CN113495146A - 样品溶液制备方法、测量单元、测量试剂盒和制备装置 - Google Patents

样品溶液制备方法、测量单元、测量试剂盒和制备装置 Download PDF

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Abstract

一种用于通过使用荧光的免疫分析方法测量食品中包含的目标化合物的样品溶液制备方法、测量单元、测量试剂盒和样品溶液制备装置。本公开的特征包括：用于使包括目标化合物的含目标化合物溶液通过透析膜与透析液接触以将目标化合物转移到透析液的透析步骤，其中透析膜的截留分子量在2×102至2×105的范围内，并且透析液的体积相比于含目标化合物溶液的体积相对更小。

Description

样品溶液制备方法、测量单元、测量试剂盒和制备装置
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月6日提交的日本专利申请号2020-068486的权益，其全部公开内容通过引用结合于此。
技术领域
本公开涉及一种用于通过使用荧光的免疫分析方法来测量食物中包含的目标化合物的浓度的样品溶液制备方法、一种测量单元、一种测量试剂盒和一种样品溶液制备装置。
背景技术
荧光偏振免疫测定法(Fluorescence polarization immunoassay，FPIA)已知为使用荧光、利用抗原-抗体反应检测目标物质的免疫分析方法。未审查的日本专利申请公开号H03-103765描述了荧光偏振免疫测定法的原理，其中利用激发光照射样品，并且在从样品发射的偏振分量当中，测量平行于入射光的偏振方向的偏振分量和垂直于入射光的偏振方向的偏振分量，并且使用两个偏振分量计算偏振度。由于荧光偏振度与目标物质的有效体积成比例，因此该值对应于物质的分子量而变大。为此，目标物质优选地具有低分子量。未经审查的日本专利申请公开号H11-503521(PCT申请的翻译)公开了一种通过FPIA测量万古霉素的方法，该方法通过将分子量低于抗原蛋白的分子量的万古霉素设定为目标物质并制备与万古霉素特异性结合的单克隆抗体，使得可以避免由万古霉素类似物的混合导致的测量误差。
包括在食物中并根据其含量导致问题的物质包括霉菌毒素、贝类毒素、用于饲养动物的化学品、用于种植作物的化学品等。预防食物中毒和评估食品中的农用化学残留物等对确保食品安全非常重要。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)(感染小麦和其他谷物的霉菌毒素)已经通过液相色谱-串联质谱(LC/MS)常规进行测量，然而，如果可以制备相对应的抗体则可以使用FPIA类似于万古霉素那样进行测量。虽然血液万古霉素浓度是在血液取样后在专门处理医学样本的实验室中测量的，但食品污染优选地在原位进行测量。由于食物包括高脂肪、高糖、高蛋白质和其他杂质，因此有必要从各种食物中提取包含霉菌毒素的成分，并制备足够浓缩以通过FPIA进行测量的样品。此外，根据食品安全法被认为有问题的目标化合物不仅仅限于霉菌毒素，还包括农用化学残留物。另外，在畜牧业和渔业中，存在声称不含抗生素和抗菌剂、口号是“健康养殖”的产品。同样重要的是测量以诸如目标化合物的方式生长的肉类和鱼类中包括的抗生素和抗菌剂的浓度，并评估肉类和鱼类的安全性。因此，需要一种用于制备样品的方法，该方法允许通过使用荧光的免疫分析方法来原位检测目标化合物，诸如食品中包含的霉菌毒素和农用化学残留物。
除了FPIA，使用荧光的免疫分析方法包括荧光酶免疫测定法(fluorescenceenzyme immunoassay，FEIA)，其中使用酶标记为标记物质的抗原或抗体进行抗原-抗体反应，并且通过添加荧光物质来测量荧光强度；以及荧光抗体(fluorescent antibody，FA)法，其中使用特异性识别抗原的抗体来检查抗原的分布。由于使用荧光的免疫分析方法可以检测微量元素，因此原位样品制备的需要不限于FPIA，还适用于FEIA、FA和使用荧光的其他免疫分析方法。
考虑到以上描述的现状，本公开的目的是提供一种用于通过使用荧光的免疫分析方法来测量食品中包含的目标化合物的浓度的样品溶液制备方法。
本公开的另一目的是提供一种用于通过使用荧光的免疫分析方法来测量食品中包含的目标化合物的浓度的测量单元、测量试剂盒和制备装置。
发明内容
为了实现以上描述的目的，样品溶液制备方法是用于通过使用荧光的免疫分析方法来测量食品中包含的目标化合物的浓度的样品溶液制备方法，该样品溶液制备方法包括：
