CN113481215A - 一种新型四环素抗性基因tetX及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型四环素抗性基因tetX及其应用。新型四环素抗性基因tetX的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本申请发现的潜在的四环素抗性基因tetX，补充了四环素抗性基因的数据库，对了解四环素的抗性机制提供了帮助，也为后续四环素作用靶点研究提供理论支持。
Description
技术领域
本发明涉及环境和生物检测技术领域，尤其是涉及一种新型四环素抗性基因tetX及其应用。
背景技术
四环素是一种广谱抗生素，通过与30S核糖体结合并抑制氨酰tRNA进入mRNA的核糖体复合物的受体位点，从而最终抑制微生物体内蛋白质的合成，对革兰氏阳性和阴性菌都具有较好的抑制作用，因此被广泛用于治疗细菌感染和畜牧业中作为添加剂促进动物生长。
近年来，随着抗生素的大量使用，不可避免地造成了大量抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)和抗性菌株的形成。四环素抗性菌株和抗性基因的出现，导致药物治疗效益显著下降，使得四环素乃至整个四环素抗生素家族的临床疗效降低甚至消失，对人类和动物健康构成严重威胁。因此，新型四环素抗性基因的发现对临床治疗以及风险评估具有重要的现实意义。目前所采用的新型抗生素抗性基因的鉴别方法主要基于纯培养和分子生物学手段，该方法鉴定周期较长，且操作复杂，效率较低，不利于大范围的实施检测。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种新型四环素抗性基因tetX及其应用，申请人基于Nanopore和Illumina测序技术，发现了一个潜在的四环素抗性基因tetX，补充了四环素抗性基因的数据库，对了解四环素的抗性机制提供了帮助，也为后续四环素作用靶点研究提供理论支持。发现新基因的方法操作简单易行，可对新型四环素抗性基因进行预测筛选，在保证预测结果准确性的基础上大大缩短了检测周期。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种新型四环素抗性基因tetX，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
另一方面，本发明提供了一种发现上述新型四环素抗性基因tetX的方法，包括以下步骤：
(1)菌株的收集；
(2)基因组DNA提取；
(3)基因组测序；
(4)基因组的组装；
(5)基因组的开放阅读框预测；
(6)将预测的开放阅读框与数据库的比对。
进一步地，所述菌株为具有四环素抗性的抗性菌株Escherichia coli TET。
进一步地，步骤(1)中所述菌株菌体的收集为：将过夜培养的菌液通过6000-8000rpm，4℃离心5-10分钟，弃上清后收集沉淀。
进一步地，步骤(3)中所述基因组测序采用的平台为Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq 6000。
进一步地，步骤(4)中所述基因组的组装为通过采用Unicycler软件对样品质控后的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因组数据。
进一步地，所述Unicycler软件的具体参数如下：unicycler-1TET_1.fq-2TET_2.fq-lTET.nano.fq-o TET-t 46--mode normal–min_polish_size 2000；其中TET_1.fq和TET_2.fq为Illlumina测序的双端数据，TET.nano.fq为Nanopore测序数据。
进一步地，步骤(5)中所述基因组的开放阅读框预测为经过prodigal软件对获得的完整基因组数据进行开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)预测。
进一步地，所述prodigal软件的具体参数如下：prodigal-i TET.fa-m-o TET_temp.txt-aTET_ORF.aa-d TET_ORF.fa；其中TET.fa为unicycler混合组装获得的基因组，TET_ORF.aa和TET_ORF.fa分别为预测得到的ORF的氨基酸和核酸序列。
进一步地，步骤(6)中所述将预测的开放阅读框与数据库的比对包括使用DIAMOND软件将预测得到的ORF与SARG数据库进行比对，提取比对结果；采用HMMER软件将比对相似性较低的ORF与SARGfam数据库进行比对(一般是上一步相似性高于70％就不用这一步了)，得到基于模型比对的ORF注释结果。
进一步地，所述DIAMOND软件的具体参数如下：diamond blastp--query TET_ORF.aa--db SARG.2.2.fasta--threads 46--outfmt 5--evalue 1e-5--max-target-seqs1--out TET_SARG_blastp_out--query-cover 70；其中TET_ORF.aa为预测得到的ORF的氨基酸序列，SARG.2.2.fasta为抗性基因数据库；
优选的，所述的HMMER软件的具体参数如下：hmmscan--tblout hmm_out.txt--cut_ga SARGfam.hmm TET_ORF.aa；SARGfam.hmm为SARGfam数据库，TET_ORF.aa为预测得到的ORF的氨基酸序列，hmm_out.txt为结果输出文件。
