CN113527329A - 含硒化合物及其医药用途 - Google Patents

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CN113527329A CN202010322264.4A CN202010322264A CN113527329A CN 113527329 A CN113527329 A CN 113527329A CN 202010322264 A CN202010322264 A CN 202010322264A CN 113527329 A CN113527329 A CN 113527329A
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Abstract

本发明公开了式I所示的含硒化合物，或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，具有所述含硒化合物的药物组合物。此外，本发明还公开了所述含硒化合物，或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，在制备抗肿瘤或抗炎药物中的用途。
Figure DDA0002461879650000011

Description

含硒化合物及其医药用途
技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及多功能含硒类化合物，该类化合物可作为广谱性抗肿瘤药物或抗炎药物。
背景技术
蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis targeting chimera，PROTAC)是一种新型的小分子药物设计策略，其核心思想是通过设计一类化学小分子，一端为结合靶蛋白的配体，另一端是结合E3泛素连接酶的配体，通过一段链连接。其在体内可以将靶蛋白和E3酶拉近，使靶蛋白被打上泛素标签，然后通过泛素—蛋白酶体途径降解。在真核细胞中，泛素蛋白(Ubiquitin)经过活性酶催化，从细胞内的蛋白质底物遴选出靶蛋白分子，并对这些靶蛋白进行特异性修饰，这个过程称为泛素化修饰(Ubiquitination)。修饰后的蛋白会进一步被蛋白酶体降解，这一过程被成为泛素—蛋白酶体降解途径，该途径介导了人体内80％的蛋白降解。理论上，依据不同的E3泛素连接酶，合理设计相应的PROTAC小分子，可降解任意经蛋白酶体降解的蛋白，达到高效选择性的治疗作用。目前，该技术已运用于抗肿瘤药物的研发中，并取得了可喜成绩。
泛素化修饰的酶催化过程需依次历经泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3催化的级联反应。CRL泛素连接酶(cullin-RING ligase，CRLs)是最大的E3泛素连接酶家族，能特异性调控约20％经过UPS系统介导的底物降解，其底物包括细胞周期调节蛋白、转录因子、信号转导分子、促癌蛋白、抑癌蛋白、DNA复制调控蛋白等。因此，针对CRLs的PROTAC小分子设计是目前的重点和热点研究领域。目前，研究较多是基于CRL泛素连接酶CRBN的PROTAC，这类小分子具有合成简便、靶降解蛋白配体多样性高、抗肿瘤效果好等优点。目前针对CRBN的配体分子主要为沙利度胺(Thalidomide，THD)、来那度胺(Lenalidomide，LED)和泊马度胺(Pomalidomide，POD)，而针对靶降解蛋白的配体“弹头”已有十余种，包括BRD、CDK、BTK、BET、ALK等著名泛素降解蛋白，这些PROTAC分子都表现出较好的抗肿瘤活性。然而目前的PROTAC小分子仍存在结构多样性不足、抗肿瘤功能单一、容易耐药等缺陷。因此，本发明从合理药物设计出发，开发更具新颖性的多功能药效骨架，综合提升药效分子的抗肿瘤活性，降低耐药性的发生。
硒元素是化学元素周期表中位于第四周期VI A族(第34号元素)，是人体的必需微量元素，具有广泛的生理功能作用。近几年，含硒类药物逐渐成为研究热点，通过替换原有结构的氧、硫等原子，获得的新型含硒结构分子普遍表现出明显的抗肿瘤、抗炎、抗氧化和免疫调节功能，比如代表性药物依布硒。近几年，除了直接的抗肿瘤治疗，通过改善免疫微环境、肿瘤微环境再塑造等间接方式影响肿瘤的发生发展被越来越多的研究证实和认可。炎症及氧化应激是肿瘤微环境典型的病理特征，炎症过度发生和ROS积聚加速了肿瘤微环境的构建，导致肿瘤患者的恶性化程度加深及肿瘤耐药性的产生。而通过清除炎症因子和氧自由基，并激活抗炎因子及抗氧化通路，能显著破坏肿瘤微环境，达到有效缓解肿瘤进展和耐药性转变的速度。
基于上述理念，并结合PROTAC分子的优势，本发明利用分子对接技术对依布硒和E3配体分子来那度胺与CRBN的结合模式进行了仔细模拟分析，获得了较清晰的构效关系。依据构效关系，将依布硒中的苯并异硒噁唑关键基团融入来那度胺中，形成硒乐度胺结构(式1)。我们进一步模拟硒乐度胺和来那度胺结构对CRBN的结合效果，发现两者高度匹配，他人研究也发现该类结构具有显著的抗炎和抗氧化功能。
