CN110042111A - 一种能够降解四环素类抗生素的基因及其蛋白和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物治理技术领域，具体涉及一种能够降解四环素类抗生素的基因及其编码得到的蛋白和应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述基因来源于大肠杆菌LHM10‑1菌株，大肠杆菌LHM10‑1菌株于2019年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60622。利用本发明提供的基因及其编码得到的蛋白，能够有效降解四环素族抗生素药物（以四环素的降解为例），利用所述基因，以此成功构建了其大肠杆菌克隆表达菌株。进一步地，应用于四环素族抗生素药物的降解，并且能够在24小时降解93.70%的四环素，效果显著，应用前景好。

Description

一种能够降解四环素类抗生素的基因及其蛋白和应用
技术领域
本发明属于生物治理技术领域，更具体地，涉及一种能够降解四环素类抗生素的基因及其蛋白和应用。
技术背景
四环素类抗生素是一类广谱抗生素，其结构均含并四苯基本骨架，包括四环素、土霉素、金霉素、多西环素、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素等，被广泛应用于人和动物细菌感染性疾病的治疗以及动物促生长。目前，四环素类抗生素是我国使用量最大的抗生素之一，2013年的使用量已高达12000吨(Qian-Qian Zhang等,2015,Environmental Science&Technology)。但由于这类药物吸收率较低，大量四环素类抗生素以母体或活性代谢物的形式存在于环境当中。
研究表明中国北方畜禽粪便中的残留量为3326.6±12302.6μg/kg，而被粪便所污染的土壤当中最高也达到10967.1μg/kg(Jie Hou等,2015,Environ Sci Pollut Res)。鉴于四环素类药物的密集使用，它所造成的环境污染问题也日益严重，并且为环境中的耐药菌和耐药基因的传播提供温床，严重威胁人类健康，因此，四环素类药物的残留问题亟待解决。
当前，解决环境中蓄积四环素类抗生素的途径主要包括非生物降解和生物降解两种 (李伟明等，2012，应用生态学报)。非生物降解包括光降解、水解和氧化降解，但作用效果相对有限且过程缓慢。生物降解包括植物降解和微生物降解，但植物降解多集中在用某一植物来修复特定污染的环境，对于多种抗生素所引起的复合污染的降解能力尚待研究。而微生物降解四环素类药物的报道相对较少但效果显著，例如栖木槿假单胞菌DT1在72小时内能够降解83.21％的四环素(专利公开号：CN104403965A)和苍白杆菌属细菌KSS10在96小时内降解63.33％的土霉素(Sicheng Shao等，2019，Ecotoxicology and EnvironmentalSafety)。目前降解四环素族抗生素的效率还有待提高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的问题，提供了一种基因。
本发明同时提供该基因编码得到的蛋白，以及上述基因及其编码蛋白在降解四环素类抗生素中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种基因在降解四环素类抗生素中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述四环素族抗生素为四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素或伊拉瓦环素中的一种或多种。
优选地，所述蛋白为所述基因编码的蛋白。
优选地，所述四环素族抗生素为四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素或伊拉瓦环素中的一种或多种。
本发明同时保护一种能够降解四环素族抗生素的基因及利用该基因编码得到的蛋白，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还保护一种大肠杆菌LHM10-1菌株基因组的扩增引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述大肠杆菌LHM10-1菌株于2019年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：60622。
进一步地，采用所述的上下游引物对，以大肠杆菌LHM10-1菌株的基因组为模板，采用PCR进行扩增得到克隆产物，可以进行产业化应用。
其中，上述PCR可以具体采用以下反应条件进行：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min 30s，循环30次；72℃再延伸10min。PCR体系如下： 18.875～18.375μl ddH2O，2.5μl 10×Buffer，2μl dNTPs，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.125μlr-taq酶和0.5～1μl DNA模板。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明利用新的大肠杆菌LHM10-1菌株，从中提取了能够降解四环素族抗生素的基因和蛋白。以此成功构建了其大肠杆菌克隆表达菌株。进一步，成功应用于四环素族抗生素药物的降解，并且能够在24小时降解93.70％的四环素，效果显著，应用前景好。
附图说明
图1: Tet(X4)编码蛋白三位空间结构图；
图2: Tet(X4)编码蛋白与其他同源蛋白的氨基酸序列比对结果；
图3: 克隆菌株JM109+pBAD24-tet(X4)对四环素降解水平的LC-MS/MS测定结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
1.复活四环素类抗生素降解菌株
将-80℃冰箱冻存的大肠杆菌LHM10-1划线接种于含有64μg/ml四环素的麦康凯琼脂(广东环凯微生物科技有限公司)平板，37℃培养16-20h。挑取培养好的红色单菌落，再次划线接种于空白LB琼脂(广东环凯微生物科技有限公司)平板，37℃培养16-20h。
