CN113474050A - 具有改进的溶解性的pic1变体及其使用方法 - Google Patents

具有改进的溶解性的pic1变体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了一种提高输注的血小板的寿命的方法。所述方法可用于对输注的血小板不应的同种免疫患者。本发明还描述了一种治疗迟发性溶血性输血反应的方法。本发明还描述了具有改进的溶解性和活性的PIC1肽变体。

Description

具有改进的溶解性的PIC1变体及其使用方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月15日提交的美国临时专利申请号62/806,432和2019年12月17日提交的美国临时专利申请号62/949,181的利益和优先权，所述两份申请整体通过参考并入本文。
背景技术
人星状病毒属于无包膜二十面体RNA病毒家族，是一种全球范围内的流行病原体，在人类婴儿中引起急性肠胃炎[1]。与引起严重急性疾病的杯状病毒和轮状病毒不同，星状病毒胃肠炎是非炎性的[2]。对星状病毒的钝化的炎症反应可能起因于形成星状病毒衣壳的787个氨基酸残基的星状病毒外壳蛋白。已发现所述外壳蛋白抑制补体经典途径的活化[3]。补体是人类的先天性免疫应答，其特征在于对病原体的强烈的炎症反应[4]。星状病毒外壳蛋白的氨基酸序列的分析鉴定到一个与人类1型嗜中性粒细胞防御素(HNP-1)具有松散同源性的区域，并导致保留了所述抑制补体经典途径的能力的短肽的开发[5]。
对于照顾同种免疫患者和应对抗血小板抗体发生的临床医生来说，血小板不应性仍然是一个具有挑战性的临床困难[18]。在这些同种免疫患者中输注的血小板的短寿命极大限制了他们维持最小化出血风险所需的血小板水平的能力。目前的管理方法聚焦于测试和鉴定对患者的循环抗血小板抗体较不敏感的血小板单元[24]。这些方法对许多患者有帮助，但额外的测试耗时，对于具有高水平的抗血小板抗体或难以匹配或避免的HLA类型的个体来说可能仅仅部分成功[22]。迄今为止，药物干预尚未在同种免疫患者中表现出减轻血小板不应性和提高输注的血小板寿命的始终如一的能力[24]。
迟发性溶血性输血反应(DHTR)的特征在于在输注后超过一周发生血细胞比容的降低。对于某些患者来说，与DHTR相关的血细胞比容下降可能是急剧的，导致严重的甚至危及生命的并发症。血细胞比容的急剧下降有时被称为高溶血症。
对DHTR的潜在机制仍然知之甚少。最常讨论的理论是当以前对红细胞(RBC)抗原敏感的患者在输血时具有不可检测的同种抗体水平时，发生DHTR[33]。因此，类型和交叉测试不会显示出不相容的证据。在用带有这种抗原的红细胞输注后1至4周，可能会发生原发性或回忆性应答，导致DHTR[34]。
许多DHTR据信是温和和自限的，使得DHTR常常未被识别。然而，在输血后1至2周之间血红蛋白降低到输血前水平，则疑似是DHTR。严重的DHTR反应在没有警告的情况下发生，并且通常是危及生命的。它们的治疗类似于急性溶血性输血反应。
在DHTR中，据推测包被有通常为IgG亚类的抗体的供体红细胞在肝脏和脾脏中被血管外溶血破坏。这种疾病过程的主要机制据信是通过Fc介导的吞噬作用发生的[35]。补体激活在DHTR中的作用，如果存在的话，仍然是未知的。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一张彩色图。本专利或专利申请出版物的具有彩图的副本将在提出请求并支付必要费用后由专利局提供。
图1A-1D示出了溶血测定法中的补体激活和C1q结合的肌氨酸变体抑制。图1A示出了在CH50类型的测定法中ABO不相容溶血的抑制的测定结果。肽的终浓度为1.8mM。PIC1表示PA-dPEG24。示出的结果是n＝4个独立实验的平均值+SEM。图1B示出了在CH50类型的测定法中剥夺因子B的血清中经典补体途径介导的溶血的抑制的测定结果。肽的终浓度为0.4mM。示出的结果是n＝4个独立实验的平均值+SEM。图1C示出了浓度逐渐增加的肌氨酸变体与纯化的C1q的结合的ELISA类型的测定法的结果。示出的数据是n＝3个独立实验的平均值±SEM。图1D示出了每种肽的结合曲线的半最大结合浓度的计算结果。
图2A-2D示出了MPO过氧化物酶活性被肌氨酸变体抑制的测定结果。图2A示出了对于一定浓度(mM)范围内的每种肽来说在基于TMB的测定法中测量MPO过氧化物酶活性的数据。PIC1表示PA-dPEG24。示出的数据是n＝3个独立实验的平均值±SEM.图2B是示出了对于每种肽的抑制曲线计算的半最大抑制浓度的图。图2C示出了浓度逐渐增加的肌氨酸变体与纯化的MPO的结合的ELISA类型的测定法的结果。示出的数据是n＝3个独立实验的平均值±SEM。图2D是示出了对于每种肽的结合曲线计算的半最大结合浓度的图。
图3A-3H示出了肌氨酸变体肽保护MPO血红素环免于氧化降解的能力的测定结果。示出了PA-dPEG24(图3A)、A2(图3B)、L3(图3C)、I4(图3D)、L5(图3E)、I8(图3F)、C9(图3G)和C9,10(图3H)的结果。示出了在不存在过氧化氢(MPO)、存在过氧化氢(MPO+H2O2)、存在肽(MPO+A2)以及过氧化氢和肽一起存在(MPO+A2+H2O2)的情况下血红素环的吸收光谱。测试的肽的浓度为3.0mM。
图4示出了在总抗氧化能力(TAC)测定法中氧化活性的肌氨酸变体抑制。抗氧化活性用铜还原当量(CRE)来度量。将肽在0.03-0.25mM的浓度范围内测试，然后与标准品进行比较。示出的数据是n＝3个独立实验的平均值+SEM。
图5A是示出了肌氨酸变体肽抑制NET形成的能力的测定结果的图。所述图示出了作为NETosis的标志物的嗜中性粒细胞的游离DNA释放的肌氨酸变体抑制。将纯化的人类嗜中性粒细胞用与卵清蛋白-抗卵清蛋白抗体免疫复合物和0.05％H2O2预温育的2％正常人血清刺激。向所述血清添加肌氨酸肽和PIC1至终浓度为2mM。示出的数据是n＝3个独立实验的平均值+SEM。
图5B示出了在用免疫复合物(IC)和过氧化氢(H2O2)刺激嗜中性粒细胞后NET形成的代表性荧光显微术图像(第二行)，并与仅含嗜中性粒细胞的对照(第一行)进行比较。第三行示出了通过用变体I8处理用IC和H2O2刺激的嗜中性粒细胞而导致的NET形成的抑制。组蛋白用抗组蛋白抗体探测(α组蛋白；左侧列)，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶用抗嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗体探测(αNE；中间列)，并且DNA用DAPI染色(右侧列)。
图6A-6C示出的数据显示用抗血小板抗体敏化的人类血小板激活补体，降低血小板存活率。将人类血小板用抗血小板抗体(Ab)敏化并与正常人血清(NHS)温育。添加浓度逐渐提高的经典补体途径抑制剂PA-dPEG24(PIC1)。图6A示出了通过剥离的血小板膜结合蛋白的iC3b ELISA测量血小板表面上的C3激活的测定结果。示出的数据是n＝5个独立实验的平均值±SEM。图6B示出了通过C5a ELISA测量上清液中补体过敏毒素C5a的产生的测定结果。示出的结果是n＝4个独立实验的平均值±SEM。在图6C中，通过Presto蓝测量细胞存活率。示出的数据是n＝6个独立实验的平均值±SEM。
图7A-7C示出了人类血小板在大鼠血清中的存活率的测定结果。图7A示出了将人类血小板与量逐渐增加的Wistar或Sprague Dawley(S-D)大鼠血清温育30分钟，并使用Presto蓝测量细胞存活率的测定结果。示出的数据是n＝3个独立实验的平均值±SEM。图7B示出了将人类血小板与Wistar大鼠血清(NRS)或热失活的Wistar大鼠血清(热失活RS)温育逐渐增加的时间量，并使用Presto蓝测定存活率的测定结果。示出的数据是n＝3个独立实验的平均值±SEM。图7C示出了将人类血小板与Wistar大鼠血清在浓度逐渐提高的PA-dPEG24(PIC1)存在下温育的测定结果。示出的数据是n＝3个独立实验的平均值±SEM。
图8A-8C是代表性的流式细胞术图像，示出了用PKH26染色的人类血小板的测定。在图8A中，通过流式细胞术测定未染色的人类血小板。在图8B中，通过流式细胞术测定用PKH26染色的人类血小板。在图8C中，将染色和未染色的人类血小板以1:1的比例混合，并通过流式细胞术测定。
图9A-9C是代表性的流式细胞术图像，示出了输注到Wistar大鼠中的PKH26染色的人类血小板的测定。在图9A中，通过流式细胞术测定输注前的血液样品(T＝0)。在图9B中，通过流式细胞术测定在血小板输注后0.5分钟抽取的血液样品(T＝0.5)。在图9C中，通过流式细胞术测定在血小板输注后2分钟抽取的血液。