Figure BDA0002461879630000021
发明内容
本发明基于硒乐度胺结构开展了靶向CRBN的PROTAC小分子设计、合成和活性测试工作，并发现了所获得的小分子可从直接抗肿瘤、抗炎、诱导肿瘤细胞铁死亡等多方面治疗多类型肿瘤的发生发展。该发明的核心思路是通过创新性地构建含硒化合物，发展一类新型多功能PROTAC抗肿瘤小分子，目前未有他人研究和专利报道，表明了本专利的新型性，良好的药效研究结果有力支持了本发明的实用性。
本发明所涉及的化合物具有全新结构的含硒类化学小分子，其设计思路是将具有抗炎抗氧化化功能的依布硒关键基团苯并异硒噁唑基和来那度胺的结构相互拼接，形成新的E3连接酶配体，并以此开展式I所示PROTAC小分子的设计、合成工作。这类含硒化合物经过多种肿瘤细胞的增殖抑制活性实验、原靶点降解活性、凋亡诱导实验、炎症因子调控表达实验、代表性含硒化合物的体内抗肿瘤活性、癌组织和癌旁组织的炎症因子、铁含量表达。
上述实验表明，该类含硒PROTAC小分子不仅保留了原有泛素-蛋白降解功能，且通过比较未插入硒原子的同类型PROTAC小分子，表现出更明显的抗炎及诱导铁死亡功能，证明全新结构的含硒PROTAC小分子具有更显著的多功能抗肿瘤活性。
本发明旨在提供一类含硒化合物，其为式I所示化合物，或其(与可药用酸或碱所成的)盐及其药用组合物的医药用途在抗肿瘤、抗炎领域内的应用。
为实现上述目的，本发明提供具有式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002461879630000031
式I中：
X为O或N；
R1代表下列任一结构基团；
Figure BDA0002461879630000032
其中：m＝0～6；n＝0～6；p＝0～6；
Y为C或O或N；
R2为下列任一结构基团；
Figure BDA0002461879630000041
附图说明
图1是BALB/c-Nude小鼠瘤体积变化图。
图2是BALB/c-Nude小鼠瘤重变化图。
图3是2BALB/c-Nude小鼠癌组织铁含量变化图。
图4是2BALB/c-Nude小鼠癌旁组织铁含量变化图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。
实施例1.I01的合成
Figure BDA0002461879630000051
I01a和I01b在吡啶下反应生成I01，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是84％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.68(s,3H),2.00-2.12(m,1H),2.39(s,3H),2.63-2.81(m,6H),3.42-3.52(m,4H),3.59-3.71(m,10H),3.81-3.83(m,2H),4.01-4.13(m,2H),4.60-4.65(m,1H),4.82-4.91(m,1H),6.35-6.53(m,1H),6.80(d,2H),6.91(d,1H),7.05(d,1H),7.36(d,2H),7.37-7.53(m,5H),8.56(d,1H),8.77(d,1H).MS(EI)m/z 975.2170[M]+。
实施例2.I02的合成
Figure BDA0002461879630000052
I02a和I02b在吡啶下反应生成I02，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是89％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm7.81(dd,1H),7.45(d,1H),7.45-7.38(m,5H),5.07(dd,1H),4.69(s,2H),4.65(dd,1H),3.43-3.32(m,3H),3.29-3.25(m,2H),2.88-2.65(m,7H),2.41(s,3H),2.12-2.02(m,1H),1.72-1.51(m,7H).MS(EI)m/z 837.1489[M]+。
实施例03.I03的合成
Figure BDA0002461879630000061