透析步骤，用于使包括目标化合物的含目标化合物溶液通过透析膜与透析液接触，以将目标化合物转移至透析液，其中
透析膜的截留分子量在2×102至2×105的范围内，并且
透析液的体积相比于含目标化合物溶液的体积相对更小。
测量单元是用于通过使用荧光的免疫分析方法测量食品中包含的目标化合物的浓度的测量单元，并且包括：
测量区域，包括透射300至800nm的范围内的波长的构件；以及
透析膜，具有在2×102至2×105的范围内的截留分子量。
测量试剂盒是用于通过使用荧光的免疫分析方法测量食品中包含的目标化合物的浓度的测量试剂盒，该目标化合物选自霉菌毒素、贝类毒素、用于饲养动物的化学品和用于种植作物的化学品组成的组，该测量试剂盒包括：
上述测量单元；
待填充在测量单元中的透析液；
与目标化合物特异性结合的抗体；以及
荧光标记目标化合物衍生物。
样品溶液制备装置是使用荧光的免疫分析方法中的样品溶液制备装置，并且包括：
容器，该容器容纳含目标化合物溶液；以及
一个或多个透析盒，该一个或多个透析盒被放置在容器中，
其中透析盒的总容量与容器的容量(透析盒的总容量/容器的容量)的比率在1/(1×104)至1/10的范围内。
应当理解的是，前面的总体性描述和下面的详细描述是示例性和解释性的，并不限制本公开。
可以制备用于通过使用荧光的免疫分析方法来测量食品中包含的目标化合物的样品。。
附图说明
当结合以下附图考虑以下详细描述时，可以获得对本申请更完整的理解，在附图中：
图1是示出了其中填充有透析液的透析盒被浸入到容纳含目标化合物溶液的提取容器中的模式的示意图；
图2是示出了其中将经研磨的食物样品放置在过滤袋中并浸入溶剂中以制备含目标化合物溶液，该溶液同时被透析盒透析的模式的示意图；
图3是描述其中透析盒配备有加热器的模式的图；
图4是描述其中具有较高比重的含目标化合物溶液被放置在下层、透析膜被置于下层的顶部上、并且透析液被填充到透析膜的上表面上的模式的图；
图5是描述这样的模式的图，在该模式中含目标化合物溶液被容纳在被放置在磁力搅拌器上的容器中，透析盒被浸入这个溶液中，并包含银颗粒的氧化铁颗粒被添加到溶液和透析液中；当磁力搅拌器被驱动时，包含银颗粒的氧化铁颗粒根据马达的旋转而旋转，从而搅拌溶液和透析液两者；
图6是描述其中透析盒浸入在被容纳在容器中的含目标化合物溶液中同时吸附剂被放置在容器的底部上的模式的图；
图7A是描述矩形测量单元的优选模式的示例；透射激发光的测量区域被布置在测量单元上方，并且透析膜布置在测量单元下方的示意图；
图7B是描述测量单元的使用方法的图；透析液被填充在测量单元中，然后将其浸入含目标化合物溶液中；
图8是描述其中样品溶液制备装置包括容器、透析盒和搅拌装置的模式的示例的图；
图9A是描述其中样品溶液制备装置包括布置在容器中的多个透析盒并且透析盒配备有塞子或盖子的模式的图；
图9B是描述其中样品溶液制备装置包括布置在容器中的多个透析盒并且透析盒通过连接构件彼此连接的模式的图；
图10是描述其中样品溶液制备装置包括布置在容器中的具有长管形状的透析盒，并且透析盒包括具有透析能力的构件和不具有透析能力的构件的模式的图；
图11是示出示例1的结果的图；
图12是示出示例2的结果的图；以及
图13是示出示例3的结果的图。
具体实施方式
本公开的第一实施例是用于通过使用荧光的免疫分析方法来测量食品中包含的目标化合物的浓度的样品溶液制备方法，该样品溶液制备方法包括
透析步骤，用于使包括目标化合物的含目标化合物溶液通过透析膜与透析液接触，以将目标化合物转移至透析液，其中
透析膜的截留分子量在2×102至2×105的范围内，并且
透析液的体积相比于含目标化合物溶液的体积相对更小。
使用荧光的免疫分析方法包括FEIA、FA和FPIA法，全部这些在本公开的范围内。为了便于解释，下面将描述FPIA的情况。
FPIA基于竞争结合免疫测定法的原理。使用两种试剂：通过用荧光材料将相同分子标记为目标分子而获得的荧光标记化合物；以及与目标分子特异性结合的抗体。将这些荧光标记化合物和抗体以及测量目标溶液添加到测量单元中，用激发光照射该单元，测量从样品发射的并平行于入射光的偏振方向的偏振分量(Ih)和从样品发射的并垂直于入射光的偏振方向的偏振分量(Iv)，并计算荧光偏振度P＝(Ih-Iv)/(Ih+Iv)。由于荧光偏振度P根据目标分子的浓度而变化，因此可以例如使用预先制备的校准曲线来检测目标分子的浓度。由于FPIA使用与抗体的特定反应，与常规液LC/MS(/M)方法等相比，FPIA可以减少由诸如代谢物的类似物引起的测量误差。