图10示出了通过荧光显微术获得的输注的PKH26染色的血小板的组织学可视化。输注PKH26染色的血小板(顶部行)。对大鼠进行假输注(底部行)。示出了肝脏和脾脏的代表性荧光显微术图像。
图11示出了在使用或不使用PA-dPEG24(PIC1)的情况下，输注到Wistar大鼠中的PKH26染色的人类血小板的流式细胞术测定的结果。在用染色的人类血小板输注之前30秒灌注PA-dPEG24(160mg/kg)。大鼠接受1×108个染色的人类血小板的输注。在输注前(T＝0)、血小板输注后0.5分钟(T＝0.5)或血小板输注后2分钟(T＝2)抽取血液样品。示出了代表性流式细胞术图像。
图12A-12B示出了在使用PA-dPEG24的补体抑制存在下体内血小板存活率测定的结果。在血小板输注前30秒灌注160mg/kg的PA-dPEG24(PIC1)。在图12A中，输注PKH26染色的人类血小板(1×108)，并随时间获取抽血样。通过流式细胞术测定所述血液样品中染色的人类血小板相对于血小板总数的百分率。示出的数据是每个组中n＝4只大鼠的平均值±SEM。在图12B中，输注未染色的人类血小板(1×108)并随时间获取抽血样。所述血液样品中血小板的总数由商业供应商测量。示出了相对于血小板输注后0.5分钟每只大鼠的绝对血小板计数，总血小板计数随时间的变化。示出的数据是每个组中n＝4只大鼠的平均值±SEM。
图13是示出了在浓度逐渐提高的PIC1(PA-dPEG24)存在下，在容许补体的缓冲液中对象的血浆中红细胞的溶血程度的图。数据示出了(n＝3)个独立实验的平均值和平均值的标准误差(SEM)。
发明内容
一方面，本发明提供了一种在对象中抑制对输注的血小板的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：a)向需要的对象给药经典补体途径抑制剂；和b)向所述对象输注血小板。
另一方面，本发明提供了一种在同种免疫对象中抑制对血小板的不应性的方法，所述方法包括下述步骤：a)用经典补体途径抑制剂处理血小板；和b)将处理过的血小板输注到所述对象。
另一方面，本发明提供了一种在接受来自于抗原不匹配供体的血小板的对象中预防血小板不应性的方法，所述方法包括向所述对象给药经典补体途径抑制剂，然后再将所述血小板输注到所述对象。
另一方面，本发明提供了一种在接受来自于抗原不匹配供体的血小板的对象中预防血小板不应性的方法，所述方法包括下述步骤：a)用经典补体途径抑制剂处理血小板；和b)将处理过的血小板输注到所述对象。
在上述方面的各种不同实施方式中，所述方法有效地提高所述输注的血小板在所述对象中的存活率。在各种不同实施方式中，所述方法有效地在所述对象中降低补体介导的对所述输注的血小板的攻击。在各种不同实施方式中，所述方法有效地提高所述输注的血小板在所述对象中的存活率。
在某些实施方式中，所述对象是人类。
在某些实施方式中，所述补体介导的抑制剂是PIC1肽。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含与SEQ ID NO：1-45中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含与SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种用于输注到接受者中的血液制品，其中所述血液制品包含血小板和经典补体途径抑制剂。在某些实施方式中，所述补体介导的抑制剂是PIC1肽。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含与SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQID NO：29的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种在对象中治疗迟发性溶血性输血反应(DHTR)的方法。所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的经典补体途径抑制剂。
在某些实施方式中，所述经典补体途径抑制剂被肠胃外给药。在某些实施方式中，所述经典补体途径抑制剂被静脉内给药。在各种不同实施方式中，所述对象是人类。在某些实施方式中，所述补体介导的抑制剂是PIC1肽。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含与SEQID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQID NO：10的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述PIC1肽包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文中描述的相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践和试验，但在下文中描述了适合的方法和材料。
术语“抑制”是指单独的或在复合物中的酶、蛋白质、肽、因子、副产物或其衍生物生物功能的降低；不论是在体内还是在体外的生物蛋白、肽或其衍生物数量的降低；或已知包含一系列相关的生物或化学反应的生物事件链、级联或途径的中断。因此，术语“抑制”可以例如用于描述与对照样品相比补体级联的单一组分的数量的减少，组分或组分的复合物的形成的速率或总量的降低，或生物反应的复杂过程或系列的总活性的降低，导致诸如细胞裂解、转化酶的形成、补体来源的膜攻击复合物的形成、炎症或炎性疾病的结果。在体外测定法中，术语“抑制”可以是指某些生物或化学事件的可测量的减少，但本领域普通技术人员会认识到，所述可测量的减少不必定全部是“抑制性的”。
术语“PIC1”是指包含IALILEPICCQERAA(SEQ ID NO：1)的极性选型(PA)序列的肽以及包含相同的氨基酸序列但具有修饰例如PEG化的肽。术语“PIC1变体”是指包含与IALILEPICCQERAA(SEQ ID NO：1)的PA序列具有至少85％同一性、或至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少99％同一性，但不是100％同一性的序列的肽。PIC1变体可以包含其中所述PA序列的至少一个氨基酸被缺失的肽。PIC1变体可以包含在所述PA序列中插入有氨基酸的肽。PIC1变体可以包含其中所述PA序列的至少一个氨基酸被另一个氨基酸例如丙氨酸、修饰的氨基酸或氨基酸衍生物例如肌氨酸(Sar)替换的肽。
当在本文中使用时，术语“对象”意味着需要诊断、预后或治疗的任何对象。例如，对象可以是哺乳动物，例如人类或非人类灵长动物(例如猿、猴、猩猩或黑猩猩)、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛或奶牛。
当在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指每种活性组分的足以显示出有意义的患者益处的总量。所述肽化合物的治疗有效量随着几种因素而变，例如待治疗的病症、病症的严重性、给药时间、给药途径、所使用的化合物的排泄速率、治疗持续时间、涉及的共同疗法以及对象的年龄、性别、体重和状况等。本领域普通技术人员可以确定所述治疗有效量。因此，暴露于普通技术人员可能需要滴定剂量并修改给药途径来获得最大治疗效果。
当在本文中使用时，“治疗”是指以有效改善障碍(例如本文中描述的障碍)或其症状或阻止或减缓障碍(例如本文中描述的障碍)或其症状的进展的量、方式(例如给药计划)和/或模式(例如给药途径)实施疗法。这可以通过例如与障碍或其症状相关的参数的改善，例如达到统计学显著程度或达到本领域技术人员可检测的程度的改善来证明。有效量、方式或模式可以随着对象而变，并且可以针对所述对象定制。通过阻止或减缓障碍或其症状的进展，治疗可以在受影响或诊断的对象中预防或减缓由障碍或其症状导致的恶化。
一方面，本发明提供了一种在对象中抑制炎症的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的PIC1或PIC1变体。另一方面，本发明提供了一种在对象中治疗炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的PIC1或PIC1变体。在相关方面，本发明提供了一种PIC1或PIC1变体，其用于在对象中治疗和/或预防炎症的方法中。所述方法包括向所述需要的对象给药包含治疗有效量的所述PIC1或PIC1变体的组合物。
PIC1和PIC1变体的实例包括但不限于表1中列出的肽。
表1.