I03a和I03b在吡啶下反应生成I03，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是78％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.65(d,1H),8.16(s,1H),7.75(t,1H),7.56(d,1H),7.36(d,1H),7.31-7.22(m,2H),5.94(s,1H),5.04(dd,1H),3.71-3.60(m,10H),3.04-3.40(m,4H),2.94-2.88(m,4H),2.82-2.73(m,2H),2.62(bs,2H),2.51(t,2H),2.43(s,3H),2.40(m,2H),2.31(s,3H),2.21-2.14(m,1H),1.75(qt,2H),1.63-1.53(m,6H),1.49-1.35(m,7H).；MS(EI)m/z 1063.2806[M]+。
实施例04.I04的合成
Figure BDA0002461879630000062
I04a和I04b在吡啶下反应生成I04，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是88％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.71(s,1H),8.90(s,1H),8.73(d,1H),7.82(s,1H),7.46(t,1H),7.44(d,1H),7.35(s,1H),7.07(d,1H),6.87(d,1H),6.50(s,2H),6.46(t,1H),4.90-4.82(m,1H),3.82(s,6H),3.72(s,2H),3.71-3.65(m,9H),3.62(t,2H),3.52-3.44(m,3H),3.46-3.41(m,2H),3.13(s,2H),2.90-2.80(m,1H),2.78-2.71(m,2H),2.32(s,3H),2.17-2.10(m,1H)；MS(EI)m/z 822.8366[M]+。
实施例05.I05的合成
Figure BDA0002461879630000071
I05a和I05b在氯化铜催化下反应生成I05，反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是85％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm12.50(s,1H),11.14(s,1H),9.66(s,1H),8.48(d,1H),8.07(s,1H),7.97(d,2H),7.90-7.76(m,2H),7.61(m,5H),6.92(s,1H),6.34(s,1H),5.35(s,2H),5.14-5.08(m,3H),4.18-4.11(m,4H),1.85-1.79(m,2H),1.66-1.60(m,2H),1.41(s,6H)；MS(EI)m/z 801.8717[M]+。
实施例06.I06的合成
Figure BDA0002461879630000072
I06a和I06b在吡啶下反应生成I06，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是83％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm12.08(br,1H),11.05(s,1H),10.43(s,1H),8.54(s,1H),8.02(dd,1H),7.53(d,1H),7.41(d,1H),7.16(d,2H),6.83-6.80(m,2H),6.27(br,1H),5.04(dd,1H),4.20(t,2H),3.91(t,2H),3.45(s,2H),3.41-3.38(m,1H),2.91-2.84(m,1H),2.63-2.49(m,2H),2.25-2.23(m,2H),2.04-1.76(m,6H),1.60-1.56(m,2H)；MS(EI)m/z 666.1831[M]+。
实施例07.I07的合成
Figure BDA0002461879630000081
I07a和I07b在吡啶下反应生成I07，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是84％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm11.12(d,1H),10.92(s,1H),9.81(s,1H),8.95(s,1H),8.20(t,1H),8.03(d,1H),7.98-7.85(m,1H),7.81-7.70(m,1H),7.64-7.51(m,1H),7.14-7.03(m,1H),6.94(t,1H),6.85(d,1H),6.76(s,1H),5.10-5.02(m,1H),4.82-4.70(m,1H),3.93(d,2H),3.81(d,2H),3.22-3.12(m,8H),3.03(s,6H),2.94-2.81(m,1H),2.65-2.51(m,2H),2.43-2.26(m,2H),2.10-1.87(m,4H),1.76-1.53(m,4H),1.51-1.42(m,2H).；MS(EI)m/z 871.3271[M]+。
