CN113521034B - 一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒，其将四氢姜黄素包埋在玉米醇溶蛋白和透明质酸复合颗粒的内部，经反溶剂技术制备出透明质酸包覆玉米醇溶蛋白和四氢姜黄素的的纳米颗粒，该纳米颗粒粒径小于300nm，透明质酸分子量为100kDa；本发明还公开了一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，其包括步骤：S1、将玉米醇溶蛋白和四氢姜黄素加入到乙醇溶液中；配制透明质酸水溶液；S2、将所得的醇溶液与透明质酸溶液混合；S3、将得到的混合液蒸发和离心后，再经过后处理得到复合纳米颗粒；本发明复合纳米颗粒能有效抑制表皮细胞的凋亡及细胞炎症反应，改善由UVB诱导的皮肤的过度角化，达到预防皮肤光老化的效果。

Description

一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及皮肤光老化防治的技术领域，特别是涉及一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
皮肤受外界环境因素的影响老化的主要原因是日晒，由日光中的紫外线导致的不同于自然老化的皮肤衰老过程称为光老化。具体表现为皮肤粗糙、干燥、松弛、皱纹、色素沉着等，急性暴露在日光紫外线可导致晒伤红斑、皮肤屏障损伤和结缔组织的降解，长期慢性的紫外线照射会造成皮肤光老化，进而引发皮肤癌。随着全球环境的恶化、臭氧层的减少和紫外线辐射量的增加，人类皮肤光老化现象日益严重，皮肤癌发病率逐年增加，抑制光老化的发生和发展，保护皮肤组织免受紫外线损害已经成为相关领域的研究热点之一。
能穿过大气层达到地球表面的日光紫外线只有UVA和UVB两种，其中UVB被认为是太阳光中引起光老化及皮肤癌等皮肤损伤的最主要的紫外线。以往研究已有成熟的UVB对表皮细胞氧化损伤的模型，并进行了细胞凋亡、炎症、相关信号通路等方面的基础研究。通过活性物质的干预，抑制AP-1信号通路(MMP-1、MMP-3及MMP-9)及NF-κB(TNF-α、IL-6及IL-1)信号通路的表达，抑制胶原蛋白的降解及细胞炎症反应，进而达到预防皮肤光老化的效果。
四氢姜黄素THC具有抑制酪氨酸酶的强效活性，能有效抑制氧自由基的生成并能清除已经形成的自由基，具有明显的抗氧化作用。THC因其优良的性能广泛用于抗衰老、美白、祛斑、抗氧化的各类护肤品，如膏霜、乳液等产品中。此外，THC还具有抗炎、促进创面愈合等多种药理活性，但是，由于THC存在水溶性低、稳定性差、生物利用度较低等问题，其的开发和应用在一定程度上受到限制。目前尚无THC纳米制剂外用治疗光老化的报道，更没有含THC纳米颗粒的Zein-HA复合胶体颗粒的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供了一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒及其制备方法，其具有预防皮肤光老化作用。
为实现上述目的，本发明提供了一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒，其以四氢姜黄素为抗皮肤光老化的活性成分，将四氢姜黄素包埋在玉米醇溶蛋白和透明质酸复合颗粒的内部，经反溶剂技术制备出透明质酸包覆玉米醇溶蛋白和四氢姜黄素的的纳米颗粒，该纳米颗粒粒径小于300nm，所述透明质酸分子量为100kDa。
优选的，所述四氢姜黄素的含量为0.24-0.26mg/mL之间。
优选的，所述玉米醇溶蛋白、透明质酸和四氢姜黄素的质量含量比为1：0.05-0.083：0.05。
与现有技术相比，本发明提供的一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的有益效果在于：
(1)本发明中基于玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的纳米颗粒均来源于天然，安全无毒无刺激，无添加任何表面活性剂；
(2)本发明的玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的纳米颗粒，克服现有技术中四氢姜黄素水溶性差、其普通制剂体外溶出速率较慢、生物利用度差等缺陷，增加四氢姜黄素在水溶液中的溶解度，显著降低四氢姜黄素的细胞毒性，提高四氢姜黄素的皮肤渗透性，增强皮肤生物利用度；
(3)本发明中基于玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的纳米颗粒有效的抑制UVB诱导人永生化表皮细胞的光老化效应，降低UVB照射后表皮细胞的凋亡；降低UVB照射后表皮细胞TNF-α、IL-6、NO炎症因子的释放量，显著提高紫外线导致的人永生化表皮细胞的存活率，提高人永生化表皮细胞的活性，减少紫外线对其的伤害，降低受损细胞内活性氧的产量，达到抗皮肤光老化的作用，从而抑制表皮增生，改善皮肤皱纹，可用于制备具有抗光老化效果的化妆品，同时还减轻光老化皮肤组织和细胞的氧化损伤及其诱导的炎症，可用于制备具有祛痘消炎效果的化妆品或外用药音，为改善皮肤状态提供一种新的添加剂，并全方位对老化皮肤进行修复。
