CN113490415A - 阳离子羟烷基瓜尔胶用于微生物生长的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及阳离子羟烷基瓜尔胶用于维持或增加微生物的生长速率的体外用途，其中，所述阳离子羟烷基瓜尔胶具有在2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量。
Description
本申请要求于2018年11月29日提交的欧洲专利申请号18209213.0的优先权，出于所有目的将所述申请的全部内容通过援引方式并入本申请。
本发明涉及阳离子羟烷基瓜尔胶用于微生物、特别是细菌的生长的用途。
微生物可能对其相互作用的培养基具有有益的作用。因此，将这种培养基与这些微生物一起播种是有用的。一旦微生物沉积在目标培养基上，它们需要生长并且因此在其中已经存在细菌群落的特定环境中生存。因此，尽管存在此细菌群落，微生物仍然能够在目标培养基中生长和繁殖是至关重要的。
因此，技术人员寻求可用于制剂如植物检疫制剂中的成分，这些成分将产生改善微生物生长的环境。
由于世界性人口增长的增加，因此对粮食的需求也在增加。因此，生物刺激素越来越多地用于世界农业生产中。
植物根部到达营养素的速度是植物最初成功发育和生长的关键参数，通常是在最初几周。生物刺激素通过从天然产品中提供营养素或通过帮助植物获取营养素来帮助改善植物生长。
生物刺激素在作物的整个生命周期(从种子萌发到植物成熟)中促进植物的生长和发育。它们改善了植物代谢的效率，从而增加了育种并且使质量更好。它们增加了植物对非生物胁迫的耐受性和恢复能力。它们促进营养素的吸收、传递和利用。它们改善了农业生产的质量，包括水果的糖含量、颜色和大小。此外，它们调节并改善了植物的含水量。最后，它们增加了土壤的某些物理化学特性并且促进了地面上的微生物的发育。
将微生物或微生物混合物用于植物生物刺激是熟知的。这些方法基于含有纯化的微生物或微生物混合物的组合物的施用。此类组合物特别地含有芽孢杆菌菌株。
迄今为止，关于将微生物用作植物生物刺激素的主要缺陷是难以维持这种活性。
因此需要找到维持或甚至改善生物刺激素如微生物、特别是细菌的活性和效率的方法。
还需要找到在给定培养基中特别维持或改善目标微生物生长的方法。
因此，本发明涉及阳离子羟烷基瓜尔胶用于维持或增加微生物的生长速率的体外用途，其中，所述阳离子羟烷基瓜尔胶具有在约2,000道尔顿与约90,000道尔顿之间的平均分子量。
根据本发明，微生物、特别是细菌的生长速率可以通过以下方法测量：
微生物在瓜尔胶存在的培养基中培养。在不同的时间进行取样，以便使用铺板法确定菌落形成单位(CFU)的数目。利用这种方法，获得了细菌细胞的数目(表示为CFU)随时间的变化。微生物的生长遵循指数定律：Nt＝N0e(μt)，其中μ是微生物的生长速率。微生物生长速率的值μ是通过以对数标度拟合实验数据得到的，它对应于ln(Nt)随时间变化的斜率(线性图：ln(Nt)＝ln(N0)+μt)。
根据实施例，本发明涉及阳离子羟烷基瓜尔胶用于维持或增加微生物的生长速率的体外用途，其中，所述阳离子羟烷基瓜尔胶具有在约2,000道尔顿与约90,000道尔顿之间的平均分子量。
因此，本发明基于阳离子羟烷基瓜尔胶的用途，该阳离子羟烷基瓜尔胶能够随着时间的推移维持微生物、特别是细菌的生物刺激素作用并且使其保持恒定，并且换句话说，维持微生物的生长速率并且特别是维持细菌的生长速率。
有利地，所述阳离子羟烷基瓜尔胶的用途能够增加微生物、特别是细菌的生物刺激素作用，换句话说，能够增加微生物的生长速率并且特别是增加细菌的生长速率。
优选地，根据本发明，当使用如上定义的阳离子羟烷基瓜尔胶时，与不使用阳离子羟烷基瓜尔胶时的微生物的生长速度相比，微生物的生长速率增加了至少5％、优选地至少10％。
根据实施例，本发明涉及阳离子羟烷基瓜尔胶用于增加微生物的生长速率的体外用途，其中，所述阳离子羟烷基瓜尔胶具有在约2,000道尔顿与约90,000道尔顿之间的平均分子量。
本发明还涉及阳离子羟烷基瓜尔胶用于维持或增加在植物上、种子上或土壤中的微生物的生长速率的用途，其中，所述阳离子羟烷基瓜尔胶具有在2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量。
本发明还涉及阳离子羟烷基瓜尔胶用于维持或增加在植物上、种子上或土壤中的细菌的生长速率的用途，其中，所述阳离子羟烷基瓜尔胶是如上定义的。
因此，根据实施例，本发明涉及农用化学品，并且更具体地涉及植物检疫领域。根据实施例，将如上提及的阳离子羟烷基瓜尔胶用于植物、种子或土壤中。
贯穿本说明，包括权利要求书，术语“包含一个/一种(comprising one)”或者“包含一个/一种(comprising a)”应理解为是与术语“包含至少一个/一种”同义，除非另外指明，“在…之间”和“从...至...”应理解为包括极限值。
如在此使用的，“重量百分比”、“wt％”、“按重量计的百分比”、“按重量计％”、以及其变体指的是当将那种物质的重量除以组合物的总重量并且乘以100时的物质浓度。
如果通过援引并入本文的任何专利、专利申请和公开物的披露内容与本申请的说明相冲突到了可能导致术语不清楚的程度，则本说明应优先。
瓜尔胶
瓜尔胶是由糖半乳糖和甘露糖构成的多糖。主链是β1,4-连接的甘露糖残基直链，平均地在每隔一个甘露糖处半乳糖残基1,6-连接到该甘露糖残基直链，形成短的侧单元。
在本发明的上下文中，“阳离子瓜尔胶”意指瓜尔胶的阳离子衍生物。“阳离子的”是指无论pH如何永久地带正电的或非永久地带电的，例如，在低于给定pH下可以是阳离子的并且大于该pH下是中性的衍生物。值得注意地，该阳离子瓜尔胶是化学改性的瓜尔胶衍生物，其在pH中性水性培养基中示出或潜在示出净正电荷。
本发明的阳离子瓜尔胶可以通过使用阳离子醚化剂、通过化学地改性瓜尔胶(总体上天然瓜尔胶)获得。适合的阳离子醚化剂包括伯、仲或叔氨基团，或者季铵、硫鎓、或膦鎓基团。值得注意地，这些阳离子醚化剂是季铵盐。
优选地，这些阳离子醚化剂是带有三个基团的季铵盐，这些基团可以是相同的或不同的，选自氢，含有1至22个碳原子、更具体地1至14个并且有利地1至3个碳原子的烷基基团。平衡离子通常是卤素，在一个实施例中该平衡离子为氯。
如在此使用的，“烷基”是指直链或支链的饱和的脂肪烃基团并且旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”两者，其中后者是指在该烷基的一个或多个碳原子上具有代替氢的取代基(如羟基和卤素基团)的烷基部分。
季铵盐可以是例如：3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(CHPTMAC)、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(EPTAC)、二烯丙基二甲基氯化铵(DMDAAC)或其他阳离子试剂如三甲基铵丙基甲基丙烯酰胺。
在这些阳离子瓜耳胶中的典型的阳离子官能团是三甲基铵(2-羟基)丙基，与平衡离子。可以利用不同的平衡离子，包括但不限于卤离子，如氯离子、氟离子、溴离子和碘离子，硫酸根，甲基硫酸根，以及其混合物。
本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶可以选自由以下项组成的组：阳离子羟烷基瓜尔胶，如阳离子羟乙基瓜尔胶、阳离子羟丙基瓜尔胶、阳离子羟丁基瓜尔胶。
在一些方面，本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶是瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵或羟丙基瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，值得注意地，瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵。
阳离子羟烷基瓜尔胶的羟烷基化度(摩尔取代度或MS)，即被存在于该瓜尔胶上的游离羟基官能团的数目所消耗的环氧烷分子的数目，可以包括在0.1与3之间，优选地在0.1与1.7之间。例如，MS为1可以代表一个环氧乙烷单元/单糖单元。根据实施例，阳离子羟烷基瓜尔胶的羟烷基化度(摩尔取代度或MS)包括在0.1与1.7之间、优选地在0.2与1.0之间。