实施例08.I08的合成
Figure BDA0002461879630000082
I08a和I08b在吡啶下反应生成I08，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是81％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm11.18(s,1H),9.05(s,1H),8.11(dt,2H),7.90(t,1H),7.81(dd,1H),7.51(d,1H),7.41(d,1H),5.87-5.80(m,1H),5.15(dd,1H),4.82(s,2H),3.93-3.80(m,4H),3.72-3.55(m,8H),3.55-3.52(m,2H),3.48-3.44(m,2H),3.40-3.19(m,8H),3.00-2.98(br,1H),2.64-2.50(m,2H),2.42(s,3H),2.33(s,3H),2.26-2.11(m,2H),2.03(ddt,1H),1.97-1.86(m,2H),1.83-1.75(m,2H),1.66-1.55(m,2H).；MS(EI)m/z 989.3424[M]+。
实施例09.I09的合成
Figure BDA0002461879630000091
I09a和I09b在吡啶下反应生成I09，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是91％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm12.23(s,1H),11.04(s,1H),7.63(t,1H),7.53(dd,1H),7.36(s,1H),7.11(d,1H),7.01(d,1H),6.67(s,1H),6.60(t,1H),5.04(dd,1H),4.04(s,2H),3.62(t,2H),3.55-3.42(m,8H),3.39(t,2H),3.25(q,2H),2.89(s,2H),2.83(d,2H),2.65-2.58(m,2H),2.49-2.38(m,2H),2.12-1.98(m,3H),1.81-1.67(m,4H),1.18(s,9H).；MS(EI)m/z 921.2542[M]+。
实施例10.I10的合成
Figure BDA0002461879630000092
I10a和I10b在吡啶下反应生成I10，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是87％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm12.22(bs,1H),11.12(bs,1H),8.17(s,1H),8.03(t,1H),7.77(dd,1H),7.46(d,1H),7.36(d,1H),7.28-7.21(m,2H),6.93(s,1H),6.93-6.85(m,2H),6.85(d,1H),5.15-5.10(m,3H),4.77(s,2H--),4.38(t,2H),4.10(s,2H),4.05(s,2H,),3.20-3.11(m,2H),2.95-2.80(m,1H),2.66-2.55(m,2H),2.28(s,6H),2.10-2.01(m,1H),1.87-1.74(m,2H),1.46-1.34(m,2H).；MS(EI)m/z905.1766[M]+。
实施例11.I11的合成
Figure BDA0002461879630000101
I11a和I11b在吡啶下反应生成I11，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是92％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm7.57(s,1H),7.41-7.32(m,2H),6.88(d,1H),6.78(d,1H),6.18(s,1H),4.95(dd,1H),4.24(q,2H),3.86(s,3H),3.70-3.46(m,16H),2.87-2.56(m,3H),2.33(s,3H),2.17(s,3H),2.04-2.00(m,2H),1.96-1.80(m,2H),1.80-1.70(m,2H),1.44(t,3H),1.13-1.02(m,2H),0.88-0.78(m,2H).；MS(EI)m/z 998.3428[M]+。
实施例12.I12的合成
Figure BDA0002461879630000102
