CN113501905A - 基于光诱导质子转移过程的光响应dna水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，在光照刺激下，光酸基团释放质子并被对质子敏感的DNA结构捕获导致DNA结构变化，进而引发具有该DNA结构的水凝胶发生溶液向凝胶态或凝胶向溶液态的转变；在紫外光照射下，修饰在丙烯酰胺/DNA共聚物上的光酸产生剂释放出氢离子，富胞嘧啶序列DNA与氢离子结合后形成分子间或分子内i‑motif四链体结构，共聚物链可随之发生交联或解离，实现光照条件下相应的相转变过程，本发明通过光酸产生剂单体、丙烯酰胺以及修饰不饱和双键DNA的共聚合，实现基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的构建，过程成本较低且操作简便，光响应DNA水凝胶在生物传感、驱动器及药物释放等领域具有一定应用前景。
Description
技术领域
本发明属于水凝胶技术领域，尤其是涉及一种基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法。
背景技术
水凝胶具有三维交联的聚合物网络结构，其含水量大于90％。正因如此，水凝胶具有和许多自然界组织中相类似的粘弹性。同时，水凝胶独特的软材料特性以及机械性能可调性使其在药物递送、分析检测、癌症治疗以及组织工程等方面有着广泛的应用前景。基于此，除了传统的由聚合物通过物理或化学交联作用构成的水凝胶外，研究者们致力于寻找构建水凝胶的新材料，以期提高水凝胶的生物相容性以及功能的多样性。DNA水凝胶因其具有核酸所赋予的独特功能而引起了研究者们极大的兴趣。自1953年沃森和克里克发现DNA双螺旋结构至今，DNA的应用已拓展至材料科学和纳米技术领域。DNA水凝胶通过将DNA分子整合在水凝胶网络结构中而具有一些显著的优点：(1)与其他生物分子(如抗体和蛋白酶等)相比，DNA在高温或不同化学方式处理下不易失活，具有更高的稳定性。(2)具有柔软亲水特性的DNA结构可以自组装形成水凝胶，其具有良好的生物相容性和生物可降解性。(3)DNA碱基互补配对作用的通用性为DNA水凝胶的构建提供了多元化的选择。(4)基于嘌呤和嘧啶间碱基配对作用以及DNA丰富的二级结构，可以通过序列设计实现自组装DNA水凝胶或DNA杂化水凝胶的构建，赋予了DNA水凝胶独特的可编程性。(5)功能性DNA可以在不同环境刺激下发生构象变化，从而使DNA水凝胶具有对不同外界刺激做出响应的能力。(6)DNA对多种靶标物具有特异性分子识别功能，增强了DNA水凝胶在靶向药物传递领域的应用。
刺激响应水凝胶可响应多种不同的信号，例如光，pH，温度，化学试剂或磁场，其已被广泛用于众多领域，包括传感平台，自修复材料，细胞迁移和组织工程等。在各种方式施加的外部刺激中，光可以实现非侵入式的远程控制，并可方便的通过调节光强度或波长来实现水凝胶的药物包封或控制释放。在以往的报道中，具有机械强度可调性质的光响应水凝胶通常由修饰有光敏性质小分子的聚合物网络构成，其中光敏分子在光刺激下的反应(如裂解、异构化或二聚化等)引起了聚合物链的交联或解离，从而实现对水凝胶机械性能的调控。作为一种新兴的刺激响应性水凝胶，DNA水凝胶基于不同DNA结构的动态交联作用实现了丰富的功能，如热可逆性，pH响应，金属离子响应和自修复能力等。其中，光响应性DNA水凝胶可以在光刺激下实现体积变化或凝胶-溶液态的转变，并已被应用在药物控释系统和形状记忆材料。在这些报道中，水凝胶中嵌入的DNA链通常修饰有光敏分子，这使得水凝胶微观结构和宏观形态的转变可以通过光照刺激下光敏分子的异构化作用来实现。但是，将光敏分子嵌入DNA分子结构内部的修饰过程存在合成效率低、成本高、耗时长和纯化复杂的问题，发展一种新型的光响应DNA水凝胶是有重要意义的。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，利用光酸产生剂在光照条件下释放氢离子以及富胞嘧啶序列DNA可以与氢离子结合而改变构象的原理，实现了光对DNA水凝胶机械性能的远程调控，过程无需在DNA分子内部修饰光敏基团。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶，使用的DNA序列包括DNA(1)、DNA(2)和DNA(3)，DNA(1)为富胞嘧啶序列，由DNA(1)序列制备的共聚物Ⅰ在光照条件下，DNA(1)的胞嘧啶与氢离子结合形成分子间i-motif结构的交联单元，共聚物Ⅰ由溶液向凝胶态转变；DNA(2)和DNA(3)为互补双链交联单元，DNA(3)为富胞嘧啶序列，由DNA(2)和DNA(3)序列制备的共聚物Ⅱ在光照条件下，胞嘧啶与氢离子结合形成分子内i-motif结构进而使双链交联单元解离，共聚物Ⅱ由凝胶向溶液态转变。