本公开中的目标化合物可以是包含在食物中并且可通过使用荧光的免疫分析方法测量的任何化合物而没有特别限制。然而，由于使用荧光的免疫分析方法允许检测处于较低浓度的化合物，所以该方法优选用于测量食品中包含的处于低浓度的影响生物体的化合物，诸如霉菌毒素、贝类毒素、用于饲养动物的化学品、用于种植作物的化学品等。
霉菌毒素包括真菌毒素，诸如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素、展青霉素、桔霉素、T-2毒素和HT2毒素，以及生物碱(诸如麦角生物碱和莨菪烷生物碱)。
贝类毒素包括冈田酸、软骨藻酸和石房蛤毒素。
进一步，用于饲养动物的化学品包括：四环素类抗生素，诸如四环素类、土霉素类、金霉素类和赖甲环素类；硝基呋喃类，诸如呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮；抗生素，诸如氯霉素；抗菌剂，诸如孔雀石绿、龙胆紫和恩诺沙星；和生长促进剂，诸如乳巴胺(lactopamine)、克伦特罗、己烯雌酚和沙丁胺醇。
另外，用于种植作物的化学品包括农用化学品，诸如吡虫啉、杀螟硫磷、溴虫腈和四氯间苯二腈。
食物包括：谷物，诸如大米、小麦、大麦和豆类；蔬菜，诸如菠菜、西红柿和胡萝卜；冷冻食品，诸如冷冻菠菜、冷冻青大豆和冷冻胡萝卜；饮料，诸如牛奶、水和酒；调味品，诸如酱油和其他酱料；肉类，诸如鸡肉和猪肉；鱼类，诸如衣鱼(bristle)、鲷鱼、金枪鱼和鳗鱼；贝类，诸如牡蛎和扇贝；以及包含这些的加工食品。
在本公开的样品溶液制备方法中，包含目标化合物的溶液被称为含目标化合物溶液，并且使这个含目标化合物溶液与透析膜接触以将目标化合物转移到透析液中。含目标化合物溶液可以是食物本身，或者可以是通过将食物或经研磨的食物与溶剂混合而获得的溶液。液体食物(诸如饮料和液体调味品)本身可以直接与透析膜接触。然而，如果食物是固体或半固体，优选的是预先在溶剂中提取目标化合物。例如，通过向食物添加溶剂并将溶剂和食物混合而获得的溶液、通过预先研磨食物并将经研磨的食物与溶剂混合而获得的溶液、以及通过向食物中添加溶剂并将溶剂和食物均质化而获得的溶液可以用作含目标化合物溶液。用于研磨食物的研磨度可以是例如当通过LC/MS(/MS)方法制备样品时应用的研磨度。从食物到溶剂的提取时间根据食物、目标化合物和使用的溶剂而变化，并且因此，可以通过预先测量提取时间和提取率来选择最佳条件。如果含目标化合物溶液包含不溶性物质，诸如纤维素、甲壳质和脱乙酰壳多糖，可以通过离心、静态分离、过滤等预先除去这些不溶性物质。
要添加到食物中的溶剂的示例包括水；醇类，诸如甲醇、乙醇和丁醇；酮，诸如丙酮、二乙基酮和甲基戊基酮；烷烃，诸如己烷和庚烷；醚类，诸如乙醚；甲基亚砜；乙腈；氯仿；和这些的混合溶剂。作为用于提取目标化合物的溶剂，可以根据需要选择和使用用于通过LC/MS(/MS)方法进行测量的溶剂。例如，为了制备用于测量小麦中包含的DON的样品，可以使用乙腈：水：甲醇＝5:95:5的混合溶液，并且，为了提取氯霉素作为用于饲养动物的化学品，可以使用甲醇。应该注意的是，也可以使用与用于制备由常规LC/MS(/MS)方法使用的样品的溶剂不同的溶剂。
本公开中使用的透析膜可以是截留分子量为2×102至2×105的膜。截留分子量优选地在2×102至1.4×105的范围内，更优选地在1.5×104至1.4×105的范围内。含目标化合物溶液可能包含盐类(诸如Tris和PBS)、还原剂(诸如DTT和β-巯基乙醇)和防腐剂(诸如叠氮化钠和硫柳汞(timerosar))，它们可能充当在通过FPIA进行的测量期间导致测量误差的抑制剂。因此，截留分子量的下限被设定为2×102以便消除这些化合物。另一方面，由于分子量大于2×105的物质具有光散射特性，这种物质很可能在FPIA中引起测量误差。因此，截留分子量的渗透上限设定为2×105。这种透析膜的示例包括由纤维素酯制成的透析管和由合成聚合物(诸如聚甲基丙烯酸甲酯和聚砜)制成的透析管。
除了截留分子量之外，本公开中使用的透析膜可以优选地为具有耐有机溶剂性的膜。