I12a和I12b在吡啶下反应生成I12，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是88％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm11.11(s,1H),9.53(s,1H),8.88(s,1H),8.62(s,1H),8.13(m,1H),7.83(d,1H),7.80(d,2H),7.65(d,1H),7.52(dd,1H),7.52(d,2H),7.17(dd,1H),7.04(d,1H),6.99(m,1H),6.82(d,1H),6.54(s,1H),5.00(dd,1H),4.20(m,2H),3.94(d,1H),3.77(m,2H),3.63(m,2H),3.54(m,4H),3.52(m,2H),3.46(t,2H),3.29(m,2H),2.92(m,1H),2.60(m,2H),2.05(m,1H),1.31(s,9H).；MS(EI)m/z 988.2567[M]+。
实施例13.I13的合成
Figure BDA0002461879630000111
I13a和I13b在吡啶下反应生成I13，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是87％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.38(d,1H),8.19(s,1H),7.95(d,1H),7.70(t,1H),7.67(s,1H),7.58(t,1H),7.43(t,1H),7.16(d,1H),7.08(d,1H),6.85(s,1H),5.03(dd,1H),4.62-4.59(m,1H),3.91(s,2H),3.65(d,2H),3.59-3.54(m,4H),3.37-3.33(m,1H),3.19(t,2H),3.09-3.05(m,1H),2.84e2.78(m,1H),2.71-2.65(m,2H),2.16(s,3H),2.07-1.96(m,5H),1.33(d,6H),1.24(d,6H).；MS(EI)m/z 966.2642[M]+。
实施例14.I14的合成
Figure BDA0002461879630000112
I14a和I14b在吡啶下反应生成I14，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是83％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm11.12(s,1H),7.57(dd,1H),7.54-7.50(m,1H),7.46(dd,2H),7.33(td,1H),7.22-7.13(m,2H),7.05(t,3H),6.62(s,1H),6.41(s,2H),5.03(dd,1H),4.41(d,1H),4.22(dd,2H),4.14(dd,1H),3.84(dd,1H),3.71-3.21(m,24H),3.05-2.85(m,2H),2.76-2.60(m,1H),2.12-1.78(m,2H),1.65-1.40(m,1H).；MS(EI)m/z 999.2967[M]+。
实施例15.I15的合成
Figure BDA0002461879630000121
I15a和I15b在吡啶下反应生成I15，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是91％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.59(q,2H),2.02-2.13(m,1H),2.31-2.38(m,4H),2.50-2.53(m,2H),2.56-2.64(m,1H),2.70-2.75(m,1H),2.77-2.91(m,1H),3.05-3.13(m,2H),3.27(s,3H),3.33-3.38(m,1H),3.42(t,2H),3.50(t,2H),3.55-3.60(m,1H),3.60-3.64(m,3H),3.81(br dd,12H),3.95(brdd,1H),4.04-4.10(m,1H),4.15-4.26(m,1H),4.34-4.40(m,3H),4.49-4.58(m,1H),5.01(dd,1H),6.82(d,1H),7.40(br s,1H),7.42(d,1H),7.45(d,1H),7.76(dd,1H),7.97(d,1H),8.06(s,1H),8.40(s,1H),10.72(br s,1H)；MS(EI)m/z 998.2718[M]+。
实施例16.I16的合成
Figure BDA0002461879630000122
