CN113476662A - 用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架、制备方法及其应用，所述生物支架包括：锂，以及用于负载锂的缓释载体；使用状态下，所述缓释载体逐步降解使锂离子逐步释放。本发明通过构建糖尿病小鼠模型，体内实验验证该支架可以有效促进糖尿病小鼠颅骨临界骨缺损修复，可以作为糖尿病骨缺损患者的支架材料，具有广泛的应用前景。

Description

用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架、制备方法及其应用。
背景技术
随着我国人口老龄化程度日益加深及人民生活水平不断提高，糖尿病及其相关的各种并发症也与日俱增，糖尿病骨病可增加全身骨质疏松及骨折的风险，阻碍骨折愈合和骨缺损修复。大块骨缺损，目前临床上还是以生物支架材料修复为主，并取得了较好的治疗效果，但对于伴有糖尿病等全身疾病的患者，治疗效果尚不理想。感染和成骨缓慢是两大主因，抗生素的迅速发展使得感染问题基本得到控制，但成骨缓慢问题仍未得到有效解决，已经成为制约糖尿病患者骨缺损修复的主要因素。目前临床用于骨缺损修复的生物支架材料，主要针对常规人群，而高糖状态下，体内大环境及局部微环境均发生变化，常规的生物支架材料很难达到理想的治疗效果。
随着3D打印技术的发展，由3D打印技术制备而成的修复支架被广泛研究用于骨缺损修复领域。3D打印材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)具有良好的生物可降解性和生物相容性，但由于缺乏亲水性和生物活性，机械强度较低，酸性降解产物释放会导致组织pH值降低等问题，难以单独应用于骨缺损修复。介孔生物玻璃(MBG)具有良好促成骨的生物活性，但纯MBG支架脆度高，实际应用难度较大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架、制备方法及其应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架，包括：锂，以及用于负载锂的缓释载体；使用状态下，所述缓释载体逐步降解使锂离子逐步释放。
可选的，所述缓释载体包括：mnHA、β-TCP、以及mnHA/β-TCP复合物中的任意一种。
可选的，所述缓释载体还包括：MBG、PLGA、以及MBG/PLGA复合物中的任意一种。
可选的，所述生物支架还包括：用于促进骨组织再生的生长因子。
可选的，所述生长因子为血小板衍生生长因子-BB。
可选的，上述用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架能够应用于高糖状态下骨缺损的修复。
本发明还提供了上述用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，制备Li-MBG，其具体方法包括：
步骤S1.1，将模板剂、硅酸酯、四水硝酸钙、氯化锂、磷酸三乙酯、盐酸加入无水乙醇中，搅拌均匀得到澄清溶液；其中，按照摩尔比氯化锂：四水硝酸钙：磷酸三乙酯：硅酸酯＝(6～8)：(8～12)：(6～8)：(70～90)；
步骤S1.2，将所述澄清溶液蒸发得到干粉，将所述干粉在650～700℃温度下进行热处理，得到Li-MBG；
步骤S2，制备用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架：
制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物凝胶，然后将Li-MBG与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物凝胶混合均匀，得到3D打印材料，通过3D打印技术制备所述用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架。
可选的，步骤S1.1中，模板剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物。
可选的，步骤S1.1中，所述硅酸酯为正硅酸乙酯。
可选的，步骤S1.2中，所述热处理是指，将干粉置于干燥箱中干燥，从室温开始升温，升温速率为1℃/min，升温至700℃后维持5h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明在缓释载体材料中复合了锂离子，能够有效促进高糖环境下细胞的增殖、迁移速率；
(2)本发明的缓释载体材料能够逐步降解，逐步释放锂离子，使患者体内的锂离子浓度平稳，提高了安全性；
(3)本发明将PLGA与MBG复合作为缓释材料，MBG可以中和PLGA的酸性降解产物，有效提高了3D打印材料的机械强度、亲水性。
附图说明
图1为本发明MBG和Li-MBG颗粒的TEM扫描电镜图。
图2为本发明MBG和Li-MBG颗粒的X射线衍射图。
图3为本发明Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架的SEM扫描电镜图。
图4为本发明Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架的降解情况图。