透析液的体积特征性地小于含目标化合物溶液的体积。例如，当在含目标化合物溶液和透析液中目标化合物的溶解度相等，并且目标化合物均匀地迁移到两侧时，通过使透析液的体积与含目标化合物溶液的体积(透析液的体积/含目标化合物溶液的体积)的比率更小，透析液中包含的目标化合物含量可以接近含目标化合物溶液中包含的目标化合物含量。例如，如果透析液和含目标化合物溶液之间的比率为1/100，则透析平衡时透析液中所含目标化合物的浓度变为含目标化合物溶液中所含目标化合物的浓度的0.99倍，其中可以几乎不稀释地制备用于测量的样品。透析液的体积与含目标化合物溶液的体积(透析液的体积/含目标化合物溶液的体积)的比率在1/(1×104)至1/10的范围内，优选地在1/1×102至1/1×104的范围内，更优选地在1/1×102至1/1×103的范围内。
透析时间根据所使用的透析膜、所使用的溶剂和目标化合物而变化，并且因此，可以通过预先测量透析时间和透析速率来选择最佳条件。
作为这样的透析膜，例如，可以使用在其外周上配备有透析膜的透析盒。这种模式的示例在图1中示出。将填充有透析液7的透析盒5浸入容纳含目标化合物溶液3的提取容器1中。包含在含目标化合物溶液3中的目标化合物通过透析膜转移到透析液7的一侧，而盐等不能转移到透析液的该侧，从而获得盐和光扩散物质等已经从其中去除的透析液7。此外，利用透析盒5，可以容易地调节透析液的体积与含目标化合物溶液的体积的比率。图1示出了其中含目标化合物溶液3的体积明显大于透析液7的体积的模式。这使得能够制备这样的样品溶液，在该样品溶液中包含在含目标化合物溶液中的目标化合物的浓度得以保持。
图2示出了其中袋式过滤器9接收经研磨的食物样品，然后将其浸入溶剂中以制备含目标化合物溶液3的模式。可以同时执行从食物中提取目标化合物以及通过透析盒5进行透析，从而减少样品溶液制备时间。
透析步骤也可以在透析液的温度高于含目标化合物溶液的温度的条件下进行。一般而言，溶解度随着溶剂温度的升高而增加。因此，将透析液的流体温度升高得比含目标化合物溶液的流体温度更高，可以将高浓度的目标化合物转移到透析液的一侧。图3示出了其中透析盒5中的透析液7被加热器11加热的模式的示例。例如，可以通过在透析盒5中插入加热设备来升高透析液7的流体温度。含目标化合物溶液3和透析液7之间的温差根据目标化合物、所使用的溶剂、透析膜的类型和透析液7而变化，并且因此，可以通过预先测量各种温差下的透析时间和透析速率来选择最佳条件。
在本公开中，作为在将食物或其经研磨的物质与溶剂混合时使用的溶剂，可以使用对目标化合物具有不同于透析液的溶解度的溶剂。例如，如果溶剂A对目标化合物的溶解度低于溶剂B对目标化合物的溶解度，则溶剂A用于制备含目标化合物溶液，并且溶剂B用于透析液。由于含乙醇的水相比于水具有对氯霉素的更高的溶解度，因此当从牛奶中检测氯霉素作为目标化合物时，含乙醇的水被用作透析液。而且，当通过将透析液的体积与含目标化合物溶液的体积(透析液的体积/含目标化合物溶液的体积)的比率设定为1/100来进行透析时，透析液中包含的目标化合物的浓度可以是透析平衡时含目标化合物溶液中包含的目标化合物的浓度的0.99倍或更多倍。
含目标化合物溶液和透析液通过透析膜的接触不限于使用以上描述的透析盒。特别地，当含目标化合物溶液和透析液的比重不同时，具有较大比重的流体可以放置在下层，透析膜可以放置在下层的顶部上，并且具有较小的比重的流体可以倾倒到透析膜上以将目标化合物转移到透析液中。图4示出了其中含目标化合物溶液3被放置在下层，并透析液7被填充到透析膜13的上表面的模式的示例。例如，当强力霉素被测定为目标化合物时，例如通过将作为食物的猪肉的经研磨的物质与水混合来制备含目标化合物溶液3，并且如果氯仿用作透析液7，则将氯仿被放置在下层，允许透析膜13置于下层的上表面上，并含目标化合物溶液3被填充在透析膜13的顶部上。这种模式对这种目标化合物有效，因为氯仿相比于水对强力霉素具有更高的溶解度。
在本公开中，透析步骤可以在用搅拌器片搅拌含目标化合物溶液和透析液的同时进行，该搅拌器片包括包含银颗粒的氧化铁颗粒。使用磁力来旋转搅拌器片而搅拌流体是众所周知的技术。利用包含银颗粒的氧化铁颗粒搅拌含目标化合物溶液和透析液可以缩短透析平衡时间。这种含银颗粒的氧化铁颗粒包括镀银的氧化铁颗粒和银-氧化铁颗粒。颗粒尺寸不受限制，但优选地直径方面在0.1至10μm的范围内，更优选地直径为1至10μm。特别地，发现当包含银颗粒的氧化铁颗粒用作搅拌器片时，包含在含目标化合物溶液和透析液中的荧光物质(诸如核黄素)可以被吸附。核黄素的分子量为376，其接近目标化合物的分子量。这样，即使当核黄素渗透透析膜时，溶液中包含的核黄素被包含银颗粒的氧化铁颗粒吸附，由此可以制备具有较小测量误差的样品溶液。图5示出了其中放置在磁力搅拌器17的上表面上的容器1容纳含目标化合物溶液3，透析盒5被浸入这个溶液中，并包含银颗粒的氧化铁颗粒15被添加到溶液和透析液中的模式。当磁力搅拌器17被驱动时，包含银颗粒的氧化铁颗粒15聚集，并且当磁力搅拌器17停止时，包含银颗粒的氧化铁颗粒15分散，由此溶液和透析液两者被搅拌。