优选的，DNA(1)、DNA(2)和DNA(3)序列均在5’端修饰不饱和双键，DNA(1)、DNA(2)和DNA(3)的序列分别为：
DNA(1)：5’-Acrydite-AAAACCCCTAACCCC-3’
DNA(2)：5’-Acrydite-GATCAGGGTTAGG-3’
DNA(3)：5’-Acrydite-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTGATC-3’。
本发明的第二个目的是提供基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)制备具有光致产酸性质的单体3-醛基-4-硝基丙烯酸苯酯：
先将5-羟基-2-硝基苯甲醛溶液和三乙胺进行混合形成混合溶液Ⅰ，再将丙烯酰氯溶液逐滴加入混合溶液Ⅰ中反应20-40分钟，分离纯化后即得具有光致产酸效应的单体3-醛基-4-硝基丙烯酸苯酯(Ac-NBA)；
(2)将单体Ac-NBA溶液、丙烯酰胺溶液和DNA(1)或者DNA(2)与DNA(3)进行混合形成混合溶液Ⅱ；
(3)将步骤(2)中制备的混合溶液Ⅱ中加入引发剂形成混合溶液Ⅲ，混合溶液Ⅲ在4℃环境下聚合10-18h后纯化得到共聚物。
优选的，步骤(1)中，丙烯酰氯溶解无水四氢呋喃中形成丙烯酰氯溶液，丙烯酰氯在混合溶液Ⅰ中的浓度为1-3wt％；
5-羟基-2-硝基苯甲醛溶液溶解在无水四氢呋喃中形成5-羟基-2-硝基苯甲醛溶液；5-羟基-2-硝基苯甲醛在混合溶液Ⅰ中的浓度为0.2-0.5M；
单体Ac-NBA溶解于DMF中形成单体Ac-NBA溶液。
优选的，单体Ac-NBA在混合溶液Ⅲ中的浓度为2-5mM；
优选的，单体Ac-NBA在混合溶液Ⅲ中的浓度为3.6mM。
优选的，步骤(2)中，将丙烯酰胺加入到Tris-HCl缓冲溶液中，丙烯酰胺在混合溶液Ⅲ中的浓度为1-3wt％。
优选的，步骤(3)中，DNA(1)在混合溶液Ⅲ中的浓度为0.6-0.9mM；优选的，DNA(1)在混合溶液Ⅲ中的浓度为0.75mM。或者，DNA(2)和DNA(3)在混合溶液Ⅲ中的浓度为0.5-0.7mM；优选的，DNA(2)和DNA(3)在混合溶液Ⅲ中的浓度为0.6mM。
优选的，所述引发剂为四甲基乙二胺和过硫酸铵的混合溶液；四甲基乙二胺混合溶液Ⅲ中的浓度为0.1-0.3wt％，过硫酸铵混合溶液Ⅲ中的浓度为0.3-0.5wt％。
本发明的第三个目的是提供基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶在光照条件下机械性能的远程调控应用。
基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶在生物传感、驱动器及药物释放等领域具有一定应用前景
本发明的原理如下：
构建了两种基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶体系，在光照刺激下，光酸基团释放质子并被对质子敏感的DNA结构捕获导致DNA结构变化，进而引发具有该DNA结构的水凝胶发生溶液向凝胶态或凝胶向溶液态的转变；
通过对DNA序列的系统设计，可以分别实现紫外光照条件下的溶液向凝胶态或凝胶向溶液态的相转变。通过将光酸产生剂单体修饰到富胞嘧啶序列DNA/聚丙烯酰胺的共聚物中，使其同时具有光响应释放氢离子改变pH值的光酸单元以及对pH敏感的富胞嘧啶序列i-motifDNA交联结构单元。在紫外光照射下，紫外光照引起光酸基团释放氢离子，修饰在丙烯酰胺/DNA共聚物上的光酸产生剂释放出氢离子，富胞嘧啶序列DNA与氢离子结合后形成分子间或分子内i-motif四链体结构，进而引发分子间或分子内四链i-motif结构形成，并引起聚丙烯酰胺链的交联或解离，进一步诱导了水凝胶相应的机械强度和宏观相态的变化，实现光照条件下相应的相转变过程。