另一方面，本发明提供了一种新型四环素抗性基因tetX的应用，用于补充四环素抗性基因的数据库。
本发明的有益效果是：本申请发现了一个潜在的四环素抗性基因tetX，补充了四环素抗性基因的数据库，对了解四环素的抗性机制提供了帮助，也为后续四环素作用靶点研究提供理论支持。该基因的发现方法基于Nanopore和Illumina测序技术获得完整的细菌基因组图谱，测序通量更高、读长更长、精确度更高，组装过程中可对数据进行自我校准，获得的基因组准确度更高，与现有的数据库进行比较，初步筛选相应的抗性基因，进而采用HMM模型进行扫描，对新型抗性基因进一步确定，操作简便快捷，大大缩减了检测周期。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的实施方法及结果分析进行详细地描述，以充分地理解本发明的特点和效果。这里需指出的是，所描述的实施例是叙述性的，不限定全部实施例，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1：四环素抗性纯培养菌株基因组DNA的提取和测序
这里以具有四环素抗性的抗性菌株Escherichia coli TET为例。将2ml过夜培养的菌液通过6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清后收集沉淀，使用Bacteria DNA Kit试剂盒完成其基因组DNA的提取，通过1％的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop One超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific,USA)检验基因组DNA的完整性和浓度，随后将获得的基因组DNA送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司利用Nanopore PromethION和IlluminaNovaSeq 6000平台对其进行测序。
实施例2：菌株基因组的组装与ORF预测
对实施例1中获得的测序数据进行质控获得clean data，随后采用Unicycler软件对样品的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因组数据，所述Unicycler软件的具体参数如下：
unicycler-1TET_1.fq-2TET_2.fq-l TET.nano.fq-o TET-t 46--mode normal–min_polish_size 2000
其中TET_1.fq和TET_2.fq为Illlumina测序的双端数据，TET.nano.fq为Nanopore测序数据。
再经过prodigal软件对获得的完整基因组数据进行开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)预测。
所述prodigal软件的具体参数如下：
prodigal-i TET.fa-m-o TET_temp.txt-a TET_ORF.aa-d TET_ORF.fa
其中TET.fa为unicycler混合组装获得的基因组，TET_ORF.aa和TET_ORF.fa分别为预测得到的ORF的氨基酸和核酸序列。
实施例3：ORF与SARG数据库比对
采用DIAMOND软件将实施例2中获得的ORF氨基酸序列与SARG数据库进行比对，结果表明，有ORF2108的注释结果为四环素抗性基因，其与数据库中参考基因序列tetX的相似度为25.5％。
实施例4：通过隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)比对获得潜在新型ARG
将实施例3中得到的ORF2108定义为潜在的新型基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，采用HMM模型进行进一步确认，从HMM模型的比对结果中可以看出，该ORF也被注释为tetX基因，因此该ORF被认为是潜在的新型基因TetX_like。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学深圳国际研究生院
<120> 一种新型四环素抗性基因tetX及其应用
<130> CP121010583C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcaaagtg ttgatgtagc cattgttggc ggcggcatgg tggggctggc ggttgcctgt 60
ggcttacagg ggagcggctt acgcgttgcc gtactggagc agcgcgtaca ggaacctctg 120
gcggcgaatg caccaccaca actgcgcgtt tcggctatca atgccgccag cgaaaaatta 180
ctcacccgtc ttggcgtctg gcaggacatt ctctctcgta gggccagctg ttatcacggt 240
atggaagtgt gggacaaaga cagctttggt cacatttcgt ttgacgatca aagcatgggc 300
tatagccatc ttgggcatat cgttgaaaat tcagtgattc actacgcgct gtggaacaaa 360
gcgcatcagt cgtcagatat cactctgtta gcccccgcag aattacagca ggtcgcctgg 420