在本公开中，透析步骤可以通过在含目标化合物溶液中添加杂质吸附剂来进行。这些杂质包括具有5至30个碳原子的中性脂肪、胆固醇、磷脂、游离脂肪酸、荧光物质(诸如维生素B2)和光散射材料(诸如蛋白质微胶粒)。这种吸附剂的示例包括明胶、石灰、蛋白质和膨润土。所使用的吸附剂的量的最佳条件可以通过预先评估要去除的杂质的种类和杂质的含量来选择。图6示出了其中透析盒5被浸入被容纳在容器1中的含目标化合物溶液3中，并且吸附剂19被放置在容器1的底部的模式。吸附剂可以是例如可以颗粒尺寸为0.1至5mm的粒状颗粒，或者可以是其中粒状颗粒与含目标化合物溶液混合的模式。在具有这种颗粒尺寸的情况下，吸附剂不会渗透透析膜，并能有效地吸附杂质。
本公开的第二实施例是一种用于通过使用荧光的免疫分析方法来测量食物中包含的目标化合物的浓度的测量单元，其中布置由透射300至800nm的范围内的波长的构件制成的测量区域和截留分子量为2×102至2×105的透析膜。在本公开中，已经描述了使用透析盒作为透析膜的示例。因为，如果这种透析盒可以原样用作测量单元，则样品制备和测量可以通过一系列操作来进行。根据本公开的测量单元的特征在于包括对样品制备有用的透析膜和对荧光测量有用的测量区域。
可以选择测量单元的形状，使得测量单元可以附接到要使用的装置上。图7A示出了测量单元的优选模式的示例，以及图7B示出了使用测量单元的样品溶液制备方法的模式的示例。为了便于解释，测量单元21的主体27的形状被定义为矩形，其中宽度为32mm、高度为50mm的两个前表面和后表面由厚度为5mm的两个侧表面和底表面连接，并且激发光透射厚度为1mm的前表面和后表面。
主体27的材料可以是树脂，诸如聚丙烯、聚乙烯、聚甲基戊烯、乙烯-四环十二碳烯共聚物、聚缩醛、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂、羟基苯甲酸酯聚酯、聚醚酰亚胺、甲基丙烯酸树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸环己烷二甲醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯醇或聚乳酸、玻璃、石英等，没有特别限制。
然而，测量单元21形成有测量区域23，该测量区域由透射300至800nm，优选400至700nm的范围内的波长的构件制成。如果波长透射是在这个范围内，荧光偏振度可以无误差地进行测量。这种构件的示例包括玻璃、石英、PMMA、PC、COP,、COC和PS。
进一步，测量单元21设有截留分子量为2×102至2×105，优选地1.5×104至1.4×105的透析膜25。通过使用截留分子量在以上描述的范围内的透析膜25，可以有效地去除盐、光散射材料和其他杂质。可商购产品也可以用作这种透析膜25。例如，可以使用透析盘或膜。
在测量单元21中，测量区域23的位置可以被形成为对应于所使用的装置的激发光的入射位置。由于激发光穿过测量单元21，所以测量区域23形成在前表面的一部分和与前表面的相对应的部分相对的后表面的一部分处。进一步，透析膜25可以布置在侧表面或底表面中，而不限于前表面和后表面，只要透析膜25不与测量区域23重叠。例如，可以预先制备测量单元主体27，在该测量单元主体中用于布置测量区域23和透析膜25的位置被形成为空腔，并且测量区域23和透析膜25可以通过粘合、焊接、装配或其他方法安装在测量单元21上。
如图7B所示，将透析液7填充在测量单元21中，然后将其浸入含目标化合物溶液3中。一定时间段后，从含目标化合物溶液3中取出测量单元21，并去除粘附到测量单元21外周的含目标化合物溶液3。此外，透析膜25的外周可以根据需要覆盖有防水薄膜。为了测量荧光偏振度P，预先制备荧光标记的化合物，其中与目标化合物相同的分子用荧光物质和与目标化合物特异性结合的抗体标记，并且在测量单元21附接到测量装置之前，将这些荧光标记的化合物和抗体添加到测量单元21。荧光偏振度P可以通过将测量区域23暴露于激发光来计算。
本公开的第三实施例是一种用于通过使用荧光的免疫分析方法测量食品中包含的目标化合物的浓度的测量试剂盒，该目标化合物选自霉菌毒素、贝类毒素、用于饲养动物的化学品和用于种植作物的化学品组成的组，该测量试剂盒包括：