本发明通过光酸产生剂单体、丙烯酰胺以及修饰不饱和双键DNA的共聚合，实现基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的构建，过程成本较低且操作简便。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明的光响应DNA水凝胶的构建无需在DNA分子中修饰光敏基团，方法简便，成本低；
2、本发明利用光酸产生剂赋予了对水凝胶状态的远程调控性能，且调控过程具有光剂量依赖特性。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是光酸产生剂单体3-醛基-4-硝基丙烯酸苯酯(Ac-NBA)的红外光谱；
图2是光酸产生剂单体3-醛基-4-硝基丙烯酸酯(Ac-NBA)的核磁共振氢谱；
图3是Ac-NBA溶液在紫外光照条件下的pH值改变情况示意图；
图4是共聚物PA在光照条件下实现溶液-凝胶态转变的原理图；
图5是共聚物PA在光照条件下实现溶液-凝胶态转变的示意图；
图6是共聚物PA在光照条件下水凝胶机械强度随光照时间的变化示意图；
图7是共聚物PB在光照条件下实现凝胶-溶液态转变的原理图；
图8是共聚物PB在光照条件下实现凝胶-溶液态转变的示意图；
图9是共聚物PB在光照条件下水凝胶机械强度随光照时间的变化示意图；
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本发明中所用试剂均为市售的分析纯或色谱纯，DNA(1)、DNA(2)和DNA(3)序列从生工生物工程有限公司购买得到。
实施例1：基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法
1、具有光致产酸效应的单体3-醛基-4-硝基丙烯酸酯(Ac-NBA)的制备方法
将1.0g 5-羟基-2-硝基苯甲醛溶解于20mL无水四氢呋喃中，再加入1.66mL的三乙胺。在冰浴中混合搅拌30分钟后，将溶解在10mL无水四氢呋喃中的0.97mL丙烯酰氯逐滴加入反应体系中，反应时间为20分钟。反应混合物在室温下搅拌24h。反应完成后旋蒸除掉溶剂，产物用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂为体积比为5:1的环己烷：乙酸乙酯。最终得到1.13g黄色固体产物Ac-NBA，产率为85.3％。具有光酸效应的单体Ac-NBA，其结构通过红外光谱和核磁氢谱确认。
图1为Ac-NBA的红外光谱图，可以看出，在1474cm-1和1507cm-1处为苯环的C-C伸缩振动峰；在871cm-1和1352cm-1处分别为硝基基团中C-N和N＝O的伸缩振动峰。在1138cm-1和1155cm-1处为酯基结构中C-O的伸缩振动峰，1741cm-1为羰基C＝O的伸缩振动峰；906cm-1为醛基中C-H的弯曲振动峰，2863cm-1和2924cm-1为C-H的伸缩振动峰；1584cm-1和1632cm-1处分别为不饱和碳碳双键中C-C和C-H的伸缩振动峰。图2中的核磁共振氢谱结果表明，Ac-NBA中苯环上的三个H原子、碳碳双键上的三个H原子以及苯环上连接的醛基上的一个H原子的化学位移都有清晰的归属。图3为Ac-NBA溶液在紫外光照下pH值的变化情况。Ac-NBA中的邻硝基苯甲醛部分(2-NBA)可在紫外光照下释放出氢离子。Ac-NBA溶液的pH值在120min的紫外光照射下发生了约2.2个pH单位(pH 7.0到4.8)的下降，验证了所制备的单体具有光致产酸的性质。
2、光酸产生剂单体Ac-NBA、Acrydite-DNA(5’端修饰不饱和双键的DNA)及丙烯酰胺共聚物的合成
2.1、将丙烯酰胺加入到Tris-HCl(pH为8.0的10mM)的缓冲溶液中，使得丙烯酰胺的终浓度为2％；
2.2、将0.16mg光酸产生剂单体Ac-NBA溶解于5μL的DMF中；
2.3、将5μL四甲基乙二胺和10mg过硫酸铵溶解于95μL水中，得到引发剂；
2.4、将10μL引发剂加入到浓度为2％的丙烯酰胺、溶解在DMF中的光酸产生剂单体Ac-NBA、DNA(1)或DNA(2)与DNA(3)的混合溶液中，DNA(1)终浓度为0.75mM，或者DNA(2)和DNA(3)的终浓度为0.6mM。在室温下充氮气除氧10min，后置于4℃环境中聚合12h。用截留分子量为10KDa的超滤离心管纯化以去除残留的单体、引发剂以及起缓冲作用的小分子，采集上清液即为共聚物。
