鞘相关的病状或疾病的方法包括髓鞘再生。本发明进一步部分地涉及在有需要的受试者中进行髓鞘再生的方法。在本发明的一方面，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的至少一种大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，受试者患有与脱髓鞘相关的病状或疾病。在一个实施例中，受试者患有响应于对CB₂受体活性的调节的病状或疾病。在一个实施例中，受试者患有与脱髓鞘相关的病状或疾病或响应于对CB₂受体活性的调节的病状或疾病。本发明还部分地涉及一种治疗脱髓鞘疾病的方法。

在一些实施例中，与脱髓鞘相关的所述病状或疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、脱髓鞘疾病、炎症相关病症以及其任何组合。在一个实施例中，与脱髓鞘相关的病状或疾病选自由以下组成的组：SSc、髓鞘破坏性病症、痛觉缺失、急性和慢性疼痛、炎性疼痛、术后疼痛、神经性疼痛、肌肉松弛、免疫抑制、作为抗炎剂、用于过敏、青光眼、支气管扩张、神经保护、骨质疏松症和骨骼系统病症、癌症、包含但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病(PD)和亨廷顿氏病的神经退行性病症、MS、肌肉痉挛、震颤、纤维肌痛、狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力、其它自身免疫性疾病、肠道易激综合症、间质性膀胱炎、偏头痛、瘙痒、湿疹、皮脂溢、银屑病、带状疱疹、脑缺血、脑溢血、颅脑创伤、中风、脊髓损伤、肝硬化、动脉粥样硬化、作为止咳药、哮喘、恶心、呕吐、胃溃疡、视神经脊髓炎、中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓病、脑白质病、脑白质营养不良、周围神经病、格林-巴利综合征、抗MAG周围神经病、夏柯-马利-杜斯氏病、进行性炎性神经病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)以及其任何组合。

在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节髓鞘再生。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物诱导髓鞘再生。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物增强髓鞘再生。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节脱髓鞘。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物预防脱髓鞘。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物减少脱髓鞘。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物加速脱髓鞘。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物终止脱髓鞘。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节神经炎症。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物缓解神经炎症。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节小胶质细胞增生。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物预防小胶质细胞增生。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物缓解小胶质细胞增生。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节星形胶质细胞增生。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物预防星形胶质细胞增生。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物缓解星形胶质细胞增生。

在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节基因表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物预防基因表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物减少基因表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物增强基因表达。

在一些实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节选自由以下组成的组的基因表达：与MS病理生理学相关的基因、与少突胶质细胞功能相关的基因、与EAE中的下调相关的基因、与Olig2的表达相关的基因以及其任何组合。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节Teneurin的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节Teneurin 4(Tenm 4)的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物增强Tenm 4的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物归一化Tenm 4的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节Olig2的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物恢复Olig2的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物增强Olig2的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTpi)的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物增强GSTpi的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物恢复GSTpi的表达。

在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物对减轻受试者的脱髓鞘有效。“脱髓鞘的减轻”意指当与以其它方式相同的病状相比时，由于疾病或疾病症状，受试者的脱髓鞘量减少和/或当与以其它方式相同的病状相比时，受试者的髓鞘再生的量增加。“减少”意指脱髓鞘的量或可归因于脱髓鞘的脱髓鞘疾病的任何症状的任何可测量或可检测的减少。同样，术语“增加”意指髓鞘再生量的任何可测量或可检测的增加，其也将表现为可归因于脱髓鞘的脱髓鞘疾病的任何症状的减少。在本发明的实施例中，与对照相比，受试者的脱髓鞘减轻。可归因于脱髓鞘的症状将因疾病而异，但可以包含，例如但不限于如认知障碍(包含记忆力、注意力、概念化和解决问题的能力)和信息处理等神经缺陷；一个或多个四肢、躯干或面部一侧的感觉异常；腿或手无力或笨拙；或视觉障碍，例如，一只眼睛部分失明和疼痛(球后视神经炎)、视力模糊或暗点。化合物减轻脱髓鞘的能力可以使用本领域已知的测定来检测或测量，例如本文所描述的铜宗诱导的脱髓鞘模型。

在一个实施例中，脱髓鞘疾病是导致围绕脑和脊髓中的神经的保护性覆盖物(髓鞘)受损的任何疾病或病状。在本发明的另外的实施例中，脱髓鞘疾病选自多发性硬化症、横贯性脊髓炎、格林巴利综合症、进行性多灶性白质脑病、横贯性脊髓炎、苯丙酮尿症和其它氨基酸尿症、泰-萨二氏病、尼曼-皮克病、戈谢病、赫尔勒氏综合症、克拉伯氏病和其它脑白质营养不良、急性播散性脑脊髓炎(感染后脑脊髓炎)、肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、视神经炎。德维克病(Devic disease)(视神经脊髓炎)、莱伯氏遗传性视神经萎缩和相关线粒体病症以及HTLV相关脊髓病或脱髓鞘疾病是局部损伤、缺血、毒性剂或代谢紊乱的结果。在一个实施例中，脱髓鞘疾病是多发性硬化症。

CB₂调节剂(即，激动剂、部分激动剂、拮抗剂或反向激动剂)具有针对以下的治疗效用：痛觉缺失、急性和慢性疼痛、炎性疼痛、术后疼痛、神经性疼痛、肌肉松弛、免疫抑制、作为抗炎剂、用于过敏、青光眼、支气管扩张、神经保护、骨质疏松症和骨骼系统病症、癌症、包含但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病(PD)和亨廷顿氏病的神经退行性病症、多发性硬化症(MS)、肌肉痉挛、震颤、纤维肌痛、狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力、其它自身免疫性疾病、肠道易激综合症、间质性膀胱炎、偏头痛、瘙痒、湿疹、皮脂溢、银屑病、带状疱疹、脑缺血、脑溢血、颅脑创伤、中风、脊髓损伤、肝硬化、动脉粥样硬化、作为止咳药、哮喘、恶心、呕吐、胃溃疡、系统性硬化症、髓鞘破坏性病症、视神经脊髓炎、中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓病、脑白质病、脑白质营养不良、周围神经病、格林-巴利综合征、抗MAG周围神经病、夏柯-马利-杜斯氏病、进行性炎性神经病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和腹泻。

因此，一方面，本发明进一步涉及一种治疗响应于对受试者的CB₂受体活性的调节的疾病或病状的方法，所述方法包括鉴定有需要的受试者，以及向受试者施用治疗有效量的大麻二酚衍生物或其调配物。一方面，本发明涉及新的候选药物，所述候选药物包括通过氧化和胺化从合成或天然大麻二酚(CBD)化学衍生的化学稳定的、非精神作用的氨基醌。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物通过靶向缓解神经炎症和有利于神经保护、防止轴突损伤、保护髓鞘结构并潜在地促进髓鞘再生的互补信号传导途径而具有新型MOA。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物是CB₂受体信号传导的调节剂。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物是PPARγ和CB₂受体信号传导的调节剂。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物是PPARγ和CB₂受体信号传导的双重调节剂，并且它通过使HIF-1α稳定来活化HIF途径并且上调包含促红细胞生成素(EPO)和血管内皮生长因子A(VEGFA)的若干种相关因子的表达。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物通过作用于PPARγ/CB₂受体，连同通过HIF途径增强的神经保护和潜在的髓鞘再生来减少神经炎症。

在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物调节CB₂的活性。在一个实施例中，与CB₁相比，非反应性合成大麻二酚衍生物优先地与CB₂受体结合。因此，在这些实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物对CB₂具有选择性。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物的胺基团增强其与CB₂的结合。在一个实施例中，非反应性合成大麻二酚衍生物的胺基团选择性地结合CB₂受体而不是CB₁受体。在一个实施例中，在体外调节CB₂受体活性，而在其它实施例中，在体内调节CB₂受体活性。

在一个实施例中，大麻二酚衍生物或其调配物与另一种治疗剂组合施用。在一个实施例中，口服施用的大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，局部施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用直肠施用来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用经粘膜施用来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用肠道施用来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用肠胃外递送来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用肌内注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用皮下注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用静脉内注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用髓内注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用鞘内注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用直接脑室内注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用腹腔内注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用鼻内注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。在一个实施例中，使用眼内注射来施用大麻二酚衍生物或其调配物。

在一个实施例中，与食物或饮料一起施用大麻二酚衍生物或其调配物。

在一个实施例中，响应于对CB₂受体活性的调节的病状或疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、脱髓鞘疾病、炎症相关病症以及其任何组合。在一个实施例中，响应于对CB₂受体活性的调节的病状或疾病选自由以下组成的组：SSc、髓鞘破坏性病症、痛觉缺失、急性和慢性疼痛、炎性疼痛、术后疼痛、神经性疼痛、肌肉松弛、免疫抑制、作为抗炎剂、用于过敏、青光眼、支气管扩张、神经保护、骨质疏松症和骨骼系统病症、癌症、包含但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病(PD)和亨廷顿氏病的神经退行性病症、MS、肌肉痉挛、震颤、纤维肌痛、狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力、其它自身免疫性疾病、肠道易激综合症、间质性膀胱炎、偏头痛、瘙痒、湿疹、皮脂溢、银屑病、带状疱疹、脑缺血、脑溢血、颅脑创伤、中风、脊髓损伤、肝硬化、动脉粥样硬化、作为止咳药、哮喘、恶心、呕吐、胃溃疡、视神经脊髓炎、中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓病、脑白质病、脑白质营养不良、周围神经病、格林-巴利综合征、抗MAG周围神经病、夏柯-马利-杜斯氏病、进行性炎性神经病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)以及其任何组合。

本领域技术人员将理解，在不脱离本公开的精神的情况下，可以进行许多和各种修改。因此，应当清楚地理解，本文所公开的形式仅是说明性的，并且不旨在限制本公开的范围。

实验实例

参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅仅是为了说明的目的，并且不旨在进行限定，除非另作说明。因此，本发明决不应解释为限于以下实例，而是应解释为涵盖由于本文所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

在不作进一步描述的情况下，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和以下说明性实例来制造和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实例具体指出了本发明的优选实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实例1：合成化合物

VCE-004.8的当前制造过程包括三个步骤，如图1A-1B和2所示。简而言之，这些步骤是：

步骤1：通过向CBD于乙酸乙酯(EtOAc)中的溶液中添加稳定的2-碘氧基苯甲酸(SIBX)来氧化CBD。在升高的温度下搅拌异质混合物，并且完成后将混合物过滤。将滤液用碳酸钾(K₂CO₃)溶液洗涤两次并且用盐酸(HCl)溶液洗涤一次。将氯化钠(NaCl)(饱和水溶液)添加到最后一次洗涤中以促进层分离。将有机层浓缩以产生VCE-004。

步骤2：将过氧化物水溶液添加到VCE-004于EtOAc中的溶液中。冷却混合物并且缓慢添加苄胺。反应完成后，添加HCl水溶液(15％)，并且将有机层用水洗涤若干次。浓缩有机层，并且从甲醇和水(MeOH/H₂O)的溶液中沉淀产物，过滤并干燥以产生VCE-004.8。

步骤3：VCE-004.8在升高的温度下通过悬浮在MeOH/H₂O 85:15中进一步纯化。冷却所得混合物，并且过滤产物。将固体干燥并且过筛以产生纯化的VCE-004.8。

将最终的药物物质过筛，包装在双层低密度聚乙烯袋和牛皮纸桶中，然后贴上标签。

然后以高产率合成了各种药用盐。

实例2：药物物质

VCE-004.8是PCT-EP2014-057767中描述的新化学实体。PCT-EP2017-057389中也描述了所述化合物的活性。PCT-EP2014-057767和PCT-EP2017-057389通过引用整体并入本文。

氨基醌VCE-004.8是源自合成大麻二酚(CBD)的新化学实体。表征研究表明，VCE-004.8是无水且非溶剂化结晶固体，分子量为433.6g/mol。熔点为90.7℃。VCE-004.8的结构解析通过以下执行：红外光谱(ATR-IR)、元素分析(CHN)、高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-MS)、质子核磁共振(1H-NMR)、碳核磁共振(13C-NMR)、其它NMR技术，即通过极化转移的无失真增强(DEPT135)、异核单量子相关(HSQC)、异核多键相关(HMBC)和2D研究。这些结构解析研究已经完成，并且分子的结构已经确定。

针对同一性、单个和总杂质、色谱纯度和测定(表1)开发了用于VCE-004.8药物物质的释放和稳定性测试的分析测试方法。还评价了潜在的手性杂质。由于原材料CBD纯度很高，并且在合成期间几乎没有获得对映体形式，因此在药物物质制造期间形成手性杂质的几率被认为非常低。尽管如此，还是开发了手性方法来评价药物物质批次。

表1.VCE-004.8药物物质的拟议规范。

进行了压力测试，结论是VCE-004.8药物物质在玻璃小瓶中在65℃+/-5℃下可稳定3天。在高于65℃的温度下观察到产物的降解。由于杂质方法处于早期开发阶段，因此在40℃下完成了短期稳定性研究，但结果不确定。