根据实施例，阳离子羟烷基瓜尔胶的取代度(DS)，即每糖单元取代的羟基的平均数目，包括在0.005与3之间。值得注意地，DS可以通过滴定确定。本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶可以具有在0.005与2之间的DS。优选地，本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶具有在0.005与1之间的DS。更优选地，本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶具有在0.12与0.5之间的DS。
阳离子羟烷基瓜尔胶的电荷密度(CD)可以包括在0.01与4.9meq/g之间，优选地在0.4与2.1meq/g之间。电荷密度指的是每克聚合物的正电荷数的比率。例如，CD＝1meq/g意指每克聚合物存在0.001个电荷。电荷密度与聚合物分子量的乘积确定了给定聚合物链上的带正电位点的数目。
根据本发明，阳离子羟烷基瓜尔胶可具有在约2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量(Mw)，优选地，阳离子羟烷基瓜尔胶具有在约5,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量，更优选地，阳离子羟烷基瓜尔胶具有在约5,000道尔顿与60,000道尔顿之间的平均分子量，还更优选地，阳离子羟烷基瓜尔胶具有在约5,000道尔顿与50,000道尔顿之间、优选地在约5,000道尔顿与40,000道尔顿之间的平均分子量。
根据另一个实施例，本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶可具有在100,000道尔顿与4,500,000道尔顿之间、例如在500,000道尔顿与4,000,000道尔顿之间、例如在1,000,000道尔顿与3,500,000道尔顿之间、例如在2,000,000与3,500,000道尔顿之间的平均分子量(Mw)。
可以通过GPC(凝胶渗透色谱法)测量阳离子羟烷基瓜尔胶的平均分子量。例如，可以使用Shodex OH Pak柱和安捷伦公司(Agilent)折光率检测器进行测量。
根据本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶可以通过解聚具有高分子量的阳离子改性的瓜尔胶以便将瓜尔胶聚合物“分裂”成所希望的尺寸来制备。应理解的是，本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶还可以通过解聚天然瓜尔胶、接着是阳离子化反应以提供具有阳离子官能度的聚合物来制备。各种解聚方法是本领域熟知的并且可以用于本发明，如通过使用过氧化合物(例如过氧化氢)的处理和照射。此类方法的实例披露于美国专利号4,547,571、美国专利号6,383,344和美国专利号7,259,192中。
使用本领域通常已知的方法，技术人员可以容易地进行瓜尔胶的阳离子化。用于提供具有阳离子官能度的瓜尔豆胶的各种方法是本领域已知的，例如如披露于美国专利公开号2008/0112907中的。用于交联瓜尔胶(有和没有瓜尔胶的阳离子改性)的各种方法也是已知的，参见例如美国专利号5,532,350和美国专利号5,801,116。可替代地，可以通过收获仍处于早期发育阶段的瓜尔胶豆来获得低分子量瓜尔胶，使得收获的瓜尔胶豆含有低分子量的天然瓜尔胶。然后可以对瓜尔胶进行阳离子化以为其提供阳离子官能度。
如上定义的阳离子羟烷基瓜尔胶可以用在组合物中。
含有阳离子羟烷基瓜尔胶的组合物可以是固体或液体组合物。在其中该组合物是固体的情况下，该组合物可以处于粉末、颗粒、团聚体、薄片、粒料、球粒、片剂、砖形物、膏剂、块状物(如模制的块状物)、单位剂量物的形式，或本领域技术人员已知的另一种固体形式。优选地，该固体组合物处于粉末或粒料的形式。
在一些方面，含有该瓜尔胶的组合物处于粒料的形式。含有阳离子羟烷基瓜尔胶的粒料可以三步法制备：湿法制粒，然后干燥并筛分。湿法制粒步骤值得注意地涉及在制粒设备(如混合制粒机)中引入并且混合阳离子羟烷基瓜尔胶粉末和载体以及任选地其他成分。进行该混合，其中将水喷雾到该混合物上。湿法制粒步骤将产生含有阳离子羟烷基瓜尔胶的湿粒料。待混合的载体与阳离子羟烷基瓜尔胶之间的重量比可以是在20:1至1:1之间，优选地在20:1至10:1之间。基于湿粒料的总重量，所引入的水含量可以包括在10wt％至50wt％之间。该载体可以是二氧化硅、无定形二氧化硅、沉淀二氧化硅、水合无定形二氧化硅、沉淀二氧化硅、水合无定形合成硅酸钙、疏水化的沉淀二氧化硅(hydrofobizedprecipitated silica)、硅胶、硅酸铝钠、粘土、沸石、膨润土、层状硅酸盐、高岭土、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、三聚磷酸钠、氯化钠、硅酸钠(水玻璃)、氯化镁、氯化钙、氯化铵、硫酸镁、碳酸钙、氧化钙、和/或硫酸钙、或其混合物。值得注意地，该载体选自氯化钙和碳酸钙。该干燥步骤值得注意地涉及通过使用热空气流干燥这些湿粒料。该步骤通常可以在装备有空气入口和空气出口的流化床中进行。该筛分步骤可以通过使用振动板进行。
粒料可以具有0.1至6mm的直径。总体上，正常粒料具有2-6mm的直径，并且微粒料具有0.1-2mm的直径。优选地，使用具有0.5-1.6mm的直径的微粒料。
可替代地，含有阳离子羟烷基瓜尔胶的粒料可以通过使用本领域技术人员熟知的挤出方法来制备。这些挤出方法描述于美国专利US 6146570中。例如，可以加热共混阳离子羟烷基瓜尔胶和载体以及任选地其他成分。载体与阳离子羟烷基瓜尔胶之间的重量比可以是在20:1至1:1之间。然后可以将粘合剂熔融并引入到阳离子羟烷基瓜尔胶和载体的混合物中。然后，可以用维持在55℃与65℃之间的挤出机温度进行挤出步骤。软的温热的粒料可以形成并且可以随后被冷却至低于该熔融粘合剂的凝固点(例如在室温下)以便获得固体粒料。
在种子处理组合物是液体的情况下，该液体组合物可以是悬浮液、分散体、浆料、液体载体(选自水、有机溶剂油或其混合物)中的溶液。可以通过使用常规方法通过将如以上所述的阳离子羟烷基瓜尔胶与液体载体、任选地与其他组分混合来制备该液体组合物。优选地，该液体组合物处于水溶液的形式。该组合物可以包含基于该组合物的总重量从1wt％至60wt％的阳离子羟烷基瓜尔胶。优选地，该组合物包含基于该组合物的总重量从5wt％至35wt％的阳离子羟烷基瓜尔胶。在一些方面，该组合物包含基于该组合物的总重量从20wt％至30wt％的阳离子羟烷基瓜尔胶。当以工业规模进行种子处理时，优选的是，用于种子处理的液体组合物含有高浓度的该阳离子羟烷基瓜尔胶，使得要求较少体积的该液体组合物以实现所希望的处理剂量(即阳离子羟烷基瓜尔胶与被处理的种子的重量比)。使用小体积的液体组合物可以节省成本并且较不冗长。然而，当液体组合物中的阳离子羟烷基瓜尔胶的浓度增加时，液体组合物的流动性将显著降低。其结果是，该液体组合物可变得太“稠”而不能有效地施用于种子或土壤中，并且具有差的在种子表面上或同样在土壤中铺展的能力。例如，包含3wt％的高分子量的阳离子羟烷基瓜尔胶的水性组合物可能已经是非常稠的并且因此具有差的流动性。本发明的一个优点是根据本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶具有相当低的分子量。在此种情况下，即使该阳离子羟烷基瓜尔胶以高浓度存在，所得到的液体组合物可以维持优异的流动性，并且因此，此种液体组合物可以方便地用于处理种子或土壤。在一个实施例中，本发明的方法包括其中用如上所述的组合物包覆种子的步骤。然后可以将该包覆的种子施用到土壤上或土壤中，值得注意地以便使该包覆的种子与土地接触。
可利用合适的包覆技术以用根据本发明的组合物包覆种子或种子的团聚体。可用于包覆的设备可包括但不限于鼓式包衣机、旋转包衣机、翻滚式鼓、流化床以及喷射床。应理解的是，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的设备或技术。可以通过分批式或连续式包覆工艺来包覆种子。可以用处于固体形式或液体形式的根据本发明的组合物包覆种子。优选地，使用水性分散体或溶液。