为实现上述目的，本发明还提供了一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
S1、将玉米醇溶蛋白和四氢姜黄素加入到乙醇溶液中，得到醇溶液；配制透明质酸水溶液，得到透明质酸溶液；
S2、将步骤S1所得的醇溶液与透明质酸溶液混合，充分搅拌，得到混合液；
S3、将步骤S2得到的混合液进行蒸发和离心后，得到复合纳米粒子胶体溶液，进而经过后处理得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒。
优选的，步骤S3中的后处理具体为如下：将步骤S3所得的复合纳米粒子胶体溶液中和到pH 7.0～7.4，然后干燥粉碎后得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒。
优选的，步骤S1中醇溶液的质量浓度为68％-72％。
优选的，步骤S1中玉米醇溶蛋白与醇溶液的质量体积比为0.8-1.2％g/mL。
优选的，步骤S1中四氢姜黄素与醇溶液的质量体积比为0.04-0.06％g/mL。
优选的，步骤S2中所述醇溶液与透明质酸溶液的体积比为1:(2.8-3.2)。
与现有技术相比，本发明提供的一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法的有益效果在于：
本制备方法步骤简单，条件可控性好，生产工艺极其稳定，可大批量生产出上述技术方案所述的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒，从而促进人类社会的进步。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中新制Zein-HA-THC复合纳米颗粒溶液外观图，序号1为1％Zein-0.05％HA-0.05％THC，序号2为1％Zein-0.083％HA-0.05％THC；
图2为实施例2中THC固体粉末、1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒中THC在水中的溶解度；
图3为实施例3中1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒、溶于DMSO的THC固体粉末、溶于水的THC固体粉末在不同THC浓度(6.25，12.5，25，50，100，200μg/mL)下对HaCaT细胞的存活率的影响；
图4为实施例3中1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒、溶于DMSO的THC固体粉末(THC-DMSO)、溶于水的THC固体粉末(THC-WATER)在THC给药浓度为12.5μg/mL时对应细胞形貌图；
图5-7为实施例4中1％Zein-0.05％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组、THC-DMSO组、THC-WATER组、空白组、模型组在THC给药浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL时的细胞凋亡结果图；
图8-10为实施例5中1％Zein-0.05％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组、THC-DMSO组、THC-WATER组、空白组、模型组在THC给药浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL时的TNF-α、IL-6、NO炎症因子释放量；
图11为实施例6中1％Zein-0.05％HA-0.01％Cou复合纳米颗粒组、1％Zein-0.083％HA-0.05％Cou复合纳米颗粒组、THC-Cou组在紫外和488nm的激发波长下的CLSM图；
图12为实施例7中1％Zein-0.083％HA-0.1％THC复合纳米颗粒上清液中样品的HPLC图和经鉴定为六氢姜黄素(HHC)、六氢姜黄素硫酸盐(HHCS)的原始质谱图；
图13是实施例8中光老化动物的HE染色的组织切片的组织学分析图；
图14是实施例8中光老化动物皮肤组织匀浆液中的抗氧化酶和细胞因子的水平的数据图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取0.2g Zein和0.01g THC溶解于20ml质量浓度为68％-72％(优选70％)的乙醇溶液；
(2)将0.03g HA溶解于60ml超纯水中，得到质量体积比为0.04％-0.06％(优选为0.05％)的HA溶液；