实例3：液体调配物

溶解度筛选研究表明，EHP-101液体(在临床前开发中也被称为VCE-004.8调配物)的活性成分VCE-004.8几乎不溶于不同pH值的水溶液和环糊精复合物中(图3A、3B和4)。所述活性成分也几乎不溶于如甘油等共溶剂，并且略溶于共溶剂如PEG400。VCE-004.8微溶于有机溶剂，如正庚烷和甲醇，易溶于有机溶剂，如DMSO和DCM。基于溶解度研究、短期稳定性研究和大鼠和小鼠体内生物利用度研究，选择如表2所示出的EHP-101的组合物用于口服调配物。

表2.药物产品EHP-101液体的组合物

组分	每克量(以mg为单位)	功能
			VCE-004.8	20	活性药用成分
栗米油	490	增溶剂
			Maisine CC	490	增溶剂

在图5A的制造流程图中，GMP DP批次(20mg/g)的当前制造工艺是基于迄今为止调配物EHP-101液体和安慰剂/媒剂的经验描述的。所述方法包括以下步骤：

1.以50:50v/v的比率混合Maisine CC和栗米油

2.在Maisine CC:栗米油混合物中溶解VCE-004.8

3.在N2覆盖的情况下将DP填充到散装容器中。

Maisine CC和栗米油(50:50v/v)媒剂的散装混合物将用于临床研究中的安慰剂(图5B)。

为控制EHP-101液体和安慰剂而开发和使用的分析测试方法概述在表3中。在开发过程中，分析测试方法将不断优化和修订。

表3.散装EHP-101和散装安慰剂的暂定发布规范

可获得6个月稳定性研究的数据，其中包含三种不同浓度的调配物，即20mg/g、25mg/g和30mg/g。油调配物组合物与用于临床研究的调配物的所选组合物相同。因此，这些调配物是临床研究中使用的调配物的代表。稳定性研究在以下条件下进行：5℃±3℃，25℃±2℃/60％RH±5％Rh和40℃±2℃/75％RH±5％RH。

这项研究的结果表明，在没有氮气覆盖的情况下，所述产品在5℃、25℃/60％RH下在琥珀色玻璃瓶中化学稳定至少6个月。

实例4：用于1期研究的调配物

在此脂质调配物中测试了不同浓度的药物物质，即20mg/g、25mg/g和30mg/g。由于20mg/g的浓度在室温下保持溶解，无需另外加热或旋转，因此选择此浓度用于临床研究。

EHP-101液体和安慰剂以散装瓶填充、储存和运输。

本发明所公开的液体调配物EHP-101液体由20mg/g的VCE-004.8于栗米油/Maisine CC(50/50v/v)的混合物中的溶液组成。类似的调配物(浓度至多为30mg/g)已用于体内非临床研究。液体油性调配物的选择基于VCE-004.8的溶解效率和>20个调配物原型的生物利用度的体内筛选研究。

将通过用散装媒剂稀释散装EHP-101来制备单剂量调配物。匹配的安慰剂将通过向散装安慰剂添加着色剂来制备。将转移分析方法以便释放单剂量调配物和匹配的安慰剂并且对这些调配物进行稳定性研究。

调配物概念的溶解度筛选和制造

为了选择最佳的VCE-004.8的调配物用于口服施用(EHP-101)，考虑了两个主要参数：溶解度和口服生物利用度。

化合物的溶解度是决定所述化合物从胃肠道吸收并最终决定其口服生物利用度的重要因素。首先确定了VCE-004.8在不同溶剂(例如，水性、脂类、有机等)的集合中的溶解度。另外，VCE-004.8在所选溶剂中的稳定性测试也被用作选择最佳溶剂的标准。基于在脂类溶剂中的溶解度研究，示出VCE-004.8在Maisine CC:栗米油的混合物中的溶解度高于在单独的玉米油或Maisine CC中(表4和图6)。

表4.VCE-004.8在25℃和37℃下在脂类溶剂中的溶解度研究。

溶剂	25℃	37℃
			Maisine CC	17.7mg/mL	34.5mg/mL
玉米油	19.3mg/mL
			Maisine CC/玉米(50:50)	20.3mg/mL	35.6mg/mL

所选溶剂用于制造VCE-004.8的若干种调配物概念，评估了通过口服摄入的药代动力学(PK)曲线。

生物利用度是药物的主要PK性质之一。生物利用度用于描述到达体循环的未改变药物的施用剂量的分数。以周期性时间间隔对血浆中药物量的测量间接指示活性药物成分从药物产品中被吸收并在作用部位变得可用的速率和程度。

实例5：浊度法水溶解度

VCE-004.8的水溶解度评估是在生理温度下进行的。将VCE-004.8(以10mM溶解于DMSO中)与PBS缓冲液pH 7.4在37℃下混合以达到1μM的最终VCE-004.8浓度和0.33％v/v的最终DMSO浓度。在PTFE

中进行温育。还在聚丙烯板中进行平行温育以评估PTFE与聚丙烯之间非特异性结合的任何差异。对于在PTFE中温育，然后在5、15、30、45和120分钟的2小时时间段内取系列样品。对于在聚丙烯中温育，仅在0分钟和120分钟取出样品。将所有样品立即添加到在干冰中冷却的微量滴定板中的两体积甲醇中以停止化学降解。采样完成时，使采样板达到室温。然后取出样品，通过LC-MS/MS对母体化合物进行定量分析。包含内标以校正分析偏差(尼卡地平(nicardipine)和芘)。然后根据LC-MS/MS峰面积比率(化合物峰面积/内标峰面积)计算相对于0分钟样品的每个时间点保留的母体化合物百分比以及与PTFE相比与聚丙烯结合的母体化合物百分比。在37℃下启动温育后0、5、15、30、45和120分钟时报告了PTFE温育的母体化合物百分比。另外，计算了与PTFE相比的与聚丙烯结合的测试化合物百分比。估计的溶解度范围(下限和上限以及以μM为单位计算的中间范围)如表5所示，指示VCE-004.8的水溶解度低。

表5.与尼卡地平和芘相比，VCE-004.8在37℃下在水溶解度测试中的估计的沉淀范围(μM)。

实例6：Log D确定

亲脂性是药物PK行为的关键决定因素。亲脂性可以影响药物在组织中的分布、吸收和结合特性，也是决定化合物溶解度的重要因素。Log D(分布系数)用作亲脂性的量度。确定化合物在有机溶剂(通常为辛醇)与水性缓冲液之间的分配是确定此参数的最常用方法之一。

为了确定log D，将0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4(用辛醇饱和)添加到含有VCE-004.8的小瓶中，然后将溶液混合并超声处理大约15分钟。将溶液转移到管中，进行离心，并且从顶部吸出上清液，在底部留下任何固体化合物。然后将此上清液通过0.2μm过滤器进行注射器过滤以产生初始溶液。制备了在磷酸盐缓冲液中含有不同比率的辛醇与化合物的三个小瓶以便覆盖一系列log D值。酮康唑和大麻二酚(CBD)用作对照。将小瓶混合至平衡，然后进行离心以确保在去除辛醇和分析缓冲液样品之前两相完全分离。对于定量分析，水溶液通过LC MS/MS进行分析。每个小瓶中VCE-004.8的量相对于通过连续稀释初始溶液产生的6点标准曲线进行定量。Log D使用等计算，如图7所示，其中ConcINITIAL是初始水溶液中化合物的浓度，ConcFINAL是最终水相中的化合物浓度，Vaq是水相的体积，并且Voct是辛醇相的体积。

表6中示出的结果指示VCE-004.8是高度亲脂的化合物，与母体分子大麻二酚(CBD)的范围相同。

表6.与CBD和酮康唑相比的VCE-004.8的LogD7.4辛醇。

测试化合物	LogD<sub>7.4</sub>辛醇
		VCE-004.8	>5
CBD	5.44
		酮康唑	3.52

实例7：溶解度筛选

对VCE-004.8进行了定量热力学溶解度测定。VCE-004.8的悬浮液在不同的药物媒剂和有机溶剂中制备。有机溶剂、脂质和共溶剂媒剂由纯溶剂或脂质组成，而环糊精溶液在磷酸盐缓冲液pH 7.0中制备。在25℃下搅拌悬浮液24小时后，从悬浮液中取一小部分母液用于溶解度测定。VCE-004.8在溶液中的浓度通过HPLC分析确定。这个溶解度测定的结果呈现在表7中。

表7.VCE-004.8的溶解度结果。((1)如在《欧洲药典》中所定义的：1)几乎不溶：溶解度<0.1mg/mL；2)极微溶：溶解度介于0.1-1mg/mL之间；3)微溶：溶解度介于1-10mg/mL之间；4)略溶：溶解度介于10-33mg/mL之间；5)可溶：溶解度介于33-100mg/mL之间；6)易溶：溶解度介于100-1000mg/mL之间；7)极溶解：溶解度>1000mg/mL；(2)Maisine35-1和CapmulMCM的溶解度在37℃下测定。)

这些结果证实，VCE-004.8在水性缓冲液中展现出非常低的、与pH无关的溶解度，然而在所有脂质媒剂和大多数共溶剂中，发现所述化合物略溶。此外，环糊精溶解度结果指示，甲基-β-环糊精与VCE-004.8发生络合，然而，使用环糊精并没有显著提高溶解度。

实例8：在脂类溶剂中的溶解度和稳定性的另外的评估

进行了在脂类溶剂中溶解度的另外测试。因此，VCE-004.8在室温下溶解并且在6种不同的脂类溶剂中搅拌最多16小时，如表7描绘的。使用以下参数通过HPLC进行不同溶解度试验的测定：柱C150724NC0047；Kinetex，C18：150mm、4,6mm、2.6μM；等度乙腈：0.2％甲酸(90:10)；流速0.35毫升/分钟；波长314nm；柱温25℃；运行时间20分钟；注射体积10μL。浓度0.1mg/mL被认为是所述技术的理论100％。结果示出于表8中。

表8.通过HPLC首次评估VCE-004.8在脂类溶剂中的溶解度(n.d.未确定)。

基于测定和杂质百分比，选择概念P03、P04和P05进行初步稳定性研究。还发现VCE-004.8在P07、P08和P09中的浓度为2mg/mL。没有一种溶液呈现任何沉淀物或可见的固体颗粒。稳定性研究条件和测定结果示出在表9中，指示P03是基于31天溶解度和稳定性的最佳调配物。因此，选择

MCT 70-中链甘油三酯(也被称为

812或

318)来评估大鼠口服施用的VCE-004.8PK曲线。制备了10mg/mL的VCE-004.8调配物用于PK分析(调配物n°1)。

表9.在Kollisolv(P04)、Labrasol(P05)和Labrafil(P05)中以0.4mg/ml调配的VCE-004.8的稳定性研究(未确定)。

实例9：脂类调配物

基于表7中示出的结果，开发了十种不同的原型脂质调配物概念。选择脂质媒剂的组合物以确保表示来自脂质分类系统的所有类别。制备如下进行，将75mg VCE-004.8称入合适的容器中，在搅拌的同时向其中添加6.75g赋形剂。如有必要，将赋形剂加热到45℃以便变成液体。表10给出了开发的十种不同的脂质调配物概念的概述。

表10.不同的脂质调配物概念。

对于每个开发的概念，样品在5℃和25℃/60％RH下储存4周。然后，通过HPLC评估稳定性(表11)。除概念8和10外，所有概念都在时间0(T0)示出可接受的测定。在25℃/60％RH下储存4周(T4W)后，概念2、3、5、6、7和9示出测定显著降低(5-10％)。

表11.不同脂类调配物中VCE-004.8测定(标示量％)的稳定性结果((1)T0是制备后大约2.5周，储存在5℃下；以及(2)未在T4W下进行测试，因为在T0时已经失败)。

对于PK供应，选择脂质调配物概念1、3、4和6进行PK评估(分别为调配物n°2、3、4、5)。调配物n°2和3如下新鲜制备，将350mg VCE-004.8称入合适的容器中，在搅拌的同时向其中添加34.65g赋形剂以获得10mg/g的浓度。如有必要，将赋形剂加热到45℃以便变成液体。浓度从10mg/g调整到4mg/g。因此，通过磁力搅拌将每种调配物n°2和3的三个小瓶合并，然后用相应的赋形剂混合物将每种调配物稀释2.5倍。如有必要，将赋形剂加热到45℃以便变成液体。另一方面，调配物n°4和5如下新鲜制备，将140mg VCE-004.8称入合适的容器中，在搅拌的同时向其中添加34.86g赋形剂以获得4mg/g的浓度。

实例10：芝麻油

在新批准的药物

中，CBD以100mg/mL的浓度调配在口服溶液中，所述口服溶液包含脱水酒精、芝麻油、草莓香精和三氯蔗糖。由于CBD是VCE-004.8的母体分子，因此选择芝麻油来评价在向大鼠口服施用时VCE-004.8的PK曲线。制备含4mg/mL VCE-004.8的芝麻油的调配物(调配物n°6)，以及另一种具有4mg/mL VCE-004.8和芝麻油(97.5％)-乙醇(2.5％)的调配物(调配物n°7)用于大鼠的PK分析。