I16a和I16b在吡啶下反应生成I16，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是93％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm7.65-7.88(br,2H),7.42-7.45(m,1H),7.25-7.39(br,4H),7.20(d,1H),7.00-7.13(br,2H),6.62-6.78(br,1H),6.37-6.58(br,1H),5.01(dd,1H),4.52-4.70(br,1H),4.08-4.28(br,2H),3.86-4.06(br,1H),3.72-3.80(br,1H),3.50-3.64(br,1H),3.42-3.50(br,1H),3.22-3.34(br,2H),3.00-3.14(br,5H),2.88-2.98(br 4H),2.69-2.85(br,6H),2.39-2.45(m,3H),2.25-2.37(br,1H),1.67-2.22(br,8H),1.42-1.53(m,1H).；MS(EI)m/z 931.2409[M]+。
实施例17.I17的合成
Figure BDA0002461879630000131
I17a和I17b在吡啶下反应生成I17，回流过夜。反应结束后，减压蒸除溶剂，加水用乙酸乙酯萃取三次，浓缩萃液得到白色固体，收率是86％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm11.12(s,1H),8.54(d,1H),8.34(s,1H),8.12(t,1H),7.83(d,1H),7.61-7.55(m,1H),7.50(t,1H),7.44-7.40(m,1H),7.36-7.30(m,4H),7.24(d,1H),7.22(d,1H),7.03(t,1H),7.00-6.90(m,2H),6.83(d,1H),6.57(dt,1H),5.05(dd,1H),4.78(t,1H),4.33(dd,1H),4.25-4.15(m,1H),3.90(d,2H),3.65-3.46(m,10H),3.41(dd,2H),3.24(dd,2H),2.96(d,4H),2.92-2.84(m,1H),2.12-1.92(m,2H),1.15-1.05(m,2H),0.91-0.80(m,2H).；MS(EI)m/z1075.3381[M]+。
实施例18.体外肿瘤细胞增殖抑制实验
采用CCK8评价候选化合物I01～I17对人源性肿瘤细胞的增殖活性。
(1)实验材料：
人源性肺癌细胞A549，人源性肺癌细胞EKVX，人源性肺癌细胞H1299，人源性肝癌细胞HepG2，人源性肝癌细胞SK-HepG1，人源性肝癌细胞Huh7，人源性乳腺癌细胞T-47D，人源性乳腺癌细胞MCF-7，人源性胃癌细胞MKN45，人源性胃癌细胞MGC803，人源性肝癌细胞PLC，人源性食管癌癌细胞U187，人源性食管癌癌细胞U85。10％牛血清培养基，PBS溶液，胰蛋白酶(sigma)，×10CCK8(sigma)。
(2)实验方法：
(i)A549细胞的复苏和传代：将装有A549的细胞冻存液从-80摄氏度冰箱中取出并离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬并转入10cm培养皿，37摄氏度培养箱中孵育24小时。选取生长较好的细胞，吸取培养液，PBS清洗并用胰酶消化，离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬；(ii)接种细胞：对上述细胞进行计数，按每孔3000～5000个细胞平均分配入各96孔板中，37摄氏度培养箱中孵育过夜；(iii)加入不同浓度的受试化合物，共孵育24小时；(iv)吸取上层清液，每孔加入100μL 10％的CCK8培养液，孵育1小时；(v)酶标仪在450nm下检测各孔吸光度的变化，并计算IC50值。
(3)实验结果：
CCK8增殖试验结果表明I01～I08能够显著抑制多种肿瘤细胞的增殖。实验值具体如表1：
表1.化合物I01～I08对各类细胞的增殖抑制活性(n＝3，SD值)
Figure BDA0002461879630000141
CCK8增殖试验结果表明I09～I17能够显著抑制多种肿瘤细胞的增殖。实验值具体如表2：
表2.化合物I09～I17对各类细胞的增殖抑制活性(n＝3，SD值)
Figure BDA0002461879630000142
Figure BDA0002461879630000151
实施例19.化合物促进靶蛋白降解活性评价实验
采用westernblotting评价候选化合物I01～I17对人源性肿瘤细胞内各个靶蛋白的降解活性。
(1)实验材料：实施例18中的各类人源性肿瘤细胞、10％牛血清培养基、PBS溶液、胰蛋白酶(sigma)、靶蛋白相关一抗(abcam公司或CST公司，2000～8000：1稀释)、二抗(IgGrabbit)、蛋白裂解液、×4SDS-loading。