(3)将步骤(1)所得醇溶液加入到步骤(2)所得HA溶液中，转速600rpm/min下磁力搅拌3min，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒胶体溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合液旋转蒸发、离心后，得到20mL复合纳米粒子胶体溶液；
(5)将步骤(4)所得胶体溶液中和到pH7.4，得Zein-HA-THC复合纳米颗粒溶液。
本实施例对步骤(2)中HA的质量浓度进行了梯度试验，质量体积比分别为：0.050％、0.083％，得到不同HA质量浓度的Zein-HA-THC复合纳米颗粒。观察新制的颗粒溶液外观和扫描电镜图如图1所示。
本实施例提供的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的好处在于：
(1)本发明中基于玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的纳米颗粒均来源于天然，安全无毒无刺激，无添加任何表面活性剂；
(2)本发明的纳米颗粒克服现有技术中四氢姜黄素水溶性差、其普通制剂体外溶出速率较慢、生物利用度差等缺陷，增加四氢姜黄素在水溶液中的溶解度，显著降低四氢姜黄素的细胞毒性，提高四氢姜黄素的皮肤渗透性，增强皮肤生物利用度；
(3)本发明的纳米颗粒有效的抑制UVB诱导人永生化表皮细胞的光老化效应，降低UVB照射后表皮细胞的凋亡；降低UVB照射后表皮细胞TNF-α、IL-6、NO炎症因子的释放量，显著提高紫外线导致的人永生化表皮细胞的存活率，提高人永生化表皮细胞的活性，减少紫外线对其的伤害，降低受损细胞内活性氧的产量，达到抗皮肤光老化的作用，从而抑制表皮增生，改善皮肤皱纹，可用于制备具有抗光老化效果的化妆品，同时还减轻光老化皮肤组织和细胞的氧化损伤及其诱导的炎症，可用于制备具有祛痘消炎效果的化妆品或外用药音，为改善皮肤状态提供一种新的添加剂，并全方位对老化皮肤进行修复。
实施例2
一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取0.2g Zein和0.01g THC溶解于20ml质量浓度为70％的乙醇溶液；
(2)将0.03g HA溶解于60ml超纯水中，得到质量体积比为0.05％的HA溶液；
(3)将步骤(1)所得醇溶液加入到步骤(2)所得HA溶液中，转速600rpm/min下磁力搅拌3min，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒胶体溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合液旋转蒸发、离心后，得到20mL复合纳米粒子胶体溶液；
本实例对步骤(2)中HA的质量浓度进行梯度试验，质量体积比分别为：0.050％、0.083％，得到不同HA质量浓度的Zein-HA-THC复合纳米颗粒1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC；
取300μL步骤(4)所得复合纳米粒子胶体溶液和700μL无水乙醇混合，涡旋震荡1min，取1mL溶液过0.22μm有机相滤膜，在紫外吸收波长280nm下用HPLC-UV法测定THC含量；同时，取0.01g THC固体粉末溶解于20mL水溶液中，涡旋震荡1min，取1mL上清过0.22μm有机相滤膜，在紫外吸收波长280nm下用HPLC-UV法测定THC含量。探究Zein-HA-THC复合纳米颗粒对THC在水溶液中的增溶性能。
THC在水溶液中和在Zein-HA-THC复合纳米颗粒中的溶解度如图2所示。结果显示1％Zein-0.05％HA-0.05％THC复合纳米颗粒的溶解度为436.86μg/mL，1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒的溶解度为383.10μg/mL，相较于THC固体粉末在水溶液中的溶解度5.97μg/mL提升了近百倍。
实施例3
一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取0.2g Zein和0.01g THC溶解于20ml质量浓度为70％的乙醇溶液；
(2)将0.03g HA溶解于60ml超纯水中，得到质量体积比为0.05％的HA溶液；
(3)将步骤(1)所得醇溶液加入到步骤(2)所得HA溶液中，转速600rpm/min下磁力搅拌3min，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒胶体溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合液旋转蒸发、离心后，得到20mL复合纳米粒子胶体溶液；