实例11：意迪那(INDENA)磷脂复合物

磷脂复合

是由意迪那Spa公司(意大利)，即领先的药物和营养品制造商开发的专利技术。磷脂复合物是含有与磷脂，主要是磷脂酰胆碱，结合的活性成分的小的细胞样结构。磷脂分子结构包含水溶性头部和两个脂溶性尾部。由于这种双重溶解度，磷脂充当产生脂质相容的分子复合物的有效乳化剂。这种磷脂复合物技术是突破性的模型，用于生物利用度显著增强、临床益处显著更大、确保递送至组织，并且不影响营养安全。

开发了从VCE-004.8开始制备VCE-004.8磷脂复合物的实验室方法。首先进行溶剂筛选，选择乙酸乙酯与乙醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯进行比较。制备了两种磷脂复合物-VCE-004.8原型：

1)磷脂复合物1:2比率，其中Emulphur/SF(2g)、VCE-004.8(1g)和麦芽糊精MD05(0.92g)悬浮在40ml乙酸乙酯中。将悬浮液在搅拌下回流1小时。在减压(300-400mbar，60℃下外部浴)下除去溶剂直到获得软物质为止。将软残余物在50℃下在真空下干燥16小时。向干燥的固体中添加2％W/W的Syloid 244FP。将固体粗磨并且以600μm筛分从而产生VCE-004.8磷脂/SF。重量产率对起始粉末总和为约98％W/W。

2)磷脂复合物1:1比率，其中Emulphur/SF(1g)、VCE-004.8(1g)和麦芽糊精MD05(1.92g)悬浮在40ml乙酸乙酯中。将悬浮液在搅拌下回流1小时。在减压(300-400mbar，60℃下外部浴)下除去溶剂直到获得软物质为止。将软残余物在50℃下在真空下干燥16小时。向干燥的固体中添加2％W/W的Syloid 244FP。将固体粗磨并且以600μm筛分从而产生VCE-004.8磷脂/SF。重量产率对起始粉末总和为约98％W/W。

化合物稳定性的初步研究表明活性成分在工艺条件下是稳定的，但是杂质峰在起始材料中未检测到并且在45分钟时几乎可以忽略不计，在6小时后增加(面积％中的1.7％)并且在24小时后增长(面积％中的6.2％)，如图8所示。

在不同pH值(1.2、4.5、6.8和8.0)的缓冲介质中测试了磷脂复合物-VCE-004.8的溶解度。对于每种pH，制备VCE-004.8以及其磷脂复合物的独立过饱和溶液。将悬浮液超声处理10分钟，并且在37℃下在水浴中保持2小时。然后过滤最终的悬浮液(使用0.45PTFE一次性过滤器)并且将溶液注入用于HPLC分析。示出于表12和图9的结果指示VCE-004.8的亲水性(表示为水溶解度)几乎为零。然而，磷脂复合化过程显著增加了化合物的溶解度。1:2比率导致比1:1比率略微更可溶，并且在中性和碱性pH下示出最佳行为。因此，选择磷脂复合物1:2用于以下大鼠PK曲线评估(调配物n°8)。磷脂复合物1:2含有24％的VCE-004.8，并且在含1％甲基纤维素的水溶液中制备，用于口服施用。

表12.在所考虑的pH下，在VCE-004.8、磷脂复合物1:1和磷脂复合物1:2的水溶液中发现的VCE-004.8浓度。

实例12：回声制药公司(Echo Pharmaceuticals)

是回声制药公司BV取得专利的药物递送技术。

是由回声成功开发和使用以改进大麻素在水溶液中的释放的乳化技术。

对于VCE-004.8的调配物，使用ECP012A，设计用于口服使用的赋形剂混合物作为基础调配物。这使得VCE-004.8的干粉调配物被压片以评估其稠度。出于进一步研究的目的，三种最终的VCE-004.8调配物作为粉末递送。

VCE-004.8ECP012A片剂由活性成分VCE-004.8通过两个制造步骤制备：造粒步骤和片剂制备步骤。第一步骤是制备中间产品(IP)：将在乙醇中含有赋形剂的造粒流体添加到初级粉末颗粒中，然后进行溶剂蒸发。所得材料的粒度通过研磨减小。这产生了IP，准备用于压片的细粒。第二制造步骤是制备药物产品(DP)。将IP与赋形剂混合，并且片剂在压片机上通过直接压缩而被压缩。如表13中所描述的制备三种不同的调配物。

表13.使用

技术的VCE-004.8的三种调配物的主要特征。

通过HPLC分析一式两份测量DP的VCE004.8含量。在变色龙(Chromeleon)软件下运行的Dionex Ultimate 3000系统。所用的HPLC方法基于针对屈大麻酚(δ-9-四氢大麻酚，THC)的美国药典(USP)方法，并且开发用于测量CBD和其它大麻素。

溶出测试用于间接确定API的生物利用度，并且测量不同调配物中API生物利用度的可能差异。根据英国药典(BP)章节2.9.3测量溶出度。所选溶出介质由含2％SDS的水组成，pH为7。将烧杯放置在受控加热套上，同时搅拌且温度在35℃与40℃之间。一旦溶出介质的温度达到37℃(t＝0)，将一片片剂滴入带有不锈钢筛网的溶出烧杯中开始实验，以在片剂与搅拌棒之间形成物理屏障。用一次性注射器在不同时间点取样品，并且转移到小瓶中进行HPLC分析。溶出度表示为在指定时间范围内溶解的活性物质的百分比。在以下不同时间点取样品：t＝0、5、10、15、30、60、90和120分钟。三种调配物的测试结果示出于图10中。

调配物测试的结果示出，调配物A具有最高溶出率(达到42％)，其次是调配物B和C。溶出率的顺序和API与乳化剂的比率的预期效果一致：乳化剂与API的比率越高，溶解度越好。尽管调配物A示出更好的溶出率，但仍选择了三种调配物A、B和C来评估大鼠的PK曲线(分别为调配物n°9、10、11)。

为了制备那些调配物，考虑到调配物n°9含有13.13％的VCE-004.8，调配物n°10含有13.75％的VCE-004.8，并且调配物n°11含有12.93％的VCE-004.8。将其制备成15mg/ml的水悬浮液。

实例13：纳米悬浮液

如下制备十种不同的原型水性纳米混悬液概念：将250mg VCE-004.8称入合适的容器中，向所述容器添加4.750g稳定剂溶液。使用磁力搅拌棒搅拌每种概念直到形成均匀的悬浮液为止。接着，向每个容器添加30g珠粒(ZYP大小1mm)，之后将容器密封并且放置在80rpm的辊磨机上。2天和5天后，通过激光衍射测量每种概念的粒度分布(PSD)。研磨5天后，采集所有概念并且稀释到10mg/g，确保充分冲洗研磨容器和珠粒。所有十种概念都被放置于25℃/60％RH稳定性条件下2周，之后再次评价PSD。结果示出于表14中。从这些结果得出结论，含有1％Pharmacoat 603+0.1％SLS作为稳定剂的概念2和含有1％HPC-SSL+0.1％SLS的概念4将被考虑用于PK测试，因为对于这些调配物概念，获得的d10-d50-d90粒度结果都<1μm。

表14.具有PSD结果的不同的纳米悬浮概念。

纳米悬浮液概念2和概念4被选择用于PK供应(分别为调配物n°12和13)，因此如下新鲜制备：将500mg VCE-004.8称入合适的容器中，向所述容器添加9.5g相应稳定剂。使用磁力搅拌棒搅拌每种概念直到形成均匀的悬浮液为止。接着，向每个容器添加30g珠粒(ZYP大小1mm)，之后将容器密封并且放置在80rpm的辊磨机上。24小时和45小时后，通过激光衍射测量每种概念的粒度分布(PSD)。研磨45小时后，采集所有概念并且稀释到10mg/g，确保充分冲洗研磨容器。剂量从10mg/g调整到4mg/g。因此，通过磁力搅拌将每种概念的三个小瓶合并，然后用相应的稳定剂将每种调配物稀释2.5倍。

实例14：固体分散体

固体分散体形成的开发始于选择聚合物以稳定化无定形API。因此，使用溶剂位移法筛选了多种聚合物(表15)。

表15.基于聚合物在这些溶液中的溶解度，用于在SIF和SGF中进行溶剂位移的聚合物列表。“S”表示已溶解的聚合物，因此进行了溶剂位移实验；“X”表示不溶解的聚合物，因此无法进行溶剂位移实验。

聚合物	SIF	SGF
			HPMC-AS-MG	S	X
HPMC-AS-LG	S	X
			HPMC-AS-HG	S	X
HPMC	S	S
			HPMC-P-55S	S	X
HPMC-P-50	S	X
			甲基纤维素	S	S
HEC	S	S
			HPC	S	S
Eudragit L100	S	X
			Eudragit E100	X	S
PEO 100K	S	S
			PEG 6000	S	S
PVP VA64	S	S
			PVP K30	S	S
TPGS	S	S
			Kollicoat IR	S	S
Carbopol 980NF	S	S
			Povocoat MP	S	S
Soluplus	S	S
			Sureteric	X	S
Pluronic F-68	S	S

这些实验适用于VCE-004.8于DMSO中的5mg/mL溶液，其中80μL添加到在模拟肠液(SIF)和模拟胃液(SGF)中制备的4mL聚合物溶液中。随后将样品在25℃下在持续搅拌下温育，并且在0.5、1、2和4小时后，取等分试样，过滤并通过HPLC分析以确定溶液中的VCE-004.8浓度。结果呈现在图11(SGF)和图12(SIF)中。

在SGF中，除TGPS溶液外，大多数聚合物无法保持持续的过饱和状态，其中4小时后可以测量VCE-004.8浓度约为0.03mg/mL。然而，在SIF中进行的实验示出了若干种具有良好抗沉淀性质的聚合物。一般而言，所有HPMC衍生物(HPMC除外)在0.5到1小时都展现出高API浓度(大约60μg/mL)。此外，Eudragit L100和PVP K30还保持过饱和至少1小时(大约60μg/mL)。因此，在制备无定形固体分散体时要考虑这些聚合物。

成功的无定形分散体背后的原理是在聚合物基质中制备API的均匀分散体，从而降低API分子的流动性并防止成核。载药量是重要参数，并且高载药量可能导致API结晶，而低载药量可以影响药物产品大小。

无定形固体分散体筛选(ASD)以10、25和50％的不同载药量进行。基于溶剂位移法观察到的聚合物-API相互作用，选择HPMC-AS-MG、Eudragit L100、HPMC-AS-HG和PVP K30进行进一步研究。均匀分散体通过冷冻干燥制备并且放置于40℃/70％RH稳定性条件下。在制备(T0)时和2天(T2D)和14天(T14D)后，通过HT-XRPD分析样品。结果示出于图13中。

得出的结论是，HPMC-AS-HG分散体能够在40℃/75％RH下稳定10％和25％的载药量至少14天。Eudragit L-100只可以稳定10％的载药量2天。HPMC-AS-MG和PVP K30在稳定性研究期间没有示出稳定化。

基于溶剂位移结果和无定形固体分散体稳定性筛选两者，两种性能最佳的聚合物是HPMC AS HG和Eudragit L100(调配物n°14)。然而，由于需要在胃中很少(或没有)释放，但目标是在近端小肠中快速释放，因此选择使用HPMC AS LG(调配物n°15)代替HPMC ASHG，因为后者仅在6.8的相当高的pH值下溶解，而LG级在pH 5.5下已经溶解。

所选两种固体分散体是在ProSepT 4M8-TriX设备上通过喷雾干燥制备的。在制造之前，最佳喷雾干燥条件首先通过安慰剂材料(即，不含VCE-004.8)的喷雾干燥来确定。用于每种聚合物的最终设置概述在表16中。喷雾干燥过程完成后，将固体分散体材料在真空烘箱中在25℃和20mbar下干燥16小时。作为分散介质，制备0.5％甲基纤维素E4M+0.2％Tween20。

表16.ProCepT 4M8-Trix喷雾干燥器模块的喷雾干燥条件((1)由于这是不断受到监测的动态过程，因此给出了动态范围)。

参数<sup>(1)</sup>	Eudragit L100	HPMC AS LG
			固体混合物	VCE-004.8:Eudragit L100	VCE-004.8:HPMC AS LG
溶剂混合物	丙酮:水，90:10，v/v	二氯甲烷:乙醇
			空气流量(立方米/分钟)	0.37-0.42	0.37-0.42
空气入口温度(℃)	97.8-100.1	98.4-98.9
			产物温度(℃)	46.5-49.1	47.6-48.7
泵速(％)	100	100
			雾化压力(升/分钟)	6.1-6.6	7.0
喷雾速率(克/分钟)	5.6-6.1	7.0-7.2
			产率(％)	3到4	3到4