使用的DNA序列如下：
DNA(1)：5’-Acrydite-AAAACCCCTAACCCC-3’
DNA(2)：5’-Acrydite-GATCAGGGTTAGG-3’
DNA(3)：5’-Acrydite-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTGATC-3’
实施例2：紫外光诱导的DNA水凝胶溶液-凝胶态的转变以及具有光剂量依赖特性的对水凝胶机械强度的远程调控
使用DNA(1)序列制备的共聚物命名为PA。将干燥后的共聚物PA溶解于100μL无机盐溶液(100mM NaCl，50mM MgCl2，pH＝6.8)中，得到共聚物溶液。为了消除热效应对实验的影响，将样品置于室温的水浴中。将5组平行样品同时置于365nm紫外光照射下，和氙灯光源的距离保持为15cm，光强度为5mW/cm2。使用365nm带通型滤光片获得紫外光源。样品分别照射不同的时间(0min，30min，60min，90min，120min)。照射完成后观察样品宏观形态的变化，通过流变学测试研究光照时间对水凝胶机械强度的影响。
图4为共聚物PA在光照条件下实现溶液-凝胶态转变的原理图。在调节初始pH值为6.8时，DNA(1)以柔性单链的形式存在，聚合物链之间没有交联作用发生，此时聚合物呈溶液态。在紫外光照射下，光酸反应发生，Ac-NBA释放出的氢离子使溶液pH值下降，当pH值下降到6.3左右时，富胞嘧啶的DNA(1)会由单链转换为半折叠的i-motif结构，当pH值继续下降至5.3时，DNA(1)会形成完全折叠的四链体i-motif构型。由于形成的四链体为分子间i-motif构型，聚合物链间的距离由于DNA构型的转换而被拉近，此时DNA链起到了交联聚合物网络的作用，最终实现了光照下溶液态到凝胶态的转换。光酸作用产生氢离子的数目由受到的光辐照剂量决定，而环境的pH决定了聚合物链上DNA的构象，使其可以完成从自由单链到半折叠到最终完全折叠的分子间四链i-motif结构，这种构象的转变会使DNA将聚合物链不断的拉近，从而使聚合物完成溶液态到凝胶态再到凝胶强度逐渐提高的过程。基于此原理，实现了基于光酸反应的光诱导DNA水凝胶的溶液-凝胶态转换，且凝胶机械强度的调控可以通过调节入射光的照射时间来实现。
如图5所示，共聚物PA在紫外光照射下实现了溶液-凝胶态的转变。光照前，样品表现为可流动的溶液态。光照后，样品转变为凝胶态并可承受自重固定在倒置的玻璃管顶部。
如图6所示，形成的水凝胶的机械强度可由光照时间决定。随着光照时间的延长，水凝胶的储能模量增加，水凝胶的机械强度提高。
实施例3：紫外光诱导的DNA水凝胶凝胶-溶液态的转变以及具有光剂量依赖特性的对水凝胶机械强度的远程调控
使用DNA(2)和DNA(3)序列制备的共聚物命名为PB。将干燥后的共聚物PB溶解于100μL无缓冲溶液中(100mM NaCl，50mM MgCl2，pH＝6.8)中。将所得混合物加热至95℃保持5min。当溶液缓慢冷却至室温后，生成DNA(2)/(3)双链结构交联的DNA水凝胶。将6组水凝胶平行样品置于365nm紫外光下照射，和氙灯光源的距离为15cm(5mW/cm2)。样品分别照射不同的时间(0min，30min，60min，90min，120min，150min)。为了消除热效应带来的影响，将水凝胶样品置于室温水浴中。照射完成后，观察样品宏观形态的变化，通过流变学测试研究光照时间对水凝胶机械强度的影响。
图7是共聚物PB在光照条件下实现凝胶-溶液态转变的原理图。在pH值为6.8的初始状态下，聚丙烯酰胺链由DNA(2)和(3)杂交形成的双链结构所交联，随之形成的交联网络结构使得样品宏观表现为凝胶态。在紫外光下(5mW/cm2)照射150min后，富含胞嘧啶序列的DNA(3)在光致产酸作用形成的酸性环境中形成分子内四链体i-motif结构，DNA(2)与DNA(3)形成的DNA双链结构被打开，聚合物链间交联单元的解离使样品在宏观上表现出凝胶-溶液态的转变。
图8是共聚物PB在光照条件下实现凝胶-溶液态转变的图片。光照前，样品呈现为可承受自重并保持在倒置玻璃管顶部的凝胶态。光照后，样品转变为可流动的溶液态。