测量单元；
待填充在测量单元中的透析液；
与目标化合物特异性结合的抗体；以及
荧光标记目标化合物衍生物。
当将透析液设置在可以用于制备样品和荧光偏振度测量两者的测量单元中时，可以容易地进行样品制备和测量操作。此外，在使用荧光的免疫分析方法中，基于竞争性结合免疫测定法的原理，FPIA不可或缺地使用与目标化合物特异性结合的抗体和荧光标记目标化合物衍生物。由此，还包括对应于目标化合物的抗体和其中目标化合物被荧光标记的目标化合物衍生物的测量试剂盒极其有用。
当这种抗体可商购时，可以使用可商购的产品。另一方面，即使在这种抗体不可商购的情况下，也可以通过使用免疫原来生产抗体，其中免疫原性载体物质通过酰胺键或其它基团与目标化合物结合。免疫原性载体物质可以选自常规已知的物质。免疫原性载体物质可以是免疫原性蛋白质、多肽、碳水化合物、多糖、脂多糖、核酸等中的任何一种。免疫原性载体物质优选地为蛋白质或多肽，更优选地为牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或甲状腺球蛋白。这种免疫原可以通过众所周知的方法用于制备多克隆和单克隆抗体。一般而言，免疫原(优选地免疫原和佐剂的混合物)被注射到宿主动物(诸如兔、山羊、小鼠、豚鼠或马)的一个或多个不同部位。以规则或不规则的间隔在相同或不同的部位进行进一步的注射。根据需要评估滴度，以获得所期望的抗体。抗体可以通过从宿主动物收集血液等来回收。应当注意的是，本公开中的抗体可以是免疫球蛋白的片段(诸如Fab、F(ab')2或Fv)，而不是完整的免疫球蛋白。如果抗体的至少一个表位与目标化合物结合，这就足够了。此外，可商购产品可以用于抗体或片段。
目标化合物衍生物可以通过将荧光标记化合物结合到目标化合物的官能团中的任何一个上来制备。荧光标记化合物的示例包括氯三嗪基氨基荧光素、4'-氨基甲基荧光素、5-氨基甲基荧光素、6-氨基甲基荧光素、6-羟基荧光素、5-羧基荧光素、5-氨基荧光素和6-氨基荧光素、硫脲荧光素和甲氧基三嗪基氨基荧光素。可以使用已知的方法将荧光标记的化合物结合到目标化合物上，以制备目标化合物衍生物。
在本公开中，测量试剂盒包括测量单元，其中布置对目标化合物优选的透析膜；对应于目标化合物的目标化合物衍生物和与目标化合物特异性结合的抗体。透析液可以作为一组多种液体出现，使得可以根据包含目标化合物的食物选择合适的液体。进一步，目标化合物衍生物或抗体可以通过预先将目标化合物衍生物或抗体溶解在合适的溶剂中而制备为液体试剂。另外，测量试剂盒可以包括进行测量所需的其他试剂、标准物、缓冲液、稀释剂等。
本公开的第四实施例是一种使用荧光的免疫分析方法中的样品溶液制备装置，并且该样品溶液制备装置包括：
容器，该容器容纳含目标化合物溶液；以及
一个或多个透析盒，该一个或多个透析盒被放置在容器中，
其中透析盒的总容量与容器的容量(透析盒的总容量/容器的容量)的比率在1/(1×104)至1/10的范围内。例如，该装置是其中透析盒5设置在容器1中的装置，如图1所示。利用这样简单的结构，该装置优选用于原位制备样品。
容器用于制备含目标化合物溶液或用于容纳含目标化合物溶液以便进行透析。容器的容量是指当容器放置在正常使用条件下时，容器能够容纳的总容量。进一步，透析盒的容量是指当透析盒布置在正常使用条件下时，透析盒能够容纳的总容量。多个透析盒也可以布置在容器中。当布置多个透析盒时，容量是指透析盒的总容量。本公开的样品溶液制备装置可以在容器下方设置有搅拌装置。图8示出了其中透析盒5被容纳在容器1中并且搅拌器17作为搅拌装置布置在容器1下方的样品溶液制备装置的示例。透析盒5的总容量与容器1的容量(透析盒的总容量/容器的容量)的比率在1/(1×104)至1/10的范围内，优选地在1/1×102至1/1×104的范围内，更优选地在1/1×102至1/1×103的范围内。即使考虑到可操作性，假设流体被填充高达容器1或透析盒5的容量的80％，当透析盒5的总容量/容器容量在1/(1×104)至1/10的范围内时，在由透析盒5进行透析后回收的透析液可以具有与填充在容器1的溶液中包含的特定组分的浓度基本相同的浓度的特定组分。
尽管图8示出了其中单个透析盒5布置在容器1中的模式，但是可以替代地布置多个透析盒5。进一步，每个透析盒可以具有用于将透析盒锚定到容器1的塞子和用于防止透析液通过入口泄漏的盖子。盖子可以是例如螺钉型或装配型。图9A示出了其中布置了三个透析盒5，并且具有塞子5a的透析盒5和具有盖子5b的透析盒5被容纳在容器1中的模式。例如，带有盖子5b的透析盒5被填充有透析液并用盖子5b覆盖，然后将其与含目标化合物溶液一起放置在带有盖子的容器中。通过从一侧到另一侧、向上和向下等使带有盖子的容器振动，可以确保含目标化合物溶液和透析液之间的分布，而无需使用搅拌装置。