实例15：大鼠的生物利用度评估

PK研究是在由詹维尔实验室(Janvier Labs)供应的大约6周龄的雄性斯普拉格-道利(Sprague Dawley)大鼠和雄性Balb/C(C57BL/6JRj)小鼠中进行的。房间内是完全人工照明，其中控制周期为12小时光照、12小时黑暗。它由被设计成在维持正常条件的系统进行空调调节。每只动物都通过耳标进行识别。在体内试验之前检查动物的一般健康和福利。所有动物在实验期间都可以自由获取食物和水(随意)。进行了标准过程、治疗和安乐死。选择每种调配物的若干个时间点(通常针对静脉注射为5分钟、20分钟、30分钟、1小时、3小时、4小时、8小时、24小时；并且针对口服施用为30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、18小时、24小时)。通常，每个时间点使用至少3只动物。

测试调配物在4℃下避光储存直到进行体内测试(通常在制造后的随后4-6天)为止。在施用前，将含有Maisine 35-1的调配物在水浴中温热到37℃–40℃并且搅拌(磁力搅拌)，避光。将调配物口服施用于动物，并且与静脉内施用溶解于DMSO中并且以1mL/kg的体积中2-10mg/Kg的剂量施用的2mg/mL VCE-004.8进行比较。在小鼠中，所选的口服施用剂量为5g/kg施用体积中20mg/Kg。在大鼠中，所选的剂量为20-50mg/kg。

对于血液采样，在规定的时间，使用毛细管在眼眶后窦内收集血液。每个时间点收集大约0.5mL。它使用肝素锂作为抗凝剂。记录每次血液采样的准确采样时间。在约10℃下以2500rpm离心血液样品，然后取出血浆并放置入标记的聚丙烯管中。将单个血浆样品冷冻保存(-20℃±5℃)直到分析为止。

对血浆样品进行分析，取100μL血浆样品并且添加300μL乙腈。蛋白质沉淀后，使用LC-MS/MS进行分析。对于分析相，将物质VCE-004.8用适当的溶剂DMSO以1mg/mL溶解。对于分析测试，在直接注入MS-MS系统后为分子选择分子和子离子。分析方法由通过添加乙腈使蛋白质沉淀，然后使用C18柱进行LC-MS/MS分析组成。根据预期的灵敏度，使用至少8个校准标准来制备血浆中的校准曲线。计算对应的相关系数并且必须高于0.75以继续进行体内测试。待测试的校准范围是1到2000ng/mL血浆。

使用

(版本4.3-热电公司(Thermo Electron Corporation)-费城-美国)进行PK参数的估计。估计以下参数：最大血浆浓度(Cmax(ng/mL))、首次达到Cmax的时间(Tmax(小时))、从施用到时间t的最后可量化浓度的血浆浓度-时间曲线下面积(AUCt(纳克/毫升*小时))和绝对生物利用度

在大鼠中，使用所选调配物获得并示出在表17中的PK参数示出，VCE-004.8与玉米油和Maisine 35-1(0.4:49.8:49.8)的调配物导致最佳的生物利用度结果。如表18所示，这种生物利用度在小鼠中得到证实。为I期临床研究选择了类似的调配物(用Maisine CC代替Maisine35-1)，并且命名为EHP-101液体调配物。

表17.若干种口服施用并且与大鼠静脉内施用相比的VCE-004.8调配物的药代动力学参数(注：此表示出了对调配物2和7获得的结果的选择。完整的结果示出于(8)中)。

表18.口服施用并且与小鼠静脉内施用相比的调配物n°15的药代动力学参数。

实例16：非临床经验

基于若干项体外生物学测定，临床前得出结论，EHP-101是：PPARγ信号传导的活化剂；CB₂受体的功能性配体激动剂；以及调节HIF途径的活化的非反应性氨基醌。此外，受体筛选研究表明了VCE-004.8特异性；对CB1受体没有可检测的亲和力，进一步支持缺乏精神药物效果。因此，使用两种标准的多发性硬化症(MS)小鼠模型进行了主要药理学研究以表明EHP-101在治疗MS方面的活性：

1)模拟人复发缓解型MS(RRMS)的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型；以及

2)模拟MS的进行性形式的泰勒(Theiler)鼠脑脊髓炎病毒诱导的脱髓鞘疾病模型(TMEV)。EHP-101在腹膜内和口服施用时已在这2种模型中显示出持久的活性。

使用由博莱霉素诱导的皮肤纤维化小鼠模型还进行了主要药理学研究以表明EHP-101在治疗系统性硬化症(SSc)中的活性。SSc是病因不明的慢性多器官自身免疫性疾病，其特征在于血管和免疫异常。若干项证据示出，内源性大麻素系统可以在SSc的病理生理学中发挥作用。考虑到双重PPARγ/CB₂激动剂以及HIF途径的活化在SSc中具有作为疾病调节剂的强大潜力，研究了EHP-101在这些靶标中的活性。

为了评估EHP-101液体的药物代谢和药代动力学(DMPK)以及安全性，已根据国际协调委员会(ICH)M3指南进行了研究，涵盖体外和体内安全性药理学研究(心血管、呼吸和CNS)、体外代谢、血浆蛋白结合、体外和体内遗传毒性研究以及至多持续28-天的啮齿和非啮齿物种的一般重复-剂量毒性研究。

EAE模型表明了VCE-004.8的临床前功效，在5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg的剂量下示出非常显著的治疗效果。VCE-004.8还显著降低了小胶质细胞的反应性和炎症细胞的浸润，同时保留了EAE动物的髓鞘结构。VCE-004.8减轻了MS的TMEV模型的临床严重程度和神经病理学，如通过活性计测试所测量的。通过VCE-004.8的治疗改进了感染泰勒病毒的小鼠的运动缺陷。VCE-004.8显著降低了小胶质细胞的反应性和炎症细胞的浸润，并且保留了感染TMEV的小鼠的髓鞘结构。VCE-004.8治疗还减少了TMEV小鼠脊髓中浸润的CD4⁺T细胞和免疫细胞的数量。在TMEV小鼠的脊髓中发现的严重脱髓鞘通过用VCE-004.8治疗显著减轻。发现通过VCE-004.8治疗会预防TMEV小鼠的轴突紊乱。

还进行了研究以示出EHP-101的活性与双重PPARγ/CB₂配体激动剂一致，所述激动剂防止体内小胶质细胞活化、轴索变性和脱髓鞘。另外，体外使用EHP-101进行的研究表明，所述分子使小胶质细胞、少突胶质细胞和内皮微血管细胞系中HIF-1α和HIF-2α蛋白的表达稳定。HIF-1α稳定化诱导促红细胞生成素(EPO)和血管内皮生长因子(VEGF)A的释放，已知它们具有神经保护作用并且具有髓鞘再生的潜力。

在SSc的实验模型中评价了EHP-101预防与SSc相关的纤维化和恢复血管形态的能力。VCE-004.8，即EHP-101的活性成分，在体外抑制TGFβ诱导的Col1A2基因转录和胶原蛋白合成。此外，VCE-004.8抑制了TGFβ介导的肌成纤维细胞分化和受损的伤口愈合活性。EHP-101减少真皮厚度、血管胶原蛋白积聚并且防止肥大细胞脱颗粒和巨噬细胞浸润皮肤。EHP-101还阻止了典型的皮肤纤维化血管CD31的表达降低。另外，皮肤活检的RNAseq分析示出EHP-101在炎性和上皮-间充质转化转录组学特征中的明显作用，使EHP-101成为管理SSc的候选物。

精神药物效果和滥用潜力

EHP-101(即，VCE-004.8)不会结合和活化CB1受体，因此不会诱导包含镇静和僵住的精神药物作用。目前没有具体的滥用相关研究。滥用相关的AE是此研究的特别关注的AE(AESI)，并且将在整个研究中监测发生情况(章节10.4.1.1)。

进行了若干项研究，其中示出VCE-004.8对大麻素CB1受体没有亲和力。筛选研究示出，所述化合物在10μM(4336ng/mL)浓度下对CB1受体没有亲和力。考虑到VCE-004.8的高血浆蛋白结合(>99％)和血浆中1％的保守游离分数估计，VCE-004.8极不可能在至少至多1mM(433600ng/mL)的总(未结合+结合)血浆浓度下在体内产生任何临床相关的CB₁受体亲和力。此血浆浓度比在治疗4周后在大鼠和狗中未观察到不良反应水平(NOAEL)下观察到的C_max值高大约50倍。因此，在临床情况下预计不会对CB1受体产生临床相关作用。此外，合成中唯一的中间体是VCE-004(也被称为HU331)，据报告VCE-004与CB1结合或诱导小鼠的精神活性作用。

实例17：EHP-101治疗学

EHP-101在MS实验模型中的治疗潜力。EHP-101示出通过作用于PPARγ/CB₂受体来减少神经炎症，同时还提供神经保护并潜在地通过HIF途径诱导髓鞘再生。EHP-101处理降低了MS实验模型中疾病临床表现的发生率和严重程度。综合这些数据指示，EHP-101可能通过潜在地改善疾病为MS患者提供临床益处。

另外，还示出了EHP-101(VCE-004.8)在SSc中的治疗潜力，提供了缓解博来霉素小鼠模型中皮肤炎症、血管损伤和皮肤纤维化的功效的证据。

实例18：EHP-101对MS小鼠模型中炎症和髓鞘再生的作用

MS的特征在于炎性和神经退行性过程的组合，这些过程在疾病的不同阶段占主导地位。因此，免疫抑制是用于解决炎症阶段的金标准，并且正在寻求新型髓鞘再生疗法来恢复失去的功能。VCE-004-8是充当双重PPARγ/CB2配体激动剂的多靶标合成大麻素衍生物，所述激动剂还活化HIF途径。在两种不同的MS模型(EAE和泰勒鼠脑炎病毒诱导的脱髓鞘疾病)中示出VCE-004.8会预防神经炎症。口服EHP-101(VCE-004.8的脂类调配物)在EAE模型中示出预防神经炎症的剂量依赖性功效曲线(图14)。

在EAE中，通过RNA-Seq和qPCR进行的转录组学分析表明，EHP-101预防脊髓中与MS病理生理学密切相关的大量基因的表达。另外，EHP-101使如在EAE中下调的Teneurin 4(Tenm4)等与少突胶质细胞功能相关的若干个基因的表达归一化。免疫组织化学分析证实了脊髓中Tenm4表达的恢复。共聚焦分析显示，EHP-101处理防止脊髓和脑两者中的小胶质细胞活化(Iba1染色)和脱髓鞘(MBP染色)。此外，EAE与胼胝体(少突胶质细胞分化的标志物)中Olig2表达的丧失相关，所述丧失通过EHP-101处理恢复。此外，EHP-101增强了谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTpi)的表达，GSTpi是用作脑中成熟少突胶质细胞的标志物的胞质同工酶。这些数据指示EHP-101防止MS小鼠模型中脱髓鞘的潜力(图15到图18)。

为了进一步评价EHP-101的潜力，研究了EHP-101在铜宗脱髓鞘模型中的作用。用含有0.2％铜宗的饮食喂食小鼠6周，然后将动物换成正常饮食，并且用EHP-101(10和20mg/kg)处理或不处理(对照)2周。铜宗诱导了通过冷冻髓鞘染色和MPB表达测量的脑中髓鞘的明显丧失。1周和2周后脱髓鞘的自发恢复可忽略不计，但EHP-101处理显著加速了髓鞘再生。此外，EHP-101还分别防止了通过Iba1和GFAP染色检测到的铜宗诱导的小胶质细胞活化和星形胶质细胞增生(图19到图20)。

总之，EHP-101表示用于治疗如不同形式的MS和其它脱髓鞘疾病等各种疾病和病症的可能候选药物。

实例19：EHP-101和髓鞘再生

实例19的方法

化合物

EHP-101是VCE-004.8[(1'R,6'R)-3-(苄胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮)]的基于脂质的调配物。VCE-004.8在EHP-101中的色谱纯度为97.6％。

铜宗诱导的脱髓鞘模型

为了诱导脱髓鞘，将8周龄C57BL/6雄性小鼠喂食0.2％铜宗TD.140800饮食(西班牙巴塞罗纳Envigo公司(Envigo,Barcelona,Spain))六周。将对照组(无脱髓鞘)在整个时期喂食对照小鼠TD.00217饮食(西班牙巴塞罗纳Envigo公司)。为了研究对髓鞘再生的作用，从第六周开始每日通过口服管饲法以20mg/kg施用EHP-101。为了比较，脱髓鞘后铜宗对照组的动物通过口服管饲法接受相同体积的媒剂。为了研究EHP-101对髓鞘再生的动态作用，在治疗后第6、7(6+1W)、8(6+2W)周处死每组动物以供进一步分析。