Figure BDA0003204009700000111
Figure BDA0003204009700000121
在某些实施方式中，PIC1包含一个或多个PEG组成部分。所述PEG组成部分可以通过PEG化附连到N-端、C-端或N-端和C-端两者。在一个或多个实施方式中，24个PEG组成部分被附连到N-端。在一个或多个实施方式中，24个PEG组成部分被附连到C-端。在一个或多个实施方式中，24个PEG组成部分被附连到N-端和C-端。在一个或多个实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个PEG组成部分被附连到N-端。在一个或多个实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个PEG组成部分被附连到C-端。在一个或多个实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个PEG组成部分被附连到N-端和C-端两者。
所述PIC1肽可以是合成肽。合成肽在体外制备。合成肽可以按照本领域中已知的各种不同方法制备。例如，合成肽可以通过顺序偶联各个氨基酸以形成所述肽来制备。在某些实施方式中，将各个氨基酸的羧基顺序偶联到生长中的肽链的氨基端。可以使用保护基团来防止在所述偶联过程中发生不想要的副反应。肽合成可以在液相或固相中进行。
示例性的PIC1肽包括但不限于PA-dPEG24(包含极性选型(PA)序列并在C-端处包含24个PEG组成部分的肽)、PA-dPEG20(在C-端处包含20个PEG组成部分)、PA-dPEG16(在C-端处包含16个PEG组成部分)、PA-dPEG12(在C-端处包含12个PEG组成部分)、PA-dPEG08(在C-端处包含8个PEG组成部分)、PA-dPEG06(在C-端处包含6个PEG组成部分)、PA-dPEG04(在C-端处包含4个PEG组成部分)、PA-dPEG03(在C-端处包含3个PEG组成部分)和PA-dPEG02(在C-端处包含2个PEG组成部分)。
PIC1肽可以通过结合级联的起始组分C1并阻断其激活来抑制补体经典途径。PA-dPEG24是PIC1家族中的一种15个氨基酸的PEG化的肽。pA-dPEG24包含SEQ ID NO：19的序列。PA-dPEG24可以抑制免疫复合物起始的补体激活并抑制NET形成。PA-dPEG24通过各种不同的免疫复合物始终如一地抑制补体激活，并且也可以抑制由几种刺激物引发的NET形成。
本文中描述了肌氨酸替换变体，其不需PEG化即可溶于水中。这些肌氨酸替换变体包括包含SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10和29中的任一者的氨基酸序列的肽。本文中提供的实施例显示，用肌氨酸替换第8位处的异亮氨酸产生了一种可溶性肽，其在补体抑制和髓过氧化物酶抑制方面超过母体分子。用肌氨酸替换第9位处的半胱氨酸提高溶解性，但与母体分子相比在其他方面不改变功能特征。然而，用单个肌氨酸残基代替第9和10位处的两个相邻半胱氨酸残基，在所试验的大多数测定法中降低功能活性。
本文中描述的几种肌氨酸PIC1变体具有改进的溶解性以及许多意料之外的结构-功能发现，它们提供了新的见解。几种肌氨酸替换变体表现出比所述母体肽提高的效力，这可能为涉及补体、髓过氧化物酶、NET或氧化胁迫的炎性疾病过程提供增加的治疗潜力。
不希望受到理论限制，肌氨酸残基常常被用于药物化学中，这是因为它有利的溶解性特性、由NH基团缺少质子而造成的分子内或分子间氢键数量的减少、以及由于φ、ψ扭转角的变化引起空间约束增加而造成的相邻残基的潜在改变[16]。用肌氨酸替换第2-5位和第8位处相对疏水的丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，可以通过降低所述肽的整体疏水性极大地提高溶解性。出人意料的是，本文中提供的数据显示，用肌氨酸替换第9位而不是第10位处的半胱氨酸也提高溶解性，用单个肌氨酸替换两个相邻半胱氨酸(C9、10)也是如此。不希望受到理论限制，半胱氨酸残基不带电荷且相对极性。第9位、第9和第10位两者但不是第10位处的肌氨酸替换提高溶解性这一观察，表明通过改变肽的构象而不是仅仅通过改变总体疏水性，可以影响溶解性。
本文还描述了一种在对象中抑制对输注的血小板的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：a)向需要的对象给药经典补体途径抑制剂；和b)向所述对象输注血小板。所述经典补体途径抑制剂可以是包含SEQ ID NO：1-45中的任一者的序列的肽，例如包含SEQ IDNO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者的序列的肽。所述补体途径抑制剂可以在输注之前、输注期间(例如作为输注的血小板的一部分)或输注之后给药。所述补体途径抑制剂可以在输注之前1小时、输注之前20-40分钟、输注之前10-20分钟、输注之前1-10分钟、输注之前约1分钟、输注之前1分钟或输注之前不到1分钟给药。所述补体途径抑制剂可以在输注之后1小时、输注之后20-40分钟、输注之后10-20分钟、输注之后1-10分钟、输注之后约1分钟、输注之后1分钟或输注之后不到1分钟给药。
本文还描述了一种在同种免疫对象中抑制对血小板的不应性的方法，所述方法包括下述步骤：a)用经典补体途径抑制剂处理血小板；和b)将所述处理过的血小板输注到所述对象。所述经典补体途径抑制剂可以是包含SEQ ID NO：1-45中的任一者的序列的肽，例如包含SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者的序列的肽。
本文还描述了一种在接受来自于抗原不匹配供体的血小板的对象中预防血小板不应性的方法，所述方法包括向所述对象给药经典补体途径抑制剂，然后再将所述血小板输注到所述对象。经典补体途径抑制剂可以是包含SEQ ID NO：1-45中的任一者的序列的肽，例如包含SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者的序列的肽。所述补体途径抑制剂可以在输注之前1小时、输注之前20-40分钟、输注之前10-20分钟、输注之前1-10分钟、输注之前约1分钟、输注之前1分钟或输注之前不到1分钟给药。
本文还描述了一种在接受来自于抗原不匹配供体的血小板的对象中预防血小板不应性的方法，所述方法包括下述步骤：a)用经典补体途径抑制剂处理血小板；和b)将所述处理过的血小板输注到所述对象。