可以在该包覆步骤之前分离种子。在一个实施例中，机械手段如筛可以用于分离种子。然后可以将所分离的种子引入具有种子储存器的包衣机中。在一个实施例中，在混料罐中，将种子与在此所述的组合物、任选地与粘合剂和/或胶粘剂组合。
在一些方面，可以将一层或多层包含根据本发明的组合物的包衣添加到种子或其团聚体上。可以通过在转鼓中包覆种子或其团聚体顺序地引入外层。
还可使用团聚剂或团聚剂设备。可以在旋转包衣机中通过将种子放入旋转室来进行包覆，该旋转室推动这些种子抵靠该室的内壁。离心力和放置在该包衣机内的混合棒使种子旋转并且与包衣层混合，该包衣层包含根据本发明的组合物。可以将粘合剂或其他包覆材料泵送到该包衣机的近似中心内、到随该包衣室旋转的雾化器盘上。在碰撞该雾化器盘时，液态胶粘剂然后以小滴地被向外引导到种子上。
种子包衣技术还包括，例如，将种子放置在旋转盘或转鼓中。然后用水或其他液体喷雾这些种子并且然后将细惰性粉末(例如，硅藻土)逐渐添加到该包覆盘上。每个经雾化的种子变成粉末、层或尺寸逐渐增加的包衣的质量体的中心。然后通过该盘内的翻滚作用将该质量体圆化并且光滑化，类似于沙滩上的鹅卵石。通过该盘中材料的重量的压实作用将这些包衣层压实。在接近该包覆工艺结束时，经常结合粘合剂来将该质量体的外层硬化。粘合剂还可以降低由处理、运输以及播种成品而产生的灰尘的量。经常利用筛选技术(如，频繁手工筛选)来消除空白物或双体物，并且确保均匀的尺寸。例如，在此描述的种子包衣组合物的公差可以是+/-1/64英寸(0.4mm)，这是美国种子尺寸行业标准，建立在引入包衣很久以前。例如，最频繁地用带式种植机通过该带上8/64英寸(3.2mm)直径的圆洞来播种包覆的莴苣种子。此洞尺寸要求这些用根据本发明的组合物包覆的莴苣种子可以通过7.5/64英寸(3.0mm)的筛和通过8.5/64英寸(3.4mm)的筛进行尺寸化。
在本发明的一个实施例中，可以通过使用“原位包覆”工艺使种子与组合物接触，值得注意地通过将植物的种子植入土壤中的洞或沟中，并且然后施用根据本发明的组合物以包围或部分地包围种子或者与种子相邻，使得种子与组合物、值得注意地与阳离子羟烷基瓜耳胶接触。根据本发明，该洞可以值得注意地是洞、腔或空心区域。该种子可以是未被任何试剂处理的种子，或者已经用农用化学品(如杀真菌剂和杀虫剂)处理的但是未用本发明的组合物处理的种子。优选地，将该组合物在施用之前沉积在该载体上以提供粒料或微粒料。含有阳离子羟烷基瓜尔胶的粒料或微粒料可以通过使用以上描述的方法制备。
在仍另一个实施例中，将根据本发明的阳离子羟烷基瓜尔胶(或含有所述阳离子羟烷基瓜尔胶的组合物)施用到种植植物的土壤中。然后可以将植物的种子施用到土壤中，使得种子与组合物、值得注意地与阳离子羟烷基瓜尔胶接触。值得注意地，可以使用以液体形式(如以水性溶液/分散体的形式)的组合物，或以固体形式(如以粉末或粒料形式)的组合物。
优选地，机械地进行该种子的施用和根据本发明的组合物的施用。应理解的是，同样可以手动地进行所提及的施用的任何一个或两个。
根据优选的实施例，如上定义的阳离子羟烷基瓜尔胶以液体形式使用。
在本发明的一个实施例中，阳离子羟烷基瓜尔胶以范围从50至500g/公担种子的量使用。
微生物
“微生物”在此意指微小的生物体，其可以以其单细胞形式或作为细胞菌落存在。在具体的实施例中，所述微生物是单细胞的。
更具体地，本发明涉及土壤微生物(soil microorganism)，也称为土壤微生物(soil microbe)。
根据实施例，这些微生物是真菌、特别是单细胞真菌或细菌。
在具体的实施例中，这些微生物是细菌。
根据实施例，根据本发明的细菌选自革兰氏阳性菌。
如在此使用的，术语“革兰氏阳性菌”是指在革兰氏染色测定中染成紫色(阳性)的细菌细胞。革兰氏染色剂结合了在革兰氏阳性菌的细胞壁中丰富的肽聚糖。相反，“革兰氏阴性菌”的细胞壁具有一层薄肽聚糖，因此革兰氏阴性菌不保留染色剂并且允许吸收革兰氏染色测定中的复染。
革兰氏阳性菌是技术人员熟知的并且包括来自以下的细菌：放线棒菌、放线菌、节杆菌、双歧杆菌、弗兰克氏菌、加特德纳菌、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)、微杆菌、微球菌、小单孢子菌、分支杆菌、诺卡菌、红球菌、链霉菌、芽孢杆菌、梭菌、李斯特氏菌、肠球菌、乳酸杆菌、明串珠菌、支原体菌、脲支原体、乳球菌乳球菌、类芽孢杆菌、片球菌、醋酸杆菌、真细菌、太阳杆菌(Heliobacterium)、草螺菌(Heliospirillum)和鼠孢菌属。
在具体的实施例中，革兰氏阳性菌选自由以下组成的组的细菌：放线棒菌、放线菌、节杆菌、双歧杆菌、弗兰克氏菌、赖氨酸芽孢杆菌、微杆菌、微球菌、小单孢菌、诺卡氏菌、红球菌、链霉菌、芽孢杆菌、李斯特菌、乳酸菌、明串珠菌、乳球菌、类芽孢杆菌、片球菌、醋酸杆菌、真细菌、太阳杆菌、草螺菌和鼠孢菌属细菌。
在具体的实施例中，革兰氏阳性菌是来自芽孢杆菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：Bacillus itcheniformis、巨大芽孢杆菌(如巨大芽孢杆菌菌株CCT0536)、短小芽孢杆菌(如短小芽孢杆菌菌株GB34(YieldShield；拜耳公司(Bayer))、短小芽孢杆菌菌株QST2808(Sonata；拜耳公司)和短小芽孢杆菌菌株BU F-33)、地衣芽孢杆菌(如地衣芽孢杆菌菌株SB3086(EcoGuard；诺维信公司(Novozymes)和地衣芽孢杆菌菌株DSM17236)、蔬菜芽孢杆菌、漠海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、枯草芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌菌株GB03(Kodiak；拜耳公司)、MBI 600(Subtilex；贝克安德伍德公司(BeckerUnderwood))和QST 713(Serenade；拜耳公司)、枯草芽孢杆菌菌株GB122 plus、枯草芽孢杆菌菌株EB120、枯草芽孢杆菌菌株J-P13、枯草芽孢杆菌FB17、枯草芽孢杆菌菌株QST30002和QST3004(NRRL B-50421和NRRLB-50455)、枯草芽孢杆菌菌株QST30002和QST3004(NRRL B-50421和NRRLB-50455)砂纸突变体、枯草芽孢杆菌菌株QST 713、枯草芽孢杆菌菌株DSM17231、枯草芽孢杆菌菌株KAS-001、枯草芽孢杆菌菌株KAS-006、枯草芽孢杆菌菌株KAS-009、枯草芽孢杆菌菌株KAS-010、枯草芽孢杆菌菌株KAS-011和枯草芽孢杆菌菌株CCT0089)、圆孢芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(如坚强芽孢杆菌菌株1-1582(Votivo和Nortica；拜耳公司))、苏云金芽孢杆菌(如苏云金芽孢杆菌蜡螟亚物种菌株SDS-502、苏云金芽孢杆菌库斯塔克VBTS2546、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚物种菌株VBTS 2477四重肠毒素缺陷型突变体)、蜡样芽孢杆菌(如蜡样芽孢杆菌BP01)、简单纯芽孢杆菌(如简单纯芽孢杆菌菌株03WN13、03WN23和03WN25)、蕈状芽胞杆菌(如蕈状芽胞杆菌分离物BmJ NRRL B-30890)、阿氏芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌(Bacillus nealsonii)、球形芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌(如死谷芽孢杆菌菌株KAS-003)、甲基营养型芽孢杆菌(如甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-002、甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-005、甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-008、甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-012、甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-013和甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-014)、缓病芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌(如萎缩芽孢杆菌菌株KAS-004)物种；来自赖氨酸芽孢杆菌属的细菌，特别是来自球形赖氨酸芽孢杆菌物种的细菌；来自微杆菌属的细菌，特别是来自橙色微杆菌物种的细菌；来自类芽孢杆菌属的细菌，特别是选自由多粘类芽孢杆菌和尘埃类芽胞杆菌物种组成的组的细菌；或来自链霉菌属的细菌，特别是来自链霉菌K61物种的细菌。