组织处理

将小鼠用氯胺酮-赛拉嗪溶液通过腹膜内施用麻醉，并且用0.9％盐水经心灌注。脑被固定、冷冻保护并且在-80℃下冷冻以供进一步分析。

免疫组织化学分析

对于抗原修复，将脑切片在柠檬酸钠缓冲液(10mM，pH 6.0)或Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris碱，1mM EDTA 0.05％Tween 20，pH 9.0)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA))中煮沸10分钟。将切片在PBS中洗涤三次。非特异性抗体结合位点在室温下用3％牛血清白蛋白(BSA)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司，PBS中)封闭1小时。接下来，将切片在4℃下在通过3％BSA在PBS中稀释的以下一级抗体中温育过夜：小胶质细胞用兔抗Iba-1抗体(1:1,000；日本大阪和光纯药化学工业有限公司(Wako Chemical Pure Industry,Osaka,Japan))染色，星形胶质细胞用小鼠抗GFAP抗体(1:500，美国加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA,USA))染色，髓鞘碱性蛋白用兔抗髓鞘碱性蛋白抗体(1:1000；英国剑桥艾博抗公司(Abcam,Cambridge,UK))标记。在PBS中充分洗涤后，将载玻片与次级抗体在室温下避光温育1小时。使用从美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司(Thermo Fischer Scientific,Walthamm,MA,USA)获得的抗兔德克萨斯红(1:100)、抗小鼠/兔Alexa 488(1:100)揭示免疫反应。然后使用具有DAPI的Vectashield抗褪色封固剂(美国加利福尼亚州伯林盖姆载体实验室(Vector Laboratories,Burlingame,Ca,USA))将载玻片封固。根据制造商的建议(美国田纳西州金斯波特喜多生物科技公司(HitobiotechCorp.,Kingsport,TN,USA))，使用Hito CryoMyelinStain^TM试剂盒(磷酸金复合物髓鞘染色试剂盒)分析髓鞘完整性。所有图像使用光谱共焦激光扫描显微镜LSM710(德国耶拿蔡司公司(Zeiss,Jena,Germany))和20×/0.8平面-复消色差物镜(Plan-Apochromat lens)获得，并使用ImageJ软件(rsbweb.nih.gov/ij/)在9-15个随机选择的字段中定量。

数据分析

所有体内数据都表示为平均值±SEM。使用方差分析，然后是用于参数分析的图基(Tukey)事后检验或在非参数分析测试的情况下的克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)事后检验来确定统计显著性。显著性水平设置为p<0.05。使用GraphPad Prism 8.00版(美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad公司(GraphPad,San Diego,CA,USA))进行统计分析。

实例19的结果：EHP-101加速铜宗攻击的小鼠模型中的髓鞘再生

为了评价EHP-101在CPZ诱导的脱髓鞘模型中对髓鞘损伤的作用(图19A)，在6周的CPZ 0.2％饮食和2周的EHP-101处理后对动物的脑冠状切片进行分析。在此模型中，EHP-101处理在去除CPZ饮食后开始，以更直接地评价调配物对髓鞘再生的作用。首先，通过免疫组织化学和冷冻髓鞘(胼胝体)(分别为图19C和图19B)染色来确定MBP(皮层)的评价，其中在染色制剂中使用磷酸金复合髓鞘染色试剂盒对髓鞘进行染色，并且髓鞘呈深黑色。1周和2周后脱髓鞘的自发恢复不显著，但EHP-101处理显著加速了髓鞘再生。有趣的是，两项研究示出在整个免疫组织化学研究中，EHP-101在染色(图19D p＝<0.0001CPZ6W，CPZ6+1W，CPZ6+2W对对照；p＝<0.0001CPZ6+1W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+1W；p＝<0.0001CPZ6+2W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+2W)和皮层(图19E p＝<0.0001CPZ6W，CPZ6+1W，CPZ6+2W对对照；p＝<0.0001CPZ6+1W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+1W)的情况下增强胼胝体的髓鞘再生。此外，还使用胼胝体中Iba-1和GFAP的免疫荧光染色研究了EHP-101对神经炎症相关神经胶质活化的作用。在对照小鼠中检测到低水平的小胶质细胞和星形胶质细胞。暴露于CPZ的小鼠示出通过EHP-101处理减轻的小胶质细胞和星形胶质细胞肥大(图20A和图20B)。定量评估还示出，CPZ中毒时胼胝体中Iba1+和GFAP+细胞的数量显著增加。EHP-101处理1周后小胶质细胞增生和星形胶质细胞再活化得到改善(图20C p＝<0.0001CPZ6W，CPZ6+1W，CPZ6+2W对对照；p＝0.0017CPZ6+1W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+1W；图20D p＝<0.0001CPZ6W，CPZ6+1W对对照；p＝0.0017CPZ6+2W对对照)。

实例20：EHP-101对多发性硬化症小鼠模型中炎症和髓鞘再生的作用

MS是影响CNS的自身免疫性疾病，并且其特征在于病理变化，包含神经炎症、脱髓鞘和轴突损伤。在经典复发缓解型MS(RRMS)的缓解期期间已经描述了受损髓鞘和轴突的自发修复，其中脱髓鞘的轴突可以被再生的髓鞘重新包裹，从而改善轴突功能障碍。从这个意义上讲，缓解期也被认为是髓鞘再生的时期，这很重要，因为所述时期可以是RRMS患者使用预防炎症和增强髓鞘再生的药物进行治疗的关键时间点。

正在探索包含作用于内源性大麻素系统(ECS)的可成药靶标的大麻素的小分子，用于管理包含MS的CNS病理。从这个意义上讲，一些证据表明ECS在少突胶质细胞功能和MS髓鞘再生活性中的作用。ECS由G蛋白偶联受体CB1和CB2、内源性大麻素和调节其合成和分解代谢的酶组成。另外，不同性质的大麻素还靶向TRP家族的离子型受体和如过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)等核受体。CB1受体主要在神经元末梢的CNS中表达，并且调节神经递质释放和精神活性过程。与之相反，CB2受体主要位于外周免疫系统上，以及在神经炎症期间CNS中活化的小胶质细胞上。用于开发CB2受体激动剂的关键考虑因素包含没有精神活性作用、持续的抗炎活性、组织/细胞保护、缺乏心血管不良反应以及在包含MS的几种神经炎症疾病模型中的功效。

PPAR是配体活化转录因子的核激素受体超家族的成员，在脂质和葡萄糖稳态以及脂肪细胞分化中具有明确的调节作用。除了脂肪细胞和肝细胞，PPARγ已被示出在不同的CNS细胞和免疫细胞中表达。此外，PPARγ已被描述为调节免疫应答的重要因素。从这个意义上讲，已示出PPARγ活化抑制星形胶质细胞和巨噬细胞/小胶质细胞中炎性细胞因子的表达。此外，PPARγ刺激少突胶质细胞从神经干细胞分化，促进和加速体外少突胶质祖细胞的分化，其中另外增加抗氧化防御并且增加培养的少突胶质细胞的脂质产生和终末分化，从而表明PPARγ在MS中作为髓鞘再生的介质可能具有另外的保护作用。包含PPARγ的PPAR的神经保护作用在各种神经退行性变实验范例中在体外也被广泛记录，拓宽了其在MS中的潜在治疗前景。

尽管目前大多数MS疗法都是针对加剧的免疫应答的调节，但迫切需要针对轴突髓鞘再生的新型疗法。实现这的新型方法是缺氧预处理过程，所述过程由轻度氧耗竭引起，对包含MS的多种神经系统病症有益。对严重或轻度缺氧的细胞适应非常快，并且涉及缺氧诱导因子-1α(HIF)的活化，其活化可以在MS的炎性和缓解期中发挥作用。另外，有证据表明HIF途径的活化也可以与神经保护和可能髓鞘再生有关。例如，其基因依赖于HIF活化的促红细胞生成素(EPO)在不同的MS动物模型中具有神经保护作用。

先前示出，VCE-004.8是作为PPARγ和CB2的双重激动剂的有前途的大麻二酚衍生物，所述双重激动剂也活化HIF途径。事实上，VCE-004.8在两种不同的MS小鼠模型中防止了如EAE和泰勒病毒诱发的脑病等神经炎症和脱髓鞘。EHP-101是在系统性硬化症的小鼠模型中示出功效的VCE-004.8的口服调配物。更重要的是，EHP-101已经完成了I期临床研究(clinicaltrial.gov：NCT03745001)，并且正在计划在SSc和MS患者中启动II期研究。本发明的实例示出了EHP-101在防止EAE中的神经炎症和脱髓鞘以及增强脱髓鞘铜宗模型中的髓鞘再生方面的功效。

实例20的方法

化合物

EHP-101是VCE-004.8[(1'R,6'R)-3-(苄胺)-6-羟基-3'-甲基-4-戊基-6'-(丙-1-烯-2-基)[1,1'双(环己烷)]-2',3,6-三烯-2,5-二酮)]的基于脂类的调配物。VCE-004.8在EHP-101中的色谱纯度为97.6％。

动物

所有实验均严格按照欧盟和政府规定进行。动物的处理是按照欧盟准则86/609/EEC以及卡哈尔研究所动物实验伦理委员会(CSIC，马德里)制定的动物护理准则进行的，并且科尔多瓦大学(UCO，科尔多瓦，西班牙)批准了本研究中描述的所有程序(对于EAE，卡哈尔研究所协议编号：96 2013/03CEEA-IC和对于铜宗模型，UCO协议编号：2018PI/02(UCO))。制定了改进福利援助和临床状态以及终点标准的措施，以最小化痛苦并确保动物福利。简而言之，当动物开始出现临床体征以促进获得食物和水合作用时，将湿食物团粒放置在床笼上。对于EAE模型，雌性C57BL/6小鼠购自哈兰公司(Harlan)(巴塞罗那，西班牙)，在铜宗模型的情况下，雄性C56BL/6小鼠购自詹维尔实验室(勒热内圣里勒，法国)。所有动物都在以下受控条件下饲养在动物设施中：12小时光照/黑暗循环；温度20℃(±2℃)和40-50％相对湿度，可自由获取标准食物和水。

EAE的诱导和评估

用MOG35-55(300μg：肽合成部分，CBM，CSIC，马德里，西班牙)和200μg结核分枝杆菌(H37Ra Difco，富兰克林湖，新泽西州，美国)与不完全弗氏佐剂(Freund's adjuvant)(CFA，西格玛)1:1混合通过皮下免疫在6-8周龄C57BL/6雌性小鼠中诱导EAE。在同一天和2天后，给小鼠腹膜内注射含200ng百日咳毒素(西格玛)的0.1mL PBS。对照动物(CFA)接种了相同的不含MOG的乳剂，并且它们没有接受百日咳毒素。当动物示出疾病的首发症状时治疗开始于免疫后第8天，并且在接下来的21天内每日口服EHP-101(1、5、10和20mg/kg)。每日检查小鼠的EAE临床体征并且如下测量疾病评分：0，无疾病；1，肢尾；2，肢尾和后肢无力；3，后肢麻痹；4，后肢和前肢麻痹；5，垂死与死亡。在第28天处死所有动物用于进一步分析。

铜宗诱导的脱髓鞘

为了诱导脱髓鞘，将8周龄C57BL/6雄性小鼠喂食0.2％铜宗TD.140800饮食(西班牙巴塞罗纳Envigo公司)六周。将对照组(无脱髓鞘)在整个时期喂食对照小鼠TD.00217饮食(西班牙巴塞罗纳Envigo公司)。为了研究对髓鞘再生的作用，从第六周开始每日通过口服管饲法以20mg/kg施用EHP-101。为了比较，铜宗对照组(最大脱髓鞘)的动物通过管饲法接受相同体积的媒剂。为了研究EHP-101对髓鞘再生的动态作用，在第6、7(6+1W)、8(6+2W)周处死每组动物以供进一步分析。

组织处理

将小鼠用氯胺酮-赛拉嗪溶液通过腹膜内施用麻醉，并且用0.9％盐水经心灌注。通过用盐水挤压获得脊髓。脑和颈脊髓立即冷冻并在-80℃下保存以进行RT-PCR分析，剩余的脑和脊髓在含4％多聚甲醛的0.1M PBS中固定，在0.1M PBS中洗涤，用含15％，然后用含30％蔗糖溶液的0.1M PBS冷冻保护，并且在-80℃下冷冻。然后对自由浮动的脑和胸脊髓切片(50μm厚：徕卡微系统(Leica Microsystems)CM1900低温恒温器，巴塞罗那，西班牙)进行免疫组织化学或免疫荧光处理。在铜宗模型的情况下，整个脑被固定、冷冻保护并且在-80℃下冷冻以供进一步分析。

免疫组织化学分析

对于IHC分析，自由浮动的胸脊髓(50μm)切片用0.1M PB洗涤。内源性过氧化物酶活性被含3.3％过氧化氢的甲醇抑制。切片用2.5％正常马血清封闭，然后在封闭缓冲液中在4℃下与兔抗Teneurin 4抗体(1:50：美国科罗拉多州诺伟思生物制品公司)温育过夜。载玻片与ImmPRESS试剂(美国加利福尼亚州伯林盖姆载体实验室)一起温育，然后用二氨基联苯胺色原(德国达姆施塔特默克公司(Merck,Darmstadt,Germany))显色。对样品进行拍照、使用徕卡DFC420c相机进行数字化并且使用Image J软件进行分析。根据制造商的建议(美国田纳西州金斯波特喜多生物科技公司)，使用Hito CryoMyelinStain^TM试剂盒(磷酸金复合物髓鞘染色试剂盒)分析髓鞘完整性。