在本文描述的实验中，使用离体系统证实了用抗血小板抗体敏化的人类血小板启动补体激活，导致细胞存活率降低。已显示，大多数所述敏化的血小板启动的补体激活通过经典途径发生。此外，经典途径抑制剂可以保护抗体敏化的血小板免于人类血清补体介导的灭杀。
Wistar大鼠血清含有启动补体介导的人类A或AB型红细胞的裂解的天然抗体[31]。不希望受到理论限制，Wistar大鼠血清还可以引起补体介导的人类血小板的灭杀，证明了人类血小板在Wistar大鼠血清中不相容。经由Wistar大鼠血清引起的补体介导的人类血小板的破坏主要通过经典途径发生。本文描述了一种血小板不应性的新的动物模型，其利用了输注到Wistar大鼠中的人类血小板。输注到Wistar大鼠中的PKH26染色的人类血小板可以通过流式细胞术测量，尽管这种血小板具有与免疫不相容性相符的短的循环半衰期。经典途径补体抑制剂PA-dPEG24有效地短暂提高循环的不相容血小板的数目。
一方面，本发明提供了一种在对象中治疗DHTR的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的PIC1或PIC1变体。所述方法包括向所述需要的对象给药包含治疗有效量的所述PIC1或PIC1变体的组合物。
本文第一次描述了补体抑制剂的使用可以治疗、改善或以其他方式缓和DHTR的进展。不希望受到理论限制，DHTR中的溶血可能涉及引起吞噬作用的抗体-Fc受体相互作用[35]。PIC1肽可以通过结合所述级联的启动组分C1并阻断其激活来抑制补体经典途径。一种示例性PIC1肽是PA-dPEG24这种15个氨基酸的PEG化的肽。PA-dPEG24可以通过免疫复合物始终如一地抑制补体激活。PA-dPEG24也可以抑制由几种刺激物引发的NET形成。
在相关方面，本发明提供了一种PIC1或PIC1变体，其用于在对象中治疗和/或预防DHTR的方法中。所述方法包括向所述需要的对象给药包含治疗有效量的所述PIC1或PIC1变体的组合物。
在某些实施方式中，所述PIC1在对所述对象实施输血之后并且DHTR的任何症状出现之前给药。
不希望受到理论限制，补体系统的抗体介导的激活由经典补体途径指导，其中起始复合物C1被IgM或多个IgG结合，触发激活和下游效应物功能(即C3a、C5a和膜攻击复合物形成)。所述经典补体途径的PIC1肽抑制剂可以结合C1q这种C1复合物的识别分子，以阻止抗体介导的激活。已证实PA-dPEG24(IALILEPICCQERAA-dPEG24(SEQ ID NO：19))在体外以及在体内当血管内给药到大鼠中两种情况下抑制经典途径激活，在所述体内情况下它在30秒内可以实现补体激活的>90％的系统性抑制。
在某些实施方式中，经典补体途径抑制剂被用于在遭受迟发性溶血性输血反应的患者中治疗活跃溶血。
实施例
本发明还利用下述实施例进行描述和证明。然而，在本说明书中的任何地方使用这个和其他实施例仅仅是说明性的，并且绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于本文描述的任何特定优选实施方式。事实上，在阅读本说明书后，本发明的许多修改和改变对于本领域技术人员来说可能是显而易见的，并且此类改变可以在不背离本发明的精神或范围的情况下做出。因此，本发明仅受权利要求书的条款以及那些权利要求项所赋予的等效物的全部范围的限制。
下面的材料和方法部分适用于下文的实施例1-6。在这些实施例中，合成了肌氨酸替换变体，评估了它们在水中的溶解性，然后在标准的补体、髓过氧化物酶、NET形成和抗氧化能力测定法中对它们进行了测试。
用于实施例1-6的材料和方法
在东弗吉尼亚医学院(Eastern Virginia Medical School)IRB批准的方案02-06-EX 0216下，经书面同意，从健康的供体获得血液。血液用于下述试剂的制备：纯化的血小板，红细胞和嗜中性粒细胞。
试剂
PA-dPEG24(IALILEPICCQERAA-dPEG24或PIC1)由PolyPeptide Group(San Diego,CA)制造，通过HPLC和质谱分析验证纯度≥95％。将冷冻干燥的PA-dPEG24溶解在0.05M组氨酸缓冲液中，并将pH调整到6.7。肌氨酸替换衍生肽和基础肽IALILEPICCQERAA(PA)由NewEngland Peptide(Gardner,MA)合成至纯度>90％。将肌氨酸变体和PEG溶解在水中，并用NaOH调整pH。将PA溶解在DMSO中，然后用水调整至终浓度以得到30％DMSO，并调节pH。抗体敏化的绵羊红细胞(EA)、纯化的C1q和剥夺因子B的人类血清购自Complement Technology(Tyler,TX)。纯化的髓过氧化物酶购自Lee BioSolutions(Maryland Heights,MO)，并且四甲基联苯胺(TMB)和PicoGreen购自Thermo Fisher(Waltham MA)。
合成了表2中示出的肽，包括16种肌氨酸替换变体。
表2.肽的名称和序列
Figure BDA0003204009700000181
Figure BDA0003204009700000191
缓冲液
制备了补体容许性GVBS++缓冲液，其包含维罗纳缓冲盐水、0.1％明胶、0.15mMCaCl2和1mM MgCl2[12]。制备了补体抑制性缓冲液GVBS--，其包含维罗纳缓冲盐水以及0.1％明胶和10mM EDTA。
合并的正常人血清(NHS)
合并的正常人血清(NHS)如以前所述来制备[12]。将来自于至少4位健康人类供体的血液收集在不含添加剂的真空采血管(红顶)中。将血液在室温放置30分钟并在冰上放置2小时以便凝血并分离血清。然后将血清合并，分成等分试样并在-80℃冷冻。
补体活性的溶血测定法
对于溶血补体测定法来说，如以前所述将来自于AB型供体的人类红细胞(RBC)纯化，清洗并标准化至1×109个细胞/ml[13]。将来自于O型供体的人类血清以20％的终浓度与1mM PIC1或肌氨酸变体肽合并，用GVBS++将体积调整到0.15ml，并添加0.5ml RBC。对于剥夺因子B的血清溶血测定法来说，将最终0.005％的剥夺因子B的血清与1mM PIC1或肌氨酸变体肽和0.1ml抗体敏化的绵羊红细胞(EA)在终体积为0.75ml的GVBS++中温育。将所述样品在37℃温育1小时。然后，向所述剥夺因子B的样品添加1.0ml GVBS--，以终止反应。将样品以3,000rpm离心5分钟。然后收集上清液并在412nm处读数。进行分析以将所述值表示成由GVBS++缓冲液中的人类O血清和AB红细胞构成的阳性对照的百分数。
MPO活性测定法
