CN113512099A - 一种葡萄球菌蛋白a、纯化制备方法及其应用 - Google Patents

一种葡萄球菌蛋白a、纯化制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用，本发明主要涉及通过基因工程改造的蛋白ProteinA基因连入表达载体来构建重组质粒，导入原核宿主细胞中进行表达，经Ni亲和和离子交换层析纯化，可获得纯度大于95％的目的蛋白。本发明纯化制备方法具有纯化工艺简便、收率高等特点。同时制备的ProteinA具有良好的免疫球蛋白IgG结合力、耐碱性和热稳定性。并且固相载体偶联ProteinA制备的亲和介质具有吸附IgG效果佳、载样量高和耐碱性的优点。本发明制备的ProteinA蛋白及其偶联制备的介质在单克隆抗体纯化领域和免疫诊断研究上均能起到重要的作用。

Description

一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程中克隆改造ProteinA的技术领域，具体涉及一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用。
背景技术
20世纪中期，Jensen发现有一种蛋白可以与人和兔血清抗体广泛结合，该蛋白于1964年首次被称为Protein A。Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42KDa，它能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段而与Fab区或轻链结合很弱。天然的ProteinA有5个IgG结合结构域E、D、A、B、C和未知功能的非Fc结合域，5个不同的结构域可以结合IgG的Fc片段，具有很强的特异性亲和力，每个ProteinA分子至少可以结合两个IgG分子。同时，IgA、IgM或者IgE也有可能和ProteinA结合。此结构的蛋白A大量结合IgG的同时，其非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够，通常工业合成的抗体经过一步蛋白A亲和层析后样品纯度可超过90％。但对于单克隆抗体来说，这个纯度往往是不够的。因此选择基因工程的方法克隆ProteinA的基因并进行改造，得到重组型蛋白A，加强特异性结合能力，降低非特异性结合，提高耐碱能力及其他性质，是获得优良性质蛋白A制备亲和层析介质的重要途径。
随着一批批单克隆抗体的获批上市，FDA获批中86％的在单克隆抗体的捕获步骤使用蛋白A，在纯化工艺中主要利用了ProteinA层析作为捕获步骤，自从1978年起，蛋白A的产率和载量已分别以每年4.3％和5.5％的速率增长。正是因为蛋白A的特异性吸附能力，在纯化单克隆抗体中体现着数量级的优势，随着单克隆抗体工业化推进的背景下，蛋白A市场巨大。
蛋白A对NaOH的耐受性特别重要，是合成高性能蛋白A亲和层析介质的重要评价指标，主要原因：
1)大规模应用所需：细菌的失活以及热原的去除和防腐剂管理是大规模纯化的重要问题，以确保没有携带和避免不同分离的蛋白质的交叉污染。
2)CIP(cleaning-in-place)所需：NaOH为首选的清洗剂，具有多种优势。能有效溶解脂质、蛋白质和核酸；且从色谱基质中解吸结合物；能够有效的灭活微生物、破坏内毒素；而且，价格便宜，易于监测和清除；
综上所述，本发明依据当前的研究背景，针对ProteinA作为工业化单克隆抗体纯化的关键步骤，同时ProteinA也存在于免疫筛查、免疫诊断等方面的广泛应用，通过基因工程等技术改造获得性能更优，同时符合工业化实际应用需求的ProteinA蛋白，是当前迫切需要的。
发明内容
本发明所要解决的问题是：提供一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用，本方法通过基因克隆改造设计于原核体系表达的ProteinA蛋白，产量高，且纯化制备工艺简单、高效、成本低。制备获得的ProteinA蛋白具有耐碱性高、热稳定性强、储存性良好及特异性吸附IgG能力强等优势，与固相载体偶联获得的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高等优点。
本发明为解决上述问题所提供的技术方案为：
一种葡萄球菌蛋白A，所述葡萄球菌蛋白A的B功能结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。
本发明还公开了一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，所述方法包括
将来源于葡萄球菌的ProteinA蛋白的B功能结构域进行部分位点突变，形成ProteinA-1和ProteinA-2；
构建重组质粒，原核体系诱导表达，表达的重组ProteinA蛋白经Ni亲和层析及离子交换层析分离纯化，纯度大于95％。
优选的，所述ProteinA-1的突变位点包含：A176V、N178H，N181D，Q184A，E190K，N198T，N203G，G204A，N218A，A221S，D228E，A229S共12处突变，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述ProteinA-2的突变位点包含：A176V，Q184H，E190K，N198S，N203G，G204A，D211H，N218A，A221S，D228E，A229S共11处突变，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的，所述重组质粒的表达载体为pET30a，宿主菌为大肠杆菌宿主细菌BL21(DE3)，经过培养OD600为0.3～0.8时添加终浓度为0.1～1.0mM的IPTG，于18～37℃诱导表达3～8h。