共聚焦显微镜分析

对于抗原修复，将脊髓或脑切片在柠檬酸钠缓冲液(10mM，pH 6.0)或Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris碱，1mM EDTA 0.05％Tween 20，pH 9.0)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)中煮沸10分钟。将切片在PBS中洗涤三次。非特异性抗体结合位点在室温下用3％牛血清白蛋白(BSA)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司，PBS中)封闭1小时。接下来，将切片在4℃下与通过3％BSA在PBS中稀释的以下一级抗体温育过夜：小胶质细胞用兔抗Iba-1抗体(1:1,000；日本大阪和光纯药化学工业有限公司)染色，星形胶质细胞用小鼠抗GFAP抗体(1:500，美国加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司)染色，髓鞘碱性蛋白用兔抗髓鞘碱性蛋白抗体(1:1000；英国剑桥艾博抗公司)标记，少突胶质细胞用小鼠抗Olig2(1:100，美国加利福尼亚州圣克鲁兹)标记，兔抗GSTPi(1:250，英国剑桥艾博抗公司)轴突损伤用小鼠抗神经丝H(NF-H)非磷酸化抗体(SMI-32)(1:50；美国加利福尼亚州生物传奇公司(Biolegend,CA,USA))确定。在PBS中充分洗涤后，将载玻片与次级抗体在室温下避光温育1小时。使用从美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司获得的抗兔德克萨斯红(1:100)、抗小鼠/兔Alexa 488(1:100)揭示免疫反应。然后使用具有DAPI的Vectashield抗褪色封固剂(美国加利福尼亚州伯林盖姆载体实验室)将载玻片封固。所有图像使用光谱共焦激光扫描显微镜LSM710(德国耶拿蔡司公司)和20×/0.8平面-复消色差物镜获得，并使用ImageJ软件(rsbweb.nih.gov/ij/)在9-15个随机选择的字段中定量。

RNA-Seq和生物信息学分析

使用QIAzol裂解试剂(德国希尔登的凯杰公司(Qiagen,Hilden,Germany))从脊髓组织中分离总RNA，并且使用RNeasy脂质组织迷你试剂盒(凯杰公司)纯化。然后，使用poly-A选择和TruSeq Stranded mRNA文库制备试剂盒(类别号RS-122-2101，美国加利福尼亚州圣地亚哥依诺米那公司(Illumina,San Diego,CA,USA))处理样品以进行高通量测序。简而言之，每个样品的1μg总RNA用于构建cDNA文库，然后在依诺米HiSeq 2500系统上进行测序，其中单端有50bp的读段并且每个样品有约4000万个读段(每组n＝3)。FASTQ文件使用Trimmomatic(v0.36)进行预处理，并且使用HISAT2(v2.1.0)与小鼠基因组组装mm10对齐。然后，使用用于mm10基因组组装的内置RefSeq注释通过featureCounts(v1.6.1)获得每个基因矩阵的计数，并且使用DESeq2(v1.20.0)进行差异表达分析，排除所有样品中计数小于15的基因。使用EnrichR和clusterProfiler进行功能过度呈现分析。使用Benjamini和Hochberg方法调整所有P值以控制错误发现率(FDR)。RNA-seq数据已存放在基因表达综合数据库中(登录号GSE131854)。

定量逆转录酶-PCR

使用iScript cDNA合成试剂盒(美国加尼福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA,USA))逆转录总RNA(1μg)，并且使用iQTM SYBR Green Supermix(伯乐公司)和CFX96实时PCR检测系统(伯乐公司)通过实时PCR分析cDNA。GAPDH基因用于标准化每个样品中的mRNA表达。使用2-ΔΔCt方法对基因表达进行定量，并且表示相对于对照的相对表达百分比。图21中描述了此研究中使用的引物。

神经丝轻多肽(NEFL)的测定

在全身麻醉下取血液样品，并且收集锂-肝素血浆。在收集的30分钟内，将样品以2000×g离心20分钟，并且根据制造商的说明使用用于神经丝轻多肽(NEFL)的酶联免疫吸附测定试剂盒(美国德克萨斯州休斯顿云克隆公司/USCN生命科学(Cloud Clone Corp./USCN Life Science,Houston,TX,USA))对神经丝轻多肽(NEFL)的循环水平进行定量。将值相对于对照组归一化并且对应于每组4到6只动物的平均值±SEM。

数据分析

所有体内数据都表示为平均值±SEM。使用方差分析，然后是用于参数分析的图基事后检验或在非参数分析测试的情况下的克鲁斯卡尔-沃利斯事后检验来确定统计显著性。显著性水平设置为p<0.05。使用GraphPad Prism 8.00版(美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad公司)进行统计分析。

实例20的结果

EHP-101减轻EAE中临床严重程度和神经炎症

EHP-101在MS中的功效首先在EAE中进行评价，在疾病的早期阶段进行治疗，因为小鼠在p.i.(免疫后)第8天接受了增加剂量的EHP-101。用MOG35-55进行皮下免疫在所有单独接受媒剂的小鼠中诱导EAE。所有媒剂处理的小鼠都发展出在免疫后第16天达到峰值并且在免疫后第28天维持的疾病。与之相反，动物的评分示出了EHP-101在所有测试剂量下的治疗功效，较高的剂量(20mg/kg)能够完全防止症状(图15A p＝0.0002EAE+EHP-10120mg/kg对EAE+媒剂；p＝0.0046EAE+EHP-101 10mg/kg对EAE+媒剂；p＝0.0068EAE+EHP-101 5mg/kg对EAE+媒剂)。来自图15A的临床评分数据用于确定曲线下面积，并且在图15B(p<0.0001EAE+EHP-101 1/5/10/20mg/kg对EAE+媒剂)中示出EHP-101以剂量依赖性方式改进症状。

为了确定EHP-101是否能够靶向EAE中的神经炎症，在脊髓中评价了小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生。组织病理学分析示出，EHP-101大大降低了由Iba-1和GFAP染色证明的EAE小鼠脊髓中广泛的小胶质细胞/巨噬细胞活化(图15C到图15F p＝0.0003EAE+媒剂对CFA；p＝0.0006EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂)和星形胶质细胞活化(图15C到图15E、图15G p<0.0001EAE+媒剂对CFA；p＝0.0051EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂)。MS病理的特征在于在脊髓和脑水平下CNS中的局灶性脱髓鞘病变。因此，为了确定脱髓鞘的程度，通过MBP免疫标记评价髓鞘。在EHP-101处理显著防止EAE小鼠的脊髓中发现明显的脱髓鞘(图15C到图15E、图15H p＝0.0001EAE+媒剂对CFA；p<0.0001EAE+EHP-101对EAE+媒剂)。

大脑皮质脱髓鞘以及胼胝体病理是MS广泛公认的特征。另外，大脑皮层在半球间交流中起着核心作用，并且MS患者的胼胝体萎缩已被示出与残疾状态相关。因此，还检查了这些结构是否也可能在EAE小鼠中受到影响。在整个EAE前脑中观察到炎性病变的增加(图16A到图16D)。具体地，观察到EAE小鼠胼胝体的小胶质细胞反应性增加，并且通过EHP-101的治疗逆转了小胶质细胞增生过程(图16E p＝0.0002EAE+媒剂对CFA；p＝0.0395EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂)。此外，还分析了来自受EAE影响的小鼠的脑切片的MBP反应性分布。MBP免疫反应性似乎在大脑皮层中显著降低(图16F p＝0.0159EAE+媒剂对CFA；p＝0.0024EAE+EHP-10120mg/kg对EAE+媒剂)，并且这种髓鞘表达的丧失被EHP-101处理强烈逆转。此外，EAE与胼胝体(少突胶质细胞分化的标志物)中Olig2表达的丧失相关，所述丧失通过EHP-101处理恢复(图16G p<0.0001EAE+媒剂对CFA；p＝0.0008EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂)。此外，EHP-101增强了谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTpi)的表达，GSTpi是用作脑中成熟少突胶质细胞的标志物的胞质同工酶(图16H p＝0.0222EAE+EHP-101 20mg对EAE+媒剂)。这些数据指示EHP-101防止MS小鼠模型中脱髓鞘的潜力。

EHP-101使脊髓处EAE转录组特征归一化

为了评价EHP-101处理产生的整体表达变化，在以下条件下对小鼠脊髓进行了RNA-Seq分析：对照、EAE和通过EHP-101处理的EAE(20mg/kg)。每个实验组获得三个生物复制品的测序数据。然后，在有或没有处理的情况下比较不同条件之间的转录组谱以初步了解模型中发生的变化。正如预期的那样，与用EHP-101处理的组相比，EAE小鼠在量级和显著性方面发现了许多变化(图17A)。然后，为了在生物学水平下评价这些变化，使用超过EAE对对照和EAE+EHP-101对EAE比较中调整后P<0.05和绝对变化倍数>2的截止值的基因来进行过度表达分析。在通过EAE的上调基因组和通过处理的下调基因组中发现了更显著的富集。在这两组之间观察到了互补的特征，其中出现了术语如“中性粒细胞介导的免疫”、“炎性反应”或“细胞因子介导的信号传导途径”，突出了EHP-101处理对脊髓的抗炎作用(图17B)。图17C中的热图表示来自“细胞因子介导的信号传导途径”的基因，这些基因由EAE诱导并由EHP-101下调。此外，为了证实EHP-101在脊髓中的这种抗炎作用，通过RT-PCR确定了如Il6、Timp1、Vcam、Il1b、Ccl4和Ccl2等若干种基因的基因表达。图17E示出EHP-101处理下调EAE小鼠中上调的这些基因的表达(Il6：p＝0.0360EAE+媒剂对CFA；p＝0.0451EAE+EHP-10120mg/kg对EAE+媒剂；Timp1：p＝<0.0001EAE+媒剂对CFA；p＝0.0001EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂；VCAM：p＝0.0058EAE+媒剂对CFA，p＝0.0381EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂；IL1b：p＝0.0018EAE+媒剂对CFA；p＝0.0027EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂；Ccl4：p＝<0.0001EAE+媒剂对CFA；p＝<0.0001EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂；Ccl2：p＝0.0003EAE+媒剂对CFA；p＝0.0054EAE+EHP-101对EAE+媒剂)，从而验证在RNA-Seq分析中发现的结果。

接下来，进行了第二分析以探索与促炎基因示出的模式相反方向的变化。因此，在EAE对对照比较中选择下调基因，并且在EAE+EHP-101对EAE比较中上调。将两组基因相交以评价它们之间的重叠，导致未处理模型中总共有193个基因下调，这些基因响应于处理而增加了它们的表达(图18A)。然后使用重叠基因列表作为输入进行第二功能分析以探索最显著富集的GO术语。如图18B所描绘的，在列表顶部发现了若干个与甾醇和羟基化合物代谢过程相关的术语。然而，鉴于疾病的背景，重点是“髓鞘形成”过程。为了探索属于此注释的特征的变化，描述了在热图中产生此结果的基因的表达水平并且示出在图18C中。这使得能够鉴定髓鞘形成过程的若干个关键基因，这些基因通过EHP-101处理恢复了它们的水平。有趣的是，这些结果指示EHP-101使如缝隙连接γ-3(Gjc3)，也被称为Connexin 29和Teneurin-4(Tenm4)等与少突胶质细胞功能相关的若干个基因的表达归一化，所述基因在EAE中被下调。这些结果是相关的，因为Tenm4已被描述为少突胶质细胞分化和CNS髓鞘形成的关键调节剂。为了验证转录组学分析，通过RT-PCR研究了Gjc4和Tenm4的表达(图18D Tenm4：p＝0.0020EAE+媒剂对CFA；p＝0.0032EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂；Gjc3：p＝0.0006EAE+媒剂对CFA；p＝0.0462EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂)，并且通过IHC研究了蛋白质水平。如图18E所描绘的(p＝<0.0001EAE+媒剂对CFA:p＝<0.0001EAE+EHP-101 20mg/kg对EAE+媒剂)，与EHP-101处理防止的CFA组相比，在脊髓白质中观察到Tenm4表达降低。综上所述，这些结果指示EHP-101防止EAE模型中脱髓鞘的潜力。