将PIC1和肌氨酸变体稀释到25mg/ml，然后在96孔板中以0.02ml的体积连续滴定。将髓过氧化物酶(MPO)稀释到20μg/ml，并将0.02ml添加到所述滴定的肽。向每个孔添加TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)(0.1ml)，放置2分钟，然后添加0.1ml 2.5N H2SO4，放置另外2分钟，然后在96孔板读板器(BioTek)上在450nm处读数。
C1q和MPO结合测定法
将Immunlon-2HB ELISA板用含有1μg/ml C1q或MPO的碳酸氢盐缓冲液在4℃包被过夜。将所述板用PBST(磷酸盐缓冲盐水+0.1％Tween)清洗，然后用1％明胶/PBS在室温阻断2小时。在清洗后，将所述板与始于2.5mg/ml、然后在1％明胶/PBS中连续稀释的PA或肌氨酸变体肽在室温温育1小时。在清洗后，将所述板用在1％明胶/PBS中1:1000稀释的兔抗PA抗体(由Cocalico Biologicals,Reamstown,PA开发)在室温探测1小时，然后用在1％明胶/PBS中1:1,000稀释的山羊抗兔HRP(Sigma Aldrich,St Louis,MO)在室温探测1小时，在两者之间具有清洗步骤。将孔用TMB底物溶液显色，用1N H2SO4终止，并在读板器中在450nm处读数。
MPO血红素的环氧化降解
在96孔板中，将0.025ml 1.7mg/ml MPO与0.00125ml 0.5％H2O2和3mM PIC1或肌氨酸变体肽合并在终体积为0.125ml的PBS中，并将其在室温温育2分钟。使用96孔板读板器扫描所述孔以获得300–550nm的吸光值，如以前所报道的产生反映出MPO血红素环中的铁状态的曲线[14]。
总抗氧化能力测定法
使用TAC(总抗氧化能力)测定法(Cell Biolabs,Inc,San Diego,CA)，在铜(II)向铜(I)的还原的基础上测量肌氨酸变体的抗氧化能力。所述测定按照推荐的试剂盒流程来进行。
NETosis测定法
使用免疫复合物的NETosis测定法如以前所述来进行[9]。简单来说，将正常人血清用GVBS++中的卵清蛋白-抗卵清蛋白抗体免疫复合物在37℃刺激30分钟。然后将该混合物与0.05％H2O2一起添加到重悬浮在含有或不含肌氨酸变体(2mM)的RPMI中的纯化的人类嗜中性粒细胞，允许NETosis发生。从嗜中性粒细胞释放的游离DNA的定量使用PicoGreen来进行。载片用DAPI(Southern Biotech,Birmingham,AL)染色。使用下述抗体来可视化NET的形成：
(i)小鼠抗弹性蛋白酶抗体(Invitrogen,Carlsbad,CA)作为第一抗体以及山羊抗小鼠第二抗体Alexa Fluor 568(Novus Biologicals,Centennial,CO)，和
(ii)兔抗组蛋白H3抗体(Abcam,Cambridge MA)和山羊抗兔抗体Alexa Fluor 488(Novus Biologicals)。
使用Olympus BX53显微镜进行荧光显微术，以可视化NET。
统计分析
使用Excel(Microsoft,Redmond,WA)对定量数据进行分析，以确定平均值、标准误差(SEM)和学生t-检验[15]。
实施例1：肽溶解性
为了评估肌氨酸残基对基础肽IALILEPICCQERAA(PA)的溶解性和生物学功能的影响，合成了在所有15个位置处具有肌氨酸残基替换的肽。还包括了其中第9和10位处的相邻半胱氨酸(C9、C10)被单个肌氨酸残基代替的肽。所述肽示出在表2中。对每种肽进行了水溶性测定，结果示出在表3中。在A2、L3、I4、L5、I8、C9和C9,10位置处肌氨酸的替换产生在水中可溶的肽。由于它们在不存在PEG化的情况下增强的溶解性，选择了这些肽用于进一步评估各种不同的生物学活性。
表3.肽的水溶性测定的结果
Figure BDA0003204009700000221
实施例2：肽变体的补体抑制测定法
进行了所述肽变体抑制抗体启动的补体激活的程度的评估。将所述肽变体在下述两种溶血测定法中进行了测试：(i)ABO不相容性离体测定法，和(ii)剥夺因子B的血清中的经典途径CH50类型的测定法。
在所述ABO不相容性溶血测定法中，将来自于“AB+型”供体的纯化的红细胞与来自于“O型”对象的含有抗A和抗B抗体的血清温育；测试的肽为1.8mM。数据示出在图1A中。在等摩尔的基础上，变体A2、I4、I8和C9各自以比PA-dPEG24(PIC1)母体化合物更大的程度抑制ABO不相容性溶血(P<0.015)。I8变体与PA-dPEG24相比减少ABO溶血多出53％(P<0.002)。然而，所述C9,10变体显示出ABO溶血的极低抑制。
然后使用抗体敏化的绵羊红细胞，利用剥夺因子B的血清分离经典途径，进行了CH50类型的溶血测定法；测试的肽为0.4mM。数据示出在图1B中。在这个测定法中，I8变体表现出优越的活性，与PA-dPEG24相比抑制溶血多出75％(P<0.001)。其他肽与PA-dPEG24相比表现出相近的经典补体途径的抑制，例外的是C9,10，其再次显示出最低活性。
然后进行了肽变体与C1q的结合的ELISA类型的测定法，其中使用C1q作为捕获底物。每种肽的结合曲线示出在图1C中。从这些结合曲线计算半最大结合浓度，如图1D中所示。这些结合曲线和半最大结合的计算证实了与其他肽相比I8和PA(母体肽)两者产生与C1q的优越的结合。然而，PA具有不良的水溶性，使得PA需要最初溶解在DMSO中，然后在水性缓冲液中稀释。较高浓度的DMSO干扰检测试剂，产生部分结合曲线。I8的优越的C1q结合与优越的补体介导的溶血的抑制相关。总而言之，与PA和其他肽变体相比，I8变体显示出优越的抗体启动的补体激活和溶血的抑制。
实施例3：髓过氧化物酶抑制和结合
然后如以前对PA-dPEG24所述，在基于TMB的体外测定法中测试髓过氧化物酶(MPO)活性的抑制[7]。在这个测定法中，测试了在一定浓度范围内的所述变体的MPO抑制。数据示出在图2A中。对所有变体来说发现了强烈的MPO抑制，例外的是无半胱氨酸变体(C9,10)。从剂量响应曲线计算每种变体的半最大抑制值，数据示出在图2B中。MPO抑制存在可测量的差异，其中在所述不同变体中变体I8再次显示出最大的功效。
进行了基于板的测定以测试所述肽变体与固相化MPO的结合。结合曲线示出在图2C中。除了C9,10之外，对所有变体鉴定到MPO结合。由于I8和PA曲线几乎完全重叠，在图中未示出PA曲线。从这些曲线计算半最大结合浓度，结果示出在图2D中。与其他肌氨酸变体相比，I8表现出优越的与MPO的结合。这个结果与通过上述剂量响应数据鉴定到的MPO抑制的增加相一致。