在更具体的实施例中，革兰氏阳性菌是来自芽孢杆菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：Bacillus itcheniformis、巨大芽孢杆菌(如巨大芽孢杆菌菌株CCT0536)、短小芽孢杆菌(如短小芽孢杆菌菌株GB34(YieldShield；拜耳公司(Bayer))、短小芽孢杆菌菌株QST2808(Sonata；拜耳公司)和短小芽孢杆菌菌株BU F-33)、地衣芽孢杆菌(如地衣芽孢杆菌菌株SB3086(EcoGuard；诺维信公司(Novozymes)和地衣芽孢杆菌菌株DSM17236)、蔬菜芽孢杆菌、漠海威芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌菌株GB03(Kodiak；拜耳公司)、MBI 600(Subtilex；贝克安德伍德公司(Becker Underwood))和QST713(Serenade；拜耳公司)、枯草芽孢杆菌菌株GB122 plus、枯草芽孢杆菌菌株EB120、枯草芽孢杆菌菌株J-P13、枯草芽孢杆菌FB17、枯草芽孢杆菌菌株QST30002和QST3004(NRRL B-50421和NRRLB-50455)、枯草芽孢杆菌菌株QST30002和QST3004(NRRL B-50421和NRRLB-50455)砂纸突变体、枯草芽孢杆菌菌株QST 713、枯草芽孢杆菌菌株DSM 17231、枯草芽孢杆菌菌株KAS-001、枯草芽孢杆菌菌株KAS-006、枯草芽孢杆菌菌株KAS-009、枯草芽孢杆菌菌株KAS-010、枯草芽孢杆菌菌株KAS-011和枯草芽孢杆菌菌株CCT0089)、圆孢芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌(如坚强芽孢杆菌菌株1-1582(Votivo和Nortica；拜耳公司))、苏云金芽孢杆菌(如苏云金芽孢杆菌蜡螟亚物种菌株SDS-502、苏云金芽孢杆菌库斯塔克VBTS 2546、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚物种菌株VBTS 2477四重肠毒素缺陷型突变体)、蜡样芽孢杆菌(如蜡样芽孢杆菌BP01)、简单纯芽孢杆菌(如简单纯芽孢杆菌菌株03WN13、03WN23和03WN25)、蕈状芽胞杆菌(如蕈状芽胞杆菌分离物BmJ NRRL B-30890)、阿氏芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌(如死谷芽孢杆菌菌株KAS-003)、甲基营养型芽孢杆菌(如甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-002、甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-005、甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-008、甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-012、甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-013和甲基营养型芽孢杆菌菌株KAS-014)、缓病芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌(如萎缩芽孢杆菌菌株KAS-004)物种。
在更具体的实施例中，革兰氏阳性菌是来自枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌物种的细菌。还仍具体的实施例中，革兰氏阳性菌是枯草芽孢杆菌CCT 0089、苏云金芽孢杆菌CCT 2335或巨大芽孢杆菌CCT 0536。
根据实施例，根据本发明的细菌选自革兰氏阴性菌。
革兰氏阴性菌是技术人员熟知的并且包括来自以下的细菌：醋杆菌、无色杆菌、放线杆菌、农杆菌、根瘤菌、固氮螺菌、固氮菌、博代氏杆菌菌、慢生根瘤菌、布鲁氏菌、伯克霍尔德菌、弯曲杆菌、嗜碳杆菌、螯合杆菌、金黄杆菌、柠檬酸杆菌、代尔福特菌、肠杆菌、欧文氏菌、埃希氏杆菌、黄杆菌、弗朗西斯氏菌、弗拉特氏菌、葡糖杆菌、螺杆菌、嗜血杆菌、Kalstia、克雷白氏菌、军团菌、中慢生根瘤菌、莫拉克斯氏菌、奈瑟氏菌、泛菌、巴斯德菌、叶杆菌、变形杆菌、假单胞菌、根瘤菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌、中华根瘤菌、密螺旋体、弧菌、黄单胞菌和耶尔森氏菌属。
在具体的实施例中，革兰氏阴性菌选自由以下组成的组：醋杆菌、无色杆菌、土壤杆菌、根瘤菌、固氮螺菌、固氮菌、慢生根瘤菌、嗜碳菌、螯合杆菌、代尔福特菌、欧文氏菌、黄杆菌、弗拉托氏菌、葡糖杆菌、中慢生根瘤菌、奈瑟氏菌、泛菌、叶杆菌、假单胞菌、根瘤菌、沙雷氏菌、中华根瘤菌、和黄单胞菌属细菌。
在具体的实施例中，革兰氏阴性菌是来自醋杆菌属的细菌，特别是来自木醋杆菌物种的细菌；来自农杆菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：放射形土壤杆菌(如放射形土壤杆菌菌株k84和放射形土壤杆菌菌株CCT4774)、发根土壤杆菌、悬钩子土壤杆菌和根癌土壤杆菌物种；来自固氮螺菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：巴西固氮螺菌、Azospirillum doebereinerae、Azospirillum halopraeferens、Azospirillum canadense、稻固氮螺菌(Azospirillum oryzae)和产脂固氮螺菌物种；来自固氮菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：圆褐固氮菌、棕色固氮菌和盐居固氮菌(Azotobacter salinestris)物种；来自慢生根瘤菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：花生慢生根瘤菌(Bradyrhizobium arachidis)、甜菜慢生根瘤菌、香炉盘慢生根瘤菌、金雀儿慢生根瘤菌(Bradyrhizobium cytisi)、大庆慢生型大豆根瘤菌、反硝化慢生根瘤菌(Bradyrhizobium denitrificans)、豆科植物共生固氮根瘤菌、埃氏慢生根瘤菌、Bradyrhizobium embrapense、格木慢生根瘤菌(Bradyrhizobium erythrophlei)、铁木慢生根瘤菌(Bradyrhizobium ferriligni)、赣州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense)、广东慢生根瘤菌(Bradyrhizobium guangdongense)、黄淮海慢生根瘤菌(Bradyrhizobium huanghuaihaiense)、Bradyrhizobium icense、印加慢生根瘤菌、Bradyrhizobium iriomotense、慢生型大豆根瘤菌(如慢生型大豆根瘤菌菌株USDA110、B.japonicum bv.genistearum、B.japonicum