本实例对步骤(2)中HA的质量浓度进行梯度试验，质量体积比分别为：0.050％、0.083％，得到不同HA质量浓度的Zein-HA-THC复合纳米颗粒1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC，同时制备THC固体颗粒溶于二甲基亚砜DMSO和超纯水的母液，母液浓度均为20mg/mL。将两种不同HA质量浓度的Zein-HA-THC复合纳米颗粒和两种不同溶剂的THC母液用细胞完全培养基(含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养液)稀释到样品工作浓度。
本实施例通过MTT法将复合纳米粒子胶体溶液作用于人永生化表皮细胞HaCaT检测复合纳米粒子胶体溶液的细胞毒性。
将HaCaT细胞以1×105个/ml浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置37℃，5％二氧化碳恒温培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入不同浓度(6.25，12.5，25，50，100，200μg/mL)的样品溶液100μL。同时设细胞对照组，即加入与样品液等量体积的完全培养液。每个浓度设3个平行。在37℃、5％CO2培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用1mL注射器小心地吸弃96孔板中的培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM基础培养液180μL，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养4h。小心吸弃孔内的细胞培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值：
细胞的存活率(％)＝A样品/A对照×100％
图3是1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒、溶于DMSO的THC固体粉末、溶于水的THC固体粉末在不同THC浓度(6.25，12.5，25，50，100，200μg/mL)下对HaCaT细胞的存活率的影响。结果表明，在任何浓度下1％Zein-0.05％HA-0.05％THC复合纳米颗粒的细胞毒性均明显小于THC-DMSO组，可显著降低THC的细胞毒性，表明玉米醇溶蛋白-透明质酸纳米颗粒对THC的包埋具有一定的保护和缓释的作用；此外，当THC给药浓度大于25μg/mL时，1％Zein-0.05％HA-0.05％THC和1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒的细胞毒性均小于THC-DMSO组，但是在THC较低浓度下，1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒显示出一定的细胞毒性，这可能是由于随着1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒中HA添加量的增多，过量的HA对细胞也有一定的负担。图4是对应的THC给药浓度为12.5μg/mL时对应细胞形貌图，可以看出THC-DMSO组相较于对照组细胞形态有一定程度的变圆，细胞数量减少，细胞不再贴壁生长，两组复合纳米颗粒组并没有此明显特征，表明纳米颗粒对THC具有一定的控制释放的作用。
实施例4
一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取0.2g Zein和0.01g THC溶解于20ml质量浓度为70％的乙醇溶液；
(2)将0.03g HA溶解于60ml超纯水中，得到质量体积比为0.05％的HA溶液；
(3)将步骤(1)所得醇溶液加入到步骤(2)所得HA溶液中，转速600rpm/min下磁力搅拌3min，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒胶体溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合液旋转蒸发、离心后，得到20mL复合纳米粒子胶体溶液；
本实例对步骤(2)中HA的质量浓度进行梯度试验，质量体积比分别为：0.050％、0.083％，得到不同HA质量浓度的Zein-HA-THC复合纳米颗粒1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC，同时制备THC固体颗粒溶于二甲基亚砜DMSO和超纯水的母液，母液浓度均为20mg/mL。将两种不同HA质量浓度的Zein-HA-THC复合纳米颗粒和两种不同溶剂的THC母液用细胞完全培养基(含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养液)稀释到样品工作浓度。
本实施例通过建立HaCaT细胞UVB损伤模型，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡探究将复合纳米粒子胶体颗粒HaCaT细胞的抗光老化作用。