实施例4：保护MPO血红素环免于降解
然后评估了所述变体防止MPO分子中的血红素环降解的能力。由于MPO在氯化物和过氧化氢存在下产生次氯酸，所述次氯酸会降解血红素环，如以前对于PA-dPEG24所示[8]。血红素环的降解可以通过300nm至550nm波长的吸收的分光光度测量来评估。在这个范围内对所有变体进行了吸光度测量，每种变体的数据示出在图3A-3H中。所有肽均显示出对血红素环降解的一定程度的抑制，其中I8和C9变体几乎完美地保存了血红素环吸收光谱，如图3F和3G中所示。这两种变体的血红素环保护高于PA-dPEG24肽(图3A)。C9,10变体也显示出血红素环降解的抑制(图3H)，表明保护机制不是C9,10变体不具有的(如图2A中所示)MPO过氧化物酶活性的抑制。
实施例5：抗氧化能力测定法
如以前对于PA-dPEG24所述，在总抗氧化能力(TAC)测定法中测试了所述变体的抗氧化能力[10]。抗氧化活性用铜还原当量(CRE)度量。在0.03-0.25mM的浓度范围内测试所述肽，然后与标准品进行比较。结果示出在图4中。所述变体显示出不同的总抗氧化能力，其中L3、I4和I8表现出接近PA-dPEG24(PIC1)的抗氧化能力。所述C9,10无半胱氨酸变体未表现出抗氧化能力。
实施例6：NETosis抑制
测试了所述肽变体对NETosis的抑制。在这个测定法中，将纯化的人类嗜中性粒细胞用卵清蛋白-抗卵清蛋白抗体免疫复合物和过氧化氢活化的正常人血清刺激。然后在PicoGreen测定法中测量从所述嗜中性粒细胞表达的游离DNA。结果示出在图5A中。在这个测定法中，与PA-dPEG24相比，包括A2、L3、L5、I8和C9在内的多种变体表现出相近的抑制NETosis的能力，正如在图5A的图中所示。与PA-dPEG24相比I4表现出降低的抑制NETosis的能力，并且C9,10相对于阴性对照(缓冲液)仅显示出轻微抑制。这些结果显示，许多肌氨酸变体肽能够将NETosis抑制到从未刺激的嗜中性粒细胞释放的游离DNA的基线值。通过荧光显微术对嗜中性粒细胞细胞外阱(NET)形成进行的直接可视化，用于确认上述使用I8变体的NETosis结果。如以前所述，将人类嗜中性粒细胞纯化并在玻璃载片上刺激，然后用DAPI染色以可视化DNA，并用抗嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗体(αNE)和抗组蛋白H3抗体(α组蛋白)探测[9]。未刺激的嗜中性粒细胞没有显示出NET的证据(图5B，第一行)，用卵清蛋白-抗卵清蛋白抗体免疫复合物和过氧化氢刺激的嗜中性粒细胞显示出许多NET(图5B，第二行)，并且在PA-dPEG24存在下用免疫复合物刺激的嗜中性粒细胞显示出NET的急剧减少(图5B，第三行)。NET的荧光显微术可视化确认了通过游离DNA的定量测量所看到的的发现。
所述测试的肽的性质概述在表4中。
表4：肽性质的概述
Figure BDA0003204009700000251
*以前发表过的ND＝未进行
一个出人意料的发现是，在大多数测试的抗炎测定法中，I8变体优于母体化合物PA-dPEG24。不希望受到理论限制，I8的C1q结合略微优于PA-dPEG24，并且可能驱动增强的C1激活的抑制。
也出人意料的是在补体抑制方面C9变体的表现几乎与母体化合物PA-dPEG24一致，尽管失去了两个半胱氨酸之一。在总抗氧化能力测定法中，C9具有PA-dPEG24的大约一半的抗氧化能力，与具有一半量的半胱氨酸相称。在补体抑制测定法中，在不存在半胱氨酸(变体C9,10)的情况下，失去了大多数但不是所有的补体抑制。宿主补体抑制剂通常富含半胱氨酸[17]。合在一起，这些发现表明半胱氨酸有助于补体抑制，但不能解释这些肽的全部补体抑制。
下面的材料和方法部分适用于下述实施例7-11。
用于实施例7-11的材料和方法
伦理学声明
在东弗吉尼亚医学院(Eastern Virginia Medical School)IRB批准的方案02-06-EX 0216下，经书面同意，从健康的供体获得血液。血液用于下述试剂的制备：纯化的血小板和正常人血清。
试剂
PIC1(IALILEPICCQERAA-dPEG24)由PolyPeptide Group(San Diego,CA)制造，通过HPLC和质谱分析验证纯度≥95％。将冷冻干燥的PIC1溶解在pH 6.7的0.05M组氨酸缓冲液中。血小板敏化的抗体从Tissue for Research LTD(Suffolk,United Kingdom)以免疫性血小板减少性紫癜(ITP)患者血清的形式获得。
Figure BDA0003204009700000261
细胞存活率试剂由LifeTechnologies(Eugene,Oregon)制造。PKH26红色荧光细胞染料由Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)制造。
缓冲液
制备了补体容许性GVBS++缓冲液，其包含维罗纳缓冲盐水、0.1％明胶、0.15mMCaCl2和1mM MgCl2[12]。制备了补体抑制性缓冲液GVBS--，其包含维罗纳缓冲盐水以及0.1％明胶和10mM EDTA。
合并的正常人血清(NHS)
合并的正常人血清(NHS)如以前所述来制备[12]。
大鼠血清
大鼠血清购自Innovative Research(Peary Court,Novi,MI)。
人类血小板纯化
血小板从多位健康人类供体纯化，以便确保在人类供体之间的可重复性。来自于健康志愿者的外周血(8mL)被直接抽取在含有柠檬酸右旋糖(ACD)的Vacutainer(BD,Franklin Lakes,NJ)无菌采集管中，并在采集的3小时内使用。在添加另外250ul ACD后，将血液在22℃下以500×g、100×g和800×g的顺序各离心5分钟，在每次离心后收集上清液并转移到新的管中。然后将所述纯化的血小板用GVBS--清洗、然后用盐水清洗，然后最终重悬浮在GBVS++中。
血小板染色
对于体外实验来说，将血小板用Presto蓝细胞存活率试剂，按照制造商的推荐进行染色。对于体内实验来说，将血小板用PKH26红色荧光细胞染料，按照制造商的推荐进行染色。
体外补体和血小板研究