大肠杆菌LHM10-1于2017年7月从江西省樟树市某猪场分离得到，能够显著降解四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素。
上述大肠杆菌(Escherichia coli)LHM10-1菌株于2019年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：60622。保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.全基因组测序及分析
刮取一环上述纯化好的大肠杆菌LHM10-1，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)使用步骤提取该菌株的基因组。随后，分别使用MiSeq平台(华银健康)和PacBio RSII系统(武汉未来组生物科技有限公司)对其进行全基因组测序。最终借助Unicycler(版本0.4.1)同时对短读长和长读长的原始序列信息进行组装，并通过RAST(http://rast.nmpdr.org/)进行序列注释和分析。与此同时，按照默认参数借助在线服务器Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id＝index)模拟四环素类抗生素降解酶基因所编码蛋白质的三维空间结构。
通过对全基因组测序数据的进一步分析，我们顺利得到一种新型的四环素类抗生素降解酶基因，被命名为tet(X4)。该基因全长为1158bp(见序列1)，能够编码一种由385个氨基酸构成的蛋白质Tet(X4)，该蛋白的三维空间结构见图1。氨基酸序列比对结果表明(见图2)，它与首次报道的四环素降解酶蛋白Tet(X)(登录号：M37699)具有94.5％的相似度，而与 Tet(X1)(登录号：AJ311171)、Tet(X2)(登录号：AJ311171)和Tet(X3)(登录号：AB097942) 的相似度也分别达到了63.9％、95.1％和85.7％。
实施例2
1、tet(X4)基因的克隆构建
以大肠杆菌LHM10-1的基因组为PCR模板，参与tet(X4)基因克隆菌株的构建。PCR体系(25μl)如下：18.375μl ddH2O，2.5μl 10×Buffer，2μl dNTPs，0.5μl上游引物(X4-F)，0.5μl 下游引物(X4-R)，0.125μl r-taq酶和1μl DNA模板。
其中，tet(X4)基因克隆用引物
(X4-F：TACGCGAATTCATGAGCAATAAAGAAAAACAAATGAATTTAC和X4-R： TACGCGTCGACTTATACATTTAACAATTGCTGAAACG)由广州擎科生物技术有限公司合成。X4-F序列如SEQ ID NO：2所示，X4-R如SEQ ID NO：3所示。
其他PCR成份购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR程序为：94℃预变性5min； 94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min 30s，循环30次；72℃再延伸10min。将PCR 产物经140V电压电泳50min后,最终利用DNA凝胶回收试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)对目的基因进行回收。
随后，利用EcoRI和SalI酶(宝生物工程(大连)有限公司)分别对工程质粒pBAD24和回收产物进行双酶切，37℃孵育2h。酶切完成后，再次用DNA凝胶回收试剂盒分别对它们进行回收，并按照1:3的摩尔比用T4连接酶(美国NEB公司)于16℃条件下连接12～16h。连接完成后，取10μl连接产物于42℃条件下热激转化至大肠杆菌JM109化转感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)，并用含有0.1％L-阿拉伯糖和4μg/ml替加环素的LB琼脂平板筛选tet(X4)基因克隆菌株。
2.最小抑菌浓度(MIC)的测定
采用微量肉汤稀释法，参照美国临床和实验室标准协会的相关标准(CLSI:M100-S26)，测定克隆菌株JM109+pBAD24-tet(X4)对四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素(均购自美国Sigma-Aldrich公司)的MICs。并以空载菌株JM109+pBAD24为阴性对照和以大肠杆菌ATCC 25922为质控菌株。
实验结果表明(见表1)，tet(X4)基因能够显著提高受体菌株JM109对所有四环素类药物的MIC值(32-512倍)。其中，克隆菌株JM109+pBAD24-tet(X4)对四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素的MIC分别达到了256μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml和4μg/ml，而阴性对照菌株JM109+pBAD24的MIC 仅为1μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml和0.0078μg/ml。
3.利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定四环素类药物降解水平
挑取克隆菌株JM109+pBAD24-tet(X4)单菌落，接种于4ml M9培养基(1×M9最小盐，2mM硫酸镁，100μm氯化钙，0.1％L-阿拉伯糖，9g/L葡萄糖，100mg/L硫胺素和100mg/L亮氨酸；均购自Sigma-Aldrich公司)，37℃、180rpm条件下培养8小时。吸取40μl上述细菌培养液至含有8μg/ml四环素且终体积为4ml的M9培养基，37℃、200rpm和避光条件下培养24小时。同时以空载菌株JM109+pBAD24为对照组。随后，将细菌培养液以12000rpm转速离心2min 并用0.22μm孔径的滤头过滤(天津津腾实验室设备有限公司)。取过滤后上清液，经10倍稀释后，参照传统方法(Kevin J.Forsberg等，2015，Chemistry&Biology)进行LC-MS/MS测定。