bv.glycinearum和慢生型大豆根瘤菌菌株CCT 4065)、Bradyrhizobium jicamae、Bradyrhizobium kavangense、扁豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium lablabi)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)、羽扇豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium lupine)、Bradyrhizobiummanausense、Bradyrhizobiumneotropicale、Bradyrhizobium oligotrophicum、渥太华慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumottawaense)、豆薯甙慢生根瘤菌(Bradyrhizobium pachyrhizi)、Bradyrhizobiumpaxllaeri、Bradyrhizobium retamae、Bradyrhizobium rifense、Bradyrhizobiumstylosanthis、Bradyrhizobium subterraneum、Bradyrhizobium tropiciagri、Bradyrhizobium valentinum、Bradyrhizobium viridifuturi和圆明慢生根瘤菌物种；来自代尔福特菌属的细菌，特别是来自代尔夫特食酸菌物种的细菌；来自弗拉托氏菌属的细菌，特别是来自橙色弗拉托氏菌(Frateuria aurantiaca)物种的细菌；来自葡糖杆菌属的细菌，特别是来自重氮营养葡糖杆菌(Gluconobacter diazotrophicus)物种的细菌；来自中慢生根瘤菌属的细菌，特别是来自鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium cicero)物种的细菌；来自假单胞菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、Pseudomonas protegens、绿针假单胞菌、桔黄假单胞菌、门多萨假单胞菌和Pseudomonas rathonis物种；来自根瘤菌属的细菌、特别是选自由以下组成的组的细菌：豌豆根瘤菌、内蒙古根瘤菌、Rhizobium bangladeshense、Rhizobium binae、高卢根瘤菌、海南根瘤菌、槐蓝根瘤菌、Rhizobium lentis、黄土根瘤菌、葡萄牙根瘤菌、菜豆根瘤菌和羽扇豆瘤菌(Rhizobium lupine)物种；来自中华根瘤菌属的细菌，特别是来自苜蓿中华根瘤菌物种的细菌。
在更具体的实施例中，革兰氏阴性菌是来自土壤杆菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：放射形土壤杆菌(如放射形土壤杆菌菌株k84和放射形土壤杆菌菌株CCT 4774)、发根土壤杆菌、悬钩子土壤杆菌和根癌土壤杆菌物种；或来自慢生根瘤菌属的细菌，特别是选自由以下组成的组的细菌：花生慢生根瘤菌(Bradyrhizobium arachidis)、甜菜慢生根瘤菌、Bradyrhizobiumcanariense、金雀儿慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumcytisi)、大庆慢生型大豆根瘤菌、反硝化慢生根瘤菌(Bradyrhizobium denitrificans)、Bradyrhizobium diazoefficiens、埃氏慢生根瘤菌、Bradyrhizobium embrapense、格木慢生根瘤菌(Bradyrhizobium erythrophlei)、铁木慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumferriligni)、赣州慢生根瘤菌(Bradyrhizobium ganzhouense)、广东慢生根瘤菌(Bradyrhizobium guangdongense)、黄淮海慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumhuanghuaihaiense)、Bradyrhizobium icense、印加慢生根瘤菌、Bradyrhizobiumiriomotense、慢生型大豆根瘤菌(如慢生型大豆根瘤菌菌株USDA110、B.japonicumbv.genistearum、B.japonicum bv.glycinearum和慢生型大豆根瘤菌菌株CCT 4065)、Bradyrhizobium jicamae、Bradyrhizobium kavangense、扁豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium lablabi)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)、羽扇豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium lupine)、Bradyrhizobiummanausense、Bradyrhizobiumneotropicale、Bradyrhizobium oligotrophicum、渥太华慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumottawaense)、豆薯甙慢生根瘤菌(Bradyrhizobium pachyrhizi)、Bradyrhizobiumpaxllaeri、Bradyrhizobium retamae、Bradyrhizobium rifense、Bradyrhizobiumstylosanthis、Bradyrhizobium subterraneum、Bradyrhizobium tropiciagri、Bradyrhizobium valentinum、Bradyrhizobium viridifuturi和圆明慢生根瘤菌物种。
在更具体的实施例中，革兰氏阴性菌是来自放射形土壤杆菌、慢生型大豆根瘤菌或恶臭假单胞菌物种的细菌。在仍具体的实施例中，革兰氏阴性菌是放射形土壤杆菌菌株CCT 4774、慢生型大豆根瘤菌菌株CCT 4065或恶臭假单胞菌CCT 5357。
根据本发明实施例中的任一个，微生物可以是例如选自枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、放射形土壤杆菌、慢生型大豆根瘤菌或恶臭假单胞菌物种的细菌。
根据另一个实施例，微生物是真菌、特别是单细胞真菌。
真菌是技术人员熟知的并且包括子囊菌、球囊菌和担子菌。在具体的实施例中，所述真菌选自子囊菌门，特别是选自由以下组成的组：木霉、绿僵菌、白僵菌、蜡蚧菌、淡紫紫孢菌、粘帚霉、棒束孢、镰刀菌、节丛孢菌、青霉菌、曲霉菌、白粉寄生孢(Ampelomyces)、盾壳霉、短梗霉和假丝酵母菌属；选自球囊菌门，特别是选自由球囊霉属和唼蜡甲属组成的组；和/或选自担子菌门，特别是选自由Phlebiopsis和丝核菌属组成的组。