EHP-101加速铜宗攻击的小鼠中的髓鞘再生

为了评价EHP-101在急性CPZ诱导的脱髓鞘方案期间对髓鞘再生的作用(图19A)，在6周的CPZ 0.2％饮食和2周的EHP-101处理后对动物的脑冠状切片进行评价。在此模型中，在去除CPZ饮食后开始EHP-101处理以研究EHP-101对自发髓鞘再生的作用。首先，MBP的评价是通过冷冻髓鞘和IHC染色确定的(分别为图19B和图19C)。在未处理的小鼠中，1周和2周后脱髓鞘的自发恢复不显著，但EHP-101处理显著加速了胼胝体(图19D p＝<0.0001CPZ6W，CPZ6+1W，CPZ6+2W对对照；p＝<0.0001CPZ6+1W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+1W；p＝<0.0001CPZ6+2W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+2W)和大脑皮层的髓鞘再生。(图19E p＝<0.0001CPZ6W，CPZ6+1W，CPZ6+2W对对照；p＝<0.0001CPZ6+1W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+1W)。此外，通过对胼胝体中Iba-1+和GFAP+细胞进行染色研究了EHP-101对神经炎症相关神经胶质活化的作用。在对照小鼠中，检测到Iba-1+和GFAP+细胞的低水平表达，但暴露于CPZ的小鼠示出小胶质细胞和星形胶质细胞活化，所述活化被EHP-101处理减轻(图20A和图20B)。定量评估还示出，CPZ中毒时胼胝体中Iba1+和GFAP+细胞的数量显著增加。EHP-101处理1周后小胶质细胞增生和星形胶质细胞活化得到改善(图20C p＝<0.0001CPZ6W，CPZ6+1W，CPZ6+2W对对照；p＝0.0017CPZ6+1W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+1W；图20D p＝<0.0001CPZ6W，CPZ6+1W对对照；p＝0.0017CPZ6+2W对对照)。为了检查EHP-101对铜宗诱导的胼胝体中轴突脱髓鞘的作用，研究了非磷酸化形式的神经丝蛋白(SMI-32染色)。尽管SMI-32免疫反应性通常出现在轴突中，但其在轴突球体中的积累是轴突病理的特征。CPZ中毒6周和7周后增加的SMI-32标记表明对轴突有显著作用，并且这种作用在EHP-101处理1周后得到改善(图22A)。此外，还测定了神经丝轻多肽(NEFL)的血浆水平。如图22B所描绘的，与对照小鼠相比，在CPZ暴露6周和7周后，通过ELISA研究检测到铜宗诱导的NEFL血浆水平的增加。还示出，用EHP-101处理一周会降低铜宗诱导的NEFL血浆水平(图22B p＝0.0113CPZ6W对对照；p＝0.0151CPZ6+1W对对照；p＝0.0125CPZ6+1W+EHP-101 20mg/kg对CPZ6+1W)。

包含植物性大麻素的天然产品已成功用于开发具有改进生物活性的合成和半合成衍生物。本文所描述的实验公开了化合物VCE-004.8(大麻二酚的半合成衍生物)的开发，它是PPARγ/CB2的双重激动剂，所述激动剂还抑制HIF脯氨酰羟化酶(PHD)的活性。因此，VCE-004.8靶向若干种可以对EAE和泰勒鼠脑脊髓炎病毒诱导的脱髓鞘疾病的神经炎症和髓鞘再生产生积极作用的途径。本文描述的研究公开了EHP-101(VCE-004.8的口服脂类调配物)在两种最常用的脱髓鞘模型中的作用，即EAE和通过铜宗的毒性诱导的脱髓鞘。

C57Bl/6小鼠的EAE通常被认为主要靶向脊髓，导致感觉和运动障碍。然而，还认识到EAE涉及包含小脑和海马体的其它CNS结构。数据清楚地指示，EHP-101可有效缓解脊髓、大脑皮层和胼胝体(CC)的神经炎症。在EAE模型中，无法区分EHP-101的作用是否发生在外周免疫系统、两者的CNS。已经表明，脑血屏障(BBB)在EAE中被破坏，允许自身免疫细胞和分子迁移到脑。然而，可能的是EHP-101可以通过作用于外周免疫系统和CNS两者来发挥抗炎作用。例如，EHP-101在BBB不受影响的如系统性硬化症等另一种自身免疫性疾病中示出抗炎活性，并且在本文中示出EHP-101还缓解CPZ中毒小鼠的神经炎症。CPZ诱导的脱髓鞘病变的特征在于伴随着小胶质细胞和星形胶质细胞的活化的严重的少突胶质细胞丧失和脱髓鞘，但它不会诱导BBB损伤，并且缺乏特征性的T细胞浸润，因此缺乏所述疾病的外周自身免疫性成分。

EHP-101在髓鞘再生过程中的作用机制尚不清楚，但它可能与HIF途径有关。大量的实验研究表明，通过抑制PHD的活化来活化HIF-1可以提供神经保护和主要来自HIF-1靶基因的表达增加的可能髓鞘再生，这些基因对抗氧化应激，改进血氧和葡萄糖供应，促进葡萄糖代谢，调节铁稳态并阻断细胞死亡信号传导途径。增加HIF-1活性可以是防止神经退行性疾病发病或改善发病机制的重要潜在策略。有趣的是，髓鞘形成指数的改进伴随着以下的增强：OPC增殖、PDGFα受体表达和前体从CC中线向侧部的迁移、然后是髓鞘蛋白的表达的诱导。另外，脱髓鞘区域的早期星形胶质细胞增生伴随着IGF-1表达的适度刺激。IGF-1与FGF-2协同作用以刺激少突胶质祖细胞进入细胞周期。这是特别关注的，因为IGF-1诱导了HIF-1活化，所述活化可以被脑中的VCE-004.8模拟，并且PDGFα和FGF2也受VCE-004.8介导的HIF途径活化的调节。

MS病变中的脱髓鞘和部分轴突损伤与和轴突密切接触小胶质细胞的反应性活化密切相关，所述轴突显示如轴突球体的形成或快速轴突运输的障碍等急性轴突损伤。反应性小胶质细胞会产生大量有毒和促炎分子，从而引发髓鞘破坏、少突胶质细胞退化、轴突损伤以及甚至神经元丧失。在此发现，口服EHP-101还可以防止脊髓和脑两者中的小胶质细胞活化和脱髓鞘，这表明口服吸收后VCE-004.8会渗透到EAE小鼠的脑中。此外，还发现EHP-101保留了轴突结构，所述轴突结构改善了用作CPZ中毒小鼠轴突损伤的标志物的SMI-32在球体上的典型积累。同样，此结果表明VCE-004.8也可以穿过CPZ模型中不受影响的BBB。

少突胶质祖细胞(OPC)由神经上皮干细胞产生，并且随后在整个脊髓中增殖和迁移。在分化期间，少突胶质细胞启动髓鞘蛋白的表达，这对于实现CNS的适当功能至关重要。Teneurin-4(Tenm4)是II型跨膜蛋白，所述II型跨膜蛋白在CNS中高度表达，并且其表达是响应于对内质网应激而诱导的，并且已表明与人的双相情感障碍有关。导致小直径轴突的震颤和严重的髓鞘形成减少的名为furue的小鼠突变减少了少突胶质细胞的分化，尤其是在CNS的脊髓中，并且它与Tenm4表达的缺失相关。因此，Tenm4是少突胶质细胞分化和CNS髓鞘形成的关键调节剂。本文首次表明，在EAE小鼠中，脊髓中Tenm4的表达下调，并且通过EHP-101的处理逆转了这种下调，这可能是VCE-004.8的抗炎活性的结果。

另外，少突胶质细胞通过由连接蛋白Cx29、Cx32和Cx47组成的称为缝隙连接(GJ)的细胞间通道与其它少突胶质细胞以及星形胶质细胞进行电耦接和代谢耦接。这种神经胶质通讯网络在脑功能的稳态中起着重要作用。若干项研究还提供了少突胶质细胞连接蛋白在获得性脱髓鞘CNS病症中的作用，特别是MS和相关实验模型。所述少突胶质细胞连接蛋白似乎在神经炎症中也具有调节作用，因为它们的缺失会进一步加剧炎性脱髓鞘。同样，结果示出EHP-101防止了EAE小鼠对对照小鼠Gjc3(连接蛋白29)表达的下调。鉴于Tenm4和Gjc3与少突胶质细胞功能和髓鞘保存的相关性，结果进一步支持了待发展为MS新型治疗的EHP-101的潜力。

总之，所公开的研究提供了EHP-101对脱髓鞘的保护作用以及其增强髓鞘再生的能力。这些结果开辟了用于治疗多发性硬化症的新策略，因为迫切需要针对轴突髓鞘再生的新型疗法。

总之，MS的特征在于脊髓和脑中的炎性和神经退行性过程的组合。天然和如VCE-004.8等合成大麻素已在MS的临床前模型中进行了研究，并且因此表示药物开发的有希望的候选者。VCE-004-8是充当双重PPARγ/CB2配体激动剂的多靶标合成大麻二酚衍生物，所述激动剂还活化HIF途径。EHP-101是VCE-004.8的口服脂类调配物，所述调配物在其它自身免疫性疾病的临床前模型中示出功效。

EHP-101的体内功效在如实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和铜宗诱导的脱髓鞘等MS的两种小鼠模型中进行了评价。在EAE中，转录组学分析通过RNA-Seq和qPCR进行，并且在两种MS模型中，炎性和髓鞘形成标志物通过免疫组织化学(IHC)和共聚焦显微镜检测到。

EHP-101缓解了EAE中的临床症状，并且转录组学分析表明，EHP-101防止了许多与脊髓中MS病理生理学密切相关的炎性基因的表达。EHP-101使如在EAE中下调的Teneurin 4(Tenm4)和缝隙连接γ-3(Gjc3)等与少突胶质细胞功能相关的若干个基因的表达归一化。EHP-101处理防止脊髓和脑两者中的小胶质细胞活化和脱髓鞘。此外，EAE与胼胝体(少突胶质细胞分化的标志物)中Olig2表达的丧失相关，所述丧失通过EHP-101处理恢复。此外，EHP-101增强了谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTpi)的表达，GSTpi是脑中成熟少突胶质细胞的标志物。还发现，含0.2％铜宗的饮食持续六周诱导通过冷冻髓鞘染色和MPB表达测量的脑中髓鞘的明显丧失。此外，EHP-101还防止铜宗诱导的小胶质细胞活化和星形胶质细胞增生，减少轴突损伤并且降低神经丝轻多肽(NEFL)的血浆水平。

本文公开的结果提供了证据，即EHP-101示出有效的抗炎活性，防止脱髓鞘并且增强髓鞘再生。因此，EHP-101表示用于治疗不同形式的MS的有希望的候选药物。

实例21：灰质和白质中的髓鞘评估

通过以下评价灰质和白质中的髓鞘评估：(1)海马体和皮层中的PLP染色和密度；以及(2)胼胝体中PPD染色和人工计数。表19表明了灰质和白质模型概述中的髓鞘评估。VCE-004.8被调配成EHP-101，并且构建了EHP-101的每日PO施用。

表19：灰质和白质模型概述中的髓鞘评估

组	小鼠N＝	脱髓鞘范式	髓鞘再生范式	采集
					1	5	12+6周年龄匹配	年龄匹配(无剂量)	18周
2	15	12+0C/R	不适用	12周
					3	15	12+6C/R	媒剂对照(PO)	18周
4	15	12+6C/R	测试化合物浓度A(PO)	18周
					5	15	12+6C/R	测试化合物浓度B(PO)	18周
6	15	12+6C/R	测试化合物浓度C(PO)	18周

灰质髓鞘再生

如图24所示，海马体中的PLP染色和海马体中PLP的定量表明，与媒剂对照相比，经EHP-101处理的动物示出在海马体中的PLP染色区域中没有变化。此外，皮层中的PLP染色和皮层中PLP的定量表明，与媒剂对照相比，经EHP-101处理的动物在所有剂量强度下示出在皮层区域中的PLP染色区域中没有变化(图25)。

白质髓鞘再生

如图26到图29所示，胼胝体中的PPD染色和胼胝体中的有髓鞘轴突表明，尽管与对照相比，EHP-101处理未示出有髓鞘轴突显著增加，但与测试物品的最低测试组相比时，两个较高组之间存在显著差异。此外，图26A、图28A和图28B表明，与对照相比，测试的较高剂量的EHP-101处理示出有髓鞘轴突的密度显著增加。当与测试物品的最低测试组相比时，两个较高组之间也存在显著差异。

总之，动物脱髓鞘非常好，并且正如预期的那样，如在Cup-Rap处理范式中在12+0时间点缺乏髓鞘所表明的。在VCE-004.8的任何剂量下，海马区中髓鞘形成都没有显著增加。任何剂量的VCE-004.8似乎都没有显著增加皮质髓鞘形成。VCE-004.8似乎对胼胝体观察区域的白质髓鞘形成具有剂量相关作用。在较高剂量下观察到有髓鞘轴突水平增加。

实例22：EHP-101的口服施用促进多发性硬化症的铜宗/雷帕霉素小鼠模型中白质 的髓鞘再生

如上所述，EHP-101是VCE-004.8的口服脂类调配物，VCE-004.8是最近完成了I期临床研究的合成大麻二酚的新型非精神药物氨基醌衍生物。VCE-004.8是PPARγ和CB₂受体的双重激动剂，具有有效抗炎活性。VCE-004.8还表明了人微血管内皮细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中HIF途径的活化。在体内，EHP-101已被示出为防止MS的不同小鼠模型的脱髓鞘，并且还被示出为通过不完全脱髓鞘、较快髓鞘再生和仅2周的治疗窗口来诱导小鼠铜宗模型的脑中的髓鞘再生。