对于用人类抗血小板抗体敏化血小板的实验来说，将纯化的血小板用4％ITP血清在30℃处理15分钟，然后添加2％正常的人类补体充足血清，并在37℃温育30分钟。对于含有PIC1的样品来说，将血清与PIC1预温育5分钟，然后与敏化的血小板合并。然后将样品离心并取出上清液，用于通过ELISA进行C5a分析。按照制造商的推荐使用C5a ELISA试剂盒(R&D Systems)。将细胞用GVBS--清洗一次并用水清洗一次，以裂解血小板。将剩余的细胞沉淀物用25mM甲胺在37℃处理1小时，离心，并通过ELISA分析上清液的iC3b。所述用于iC3b的ELISA如以前所述进行，将山羊抗人类C3抗体(Complement Technology,Tyler,TX)用于捕获，小鼠抗人类iC3b抗体(Quidel,San Diego,CA)用于探测，并将山羊抗小鼠HRP(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)用于检测[30]。
对于使用大鼠血清的实验来说，将纯化的血小板与5％Wistar大鼠血清在37℃水浴中温育不同的时间点(5min、20min和60min)。然后向所述混合物添加GVBS--，并将其在22℃以500g离心5min。在用250ul PBS重悬浮后，以1:10的稀释率向细胞添加Presto蓝，并在37℃水浴中温育30min。然后将细胞铺板并在微孔板读板器上在530nm处读数。在向血清添加PIC1的情况下，在添加血小板之前存在5分钟的预温育时间。
动物实验
购买约16周龄并且体重为250克的具有留置颈内导管的雄性Wistar大鼠(HilltopScottdale,PA)。在整个实验过程中，将大鼠用氯胺酮和乙酰丙嗪镇定，并监测生命体征。在输注PKH26染色的人类血小板之前30秒进行PIC1灌注。在输注之前，然后在输注之后0.5、2、5、20、60和120min，从所述动物收集血液样品到K2EDTA微量采血管(BD,Franklin Lakes,NJ,USA)中。在最后一次抽血完成后，使用Fatal Plus(Vortech Pharmaceuticals,Dearborn,MI,USA)将动物安乐死。在安乐死后完成尸检以收集用于组织病理学的器官。
流式细胞术
流式细胞术使用带有DXP 8Color 488/637/407升级(Cytek Development,Freemont,CA,USA)的FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)进行。使用Cytek FlowJo CE7.5.110.7版获取数据。在流式细胞仪上分析之前，将大鼠全血以500×g离心5min。取出血浆血小板层，然后用PBS 1:10稀释。在FlowJo机器上运行大约20,000个选择血小板尺寸的事件。数据使用FlowJo V10.4.2(FlowJo LLC,Ashland,OR,USA)来分析。
染色的血小板器官组织学
在安乐死后回收肝脏和脾脏，在福尔马林中固定并切片，用于组织学载片。使用荧光显微镜观察载片。
统计分析
使用Excel(Microsoft,Redmond,WA)对定量数据进行分析，以确定平均值、标准误差(SEM)和学生t-检验[15]。
实施例7：人类血清对抗体敏化的人类血小板的补体攻击
为了阐明抗体敏化的血小板可以激活补体的程度，如下进行了使用纯化的人类血小板和合并的正常人血清(NHS)的离体实验。不希望受到理论限制，在临床医学中，血小板不应性通常与抗血小板抗体的存在相关。在这些实验中，利用ITP血清抗体来敏化血小板。
将人类血小板与敏化抗体、NHS或两者温育。在敏化抗体和NHS存在下添加浓度逐渐提高的PA-dPEG24(PIC1)。测定血小板的补体攻击和细胞存活率。C3是补体激活级联的中心组分。C3片段iC3b是对吞噬作用有贡献的调理素。血小板表面上的C3激活通过剥离的血小板膜结合蛋白的iC3b ELISA来测定，数据示出在图6A中。所述实验涉及以下组的iC3b测定：(i)单独的血小板、(ii)血小板与敏化抗体、(iii)血小板与NHS、(iv)血小板与敏化抗体和NHS两者以及(v)血小板与敏化抗体、NHS和增加量的PIC1。结果指示了抗体启动的经典补体途径介导的攻击。浓度逐渐增加的PA-dPEG24以剂量依赖性方式降低血小板的iC3b调理作用。在0.8mM PA-dPEG24下，iC3b以与对于单独的敏化抗体测量到的背景水平相近的水平结合到血小板。
然后通过ELISA测定从这些实验回收的血浆的促炎性过敏毒素C5a。数据示出在图6B中。与结合的iC3b相同，对于在敏化抗体和NHS存在下温育的血小板来说，与单独的任一者相比C5a生成显著增加。浓度逐渐提高的PA-dPEG24剂量依赖性地抑制C5a生成。在1.5mM(P＝0.028)和3.0mM(降低44％，P＝0.006)下发生C5a生成的显著抑制。
血小板的细胞存活率利用活体染料Presto蓝来测量。数据示出在图6C中。与仅与敏化抗体和NHS温育的血小板相比，在敏化抗体和NHS存在下，随着PA-dPEG24浓度的逐渐提高，血小板存活率剂量依赖性地提高。在1.5mM(P＝0.031)和3.0mM(提高53％，P＝0.003)的PA-dPEG24浓度下，发生血小板存活率的显著提高。这些结果表明抗血小板抗体可以激活补体，引起调理作用、过敏毒素生成和细胞存活率降低。这些效应在经典补体途径抑制剂存在下可以被极大逆转。
实施例8：大鼠血清对抗体敏化的人类血小板的补体攻击
为了将我们的离体发现转变成血小板不应性的动物模型，测定了在大鼠血清中人类血小板激活补体的程度。将以前开发的急性溶血性输注反应(AHTR)的同种异体红细胞输注模型用于所述测定[29]。在这个模型中，预先存在于Wistar大鼠血浆中的天然抗体针对人类红细胞，导致补体介导的溶血以及输注的人类红细胞的血管外移除。此外，在这个模型中，补体抑制使循环的输注红细胞的数目在一段时间内增加[29,31]。为了评估大鼠血清可以降低人类血小板存活率的程度，将人类血小板在来自于Wistar或Sprague Dawley大鼠的浓度逐渐提高的大鼠血清中温育。数据示出在图7A中。使用活体染料Presto蓝测定细胞存活率。随着大鼠血清浓度提高，存活的人类血小板的数目急剧减少，使得在10％血清中温育30分钟后，只有25％或更少的血小板存活(P<0.02)。
然后在时间过程实验中测试Wistar大鼠血清补体介导的人类血小板的灭杀。数据示出在图7B中。使用热失活的大鼠血清作为对照来分离补体介导的对血小板存活率的效应。使用Presto蓝测定在5％补体充足的大鼠血清中存活的血小板的数目。在前5分钟内活的血小板的数目减少接近50％，并在随后的时间点保持稳定。这些数据表明补体介导的血小板存活率的降低发生得非常快，可能反映了补体介导的细胞裂解。在5分钟时，与热失活的大鼠血清相比，在补体充足的大鼠血清中观察到人类血小板的血小板存活率降低两倍(P＝0.01)。这些数据证实了大鼠血清中的补体系统可以快速灭杀人类血小板。