优选的，Ni亲和层析工艺的结合缓冲液含有20mM咪唑，淋洗缓冲液含有40mM咪唑，洗脱缓冲液含有500mM咪唑；选用阴离子交换层析进行进一步纯化，流动相pH为7.0～9.0，采用盐离子浓度增加的方式洗脱目的蛋白。
本发明还公开了一种采用上述葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法制得的葡萄球菌蛋白A在亲和介质的配基中的应用。
本发明还公开了一种采用上述葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法制得的葡萄球菌蛋白A在抗体纯化及免疫诊断研究中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点是：
本发明构建获得的ProteinA蛋白，纯化制备工艺简单、收率高。并具有耐碱性高、热稳定性强、储存性良好及特异性吸附IgG能力强等优势，与固相载体偶联获得的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高的优点。本发明涉及的葡萄球菌蛋白A纯化制备方法及应用针对当前市场需求极大的抗体纯化市场及相关的免疫诊断及筛查具有重要意义。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明ProteinA蛋白构建的重组质粒示意图；
图2为本发明实施例2中纯化制备获得的ProteinA-1和ProteinA-2蛋白SDS-PAGE电泳分析图；
图3为本发明实施例2中纯化制备获得的Protein A-1和Protein A-2蛋白耐碱性测试的SDS-PAGE电泳分析图；
图4为本发明实施例2中ProteinA-1和ProteinA-2蛋白偶联固相获得的亲和介质特异性吸附IgG抗体的测试结果分析图；
图5为本发明实施例2中ProteinA-2固相亲和介质的耐碱性测试结果分析图。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
一种葡萄球菌蛋白A，所述葡萄球菌蛋白A的B功能结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。
一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，所述方法包括
将来源于葡萄球菌的ProteinA蛋白的B功能结构域进行部分位点突变，形成ProteinA-1和ProteinA-2；
构建重组质粒，原核体系诱导表达，表达的重组ProteinA蛋白经Ni亲和层析及离子交换层析分离纯化，纯度大于95％。
在本实施例中，所述ProteinA-1的突变位点包含：A176V、N178H，N181D，Q184A，E190K，N198T，N203G，G204A，N218A，A221S，D228E，A229S共12处突变，氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
在本实施例中，所述ProteinA-2的突变位点包含：A176V，Q184H，E190K，N198S，N203G，G204A，D211H，N218A，A221S，D228E，A229S共11处突变，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本实施例中，所述重组质粒的表达载体为pET30a，宿主菌为大肠杆菌宿主细菌BL21(DE3)，经过培养OD600为0.3～0.8时添加终浓度为0.1～1.0mM的IPTG，于18～37℃诱导表达3～8h。
在本实施例中，Ni亲和层析的结合缓冲液含有20mM咪唑，淋洗缓冲液含有40mM咪唑，洗脱缓冲液含有500mM咪唑；选用阴离子交换层析进行进一步纯化，流动相pH为7.0～9.0，采用盐离子浓度增加的方式洗脱目的蛋白。
本发明还公开了一种采用上述葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法制得的葡萄球菌蛋白A在亲和介质的配基的应用。
本发明还公开了一种采用上述葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法制得的葡萄球菌蛋白A在抗体纯化及免疫诊断研究的应用。
实施例2
1.1ProteinA蛋白基因合成改造设计：
其中突变位点包含：A176V，N178H，N181D，Q184A，E190K，N198T，N203G，G204A，N218A，A221S，D228E，A229S共12处突变的ProteinA-1蛋白，及A176V，Q184H，E190K，N198S，N203G，G204A，D211H，N218A，A221S，D228E，A229S共11处突变的ProteinA-2蛋白，目的为增强目的蛋白的稳定性及耐碱性。
1.2ProteinA蛋白重组质粒构建：
本发明一种ProteinA蛋白纯化制备方法及应用，依据1.1中基因合成改造设计，委托金斯瑞公司合成相应的基因，并连入pET30a(金斯瑞)载体构建重组质粒。为了更好的说明本发明ProteinA的优越性能，将野生型ProteinA(WT)同样委托公司进行合成，作为阴性对照。
通过DNA合成公司，合成的ProteinA基因序列(ProteinA-1和ProteinA-2蛋白)及野生蛋白A基因序列(WT)。将合成的3种蛋白基因片段与原核表达载体pET30a连接，构建得到重组质粒，如图1所示。
1.3阳性菌培养表达条件的优化：
将获得的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3，CD601-02，全式金)，挑取单克隆尝试小量诱导表达尝试，确定较适的蛋白表达条件；