将处于对数生长期的HaCaT细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，反复吹打均匀并以每孔2×105个细胞的密度接种于无菌直径6cm细胞培养皿中(2mL/皿)。置于5％CO2培养箱中37℃培养，24h后，弃去细胞培养基，用1mLPBS清洗细胞1次，之后再加入1mLPBS，1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒、THC-DMSO、THC-WATER组和对照组用紫外交联仪进行10mJ/cm2能量的照射(UVB辐照波长为317nm)，空白组不进行紫外辐照。之后吸弃PBS，实验组加入四组2mL不同THC终浓度(10,20,40μg/mL)的样品溶液，空白组和对照组加入等体积的DMEM完全培养基，加入样品之后将培养皿放回CO2培养箱中继续培养24小时，收集所有细胞。将10×Binding Buffer用双蒸水稀释成1×BindingBuffer工作液，吸取500μL的1×Binding Buffer工作液重悬细胞，随后每管依次加入5μLAnnexin V-FITC和5μLPI，轻柔涡旋混合均匀后，避光条件下室温孵育15min。用流式细胞仪进行检测，FL1通道为AnnexinV-FITC的绿色荧光，FL2通道为PI的红色荧光。激发波长为488nm，吸收波长为530nm。用Cell Quest Research Software(Becton Dickinson)软件进行数据处理和分析。
图5-7为实施例4中1％Zein-0.05％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组、THC-DMSO组、THC-WATER组、空白组、模型组在THC给药浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL时的细胞凋亡结果图。整体对比三个不同的给药浓度，我们可以看出随着THC浓度的增加，抗光老化的作用并没有呈现明显增加的趋势，在THC在较低剂量下10μg/mL时，具有较为明显的抗光老化的作用，此时，两组复合纳米颗粒组的活细胞存活率相较于模型组提高了10％左右，但是相较于THC-DMSO组并没有明显的提升，相较于THC-WATER组细胞存活率只是提高了5％左右，由于较低浓度下THC在水溶液中有一定的溶解度，包埋之后溶剂替换的优势也并不是很明显，提示在THC低浓度下复合纳米颗粒较THC-DMSO组并没有很明显的优势。但是当THC给药剂量为20μg/mL和40μg/mL时，我们可以很明显的看到两组复合纳米颗粒组相较于THC-DMSO组能够显著降低THC的细胞毒性，尤其是在40μg/mL时，THC-DMSO组的活细胞比例只有12.70％，1％Zein-0.05％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组活细胞占比67.27％，1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组活细胞占比78.22％，此时包埋之后的复合纳米颗粒较THC-DMSO组的优势非常明显，1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组相较于模型组63.06％的活细胞占比具有很明显的抗光老化的作用，虽然在此浓度下复合纳米颗粒组对HaCaT正常细胞有一定的细胞毒性，这可能是由于随着HA含量的增多，较高剂量的HA对紫外受损细胞的修复作用远大于其细胞毒性，这也是HA经常用于创面修复的原因之一。
实施例5
一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取0.2g Zein和0.01g THC溶解于20ml质量浓度为70％的乙醇溶液；
(2)将0.03g HA溶解于60ml超纯水中，得到质量体积比为0.05％的HA溶液；
(3)将步骤(1)所得醇溶液加入到步骤(2)所得HA溶液中，转速600rpm/min下磁力搅拌3min，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒胶体溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合液旋转蒸发、离心后，得到20mL复合纳米粒子胶体溶液；
本实例对步骤(2)中HA的质量浓度进行梯度试验，质量体积比分别为：0.050％、0.083％，得到不同HA质量浓度的Zein-HA-THC复合纳米颗粒1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC，同时制备THC固体颗粒溶于二甲基亚砜DMSO和超纯水的母液，母液浓度均为20mg/mL。将两种不同HA质量浓度的Zein-HA-THC复合纳米颗粒和两种不同溶剂的THC母液用细胞完全培养基(含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养液)稀释到样品工作浓度。