(2)实验方法：(i)A549细胞的复苏和传代：将装有A549的细胞冻存液从-80摄氏度冰箱中取出并离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml10％牛血清培养基重悬并转入10cm培养皿，37摄氏度培养箱中孵育24小时。选取生长较好的细胞，吸取培养液，PBS清洗并用胰酶消化，离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬；(ii)接种细胞：对上述细胞进行计数，按每皿30万个细胞平均分配入各培养皿中，37摄氏度培养箱中孵育过夜；(iii)加入受试化合物(100nM、33.3nM、10nM、3.3nM)，共孵育6小时；(iv)孵育完，蛋白定量；(iv)10％的SDS-PAGE制胶并进行电泳实验；(v)转膜1小时后，20％牛奶封闭1小时，加入一抗孵育过夜；(vi)洗膜，并加入二抗孵育1小时。
(3)实验结果：
17个样品在100nM的给药浓度下，表现出了较好的细胞内靶蛋白降解活性活性，具体结果如表3：
表3.化合物I09～I17对各类靶蛋白的降解活性
Figure BDA0002461879630000152
Figure BDA0002461879630000161
实施例20.化合物促进肿瘤细胞凋亡评价实验
本发明又利用Annexin V/PI双染色法开展了I01～I17体外肿瘤细胞凋亡实验。
(1)实验材料：
各人源性肿瘤细胞，10％牛血清培养基，PBS溶液，胰蛋白酶(sigma)，Annexin V/PI双染色试剂盒。
(2)实验方法：(i)肿瘤细胞的复苏和传代：将装有A549的细胞冻存液从-80摄氏度冰箱中取出并离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml10％牛血清培养基重悬并转入10cm培养皿，37摄氏度培养箱中孵育24小时。选取生长较好的细胞，吸取培养液，PBS清洗并用胰酶消化，离心(1200rmp，3分钟)，去除上层清液，加入2ml 10％牛血清培养基重悬；(ii)接种细胞：对上述细胞进行计数，按每皿30万个细胞平均分配入各培养皿中，37摄氏度培养箱中孵育过夜；(iii)加入受试化合物，共孵育48小时；(iv)悬浮细胞离心(2000rpm离心5min)收集，用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1～5×10^5细胞，加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀，室温、避光、反应5～15min；(v)流式细胞仪分析受试样品。
(3)实验结果：
I01～I17在100nM给药浓度下，与各肿瘤细胞共孵育48小时，表现出明显的凋亡过程，而空白对照并没有发生细胞凋亡过程。实验值具体如表4：
表4.化合物I01～I17诱导肿瘤细胞凋亡
Figure BDA0002461879630000162
Figure BDA0002461879630000171
实施例21.化合物I01～I17的抗炎活性
(1)实验方法：颈椎脱臼处死小鼠，用75％乙醇浸泡小鼠5min；无菌条件下取出小鼠脾脏，剪去周围脂肪等结缔组织，RPMI 1640培养基洗涤组织2～3次；研磨脾脏，过200目细胞筛。将收集到的细胞悬液离心，再加入红细胞裂解液，轻轻吹匀后静置5min，离心，PBS洗涤；将细胞重悬于RPMI 1640(含10％FBS及1％双抗)完全培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4h；收集细胞悬液，离心，并用1640培养基(含10％FBS)重悬，台盼蓝染色，细胞计数，活细胞数大于95％，调整细胞密度至2.5X106/mL，即为小鼠脾淋巴细胞悬液，包含T、B淋巴细胞。实验分为对照组、LPS处理组(培养24h后，加入10μg/mL LPS)、LPS联合给药处理组(培养24h后，加入10μg/mL LPS，Selidomides)。ELISA检测培养淋巴细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8。
(2)实验结果：代表性含硒化合物I01、I04、I07、I10、I11整体下调TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8等多种促炎因子，但类似结构的非含硒类PROTAC分子多数没有该类功能报道，证明硒原子的引入能显著提升含硒PROTAC小分子的抗炎活性。
实施例22.代表性含硒化合物I01、I04、I07、I10、I11通过靶向硫氧还原蛋白诱导肿瘤细胞铁死亡
硒元素调节细胞铁死亡的研究报道已较多，单质硒元素在体内参与抗氧化并抑制细胞铁死亡。然而还原性硒元素能参与硫氧还原蛋白酶对肿瘤细胞内谷胱甘肽的循环氧化-还原过程，达到特异性诱导肿瘤细胞铁死亡的作用。