图5为本发明Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架浸润液pH变化图。
图6为本发明Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架浸润液中离子浓度变化图。
图7为本发明采用Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架进行颅骨缺损修复6周后小鼠颅骨的Micro-CT检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。如按照[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译，分子克隆试验指南，第三版，北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配制。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
糖尿病患者体内大环境较常规患者含糖量偏高，发生骨缺损后成骨缓慢，常规的生物支架材料很难达到理想的治疗效果。为解决这一难题，本申请通过高脂饮食结合链脲佐菌素注射构建了糖尿病小鼠模型，以期模拟糖尿病患者体内环境，开发适合糖尿病患者使用的生物支架。
本申请通过体外实验研究发现氯化锂促进高糖微环境下BMSCs成骨分化，将氯化锂与MBG/PLGA结合后，制作出Li-MBG/PLGA支架；进一步通过体内实验验证Li-MBG/PLGA能够在高糖微环境下对小鼠骨髓间充质干细胞增殖、迁移和成骨分化等生物学功能具有促进作用。
本发明提供了一种用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架，包括：锂，以及用于负载锂的缓释载体；使用状态下，所述缓释载体逐步降解使锂离子逐步释放。
可选的，所述缓释载体包括：羟基磷灰石(mnHA)、β-磷酸三钙(β-TCP)、以及mnHA/β-TCP复合物。
可选的，所述缓释载体还包括：介孔生物玻璃(MBG)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、以及MBG/PLGA复合物。
上述缓释载体具有良好的降解速率和缓释速率的可控性，随着材料的降解使锂离子得到逐步释放，提高干细胞迁移及成骨性能。
此外，所述用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架还包括：用于促进骨组织再生的生长因子。所述生长因子包括：血小板衍生生长因子-BB。血小板衍生生长因子-BB能够趋化募集内源性干细胞，从而解决外源性干细胞成活率低、免疫排斥等问题，进一步增强了高糖状态下的成骨效果。
实施例一种用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架的制备方法
本实施例提供了一种用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架(Li-MBG/PLGA支架)的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，制备Li-MBG：
将6g的聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123，Mw＝5800)、10.1g的正硅酸乙酯(TEOS，98％)、1.4g的四水硝酸钙、0.125g的氯化锂、1.10g磷酸三乙酯(TEP，99.8％)和0.5M HCl加入乙醇中，室温搅拌机中搅拌至所有材料充分溶解，得到混合溶液。此时液体澄清透明，各元素摩尔比为Li/Ca/P/Si＝5/10/5/80。其中，乙醇与0.5M HCl的质量比为(50～70)：1；乙醇用于溶解P123、正硅酸乙酯、四水硝酸钙、氯化锂、磷酸三乙酯；盐酸用于调节混合溶液的pH，使上述固体更易溶解。
优选地，乙醇与0.5M HCl的质量比为60：1。
将所述混合溶液转移至培养皿，通风处下蒸发。待样品完全干燥后，将样品置于干燥箱中干燥，从室温开始升温，升温速率为1℃/min，升温至700℃后维持5h，得到Li-MBG。
步骤S2，制备用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架：
将PLGA溶于氯仿中(25wt％)，充分搅拌直至澄清；将Li-MBG研磨，过400目筛子后加入PLGA凝胶中(Li-MBG与PLGA的质量比＝2：1)，充分搅拌混匀。
使用3D打印设备制备用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架，具体参数如下：支架共三层，每层均打印出方向一致的线条结构，相邻两层线条之间的夹角为60°，相邻线条间隔0.7mm；针头直径400μm，打印压力4.5-5MPa；打印速度3-4mm/s，打印直径4mm。打印后将材料置于通风橱中，充分挥发溶剂后室温保存备用。
制备完成后，本申请对上述制备得到的生物支架进行表征对比、体内实验验证，具体方法、结果如下所示：
1、支架材料表征对比
实验方法：
(1)通过上述制备方法制备MBG、MBG/PLGA支架、PLGA支架，MBG、MBG/PLGA支架的步骤S1中不加入氯化锂，Li/Ca/P/Si的摩尔比为0/15/5/80，PLGA支架以纯PLGA材料进行3D打印。