本实施例通过建立HaCaT细胞UVB损伤模型，采用酶联免疫吸附法法检测HaCaT细胞中分泌的TNF-α、IL-6、NO的含量探究复合纳米粒子胶体颗粒对HaCaT细胞的抗光老化作用。
将处于对数生长期的HaCaT细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，反复吹打均匀并以每孔2×105个细胞的密度接种于无菌直径6cm细胞培养皿中(2mL/皿)。置于5％CO2培养箱中37℃培养，24h后，弃去细胞培养基，用1mLPBS清洗细胞1次，之后再加入1mLPBS，1％Zein-0.05％HA-0.05％THC、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒、THC-DMSO、THC-WATER组和对照组用紫外交联仪进行10mJ/cm2能量的照射(UVB辐照波长为317nm)，空白组不进行紫外辐照。之后吸弃PBS，实验组加入四组2mL不同THC终浓度(10,20,40μg/mL)的样品溶液，空白组和对照组加入等体积的DMEM完全培养基，加入样品之后将培养皿放回CO2培养箱中继续培养24小时，收集每组细胞上清液进行测量TNF-α、IL-6、NO的含量。
紫外线辐射照射到皮肤表面，除了会产生大量自由基，还会使皮肤细胞分泌多种炎症因子，介导炎症反应，能够调节免疫应答和诱导凋亡。图8-10为实施例5中1％Zein-0.05％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组、1％Zein-0.083％HA-0.05％THC复合纳米颗粒组、THC-DMSO组、THC-WATER组、空白组、模型组在THC给药浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL时的TNF-α、IL-6、NO炎症因子释放量。整体对比三个不同的炎症因子，我们可以看出THC对于IL-6炎症因子的释放量具有明显的抑制作用，并且呈明显的浓度依赖性，而对于TNF-α和NO释放量的影响并不是很显著，提示IL-6可能是影响THC减少HaCaT紫外受损细胞炎症的主要通路之一，THC可以通过细胞内MAPKs/NF-κB信号转导通路，抑制TNF-α、IL-6mRNA等相关基因转录从而进一步抑制NO及相关炎症因子的产生，最终起到抗炎作用。对于IL-6炎症因子，我们可以从图9中可以看出，THC-DMSO组的炎症因子减少量较模型组呈现明显优势，但THC-WATER组整体效果较差，呈现明显的溶剂替代优势，并且两组复合纳米颗粒组的IL-6释放量THC-WATER组具有明显的降低，表明包埋之后的复合纳米颗粒不仅能显著降低细胞毒性，还具有显著的抗炎效果在制备具有祛痘消炎的护肤品方面具有良好的应用前景。
实施例6
本实例采用香豆素-6替代THC进行荧光标记一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒，包括以下步骤：
(1)准确称取0.2g Zein和0.002g香豆素-6(Cou)溶解于20ml质量浓度为70％的乙醇溶液；
(2)将0.03g HA溶解于60ml超纯水中，得到质量体积比为0.05％的HA溶液；
(3)将步骤(1)所得醇溶液加入到步骤(2)所得HA溶液中，转速600rpm/min下磁力搅拌3min，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载香豆素-6的复合纳米颗粒胶体溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合液旋转蒸发、离心后，得到20mL复合纳米粒子胶体溶液；
本实例对步骤(2)中HA的质量浓度进行梯度试验，质量体积比分别为：0.050％、0.083％，得到不同HA质量浓度的Zein-HA-Cou复合纳米颗粒1％Zein-0.05％HA-0.05％Cou、1％Zein-0.083％HA-0.05％Cou，同时制备Cou溶于二甲基亚砜DMSO的母液，母液浓度为1mg/mL。将两种不同HA质量浓度的Zein-HA-Cou复合纳米颗粒和Cou-DMSO母液用细胞基础培养基(DMEM高糖培养液)稀释到样品工作浓度(10μg/mL)。
本实例使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)显现荧光标记的颗粒的细胞摄取。在共聚焦皿(直径6cm)中，在37℃和5％CO2下，以每孔20,000个细胞的密度接种HaCaT细胞。24小时后，除去培养基，用预冷的PBS(pH＝7.4)洗涤细胞。为了研究细胞摄取，将细胞在无血清DMEM培养基中孵育4小时。孵育后，除去含有非内化颗粒的培养基，用预冷的PBS(pH＝7.4)洗涤细胞三次，以除去未掺入细胞中的样品，然后用PBS中的4％w/v多聚甲醛(sigmaaldrich)固定10分钟，并用预冷的PBS(pH＝7.4)洗涤两次。随后，用蓝色荧光DAPI核酸(400ng/mL)染色细胞核孵育20分钟。用预冷的PBS(pH＝7.4)洗涤细胞数次。最后，使用CLSM在488nm的激发波长下观察细胞的相关荧光。所有测量一式三份进行。