在具体实施例中，所述真菌是来自木霉属的真菌，特别是选自由以下组成的组的真菌：绿色木霉、深绿木霉、绿木霉、哈茨木霉、钩状木霉、棘孢木霉、康宁木霉、长柄木霉、卵孢木霉、Trichoderma paucisporum、Trichoderma songyi、可可木霉和盖姆斯木霉物种；来自绿僵菌属的真菌，特别是选自由以下组成的组的真菌：金龟子绿僵菌、大孢绿僵菌、褐色绿僵菌和黄绿绿僵菌物种；来自白僵菌属的真菌，特别是来自球孢白僵菌物种的真菌；来自蜡蚧菌属的真菌，特别是选自由蜡蚧轮枝菌和蜡蚧蝇蚧霉物种组成的组的真菌；来自淡紫紫孢菌(Purpureocillium)属的真菌，特别是来自淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)物种的真菌；来自粘帚霉属的真菌，特别是来自链孢粘帚霉物种的真菌；来自棒束孢属的真菌，特别是来自玫烟色棒束孢物种的真菌；来自镰刀菌属的真菌；来自节丛孢属的真菌，特别是来自指状节丛孢物种的真菌；来自青霉属的真菌，特别是选自由拜赖青霉和指状青霉物种组成的组的真菌；来自曲霉属的真菌，特别是选自由泡盛曲霉和黑曲霉物种组成的组的真菌；来自白粉寄生孢(Ampelomyces)属的真菌，特别是来自白粉寄生孢物种的真菌；来自盾壳霉属的真菌，特别是来自小盾壳霉(Coniothyrium minitans)物种的真菌；来自短梗霉属的真菌，特别是来自出芽短梗霉物种的真菌；来自假丝酵母菌属的真菌，特别是来自假丝酵母菌(Candida oleophila)物种的真菌；来自球囊霉属的真菌，特别是选自由Glomus iranicum和摩西球囊霉物种组成的组的真菌；来自Rhizophagus属的真菌，特别是来自根内球囊霉(Rhizophagus irregularis)物种的真菌；来自Phlebiopsis属的真菌，特别是来自大伏革菌物种的真菌；或来自丝核菌属的真菌，特别是来自立枯丝核菌物种的真菌。
在更具体的实施例中，真菌是来自黑曲霉、哈茨木霉或球孢白僵菌物种的真菌。在仍具体的实施例中，真菌是黑曲霉ATCC 16404、哈茨木霉CCT 4790或球孢白僵菌ATCC7159/DSM 1344。
根据本发明实施例中的任一个，微生物可以是例如选自枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、放射形土壤杆菌、慢生型大豆根瘤菌或恶臭假单胞菌物种的细菌，或是选自黑曲霉、哈茨木霉或球孢白僵菌物种的真菌，如先前描述的那些。例如，可以是选自枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、慢生型大豆根瘤菌或恶臭假单胞菌物种的细菌，或是选自黑曲霉、哈茨木霉或球孢白僵菌物种的真菌，如先前描述的那些。
待使用的微生物的量可能根据微生物而变化，并且还可能取决于待处理的种子。在本发明的一个实施例中，微生物以范围从1.104至1.1015CFU/公担种子的量使用。
本发明还涉及一种用于维持或增加微生物、特别是细菌的生长速率的方法，该方法包括使至少一种种子与如上定义的阳离子羟烷基瓜尔胶接触的步骤。
根据优选的实施例，此方法在液体培养基中进行。因此，优选地，此方法包括使至少一种种子与如上定义的呈液体形式的阳离子羟烷基瓜尔胶或与如上定义的包含阳离子羟烷基瓜尔胶的液体组合物接触的步骤。
本发明还涉及微生物、特别是细菌以及如上定义的阳离子羟烷基瓜尔胶作为植物生物刺激素的用途。因此，本发明涉及所述微生物、特别是细菌以及阳离子羟烷基瓜尔胶的组合用途。已经示出了所述微生物、特别是细菌以及阳离子羟烷基瓜尔胶的组合给予了植物生物刺激素活性。
本发明还涉及一种生物刺激素组合物，其包含至少一种微生物、特别是细菌以及至少一种如上定义的阳离子羟烷基瓜尔胶。
根据本发明实施例中的任一个，微生物与阳离子羟烷基瓜尔胶以如下比率组合：微生物:阳离子羟烷基瓜尔胶的范围为从1.104至1.1015，例如范围从1.104至1.1012，例如范围从1.104至1.1011CFU/g，例如范围从1.104至5.1010CFU/g，例如范围从1.105至1.1010CFU/g。例如，微生物与阳离子羟烷基瓜尔胶可以以如下比率组合：微生物:阳离子羟烷基瓜尔胶的范围为从1.108至1.1012。
优选地，此生物刺激素组合物呈液体形式。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含至少一种微生物、特别是细菌以及至少一种如上定义的阳离子羟烷基瓜尔胶，所述试剂盒优选地用作植物生物刺激素。
因此，本发明还涉及以上提及的试剂盒作为植物生物刺激素的用途。
本发明还涉及一种包覆有如上定义的生物刺激素组合物的种子。
在一个实施例中，该种子是作物或植物物种，这些作物或植物物种包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属物种(例如，B.napus、B.rapa、B.juncea)、苜蓿(Medicagosativa)、稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、蜀黍(Sorghum bicolor、Sorghumvulgare)、粟(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍(Panicummiliaceum)、小米(Setariaitalica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、葵花(Helianthus annuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotianatabacum)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypiumbarbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、树薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘属果树(Citrusspp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、牛油果(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、夏威夷果(Macadamia integrifolia)、扁桃仁(Prunus amygdalus)、糖甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物、木本植物如针叶树和落叶乔木、南瓜属植物、南瓜、绿皮西葫芦、苹果、梨、温柏、甜瓜、李子、樱桃、桃子、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、大豆、蜀黍、甘蔗、油菜籽、三叶草、胡萝卜、和拟南芥。
在一个实施例中，该种子是任何蔬菜物种，这些蔬菜物种包括但不限于西红柿(Lycopersicon esculentum)、生菜(例如，Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)、花椰菜、西兰花、芜菁(turnip)、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、以及黄瓜属的成员(如黄瓜(C.sativus)、罗马甜瓜(C.cantalupensis)、以及香瓜(C.melo))。
在一个实施例中，该种子是任何观赏植物物种，这些观赏植物物种包括但不限于绣球花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、喇叭花(Petuniahybrida)、玫瑰(Rosa spp.)、杜鹃花(Rhododendron spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、圣诞红(Euphorbia pulcherrima)、以及菊花。
在一个实施例中，该种子是任何针叶树物种，这些针叶树物种包括但不限于针叶松树如厚皮刺果松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、杰克松(Pinus ponderosa)、美国黑松(Pinus contorta)、和蒙特利松(Pinus radiata)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；西加云杉(Picea glauca)；红木(Sequoiasempervirens)；冷杉如银杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；以及香柏如西红杉(Thuja plicata)和阿拉斯加黄杉(Chamaecyparis nootkatensis)。