(2)使用研钵充分研磨Li-MBG和MBG后，过400目筛子。对经过研磨后粒径尺寸为400目的Li-MBG和MBG进行TEM检测：将颗粒溶于75％乙醇中，超声机中震荡半小时充分混匀后，滴加1μl待测样品于铜网上，待样品充分干燥后TEM拍摄样品内部结构；
对经过研磨后粒径尺寸为400目的Li-MBG和MBG进行XRD检测：使用XRD分析仪检测，辐射源为CuKα，管电压40kV，管电流35mA，准直器1mm，步宽0.02°，扫描范围(2θ)为10°到80°，扫描速度5°/分钟，以2θ为横坐标，强度为纵坐标作图。
(3)分别对PLGA支架、MBG/PLGA和Li-MBG/PLGA支架表面进行喷金处理，使用SEM分析支架材料表面形貌结构，并拍照。
同时，为研究支架的降解性能、离子释放性能，分别将三种支架放置于10ml PBS，37℃恒温摇床震荡，每3天换液一次。在第1、3、5、7、10、14、21、28、35、42天时，测定溶液的pH值，ICP-MS测定Li和Si离子的浓度。同时在对应时间将支架冷冻干燥后称量其重量。
实验结果：
对MBG和Li-MBG颗粒进行TEM观察其内部介孔结构，如图1的a和图1的b所示，MBG和Li-MBG都具有明显的介孔结构；XRD结果如图2所示，MBG和Li-MBG在10°到30°都具有特征的“馒头峰”，表明二者都具有介孔结构。
Li-MBG/PLGA支架和MBG/PLGA支架的SEM检测结果分别如图3的a和图3的b所示。低放大倍数时，可以观察到两种支架都有三层结构，排列规则，孔隙度相似；高放大倍数时，可以观察到两种支架表面遍布颗粒状突起，且粗糙度基本相同，细微结构相似。图3的c为纯PLGA支架的表面形貌，同样支架有三层结构，排列规则，但材料表面光滑无突起。
图4为本发明Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架的降解情况图。如图4所示，PLGA支架体积减少的速度最快，体积减少的量也最多，MBG/PLGA支架和Li-MBG/PLGA支架体积减少的速度和量都相似，Li-MBG/PLGA支架略少于MBG/PLGA支架。该结果表明，纯PLGA支架降解速度最快，MBG/PLGA支架和Li-MBG/PLGA支架降解速度类似。
图5为本发明Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架浸润液pH变化图。可以看到42天内，MBG/PLGA支架和Li-MBG/PLGA支架浸润液pH都无显著变化，维持在7.2-7.4左右；而纯PLGA支架浸润液在前3周pH值都无显著变化，但从21天开始其pH值开始降低，且随时间进展pH约趋向酸性。
表明，MBG可以中和PLGA的酸性降解产物，最大限度地发挥每种材料的优点。
图6为本发明Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架浸润液中离子浓度变化图。图6的a为上述三种支架浸润液中Si离子的浓度变化图。图6的b为上述三种支架浸润液中Li离子的浓度变化图。结果显示，PLGA支架的浸润液中均未检测出Si离子和Li离子，MBG/PLGA支架和Li-MBG/PLGA支架浸润液中Si离子浓度变化情况类似，42天内浓度持续增加并逐渐趋于平稳，仅在Li-MBG/PLGA支架浸润液中检测到Li离子，Li离子浓度在前5天极速增加后开始快速降低，并于第14天开始趋于平稳。
2、Li-MBG/PLGA能够募集BMSCs
(1)构建糖尿病小鼠模型
选用4周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠。所有小鼠的生产和使用都严格遵从上海交通大学动物中心的标准。五只小鼠分一笼，环境室温20-25℃，相对湿度约80％，每12小时交替明暗。一周适应性喂养后，小鼠随机分为两组：正常对照组(NC组)喂养普通维持饲料，高脂饮食组(HFD组)喂养60％脂肪含量高脂饲料。所有老鼠自由摄入无菌水。高脂饮食后6周，HFD组小鼠禁食一晚(正常饮水)后，连续5天腹腔注射链脲佐菌素(STZ，溶于新鲜柠檬酸缓冲液，pH 4.5)40mg/kg。注射STZ一周后，空腹血糖高于11.1mM的HFD+STZ小鼠视为T2DM小鼠。所有的老鼠继续按照原来的饲料喂养，以备后续实验。本研究所有动物实验步骤都经过上海交通大学动物伦理委员会审批，严格遵从其规范。
(2)构建小鼠颅骨临界缺损模型
将3个月大的糖尿病小鼠以2％水合氯醛腹腔注射麻醉。待小鼠麻醉无意识后，对其颅顶部术区消毒；于颅顶中线处做一纵行切口，深达骨膜，翻开骨膜，充分暴露术野。在颅骨中线处以慢机制备一个直径4mm的缺损，注意控制深度，以免损伤小鼠脑组织。制备完成后去除骨块，暴露缺损区域。
将小鼠随机分为四组，分别为不置入材料、置入PLGA支架、置入MBG/PLGA复合支架和置入Li-MBG/PLGA复合支架。以4-0缝线关闭皮肤层。
(3)体内迁移实验
颅骨缺损术后3天，四组小鼠每只分别尾静脉注射1×106个BMSCs-GFP(MUBMX-01101，赛业，中国)。两周后，分离小鼠颅骨，4％PFA固定48h后，脱钙液脱钙。待脱钙完成，脱水后进行冰冻切片，切片厚度9μm。
实验结果：