此外，多个透析盒可以通过连接构件彼此连接。图9B示出了其中三个透析盒5通过连接构件5c连接并容纳在容器1中的模式。
而且，透析盒可以是长管形形状，在其长度上可以布置透析膜或者可以间歇地连接多个膜。图10示出了其中长管形透析盒5包括具有透析能力的构件5d和不具有透析能力的构件5’，并且具有透析能力的构件5d布置在容器1的液体容纳部分中，并且不具有透析能力的构件5’与容器1的上部部分接合的模式。作为具有透析能力的构件，可以使用透析膜。截留分子量在2×102至2×105的范围内，优选地在2×103至2×105的范围内，更优选地在2×104至2×105的范围内。没有透析能力的构件5d可以是例如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酯树脂、乙烯基树脂等。
实例
将在下面利用说明性示例具体描述本公开，而这些示例并不旨在以任何方式限制本公开。
(实例1)
通过加入荧光素钠调节至荧光素钠浓度为1.06×10-4M的几毫升牛奶被制备并用作含目标化合物溶液。500μL容量的微透析盒(包括截留分子量为4×102至1.4×105的透析膜)填装有300μL纯水，并浸入含目标化合物溶液中持续2小时。浸入后，观察透析液和含目标化合物溶液的荧光光谱。结果在图11中示出。这表明，含目标化合物溶液在470nm和520nm处具有峰，而透析液在520nm处具有主峰，因此，透析膜可以将荧光素钠的峰分离。
(实例2)
提取液通过以下方式制备：将荧光素钠和70ml纯水加入到7g已通过电动研磨机研磨的棕色小麦中，以将荧光素钠浓度调节至1.06×10-4M，其用作含目标化合物溶液。容量为300μL的微透析盒(包括截留分子量为4×102至1.4×105的透析膜)填装有300μL纯水，并浸入含目标化合物溶液中持续2小时。观察30分钟、1小时和2小时的浸入后的透析液和2小时的浸入后含目标化合物溶液的荧光光谱。结果在图12中示出。透析液的荧光光谱的峰高随着浸入时间而增加，这表明目标化合物转移到透析液侧。
(实例3)
将每10克鲑鱼、猪肉和胡萝卜在小研磨机中研磨，并分别容纳在网眼尺寸为100目且容量为50mL的过滤膜中。具有130mL的容量的三个容器各自容纳100mL纯水和包含经研磨的食物的过滤膜中的一个。
容量为300μL的微透析盒(包括截留分子量为4×102至1.4×105的透析膜)填装有300μL纯水，并在每个容器中浸入持续90分钟。浸入后，回收容器中的食物提取液和透析液，并测量荧光。结果在图13中示出。在这些食物中的任何一个的情况下，提取液中包含的荧光物质(诸如核黄素)的含量降低。
(实例4)
将包含以107ng/mL的浓度溶解在纯水中的氯霉素(CAP：分子量323.1)的110mL样品溶液容纳在130mL容量的容器中。四个微透析盒(各自具有300μL的容量，并且由截留分子量为4×102至1.4×105的透析膜组成)分别填充有250μL纯水作为透析液。在将搅拌器片放入容器中后，在利用搅拌器搅拌的同时透析样品溶液。在透析开始时以及90、180、300和1350分钟的透析后，通过LC/MS测量微透析盒中的CAP浓度。结果在表1中示出。
表1
Figure BDA0003005451680000151
Figure BDA0003005451680000161
(实例5)
将包含以112ng/mL的浓度溶解在牛奶中的氯霉素(CAP：分子量323.1)的110mL样品溶液容纳在130mL容量的容器中。四个微透析盒(各自具有300μL的容量，并且由截留分子量为4×102至1.4×105的透析膜组成)分别填充有250μL纯水作为透析液。在将搅拌器片放入容器中后，在利用搅拌器搅拌的同时透析样品溶液。在透析开始时以及90、180、300和1,260分钟的透析后，通过LC/MS测量微透析盒中的CAP浓度。结果在表2中示出。
表2
Figure BDA0003005451680000162
根据实例5，与如实例4中示出的使用纯水从样品溶液中进行的物质收集速率相比，透析液的物质收集速率更低。然而，即使在使用包含脂肪和蛋白质的牛奶作为样品溶液的情况下，也可以通过透析回收氯霉素。