在一个实施例中，该种子是任何豆科植物物种，这些豆科植物物种包括但不限于豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、菜用刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆、豌豆、乌头叶菜豆、蚕豆、菜豆、兵豆、干菜豆等。豆科植物包括但不限于，落花生属(例如，花生)、蚕豆属(例如，小冠花、毛叶苕子、赤豆、绿豆、和鹰嘴豆)、羽扇豆属(例如，羽扇豆)、三叶草属、菜豆属(例如，普通菜豆和利马豆)、豌豆属(例如，蚕豆)、草木犀属(例如，三叶草)、苜蓿属(例如，苜蓿)、百脉根属(例如，车轴草)、兵豆属(lens)(例如，兵豆)、以及紫穗槐。用于在在此描述的方法中使用的典型的饲草和草坪草包括但不限于苜蓿、野茅、高羊茅、黑麦草、匍匐翦股颖、苜蓿、百脉根、三叶草、笔花豆属物种、贝恩斯罗顿豆(lotononis bainessii)、红豆草和小糠草。其他草类物种包括大麦、小麦、燕麦、黑麦、野茅、羊草、高粱或草坪草植物。
在另一个实施例中，该种子选自以下作物或蔬菜：玉米、小麦、高粱、大豆、西红柿、花椰菜、萝卜、卷心菜、油菜、生菜、黑麦草、草、稻、棉花、葵花以及类似物。在另一个实施例中，该种子选自玉米、小麦、大麦、稻、豌豆、燕麦、大豆、葵花、苜蓿、高粱、油菜籽、糖甜菜、棉花、烟草、饲料作物、亚麻籽、草、蔬菜、水果和葵花籽。
应理解的是术语“种子”或“秧苗”不限于特定或具体类型的物种或种子。术语“种子”或“秧苗”可指的是来自单一植物物种的种子、来自多种植物物种的种子混合物、或来自一个植物物种中不同株的种子共混物。在一个实施例中，作物种子包括但不限于稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、大豆、棉花、向日葵、苜蓿、高粱、油菜籽、甜菜、西红柿、豆、胡萝卜、烟草或花籽。
以下实例被包括来说明本发明的实施例，但并不限于所描述的实例。
实例
实例1：
在实验中使用了以下材料：
瓜尔胶：瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，其平均分子量在5,000与25,000道尔顿之间，DS为0.2且MS在0.2与1.0之间，从索尔维公司(Solvay)可获得的(作为粉末提供)
从巴西的安德烈托塞洛基金会(AndréTosello Foundation)的热带培养物保藏获得细菌菌株。
·枯草芽孢杆菌CCT 0089
·巨大芽孢杆菌CCT 0536
·慢生型大豆根瘤菌CCT 4065
将所有菌株在-80℃下储存在含有15％甘油的适当培养基中。
实验中使用了两种不同的培养基：
·每升含有以下项的NA培养基：3g肉膏、5g蛋白胨和15g琼脂(仅用于固体培养基)
·每升含有以下项的YMA培养基：0.5g磷酸二氢钾、0.2g硫酸镁；0.1g氯化钠；0.5g酵母提取物；10g甘露醇(仅用于接种物和固体培养基)；5mL的5％溴百里酚蓝溶液和15g琼脂(仅固体培养基)。
对于菌株枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，使用NA培养基。对于菌株慢生型大豆根瘤菌，使用YMA培养基。根据菌株供应商来选择这些培养基。
用1mL的储用培养物接种含有100mL的NA或YMA培养基的250mL的摇瓶，并且在30℃、150rpm下培养72小时。
对于每种菌株，然后将10mL的再活化培养基转移到含有100mL相同培养基的250mL摇瓶中，添加瓜尔胶粉末(占培养基的1wt％)；并且在30℃、150rpm下培养96小时。还对每种菌株进行了不添加瓜尔胶粉末的实验作为对照。
培养0h、24h、48h、72h和96h后，取每个实验的100μL样品。将这些样品稀释(稀释度根据菌株的生长而变化，从1x10-5至1x10-15)，并将稀释物在固体NA或YMA培养基中铺板。将平板在30℃下培养直至出现菌落。培养后，对每种稀释液中存在的菌落数目进行计数，并用于评估细菌的生长。
为了确定细菌的生长速率，构建log10(菌落的数目)对培养时间的曲线图。此曲线图中的直线表示细菌生长的指数阶段，并且角系数表示细菌的生长速率(μ)。
μ值用于比较所有实验并评估瓜尔胶的添加对于细菌生长的影响。
对于此组实验，微生物与瓜尔胶的比率等于3.50x104CFU/g。表1总结了不同实验获得的细菌生长速率(μ)：
表1
对于这三种菌株，在瓜尔胶的存在下获得了相当或更高的细菌生长速率值。瓜尔胶的添加允许维持或增加这些不同的细菌菌株的生长速率。在表2中报告了与每种菌株的对照相比，添加瓜尔胶的细菌生长速率的相对增加或减少。对于两种革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌)，观察到细菌的生长速率增加了+14％，而对于慢生型大豆根瘤菌，则观察到了零值，这与有和没有瓜尔胶的细菌的生长速率相当。
表2
在相同的细菌物种上，以细菌/瓜尔胶等于7.00x105的比率进行了类似的实验，在瓜尔胶存在下，获得了相当或更高的细菌生长值。
实例2：
在实验中使用了以下材料：
瓜尔胶：瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，其平均分子量在5,000与25,000道尔顿之间，DS为0.2且MS在0.2与1.0之间，从索尔维公司可获得的(作为粉末提供)
液体瓜尔胶制剂：来自索尔维公司的25％的粉末瓜尔胶的水性制剂
从巴西的安德烈托塞洛基金会(AndréTosello Foundation)的热带培养物保藏获得细菌菌株。
·枯草芽孢杆菌CCT 0089
·巨大芽孢杆菌CCT 0536
·慢生型大豆根瘤菌CCT 4065
将所有菌株在-80℃下储存在含有15％甘油的适当培养基中。
实验中使用了两种不同的培养基：
·每升含有以下项的NA培养基：3g肉膏、5g蛋白胨和15g琼脂(仅用于固体培养基)
·每升含有以下项的YMA培养基：0.5g磷酸二氢钾、0.2g硫酸镁；0.1g氯化钠；0.5g酵母提取物；10g甘露醇(仅用于接种物和固体培养基)；5mL的5％溴百里酚蓝溶液和15g琼脂(仅固体培养基)。
对于菌株枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，使用NA培养基。对于菌株慢生型大豆根瘤菌，使用YMA培养基。根据菌株供应商来选择这些培养基。
用1mL的储用培养物接种含有100mL的NA或YMA培养基的250mL的摇瓶，并且在30℃、150rpm下培养72小时。
对于每种菌株，然后将10mL的再活化培养基转移到含有100mL相同培养基的250mL摇瓶中，添加瓜尔胶粉末或瓜尔胶液体制剂；并且在30℃、150rpm下培养96小时。还对每种菌株进行了不添加瓜尔胶粉末的实验作为对照。
培养0h、24h、48h、72h和96h后，取每个实验的100μL样品。将这些样品稀释(稀释度根据菌株的生长而变化，从1x10-5至1x10-15)，并将稀释物在固体NA或YMA培养基中铺板。将平板在30℃下培养直至出现菌落。培养后，对每种稀释液中存在的菌落数目进行计数，并用于评估细菌的生长。
为了确定细菌的生长速率，构建log10(菌落的数目)对培养时间的曲线图。此曲线图中的直线表示细菌生长的指数阶段，并且角系数表示细菌的生长速率(μ)。
μ值用于比较所有实验并评估添加两种瓜尔胶对于细菌生长的影响。对于此组实验，将微生物与瓜尔胶的比率设置为1.0x1010CFU/g。表3总结了不同实验获得的细菌生长速率(μ)：
表3
对于这三种菌株，在粉末形式的瓜尔胶和呈水性制剂的瓜尔胶的存在下，获得了相当或更高的细菌生长速率值。瓜尔胶的添加允许维持或增加这些不同的细菌菌株的生长速率。在表4中报告了与每种菌株的对照相比，添加两种瓜尔胶等级的细菌生长速率的相对增加或减少。对于两种革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌)，观察到细菌的生长速率增加了范围从8％至22％，而对于慢生型大豆根瘤菌，则观察到了零值或2％，这与有和没有瓜尔胶的细菌的生长速率相当。
表4
实例3：
在实验中使用了以下材料：
瓜尔胶：瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，其平均分子量在5,000与25,000道尔顿之间，DS为0.2且MS在0.2与1.0之间，从索尔维公司(Solvay)可获得的(作为粉末提供)
从巴西的安德烈托塞洛基金会的热带培养物保藏获得细菌菌株：