图11为实施例6中1％Zein-0.05％HA-0.01％Cou复合纳米颗粒组、1％Zein-0.083％HA-0.05％Cou复合纳米颗粒组、THC-Cou组在紫外和488nm的激发波长下的CLSM图。对比THC-Cou组我们可以很明显的看到，1％Zein-0.05％HA-0.01％Cou复合纳米颗粒组、1％Zein-0.083％HA-0.05％Cou复合纳米颗粒组的香豆素-6在蓝色的细胞核周围呈现均匀分布，并且并没有摄入到细胞核内部，不会对细胞核产生损伤，但是THC-Cou组香豆素-6在细胞中呈现松散分布，有些已经成功进入细胞核，可能对细胞核带来损伤促进细胞凋亡，由此可见，玉米醇溶蛋白-透明质酸复合纳米颗粒可以成功递送活性物质到细胞中，并起到降低细胞毒性和控制释放的作用。
实施例7
一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取0.2g Zein和0.01g THC溶解于20ml质量浓度为70％的乙醇溶液；
(2)将0.03g HA溶解于60ml超纯水中，得到质量体积比为0.05％的HA溶液；
(3)将步骤(1)所得醇溶液加入到步骤(2)所得HA溶液中，转速600rpm/min下磁力搅拌3min，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒胶体溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合液旋转蒸发、离心后，得到复合纳米颗粒1％Zein-0.083％HA-0.1％THC；
本实例将HaCaT细胞以每孔2.0×105个细胞的密度接种在φ35mm圆形细胞培养皿中24小时。然后将细胞与1％Zein-0.083％HA-0.1％THC纳米颗粒在HBSS培养基中孵育4h，通过原始纳米颗粒中THC量中减去从细胞培养上清液中回收的未摄取的THC来确定细胞对THC的摄取量。细胞吸收实验后的的上清液经过预处理后进行HPLC-MS分析。图12为实施例7中1％Zein-0.083％HA-0.1％THC复合纳米颗粒上清液中样品的HPLC图和经鉴定为六氢姜黄素(HHC)、六氢姜黄素硫酸盐(HHCS)的原始质谱图。
由于THC具有酮羰基和烯醇结构互变，因此标准THC色谱图中有两个峰。细胞吸收4h后，在4.532和8.129分钟的峰时间细胞内和吸收后的上清液中军没有峰，而在3.836分吸收后的上清液中出现了一个信号值更高的新峰。没有经过纳米颗粒吸收的细胞对照的HPLC图在3.836分没有信号峰排除了此新峰源自细胞自身分泌物的影响，因此，可以确定THC纳米颗粒成功进入细胞并在细胞中发生代谢转化，其中代谢物释放到细胞培养基中，导致出现新的峰。
图12中HPLC-MS/MS的结果首次证明1％Zein-0.083％HA-0.1％THC复合纳米颗粒在经过HaCaT细胞吸收后转化为六氢姜黄素(HHC)(m/z373)和六氢姜黄素硫酸盐(HHCS))(m/z 453)，尤其是在细胞培养液中，HHC是最大的代谢产物，具有最高的峰面积(AA＝9929449806)。
实施例8
一种抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取0.2g Zein和0.02g THC溶解于20ml质量浓度为70％的乙醇溶液；
(2)将0.05g HA溶解于60ml超纯水中，得到质量体积比为0.05％的HA溶液；
(3)将步骤(1)所得醇溶液加入到步骤(2)所得HA溶液中，转速600rpm/min下磁力搅拌3min，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒胶体溶液；
(4)将步骤(3)得到的混合液旋转蒸发、离心后，得到20mL复合纳米颗粒1％Zein-0.083％HA-0.1％THC(ZHT)。
本实施例建立UVB损伤的小鼠皮肤光老化模型，通过苏木精和曙红(HE)染色光镜观察皮肤厚度和酶联免疫吸附法法检测皮肤组织中TNF-α、IL-6、MMP-1、Ⅰ型前胶原蛋白(PC-Ⅰ)含量。
4-5周龄的雌性小鼠(ICR)(20-25g；n＝50)从湖南斯莱克实验动物有限公司购买。该研究的实验方案已获得华南理工大学动物伦理与使用委员会的批准(2020018)。小鼠经过一周的检疫和适应后，在背部2cm×3cm的区域中用3％的硫化钠处理用于小鼠脱毛，然后将其随机分为5组(每组10只小鼠)：Control组(不照射紫外)，UVB Model组(照射紫外)，阳性对照(PC，0.05％视黄酸)，ZHT纳米颗粒治疗组和THC组，剂量为0.25mg/mL THC。在UVB照射前一小时，用0.3mL的样品制剂处理每只小鼠背侧表面的焦点部分。对于局部实验，每隔一天用312nm的UVB照射小鼠背部皮肤8周。在最初的2周内将辐照强度设置为60mJ/cm2，在第三周内将辐照强度提高至120mJ/cm2，在第四周内提高至180mJ/cm2，在第五周至第八周内提高至240mJ/cm2。