因此，本发明的实例侧重于评价口服施用EHP-101以通过较慢的自发髓鞘再生和6周的治疗窗口在广泛脱髓鞘的铜宗/雷帕霉素(C/R)小鼠模型中促进灰质和白质中的髓鞘再生。

雄性C57BL/6J(n＝5或12/组)用C/R处理12周，导致脑白质和灰质区域脱髓鞘。然后以0、5、10和20毫克/千克/天给小鼠口服施用EHP-101，持续6周(图23)。此后，采集脑并且通过蛋白脂质蛋白(PLP)染色对灰质(海马体(HIP)、大脑皮层(CTX))和对苯二胺(PPD)染色对白质(胼胝体(CC))中的有髓鞘轴突进行免疫组织化学染色和定量。

在C/R施用12周后，与年龄匹配的对照相比，皮层和海马体中存在近乎完全的轴突组织脱髓鞘，如通过髓鞘蛋白脂质蛋白染色的减少定量的，并且胼胝体中存在近乎完全的轴突组织脱髓鞘，如通过对苯二胺染色的减少定量的。EHP-101处理后海马体和大脑皮层中PLP染色区域无显著变化。与媒剂对照相比时，在以≥5毫克/千克/天口服施用EHP-101后，灰质髓鞘形成没有显著增加。在白质中，胼胝体中髓鞘轴突水平呈剂量依赖性增加。相对于对照，在以10(p<0.005)和20毫克/千克/天(p<0.001)施用EHP-101后，观察到有髓鞘轴突密度的统计学显著增加。

总之，在脱髓鞘的增强铜宗模型中，口服施用EHP-101诱导白质而非灰质中脱髓鞘轴突的显著髓鞘再生。EHP-101诱导胼胝体中PPD染色密度的显著的、与剂量相关的增加。这些数据支持将EHP-101作为用于治疗MS患者的疗法推进到2期临床研究。

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用整体结合在此。尽管已经参照特定实施例公开了本发明，但是显而易见的是，在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下，所属领域的其它技术人员可以设计出其它实施例和本发明的变体。所附权利要求旨在被理解为包含所有此类实施例和等效变化。

Claims (53)

1.一种组合物，其包括至少一种式(I)化合物或其衍生物，

其中R是独立地选自以下的基团的氮原子：直链或支链烷基胺、芳基胺、芳基烷基胺、杂芳基胺、杂芳基烷基胺、直链或支链烯基胺、直链或支链炔基胺或NH₂，

所述组合物溶解于药物媒剂中，

其中所述药物媒剂选自由以下组成的组：水性缓冲液、溶剂、共溶剂、环糊精复合物、脂质媒剂以及其任何组合。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是液体调配物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是悬浮液调配物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述调配物是纳米悬浮液调配物。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是乳剂调配物。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是干粉调配物。

7.根据权利要求5所述的组合物，其中粉末被压制成片剂。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是溶液、凝胶、洗剂、糊剂、软膏、润肤剂、脂质体、纳米球、皮肤滋补剂、漱口水、口腔冲洗剂、摩丝、喷雾剂、包装剂、胶囊剂、颗粒剂、贴剂、闭塞皮肤剂或其任何组合。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述式(I)化合物选自由以下组成的组：

以及

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述药物媒剂选自由以下组成的组：水性缓冲液、溶剂、共溶剂、环糊精复合物、脂质媒剂以及其任何组合，并且进一步包括至少一种稳定剂、乳化剂、聚合物以及其任何组合。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述水性缓冲液选自由以下组成的组：HCl水溶液、水性柠檬酸盐-HCl缓冲液、NaOH水溶液、水性柠檬酸盐-NaOH缓冲液、水性磷酸盐缓冲液、KCl水溶液、水性硼酸盐-KCl-NaOH缓冲液、PBS缓冲液以及其任何组合。

12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述溶剂选自由以下组成的组：丙酮、乙酸乙酯、乙腈、戊烷、己烷、庚烷、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲亚砜(DMSO)、水、氯仿、二氯甲烷、二乙醚、PEG400、Transcutol(二乙二醇单乙醚)、MCT 70、Labrasol(PEG-8辛酸/癸酸甘油酯)、Labrafil M1944CS(PEG 5油酸酯)、丙二醇、Transcutol P、PEG400、丙二醇、甘油、Captex300、Tween 85、Cremophor EL、Maisine 35-1、Maisine CC、Capmul MCM、粟米油以及其任何组合。

13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述共溶剂选自由以下组成的组：丙酮、乙酸乙酯、乙腈、戊烷、己烷、庚烷、甲醇、乙醇、异丙醇、二甲亚砜(DMSO)、水、氯仿、二氯甲烷、二乙醚、PEG400、Transcutol(二乙二醇单乙醚)、MCT 70、Labrasol(PEG-8辛酸/癸酸甘油酯)、Labrafil M1944CS(PEG 5油酸酯)、丙二醇、Transcutol P、PEG400、丙二醇、甘油、Captex300、Tween 85、Cremophor EL、Maisine 35-1、Maisine CC、Capmul MCM、粟米油以及其任何组合。

14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述环糊精复合物选自由以下组成的组：甲基-β-环糊精、甲基-γ-环糊精、HP-β-环糊精、HP-γ-环糊精、SBE-β-环糊精、α-环糊精、γ-环糊精、6-O-葡糖基-β-环糊精以及其任何组合。

15.根据权利要求10所述的组合物，其中所述稳定剂选自由以下组成的组：Pharmacoat603、SLS、Nisso HPC-SSL、Kolliphor、PVP K30、PVP VA 64以及其任何组合。

16.根据权利要求10所述的组合物，其中所述聚合物选自由以下组成的组：HPMC-AS-MG、HPMC-AS-LG、HPMC-AS-HG、HPMC、HPMC-P-55S、HPMC-P-50、甲基纤维素、HEC、HPC、Eudragit L100、Eudragit E100、PEO 100K、PEG 6000、PVP VA64、PVP K30、TPGS、KollicoatIR、Carbopol 980NF、Povocoat MP、Soluplus、Sureteric、Pluronic F-68。

17.根据权利要求10所述的组合物，其中抗氧化剂选自由以下组成的组：维生素A、维生素C、维生素E、辅酶Q10、锰、碘化物、褪黑素、α-胡萝卜素、虾青素、β-胡萝卜素、角黄素、隐黄素、叶黄素、番茄红素、玉米黄素、多酚抗氧化剂、类黄酮、黄酮、芹菜素、木犀草素、柑橘黄酮、黄酮醇、异鼠李素、山奈酚、杨梅酮、原花色素、槲皮素、黄烷酮、圣草酚、橙皮素、柚皮素、黄烷醇、儿茶素、没食子儿茶素、没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素、茶黄素、茶红素、异黄酮植物雌激素、黄豆苷元、染料木素、黄豆黄素、芪类、白藜芦醇、紫檀芪、花青素、矢车菊素、花翠素、锦葵色素、花葵素、芍药花青素、牵牛花色素、菊苣酸、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、肉桂酸、鞣花酸、鞣酐、没食子酸、没食子丹宁、迷迭香酸、水杨酸、姜黄素、黄酮木脂素、水飞蓟素、氧杂蒽酮、丁子香酚、辣椒素、胆红素、柠檬酸、草酸、植酸、n-乙酰半胱氨酸、R-α-硫辛酸以及其任何组合。

18.根据权利要求10所述的组合物，其中所述脂质媒剂选自由以下组成的组：Captex300、Tween 85、Cremophor EL、Maisine 35-1、Maisine CC、Capmul MCM、玉米油以及其任何组合。

19.根据权利要求10所述的组合物，其中所述脂质媒剂是油。

20.根据权利要求10所述的组合物，其中所述脂质媒剂是包括至少两种油的油混合物。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述油混合物是Maisine CC和粟米油的混合物。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中Maisine CC和粟米油的所述混合物包括50Maisine CC:50粟米油v/v。

23.根据权利要求2所述的调配物，其中所述药物媒剂是油。

24.根据权利要求2所述的调配物，其中所述药物媒剂是油混合物。

25.根据权利要求24所述的调配物，其中所述油混合物是Maisine CC和粟米油的混合物。

26.根据权利要求25所述的调配物，其中Maisine CC和粟米油的所述混合物包括50Maisine CC:50粟米油v/v。

27.一种治疗有需要的受试者的响应于对2型大麻素受体(CB₂)活性的调节的病状或疾病的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或向有需要的受试者施用其调配物或其衍生物，

其中R是独立地选自以下的基团的氮原子：直链或支链烷基胺、芳基胺、芳基烷基胺、杂芳基胺、杂芳基烷基胺、直链或支链烯基胺、直链或支链炔基胺或NH₂。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述式(I)化合物或其调配物独立地选自由以下组成的组：

以及

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述式(I)化合物选择性结合所述2型大麻素受体(CB₂)。

30.根据权利要求27所述的方法，其中R结合所述2型大麻素受体(CB₂)。

31.根据权利要求27所述的方法，其中响应于对2型大麻素受体(CB₂)活性的调节的所述病状或疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、脱髓鞘疾病、炎症相关病症以及其任何组合。

32.根据权利要求27所述的方法，其中响应于对2型大麻素受体(CB₂)活性的调节的所述病状或疾病选自由以下组成的组：系统性硬化症、髓鞘破坏性病症(myelinoclasticdisorder)、多发性硬化症、视神经脊髓炎、中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓病、脑白质病、脑白质营养不良、周围神经病、格林-巴利综合征(Guillain-Barresyndrome)、抗MAG周围神经病、夏柯-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、进行性炎性神经病以及其任何组合。

33.根据权利要求27所述的方法，其中响应于对2型大麻素受体(CB₂)活性的调节的所述病状或疾病是多发性硬化症。

34.根据权利要求27所述的方法，其中口服施用所述式(I)化合物或其调配物。

35.根据权利要求27所述的方法，其中局部施用所述式(I)化合物或其调配物。

36.根据权利要求27所述的方法，其中通过肌内注射施用所述式(I)化合物或其调配物。

37.根据权利要求27所述的方法，其中通过静脉注射施用所述式(I)化合物或其调配物。

38.根据权利要求27所述的方法，其中与食物或饮料一起施用所述式(I)化合物或其调配物。

39.根据权利要求27所述的方法，其中与另一种治疗剂组合施用所述式(I)化合物或其调配物。

40.一种液体调配物，其包括式(VIII)化合物或其衍生物，所述液体调配物溶解于药物媒剂中，其中所述药物媒剂是50:50v/v Maisine CC:粟米油混合物，

41.一种治疗有需要的受试者的响应于对CB₂受体活性的调节的多发性硬化症或系统性硬化症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(VIII)化合物或其调配物或其衍生物，

42.一种治疗有需要的受试者的与脱髓鞘相关的病状或疾病的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或向有需要的受试者施用其调配物或其衍生物，

其中R是独立地选自以下的基团的氮原子：直链或支链烷基胺、芳基胺、芳基烷基胺、杂芳基胺、杂芳基烷基胺、直链或支链烯基胺、直链或支链炔基胺或NH₂。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述式(I)化合物或其调配物独立地选自由以下组成的组：

以及

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者进一步患有响应于对2型大麻素受体(CB₂)活性的调节的病状或疾病。

45.根据权利要求42所述的方法，其中与脱髓鞘相关的所述病状或疾病选自由以下组成的组：自身免疫性疾病、脱髓鞘疾病、炎症相关病症以及其任何组合。

46.根据权利要求42所述的方法，其中与脱髓鞘相关的所述病状或疾病选自由以下组成的组：系统性硬化症、髓鞘破坏性病症、多发性硬化症、视神经脊髓炎、中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓病、脑白质病、脑白质营养不良、周围神经病、格林-巴利综合征、抗MAG周围神经病、夏柯-马利-杜斯氏病、进行性炎性神经病以及其任何组合。

47.根据权利要求42所述的方法，其中与脱髓鞘相关的所述病状或疾病是多发性硬化症。

48.一种有需要的受试者的髓鞘再生的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或向有需要的受试者施用其调配物或其衍生物，

其中R是独立地选自以下的基团的氮原子：直链或支链烷基胺、芳基胺、芳基烷基胺、杂芳基胺、杂芳基烷基胺、直链或支链烯基胺、直链或支链炔基胺或NH₂。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述式(I)化合物或其调配物独立地选自由以下组成的组：

以及

50.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的组的病状或疾病：响应于对2型大麻素受体(CB₂)活性的调节的病状或疾病、与脱髓鞘相关的病状或疾病以及其任何组合。

51.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的组的病状或疾病：自身免疫性疾病、脱髓鞘疾病、炎症相关病症以及其任何组合。

52.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的组的病状或疾病：系统性硬化症、髓鞘破坏性病症、多发性硬化症、视神经脊髓炎、中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、脊髓病、脑白质病、脑白质营养不良、周围神经病、格林-巴利综合征、抗MAG周围神经病、夏柯-马利-杜斯氏病、进行性炎性神经病以及其任何组合。

53.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者患有多发性硬化症。

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