(1)、取出一支50μL大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3，CD601-02，全式金)于冰上放置，待解冻后加入2μL质粒(100ng/μL)，用手指轻轻弹拨混匀，冰上放置30min，42℃热击90s，冰上放置3min后加入350μL无抗性的的LB培养基，37℃，180rpm孵育45min～1h，3000rpm离心2min，弃去250μL上清，轻轻吹打混匀，涂布在含有Kan抗性(100μg/mL，Solarbio，K8020-10g)的LB固体培养基上，37℃培养箱倒置过夜培养，获取单菌落。
(2)、挑取2-4个转化后的单菌落分别接种至5mL含含有Kan抗性(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，180rpm摇床过夜培养。保存菌种后1％的接菌量接种于含有Kan抗性(100μg/mL)的20mL LB培养基中，37℃、180rpm培养至OD600为0.4～0.6，分别进行18℃低温诱导和37℃诱导。
(3)、18℃低温诱导：加入5μL IPTG(1mol/L，Solarbio，I8070-5g)诱导剂，18℃，70rpm诱导12h。
37℃诱导：加入5μL IPTG(1mol/L)诱导剂，37℃，180rpm诱导3h。
(4)、收集诱导后的菌体进行超声破碎，每一步收集样本进行SDS-PAGE电泳检测，分析不同温度诱导融合蛋白的表达情况。12％SDS-PAGE电泳检测诱导结果。
1.4蛋白表达及纯化：
在最适表达条件下对菌体进行扩大培养，诱导大量目标蛋白表达，表达菌体经超声破碎、镍柱亲和层析、阴离子交换层析、超滤浓缩等单元操作制备过程，最终获得电泳纯度大于95％的目标蛋白。
具体实验方法如下：
(1)、蛋白表达：挑取重组质粒转化大肠杆菌BL21后涂布平板的单菌落于20mL含100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃、180rpm培养过夜，按1％的比例接种于500mL含100μg/mLKan的LB培养基中，37℃、180rpm培养3h后加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导(125μL1M IPTG)，37℃、100rpm培养3h。4700rpm 4℃离心20min收集菌体。
(2)、菌体破碎处理：取(1)中菌液各1管(30ml)加溶菌酶(Solarbio，L8120-50g终浓度1mg/mL)，冰上超声破碎(30％功率，破2s停2s，3min)，破碎2次。取破碎液80μL，加入20μL 5×上样缓冲液，95℃变性10min，进行12％SDS-PAGE电泳分析。
(3)、镍柱亲和层析：破碎后12000rpm 4℃离心5min后过0.45μm的滤膜，取上清80μl，加入20μL 5×上样缓冲液，95℃变性10min，进行12％SDS-PAGE电泳分析。剩余上清泵上样，AKTApure蛋白纯化仪，40Ni柱(16*70mm)，15mL色谱柱，流动相为Binding buffer(20mMNa3PO4、20mM咪唑、pH＝7.4)；Washing buffer(20mM Na3PO4、40mM咪唑、500mM NaCl pH＝7.4)；Elution buffer(20mM Na3PO4、500mM咪唑、pH＝7.4)；流速：5mL/min；检测波长：280nm；平衡：3个柱体积Binding buffer；淋洗：3个柱体积Binding buffer；洗脱1：3个柱体积Washing buffer；洗脱2：3个柱体积60％Elution buffer；收集馏分，通过第一次镍柱纯化，有效捕获到了目的蛋白，收集样品进行12％SDS-PAGE电泳检测。因下一步需进行阴离子交换层析，除去更多杂质，获得精纯的目的蛋白，因此，将洗脱样品进行无菌纯水进行稀释10倍左右。
(4)、阴离子交换层析：使用AKTApure蛋白纯化仪，选择色谱柱40Q(16*100mm，20mL)；流动相A相为BufferA(20mM Tris，pH＝8.0)，B相为Buffer B(20mM Tris+1MNaCl，pH＝8.0)；检测波长为280nm；流速设定为4mL/min；样品为上一步骤Buffer置换后获得；实验方法如下：a)平衡：使用2倍柱体积流动相A平衡至响应值稳定，调零，保持基线平行；b)上样：泵上样；c)淋洗：2倍柱体积流动相A冲洗，紫外曲线冲洗至稳定的基线；d)洗脱：3％流动相B等度洗脱，12％流动相B等度洗脱，20％流动相B等度洗脱，30％流动相B等度洗脱，100％流动相B等度洗脱，收集紫外峰，进行12％SDS-PAGE电泳检测。
(5)、超滤浓缩：根据电泳结果合并馏分，选择10KDa截留Millipore超滤离心管进行超滤浓缩，即得纯度合格的融合蛋白。12％SDS-PAGE电泳检测如图2所示。
所获得的ProteinA蛋白，产量较高，经过简略的两步纯化工艺，即可获得高纯度及高浓度的目的蛋白，纯化工艺简单、高效且成本低。从电泳的胶图所示，目的条带较为明显，几乎肉眼难以观察杂带的出现，目的蛋白的纯度大于95％。
1.5对纯化的ProteinA蛋白进行耐碱性测试：
为探究ProteinA-1和ProteinA-2蛋白的耐碱性，向蛋白样品中分别加入终浓度为0.3M的NaOH溶液，设置0h对照组为蛋白中加入相应体积的超纯水，充分混匀后静置孵育12h后取样进行12％SDS-PAGE电泳检测，电泳图如图3所示，经过0.3M NaOH处理12h后，WT已出现严重弥散现象，而ProteinA-1和ProteinA-2蛋白相对稳定，主带仍然可见。
1.6ProteinA-1和ProteinA-2蛋白固相偶联亲和介质特异性吸附IgG抗体测试：