免疫荧光实验结果表明，PLGA支架和MBG/PLGA支架材料都难以在糖尿病小鼠体内有效募集BMSCs，而Li-MBG/PLGA支架材料能够募集BMSCs，促进骨组织的修复。
3、Micro-CT检测
实验方法：
颅骨缺损术后6周的小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，75％乙醇消毒5min；将小鼠背部的皮肤剥除，用钩镊在眼眶处固定小鼠颅骨；将剪刀头部深入枕骨大孔，朝向同侧眼眶方向剪断骨头，剪刀眼眶处，从小鼠眼眶之间剪断颅骨；将颅骨掀起，置于4％多聚甲醛中固定备用。
对采集的颅骨进行Micro-CT扫描(9μm，48kV，201mA)。使用CTAn软件对原始扫描数据进行重建，分析新骨形成情况。
实验结果：
图7为本发明采用Li-MBG/PLGA支架、MBG/PLGA支架和PLGA支架进行颅骨缺损修复6周后小鼠颅骨的Micro-CT检测结果图。如图7所示，不置入材料组缺损周缘有零新的新骨形成，PLGA组情况类似略好于不置入材料组；MBG/PLGA组支架上分布一些小的新生骨，但未填支架孔隙；而Li-MBG/PLGA组支架上遍布较多的新生骨组织。表明，在糖尿病小鼠体内，MBG/PLGA支架难以达到有效的促成骨效果，Li-MBG/PLGA支架有着显著的促成骨效果。
需要说明的是，本发明中，“锂”可以指锂离子、锂金属、纳米锂等一系列含有锂元素的物质，上述以MBG/PLGA负载锂离子作为优选实施例进行说明，但不应被认为是对本发明的限制。
综上所述，本发明的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架(Li-MBG/PLGA支架)可以有效促进糖尿病小鼠颅骨临界骨缺损修复，可以作为糖尿病骨缺损患者的支架材料，具有广泛的应用前景。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架，其特征在于，其包括：锂，以及用于负载锂的缓释载体；使用状态下，所述缓释载体逐步降解使锂离子逐步释放。
2.如权利要求1所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架，其特征在于，所述缓释载体包括：mnHA、β-TCP、以及mnHA/β-TCP复合物中的任意一种。
3.如权利要求1所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架，其特征在于，所述缓释载体还包括：MBG、PLGA、以及MBG/PLGA复合物中的任意一种。
4.如权利要求1所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架，其特征在于，其还包括：用于促进骨组织再生的生长因子。
5.如权利要求4所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架，其特征在于，所述生长因子为血小板衍生生长因子-BB。
6.权利要求1-5中任意一项所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架在高糖状态下骨缺损修复中的应用。
7.如权利要求1-5中任意一项所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，制备Li-MBG，其具体方法包括：
步骤S1.1，将模板剂、硅酸酯、四水硝酸钙、氯化锂、磷酸三乙酯、盐酸加入无水乙醇中，搅拌均匀得到澄清溶液；其中，按照摩尔比氯化锂：四水硝酸钙：磷酸三乙酯：硅酸酯＝(6～8)：(8～12)：(6～8)：(70～90)；
步骤S1.2，将所述澄清溶液蒸发得到干粉，将所述干粉在650～700℃温度下进行热处理，得到Li-MBG；
步骤S2，制备用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架：
制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物凝胶，然后将Li-MBG与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物凝胶混合均匀，得到3D打印材料，通过3D打印技术制备所述用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架。
8.如权利要求7所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架的制备方法，其特征在于，步骤S1.1中，模板剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物。
9.如权利要求7所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架的制备方法，其特征在于，步骤S1.1中，所述硅酸酯为正硅酸乙酯。
10.如权利要求7所述的用于高糖状态下骨缺损修复的生物支架的制备方法，其特征在于，步骤S1.2中，所述热处理是指，将干粉置于干燥箱中干燥，从室温开始升温，升温速率为1℃/min，升温至700℃后维持5h。
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