·苏云金芽孢杆菌CCT 2335
·恶臭假单胞菌CCT 2357
将所有菌株在-80℃下储存在含有15％甘油的适当培养基中。
两种菌株仅使用一个培养基
·每升含有以下项的NA培养基：3g肉膏、5g蛋白胨和15g琼脂(仅用于固体培养基)
用1mL的储用培养物接种含有100mL的NA或YMA培养基的250mL的摇瓶，并且在30℃、150rpm下培养72小时。
对于每种菌株，然后将10mL的再活化培养基转移到含有100mL相同培养基的250mL摇瓶中，添加瓜尔胶粉末或瓜尔胶液体制剂；并且在30℃、150rpm下培养96小时。还对每种菌株进行了不添加瓜尔胶粉末的实验作为对照。
培养0h、24h、48h、72h和96h后，取每个实验的100μL样品。将这些样品稀释(稀释度根据菌株的生长而变化，从1x10-5至1x10-15)，并将稀释物在固体NA培养基中铺板。将平板在30℃下培养直至出现菌落。培养后，对每种稀释液中存在的菌落数目进行计数，并用于评估细菌的生长。
为了确定细菌的生长速率，构建log10(菌落的数目)对培养时间的曲线图。此曲线图中的直线表示细菌生长的指数阶段，并且角系数表示细菌的生长速率(μ)。
μ值用于比较所有实验并评估添加两种瓜尔胶对于细菌生长的影响。对于此组实验，将微生物与瓜尔胶的比率设置为1.0x105CFU/g。表5总结了不同实验获得的细菌生长速率(μ)：
| 组成 | 细菌生长速率(h<sup>-1</sup>) |
| 苏云金芽孢杆菌CCT 2335 | 0.0898 |
| 苏云金芽孢杆菌CCT 2335+瓜尔胶 | 0.1028 |
| 恶臭假单胞菌CCT 5357 | 0.1133 |
| 恶臭假单胞菌CCT 5357+瓜尔胶 | 0.1282 |
表5
对于这两种菌株，存在瓜尔胶的比未添加瓜尔胶的获得更高的细菌生长速率值。瓜尔胶的添加允许增加这些不同的细菌菌株的生长速率。在表6中报告了与每种菌株的对照相比，添加瓜尔胶的细菌生长速率的相对增加。对于这两种细菌菌株，观察到了范围从13％至14％的细菌生长速率的增加。
表6
实例4：
在实验中使用了以下材料：
瓜尔胶：瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵，其平均分子量在5,000与25,000道尔顿之间，DS为0.2且MS在0.2与1.0之间，从索尔维公司(Solvay)可获得的(作为粉末提供)
液体瓜尔胶制剂：来自索尔维公司的25％的粉末瓜尔胶的水性制剂
从巴西的安德烈托塞洛基金会的热带培养物保藏获得所有的微生物菌株，它们中的一些在美国模式培养物保藏所(ATCC)中具有参考。
·哈茨木霉CCT 4790
·黑曲霉ATCC 16404
将所有菌株在-80℃下储存在含有20％甘油的适当培养基中。
实验中使用了以下培养基：
·每升含有以下项的营养肉汤(NA)培养基：3g肉膏、5g蛋白胨和15g琼脂(仅用于固体培养基)
·每升含有以下项的燕麦琼脂(OA)：25g燕麦片或燕麦粉和15g琼脂
·每升含有以下项的沙氏葡萄糖琼脂(SDA)：40g葡萄糖、10g蛋白胨和20g琼脂
根据供应商的推荐，将培养基SDA和OA分别用于菌株黑曲霉和哈茨木霉的再活化。
对于具有瓜尔胶的实验，仅使用NA培养基。
微生物的再活化：
将含有20mL的SDA或OA培养基的皮氏培养皿用于分别对菌株黑曲霉和哈茨木霉的再活化。
储用培养物用于接种各菌株的固体培养基，并且在25℃下培养皮氏培养皿直至完全生长。
具有瓜尔胶的培养：
从皮氏培养皿上的再活化培养基中回收真菌的孢子并且制备孢子溶液。
将500μL的孢子溶液(大约1x1010CFU/mL)转移到含有50mL培养基(对照和具有瓜尔胶的NA培养基)的锥形瓶中并且在25℃下培养。在48h、120h和168h取样，在滤纸上过滤并在60℃下培养，然后称重
*对照培养基＝未添加瓜尔胶的NA
生长评估：
将每个样品后的干生物质回收绘制成干生物质对时间的曲线图，并可获得生长曲线。
仅考虑生长的指数阶段计算生长速率(μ)，并与对照进行比较。
μ值用于比较所有实验并评估瓜尔胶的添加对于真菌生长的影响。表7总结了不同实验获得的微生物生长速率(μ)：
| 组成 | 真菌生长速率(h<sup>-1</sup>) |
| 哈茨木霉CCT 4790 | 0.0009 |
| 哈茨木霉CCT 4790+瓜尔胶粉末 | 0.0013 |
| 哈茨木霉CCT 4790+瓜尔胶液体制剂 | 0.0015 |
| 黑曲霉ATCC 16404 | 0.0008 |
| 黑曲霉ATCC 16404+瓜尔胶粉末 | 0.0014 |
| 黑曲霉ATCC 16404+瓜尔胶液体制剂 | 0.0015 |
表7
对于这两种菌株，与对照相比，在粉末形式的瓜尔胶和呈水性制剂的瓜尔胶的存在下，获得了更高的生长率值。因此，瓜尔胶的添加使得这些不同的真菌菌株的生长速率增加。在表8中报告了与每种菌株的对照相比，添加两种瓜尔胶等级的生长速率的相对增加。对于这两种真菌菌株，观察到了范围从44％至88％的细菌生长速率的增加。
表8
Claims (15)
1.阳离子羟烷基瓜尔胶用于维持或增加微生物的生长速率的体外用途，其中，所述阳离子羟烷基瓜尔胶具有在2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量。
2.阳离子羟烷基瓜尔胶用于维持或增加在植物上、种子上或土壤中的微生物的生长速率的用途，其中，所述阳离子羟烷基瓜尔胶具有在2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中，该微生物是真菌或细菌。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，该用途用于增加微生物的生长速率。
5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，该阳离子羟烷基瓜尔胶是通过用阳离子醚化剂对瓜尔胶进行化学改性而获得的，例如用阳离子醚化剂，其是选自由以下组成的组的季铵盐：3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、二烯丙基二甲基氯化铵和三甲基铵丙基甲基丙烯酰胺。
6.如权利要求1至5中任一项所述的用途，其中，该阳离子羟烷基瓜尔胶选自由以下组成的组：阳离子羟乙基瓜尔胶、阳离子羟丙基瓜尔胶、阳离子羟丁基瓜尔胶，并且优选地是瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵。
7.如权利要求1至6中任一项所述的用途，其中，该阳离子羟烷基瓜尔胶具有在0.005与1之间，例如在0.12与0.5之间的取代度。
8.如权利要求1至7中任一项所述的用途，其中，该阳离子羟烷基瓜尔胶具有在5,000道尔顿与90,000道尔顿之间，例如在5,000道尔顿与60,000道尔顿之间的平均分子量。
9.如权利要求1至8中任一项所述的用途，其中，该阳离子羟烷基瓜尔胶具有包括在0.1与1.7之间、优选地在0.2与1.0之间的羟烷基化度。
10.一种用于维持或增加微生物、特别是细菌的生长速率的方法，该方法包括使至少一种种子与阳离子羟烷基瓜尔胶接触的步骤，该阳离子羟烷基瓜尔胶具有在2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量。
11.微生物、特别是细菌，以及阳离子羟烷基瓜尔胶作为植物生物刺激素的用途，该阳离子羟烷基瓜尔胶具有在2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量。
12.一种生物刺激素组合物，其包含至少一种微生物、特别是细菌，以及至少一种阳离子羟烷基瓜尔胶，该阳离子羟烷基瓜尔胶具有在2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量。
13.一种试剂盒，其包含至少一种微生物、特别是细菌，以及至少一种阳离子羟烷基瓜尔胶，该阳离子羟烷基瓜尔胶具有在2,000道尔顿与90,000道尔顿之间的平均分子量。
14.如权利要求13所述的试剂盒作为植物生物刺激素的用途。
15.一种种子，其包覆有如权利要求12所述的生物刺激素组合物。
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