结果表明(见图3)，克隆菌株JM109+pBAD24-tet(X4)在24小时后对四环素的降解率高达93.70％(总体标准偏差为0.84％)。与此同时，对照组JM109+pBAD24中四环素几乎没有降解。以上表明经过tet(X4)基因的克隆构建的菌株具备显著的降解能力。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种能够降解四环素类抗生素的基因及其蛋白和应用
<141> 2019-04-11
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1158
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
atgagcaata aagaaaaaca aatgaattta cttagtgata agaacgttgc aataattggt 60
ggtggacccg ttggactgac tatggcaaaa ttattacagc aaaacggcat agacgtttca 120
gtttacgaaa gagacaacga ccgagaggca agaatttttg gtggaaccct tgacctacac 180
aaaggttcag gtcaggaagc aatgaaaaaa gcgggattgt tacaaactta ttatgactta 240
gccttaccaa tgggtgtaaa tattgctgat gaaaaaggca atattttatc cacaaaaaat 300
gtaaagcccg aaaatcgatt tgacaatcct gaaataaaca gaaatgactt aagggctatc 360
ttgttgaata gtttagaaaa cgacacggtt atttgggata gaaaacttgt tatgcttgaa 420
cctggtaaga agaagtggac actaactttt gagaataaac cgagtgaaac agcagatctg 480
gttattattg ccaatggtgg aatgtctaaa gtaagaaaat ttgttaccga cacggaagtt 540
gaagaaacag gtactttcaa tatacaagcc gatattcatc atccagaggt gaactgtcct 600
ggattttttc agctatgcaa tggaaaccgg ctaatggctg ctcatcaagg taatttatta 660
tttgcgaatc ctaataataa tggtgcattg cattttggaa taagttttaa aacacctgat 720
gaatggaaaa accaaacgca ggtagatttt caaaacagaa atagtgtcgt tgattttctt 780
ctgaaagaat tttccgattg ggacgaacgc tacaaagaac tgattcgtgt gacatcatct 840
tttgtagggt tagcgacacg aatatttccc ttaggtaagt cttggaaaag taagcgtcca 900
ttacccataa cgatgattgg agatgctgct catttgatgc ctccttttgc aggacaaggc 960
gtaaacagcg ggttgatgga tgccttgata ttgtcggata atctgaccaa tgggaaattt 1020
aacagcattg aagaggctat tgaaaattat gaacagcaaa tgtttatcta tggcaaagaa 1080
gcacaagaag aatcaactca aaacgaaatt gaaatgttta aacccgactt tacgtttcag 1140
caattgttaa atgtataa 1158
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> X4-F
<400> 2
tacgcgaatt catgagcaat aaagaaaaac aaatgaattt ac 42
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> X4-R
<400> 3
tacgcgtcga cttatacatt taacaattgc tgaaacg 37

Claims (8)

1.一种基因在降解四环素类抗生素中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述基因在降解四环素类抗生素中的应用，其特征在于，所述四环素族抗生素为四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素或伊拉瓦环素中的一种或多种。
3.一种蛋白在降解四环素类抗生素中的应用，其特征在于，所述蛋白为权利要求1所述基因编码得到的蛋白。
4.根据权利要求3所述蛋白在降解四环素类抗生素中的应用，其特征在于，所述四环素族抗生素为四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素或伊拉瓦环素中的一种或多种。
5.一种能够降解四环素族抗生素的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
6.一种大肠杆菌LHM10-1菌株基因组的扩增引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示；
所述大肠杆菌LHM10-1菌株于2019年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60622。
7.一种大肠杆菌LHM10-1菌株基因组的扩增方法，其特征在于，采用权利要求6所述的上下游引物对，以大肠杆菌LHM10-1菌株的基因组为模板，采用PCR进行扩增。
8.根据权利要求7所述大肠杆菌LHM10-1菌株基因组的扩增方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min 30s，循环30次；72℃再延伸10min。
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