ggagaaaatg aaaccttcct gacgctgaaa gatggcagca tgttaacggc gcgtctggtg 480
attggcgcgg acggcgctaa ttcctggttg cgcaacaaag ccgatattcc gctgactttc 540
tgggattatc agcatcacgc gctggtagcg accattcgca cggaagaacc gcatgatgcg 600
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agtgaagacg aatttaatcg cgcgttaaat atcgcttttg ataatcgcct gggcttatgc 780
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gttaagccgc aacttatccg ccaggcaatg ggattaaacg atttgcctga atggctgcgt 1200
taa 1203
Claims (10)
1.一种新型四环素抗性基因tetX，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种发现新型四环素抗性基因tetX的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌株的收集；
(2)基因组DNA提取；
(3)基因组的测序；
(4)基因组的组装；
(5)基因组的开放阅读框预测；
(6)将预测的开放阅读框与数据库的比对。
3.根据权利要求2所述的发现新型四环素抗性基因tetX的方法，其特征在于，所述菌株为具有四环素抗性的抗性菌株Escherichia coli TET。
4.根据权利要求2所述的发现新型四环素抗性基因tetX的方法，其特征在于，步骤(1)中所述菌株菌体的收集为：将过夜培养的菌液通过6000-8000rpm，4℃离心5-10分钟，弃上清后收集沉淀。
5.根据权利要求2所述的发现新型四环素抗性基因tetX的方法，其特征在于，步骤(3)中所述基因组测序采用的平台为Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq 6000。
6.根据权利要求5所述的发现新型四环素抗性基因tetX的方法，其特征在于，步骤(4)中所述基因组的组装为通过采用Unicycler软件对样品质控后的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因组数据；
优选地，所述Unicycler软件的具体参数如下：unicycler-1TET_1.fq-2TET_2.fq-lTET.nano.fq-o TET-t 46--mode normal–min_polish_size 2000；其中TET_1.fq和TET_2.fq为Illlumina测序的双端数据，TET.nano.fq为Nanopore测序数据。
7.根据权利要求6所述的发现新型四环素抗性基因tetX的方法，其特征在于，步骤(5)中所述基因组的开放阅读框预测为经过prodigal软件对获得的完整基因组数据进行开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)预测；
优选地，所述prodigal软件的具体参数如下：prodigal-i TET.fa-m-o TET_temp.txt-a TET_ORF.aa-d TET_ORF.fa；其中TET.fa为unicycler混合组装获得的基因组，TET_ORF.aa和TET_ORF.fa分别为预测得到的ORF的氨基酸和核酸序列。
8.根据权利要求7所述的发现新型四环素抗性基因tetX的方法，其特征在于，步骤(6)中所述将预测的开放阅读框与数据库的比对包括使用DIAMOND软件将预测得到的ORF与SARG数据库进行比对，提取比对结果；采用HMMER软件将比对相似性较低的ORF与SARGfam数据库进行比对，得到基于模型比对的ORF注释结果。
9.根据权利要求8所述的发现新型四环素抗性基因tetX的方法，其特征在于，所述DIAMOND软件的具体参数如下：diamond blastp--query TET_ORF.aa--dbSARG.2.2.fasta--threads 46--outfmt 5--evalue 1e-5--max-target-seqs 1--outTET_SARG_blastp_out--query-cover 70；其中TET_ORF.aa为预测得到的ORF的氨基酸序列，SARG.2.2.fasta为抗性基因数据库；
优选的，所述的HMMER软件的具体参数如下：hmmscan--tblout hmm_out.txt--cut_gaSARGfam.hmm TET_ORF.aa；SARGfam.hmm为SARGfam数据库，TET_ORF.aa为预测得到的ORF的氨基酸序列，hmm_out.txt为结果输出文件。
10.一种新型四环素抗性基因tetX的应用，其特征在于，用于补充四环素抗性基因的数据库。
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2021
- 2021-07-06 CN CN202110763548.1A patent/CN113481215A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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