在最后一次UVB照射之后，对动物实施安乐死，并从背侧皮肤进行活检以进行组织学分析。将活检组织在4％多聚甲醛中固定24小时，然后包埋在石蜡中。皮肤组织切片用HE染色并观察组织形态。称重皮肤并以1：9(w/v)的比例与生理盐水混合，在冰上均质，并以5000g离心10分钟，测量10％匀浆上清液中的抗氧化酶和细胞因子的水平。
图13是实例8中光老化动物的HE染色的组织切片的组织学分析，Model组与Control组相比证实已成功建立了动物皮肤光老化模型，其特征是Model组的皮脂腺中真皮层紊乱、嗜碱性变性和细胞异常增殖，与UVB照射的Model组相比，ZHT纳米颗粒显着减轻了表皮增厚，在相同浓度下，ZTH的作用强于THC。
图14是实例8中光老化动物皮肤组织匀浆液中的抗氧化酶和细胞因子的水平，UVB辐射诱导内源性抗氧化酶的消耗，这使ROS在组织细胞中积聚并引起氧化损伤，ZHT纳米粒子处理的光老化的皮肤中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)蛋白水平显着增加，可防止UVB介导的光老化。此外，在图14中，我们可以看到治疗效果部分可追溯到炎症减轻和MMP-1抑制。THC对皮肤组织中细胞因子表达的影响比在阳性对照组中更明显。UVB辐照诱导的ROS积累激活丝裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)，后者通过ROS介导的途径与激活蛋白1相关联。激活蛋白1可以提高MMP和促炎细胞因子的转录活性，并进一步表明其在光老化过程中的重要影响。在衰老过程中，通过纳米颗粒处理造成的I型前胶原蛋白的上调导致皮肤疾病的缓解，包括皮肤厚度减小和其坚韧的机械完整性。这些结果表明ZHT纳米粒子在保护小鼠皮肤免受UVB诱导的光老化方面具有最显着的功效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种外用的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒，其特征在于，以四氢姜黄素为抗皮肤光老化的活性成分，将四氢姜黄素包埋在玉米醇溶蛋白和透明质酸复合颗粒的内部，经反溶剂技术制备出透明质酸包覆玉米醇溶蛋白和四氢姜黄素的纳米颗粒，该纳米颗粒粒径小于300nm，所述透明质酸分子量为100kDa；
所述玉米醇溶蛋白、透明质酸和四氢姜黄素的质量含量比为1：0.05-0.083：0.05。
2.根据权利要求1所述的一种外用的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒，其特征在于，所述四氢姜黄素的含量为0.24-0.26mg/mL之间。
3.一种外用的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1、将玉米醇溶蛋白和四氢姜黄素加入到乙醇溶液中，得到醇溶液；配制透明质酸水溶液，得到透明质酸溶液；
S2、将步骤S1所得的醇溶液与透明质酸水溶液混合，充分搅拌，得到混合液；
S3、将步骤S2得到的混合液进行蒸发和离心后，得到复合纳米粒子胶体溶液，进而经过后处理得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的一种外用的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S3中的后处理具体为如下：将步骤S3所得的复合纳米粒子胶体溶液中和到pH7.0～7.4，然后干燥粉碎后得到玉米醇溶蛋白-透明质酸负载四氢姜黄素的复合纳米颗粒。
5.根据权利要求3所述的一种外用的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S1中醇溶液的质量浓度为68％-72％。
6.根据权利要求3所述的一种外用的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S1中玉米醇溶蛋白与醇溶液的质量体积比为0.8-1.2％g/mL。
7.根据权利要求3所述的一种外用的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S1中四氢姜黄素与醇溶液的质量体积比为0.04-0.06％g/mL。
8.根据权利要求3所述的一种外用的抗皮肤光老化的复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述醇溶液与透明质酸溶液的体积比为1:(2.8-3.2)。
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