出于解释的目的，前述内容描述了一些示例实施例。尽管前面的讨论已经呈现了具体的实施例，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的更广泛的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行改变。因此，以说明性的而不是限制性的意义来看待说明书和附图。因此，该详细描述不应被认为是限制性的，并且本发明的范围仅由所包括的权利要求以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围来限定。

Claims (14)

1.一种用于通过使用荧光的免疫分析方法来测量食品中包含的目标化合物的浓度的样品溶液制备方法，所述样品溶液制备方法包括：
透析步骤，用于使包括所述目标化合物的含目标化合物溶液通过透析膜与透析液接触，以将所述目标化合物转移至所述透析液，其中
所述透析膜的截留分子量在2×102至2×105的范围内，并且
所述透析液的体积相比于所述含目标化合物溶液的体积相对更小。
2.根据权利要求1所述的样品溶液制备方法，其中所述透析液的体积与所述含目标化合物溶液的体积(所述透析液的体积/所述含目标化合物溶液的体积)的比率在1/(1×104)至1/10的范围内。
3.根据权利要求1或2所述的样品溶液制备方法，其中所述透析步骤是将所述透析溶液填充在所述透析盒的外周上具有所述透析膜的所述透析盒中，并将所述透析盒浸入所述含目标化合物溶液中，以将所述目标化合物转移至所述透析液。
4.根据权利要求1至3中任一项的样品溶液制备方法，其中所述目标化合物在所述透析液中的溶解度高于所述目标化合物在所述含目标化合物溶液中的溶解度。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的样品溶液制备方法，其中所述透析步骤在其中所述透析液的温度高于所述含目标化合物溶液的温度的条件下进行。
6.根据权利要求1所述的样品溶液制备方法，其中所述透析步骤包括：
比较所述含目标化合物溶液的比重和所述透析液的比重；
将具有较高比重的流体放置在下层；
将所述透析膜放置在所述下层的顶部上；以及
将具有较低比重的流体倾倒所述透析膜上，以将所述目标化合物转移到所述透析液。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的样品溶液制备方法，其中所述透析步骤在利用搅拌器片搅拌所述含目标化合物溶液和/或所述透析液的同时进行，所述搅拌器片包括包含银颗粒的氧化铁颗粒。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的样品溶液制备方法，其中所述透析步骤通过将杂质吸附剂放置在所述含目标化合物溶液中来进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的样品溶液制备方法，其中所述目标化合物是选自霉菌毒素、贝类毒素、用于饲养动物的化学品和用于种植作物的化学品组成的组中的一种。
10.一种用于通过使用荧光的免疫分析方法测量食品中包含的目标化合物的浓度的测量单元，所述测量单元包括：
测量区域，包括透射300至800nm的范围内的波长的构件；以及
透析膜，所述透析膜具有2×102至2×105的截留分子量。
11.一种用于通过使用荧光的免疫分析方法测量食品中包含的目标化合物的浓度的测量试剂盒，所述目标化合物选自霉菌毒素、贝类毒素、用于饲养动物的化学品和用于种植作物的化学品组成的组，所述测量试剂盒包括：
根据权利要求10所述的测量单元；
待填充在测量单元中的透析液；
与目标化合物特异性结合的抗体；以及
荧光标记目标化合物衍生物。
12.一种使用荧光的免疫分析方法中的样品溶液制备装置，所述样品溶液制备装置包括：
容器，该容器容纳含目标化合物溶液；以及
一个或多个透析盒，该一个或多个透析盒被放置在容器中，
其中所述透析盒的总容量与所述容器的容量(所述透析盒的总容量/所述容器的容量)的比率在1/(1×104)至1/10的范围内。
13.根据权利要求12所述的样品溶液制备装置，
其中所述透析盒在所述透析盒的透析液入口处配备有盖子。
14.根据权利要求12或13所述的样品溶液制备装置，还包括用于搅拌容纳在所述容器中的溶液的搅拌装置。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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