将ProteinA-1和ProteinA-2蛋白与固相琼脂糖填料偶联，制备亲和介质，使用PBS缓冲液冲洗3遍后加入等量的BSA和IgG蛋白，补加PBS至1.0mL，混匀。室温摇床孵育2h后，离心取上清进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图4所示。结果表明孵育前后，Protein A-1和ProteinA-2蛋白与固相琼脂糖填料偶联获得的亲和介质均能特异性选择性吸附了IgG，而没有吸附BSA蛋白。使用兔血清样本进一步对亲和介绍进行测试，如图4所示，经过ProteinA-1和ProteinA-2固相亲和介质纯化后的兔血清样本能够获得较高纯度的IgG抗体。
1.7ProteinA-1和ProteinA-2固相亲和介质耐碱性测试:
为了测试ProteinA-1和ProteinA-2固相亲和介质的耐碱能力，将其填装为预装柱，柱体积为1mL，循环次数对预装柱进行0.1M NaOH清洗，循环50个柱体积及100个柱体积后，分8个柱体积上样IgG(2.5mg/mL)抗体，监测耐碱后对IgG吸附能力的情况。样品进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图5所示。胶图结果显示，当预装柱经过50个柱体积的碱性处理后，与未经碱处理时吸附IgG的能力相当。当经过100个柱体积的碱性处理后，吸附IgG的能力明显有下降的趋势。因此，ProteinA-2填料在循环使用50个柱体积0.1M NaOH处理，并不影响其吸附IgG的能力，当进行循环100个柱体积0.1M NaOH处理时才能影响其吸附IgG的能力。
根据以上实施例的方法与结果可知，通过本发明的基因克隆改造设计获得的重组质粒，经过表达诱导，可以通过相对较为简便的纯化制备工艺，高效率的制备ProteinA蛋白，经检测本发明获得的ProteinA蛋白体积排阻色谱分析显示纯度高于95％以上，通过实验测试，本发明获得的ProteinA蛋白具有耐碱性强、热稳定良好、储存性好及吸附IgG能力强等优势，与固相载体偶联获得的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率高的优点。本发明涉及的新一种葡萄球菌蛋白A纯化制备方法及应用，针对当前需求极大的抗体纯化市场及相关的免疫诊断及筛查具有深远意义。本发明通过基因克隆改造设计获得的ProteinA通过检测数据表明其耐碱性、热稳定性、储存性能及特异性吸附IgG性能具有一定的优势，与固相载体偶联获得的亲和层析介质具有IgG选择特异性吸附、动态载样量高、耐碱性稳定的优点。本发明涉及ProteinA的表达及纯化制备方法可为当前需求极大的抗体纯化市场及相关的免疫诊断提供物质基础。
以上仅就本发明的最佳实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化。凡在本发明独立权利要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明保护范围内。
序列表
<110> 江西省中科院大连化物所中药科学中心
<120> 一种葡萄球菌蛋白A、纯化制备方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> Protein A-1
<400> 1
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe
50 55 60
Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn
65 70 75 80
Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp
85 90 95
Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu
100 105 110
Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn
115 120 125
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn
145 150 155 160
Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Val
165 170 175
Asp His Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Asn Ala Phe Tyr Lys Ile Leu
180 185 190
His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Gly Ala Phe Ile Gln Ser
195 200 205
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Ala Leu Leu Ser Glu Ala Lys
210 215 220
Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys
225 230 235 240
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
245 250 255
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
260 265 270
Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
275 280 285
Ala Pro Lys
290
<210> 2
<211> 286
<212> PRT
<213> Protein A-2
<400> 2
Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
1 5 10 15
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
20 25 30
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln
35 40 45
Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln
50 55 60
Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln
65 70 75 80
Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr
85 90 95
Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
100 105 110
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
115 120 125
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
130 135 140
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
145 150 155 160
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn
165 170 175
Lys Glu His Gln Asn Ala Phe Tyr Lys Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
180 185 190
Ser Glu Glu Gln Arg Gly Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys His Asp Pro
195 200 205
Ser Gln Ser Ala Ala Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser
210 215 220
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
225 230 235 240
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
245 250 255
Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile
260 265 270
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
275 280 285

Claims (8)

1.一种葡萄球菌蛋白A，其特征在于：所述葡萄球菌蛋白A的B功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.一种如权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，其特征在于：所述方法包括
将来源于葡萄球菌的ProteinA蛋白的B功能结构域进行部分位点突变，形成ProteinA-1和ProteinA-2；
构建重组质粒，原核体系诱导表达，表达的重组ProteinA蛋白经Ni亲和层析及离子交换层析分离纯化，纯度大于95％。
3.根据权利要求1所述的一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，其特征在于：所述Protein A-1的突变位点包含：A176V、N178H，N181D，Q184A，E190K，N198T，N203G，G204A，N218A，A221S，D228E，A229S共12处突变，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求2或3所述的一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，其特征在于：所述ProteinA-2的突变位点包含：A176V，Q184H，E190K，N198S，N203G，G204A，D211H，N218A，A221S，D228E，A229S共11处突变，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.根据权利要求1所述的一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，其特征在于：所述重组质粒的表达载体为pET30a，宿主菌为大肠杆菌宿主细菌BL21(DE3)，经过培养OD600为0.3～0.8时添加终浓度为0.1～1.0mM的IPTG，于18～37℃诱导表达3～8h。
6.根据权利要求1所述的一种葡萄球菌蛋白A的纯化制备方法，其特征在于：Ni亲和层析工艺的结合缓冲液含有20mM咪唑，淋洗缓冲液含有40mM咪唑，洗脱缓冲液含有500mM咪唑；选用阴离子交换层析进行进一步纯化，流动相pH为7.0～9.0，采用盐离子浓度增加的方式洗脱目的蛋白。
7.一种如权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A在亲和介质的配基中的应用。
8.一种如权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A在抗体纯化及免疫诊断研究中的应用。
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