该实施例中涉及到的实验方法同实施例19，并利用western blotting检测了铁死亡相关蛋白COX2、NOX1、GPX4、FTH1，结论如下：
COX2、NOX1在给药浓度50～200nM时发生明显上调(与空白比较上调80％)；GPX4、FTH1在给药浓度50～200nM时发生上调(与空白比较下调80％)；同时非含硒类相关PROTAC没有该类作用；
本发明还利用市售试剂盒测试了细胞内谷胱甘肽过氧化物酶水平和二价铁离子水平，结论如下：谷胱甘肽过氧化物酶水平和二价铁离子水平明显下降，而三价铁离子的水平变化不大，直接表明代表性含硒化合物I01、I04、I07、I10、I11通过靶向硫氧还原蛋白诱导肿瘤细胞铁死亡。
实施例23.代表性化合物I01、I07、I11的体内抗肿瘤活性和铁死亡相关活性指标检测
取6周龄的BALB/c-Nude小鼠，按6～8只/组随机分组，每只小鼠皮下注射100μL，2～10×106个肿瘤细胞(数量由不同类型受试细胞生长状态决定)，种瘤完毕，观察瘤体积长至80～200mm3(V＝(长×宽2)/2)开始给药。给药剂量按1mg/Kg、10mg/Kg(给药频率为一天一次，5天连续给药后停2天，作为一个疗程)，并分别设置卡维地洛组(30mg/Kg)和阿霉素(1mg/Kg)两个阳性组，隔天称体重及测量瘤体积，空白组小鼠瘤体积长至1000mm3视为临床终点，断颈处死后取瘤测瘤重及拍照比对。同时，取小鼠癌组织及其癌旁组织，测试铁含量。
实验结果：如图1-2所示，代表性化合物I01、I07、I11表现出显著的体内抗肿瘤活性，且癌组织及其癌旁组织的二价铁离子明显下降(如图3-4所示)，说明其抗氧化功能被显著破坏，从而诱导肿瘤铁死亡。

Claims (10)

1.式I所示的含硒化合物，或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，
Figure FDA0002461879620000011
式I中：
X为O或N；
R1代表下列任一结构基团；
Figure FDA0002461879620000012
其中：m＝0～6；n＝0～6；p＝0～6；
Y为C或O或N；
R2为下列任一结构基团。
Figure FDA0002461879620000013
2.如权利要求1所述的含硒化合物，其特征是，其为式I-01、I-02、I-03、I-04、I-05、I-06、I-07、I-08、I-09、I-10、I-11、I-12、I-13、I-14、I-15、I-16或I-17所示的化合物。
Figure FDA0002461879620000021
3.具有权利要求1或2所述含硒化合物的药物组合物。
4.权利要求1或2所述含硒化合物，或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体，在制备抗肿瘤或抗炎药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征是，所述的肿瘤为肺癌、肝癌、胃癌、唇癌、食道癌、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、胆囊癌、喉癌、脑瘤、鳞癌、血管瘤、前列腺癌、肠癌、肾癌、骨癌、舌癌、淋巴癌、胰腺癌、膀胱癌、黑素瘤、白血病、皮肤癌、脂肪瘤、宫颈癌、甲状腺癌或胸腺癌。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征是，所述抗肿瘤包括抑制肿瘤细胞增殖、加速促癌蛋白降解、促进肿瘤细胞铁死亡、选择性诱导肿瘤细胞凋亡。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征是，所述抗炎包括抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8，或者激活抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征是，所述肿瘤细胞为人肺癌细胞、人肝癌细胞、人胃癌细胞、人唇癌细胞、人食道癌细胞、人鼻咽癌细胞、人乳腺癌细胞、人卵巢癌细胞、人子宫癌细胞、人胆囊癌细胞、人喉癌细胞、人脑瘤细胞、人鳞癌细胞、人血管瘤细胞、人前列腺癌细胞、人肠癌细胞、人肾癌细胞、人骨癌细胞、人舌癌细胞、人淋巴癌细胞、人胰腺癌细胞、人膀胱癌细胞、人黑素瘤细胞、人白血病细胞、人皮肤癌细胞、人脂肪瘤细胞、人宫颈癌细胞、人甲状腺癌细胞、人胸腺癌细胞。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征是，所述促进肿瘤细胞铁死亡，由含硒化合物中硒元素提供。
10.根据权利要求6所述的用途，其特征是，所述抗炎，主要由含硒化合物中硒元素提供。
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