图9是共聚物PB在光照条件下机械强度随光照时间的变化。随着光照时间的延长，水凝胶的储能模量降低，水凝胶的机械强度下降。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶，其特征在于：使用的DNA序列包括DNA(1)、DNA(2)和DNA(3)，DNA(1)为富胞嘧啶序列，由DNA(1)序列制备的共聚物Ⅰ在光照条件下，DNA(1)的胞嘧啶与氢离子结合形成分子间i-motif结构的交联单元，共聚物Ⅰ由溶液向凝胶态转变；DNA(2)和DNA(3)为互补双链交联单元，DNA(3)为富胞嘧啶序列，由DNA(2)和DNA(3)序列制备的共聚物Ⅱ在光照条件下，胞嘧啶与氢离子结合形成分子内i-motif结构进而使双链交联单元解离，共聚物Ⅱ由凝胶向溶液态转变。
2.根据权利要求1所述的基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶，其特征在于：DNA(1)、DNA(2)和DNA(3)序列均在5’端修饰不饱和双键，DNA(1)、DNA(2)和DNA(3)的序列分别为：
DNA(1)：5’-Acrydite-AAAACCCCTAACCCC-3’
DNA(2)：5’-Acrydite-GATCAGGGTTAGG-3’
DNA(3)：5’-Acrydite-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTGATC-3’。
3.权利要求1-2任意一项所述的基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)制备具有光致产酸性质的单体3-醛基-4-硝基丙烯酸苯酯：
先将5-羟基-2-硝基苯甲醛溶液和三乙胺进行混合形成混合溶液Ⅰ，再将丙烯酰氯溶液逐滴加入混合溶液Ⅰ中反应，分离纯化后即得具有光致产酸效应的单体3-醛基-4-硝基丙烯酸苯酯(Ac-NBA)；
(2)将单体Ac-NBA溶液、丙烯酰胺溶液和DNA(1)或DNA(2)与DNA(3)进行混合形成混合溶液Ⅱ；
(3)将步骤(2)中制备的混合溶液Ⅱ中加入引发剂形成混合溶液Ⅲ，聚合后纯化得到共聚物。
4.根据权利要求3所述的基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，丙烯酰氯溶解无水四氢呋喃中形成丙烯酰氯溶液，丙烯酰氯在混合溶液Ⅰ中的浓度为1-3wt％；
5-羟基-2-硝基苯甲醛溶液溶解在无水四氢呋喃中形成5-羟基-2-硝基苯甲醛溶液，5-羟基-2-硝基苯甲醛在混合溶液Ⅰ中的浓度为0.2-0.5M；
单体Ac-NBA溶解于DMF中形成单体Ac-NBA溶液，单体Ac-NBA在混合溶液Ⅲ中的浓度为2-5mM。
5.根据权利要求4所述的基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：所述单体Ac-NBA在混合溶液Ⅲ中的浓度为3.6mM。
6.根据权利要求3所述的基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将丙烯酰胺加入到Tris-HCl缓冲溶液中形成丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺在混合溶液Ⅲ中的浓度为1-3wt％。
7.根据权利要求3所述的基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，DNA(1)在混合溶液Ⅲ中的浓度为0.6-0.9mM；DNA(2)与DNA(3)在混合溶液Ⅲ中的浓度为0.5-0.7mM。
8.根据权利要求7所述的基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：所述DNA(1)在混合溶液Ⅲ中的浓度为0.75mM，DNA(2)与DNA(3)在混合溶液Ⅲ中的浓度为0.6mM。
9.根据权利要求3所述的基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，引发剂为四甲基乙二胺和过硫酸铵的混合溶液；四甲基乙二胺混合溶液Ⅲ中的浓度为0.1-0.3wt％，过硫酸铵混合溶液Ⅲ中的浓度为0.3-0.5wt％。
10.基于光诱导质子转移过程的光响应DNA水凝胶在光照条件下的机械性能的远程调控应用。
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