为了评估由补体经典途径介导的大鼠血清对人类血小板的灭杀的程度，我们使用了PA-dPEG24。如上所述进行了使用人类血小板和大鼠血清的体外实验，包括在含有浓度逐渐提高的PA-dPEG24的血清中温育。数据示出在图7C中。存活率使用活体染料Presto蓝来测定，结果显示出随着PA-dPEG24剂量的增加，血小板存活率剂量依赖性地提高。与正常大鼠血清中的血小板对照相比，对于所有测试的剂量来说，PA-dPEG24提高人类血小板在大鼠血清中的存活率(P<0.017)。合在一起，这些数据表明大鼠血清中的人类血小板将经历存活率降低，其大部分可以通过补体失活或抑制来逆转。
实施例9：PKH26染色的血小板的流式细胞术测定法
对以前报道的用PKH26染色血小板的方法进行优化，并用于测定大鼠血液样品中的输注的血小板[32]。PKH26已被用于在输注到Wistar大鼠中之前染色人类红细胞，然后通过流式细胞术测量红细胞在循环中的持久性[31]。正如图8A中的数据所示，通过在530/30nm处的流式细胞术，未染色的纯化的人类血小板表现出具有低背景信号的典型分布。在图8B中，PKH26染色的纯化的人类血小板显示出比背景高大约104的峰值信号强度。将所述染色和未染色的血小板以1:1的比例混合。如图8C中所示，流式细胞术柱状图显示出峰的良好分离和相近的曲线下面积。这些结果表明所述人类血小板的PKH26染色的优化方法在输注后产生可靠的流式细胞术数据。
实施例10：PKH26染色的血小板的试验性输注
对具有留置颈静脉导管的6只大鼠进行试验性研究，以评估是否可以在输注后的血液样品中测量PKH26染色的人类血小板。三只大鼠IV接受1×108个PKH26染色的人类血小板。三只大鼠接受假输注。在输注之前(T＝0)和输注后0.5、2、5、20、60和120分钟获取血液样品。将血液收集在儿科K2EDTA小管中，然后用盐水稀释并通过流式细胞术进行分析。对于T＝0样品来说仅仅检测到极低的染色血小板信号，如图9A中所示。在输注后0.5分钟，在正确的荧光强度下可以检测到PKH26染色的血小板，如图9B中所示。对三只输注大鼠中的每一只来说，在0.5分钟时间点测量到的染色的血小板约为血液样品中血小板总数的5％。在输注后2分钟，来自于PKH26染色的血小板的信号降低，但仍可测量，高于背景，如图9C中所示。在更晚的时间点，血液样品中染色的血小板的流式细胞术检测继续降低。
所述数据表明，使用1×108个PKH26染色的人类血小板的IV输注可以产生可被流式细胞术检测的信号。保留在大鼠血流中的输注人类血小板的数目随时间快速减少，与免疫不相容性相符。
然后评估了是否可以通过荧光显微术在大鼠的肝脏和脾脏中鉴定到PKH26输注的血小板。在安乐死后回收肝脏和脾脏，用福尔马林固定并通过标准方法切片。PKH26染色的血小板可以容易地在肝脏(如图10A中所示)以及脾脏(如图10B中所示)中观察到，其中在红髓中的分布是明显的。这些结果表明在这种模型中血小板强烈的血管外移除。
实施例11：不相容的血小板的补体抑制和输注
使用经典补体途径抑制剂PA-dPEG24来评估经典补体途径的抑制是否可以影响血流中输注的不相容血小板的数目。在AHTR的大鼠模型中，PA-dPEG24可以减少血流中不相容的输注红细胞的数目。如图6C中所示，PA-dPEG24可以提高人类血小板在大鼠血清中的存活率。
在灌注(i)PA-dPEG24或(ii)盐水介质对照后，如上所述使用PKH26染色的人类血小板进行输注。图11示出了对于用PA-dPEG24(PIC1)或盐水对照处理的大鼠来说，在输注后0、0.5和2分钟对于血小板选择的代表性流式细胞术测量值。未染色的本源大鼠血小板在竖直线的左侧，染色的输注的血小板在右侧。在输注后0.5分钟，与接受介质的动物相比，对于PA-dPEG24处理的动物观察到染色的输注的血小板数目的增加。在2分钟时这种差异并不明显。
图12A中这些实验的汇集数据显示出与对照相比，接受PA-dPEG24的动物在0.5分钟时输注的血小板增加两倍(P＝0.05)，在更晚的时间点输注的血小板的量没有显著差异。评估了输注有用PIC1或盐水对照处理的未染色的血小板的大鼠的总血小板计数(如图12B中所示)，以便评估是否可以对于未染色的血小板确定相似的趋势。由Antech Diagnostics(Chesapeake,VA)测量每个血液样品的血小板计数。与30秒时输注后即刻的最大血小板计数相比，计算每个时间点血小板计数的减少。盐水处理的动物与PA-dPEG24处理的动物相比，发现在2分钟(P＝0.04)和20分钟(P＝0.03)时存在血小板计数的统计学显著的更大降低。这些结果表明，输注到Wistar大鼠中的人类血小板可以产生血小板不应性表型，并且可以使用经典补体抑制短暂提高输注的血小板的存活率。
实施例12：PIC1用于迟发性溶血性输血反应的治疗
一位14岁镰状细胞病患者因血管阻塞性疾病和急性胸腔综合征而接受pRBC(压积红细胞)输注。在输注后8天，她遭受恶化的肢体疼痛，继而新出现发热、高血压和呼吸系统代偿失调。她的血红蛋白一夜之间从7.6g/dL降低到5.0g/dL，与迟发性溶血性输血反应相符。随后，她在ICU住院8天后幸存，需要多次pRBC输注并接受多种免疫调节剂包括甲基泼尼松龙、IVIg(静脉内免疫球蛋白)、依库珠单抗、利妥昔单抗和托珠单抗。为了更好地理解她的疾病过程，将患者的红细胞和血浆在存在或不存在经典补体途径抑制剂PIC1(PA-dPEG24)的情况下在溶血测定法中进行了分析。
废弃的去标识化血液，从在用依库珠单抗治疗之前来自于所述患者的常规医学管理抽血样品获得。在补体容许性缓冲液(GVBS++)或补体抑制性缓冲液(GVBS--)中利用患者的血浆和红细胞的溶血性补体测定法，在浓度逐渐提高的PA-dPEG24存在下进行。补体容许性GVBS++缓冲液是含有0.1％明胶、0.15mM CaCl2和1mM MgCl2的维罗纳缓冲盐水[11]。补体抑制性GVBS--是含有0.1％明胶和10mM EDTA的维罗纳缓冲盐水。将大约5x 107个清洗过的红细胞与20％血浆在0.15ml的反应体积中，在37℃温育1小时。
通过以1,500x g离心5分钟将红细胞沉积，然后回收上清液。将所述上清液在BioTek Synergy HT读板器分光光度计上测量412nm处的吸光度。通过在分光光度计上在412nm处定量游离血红蛋白来测量溶血。
所述患者的血浆引起她的红细胞在补体容许性缓冲液中溶血，证实了补体介导的溶血(图1)。PIC1的添加显示出统计显著的溶血的剂量依赖性减少。在较高剂量下，PIC1将溶血抑制到背景信号。
对于该镰状细胞病和DHTR患者来说，离体证实了她的红细胞被她的血浆的补体介导的溶血。使用经典补体途径抑制剂PIC1，在较高剂量下所述补体介导的溶血被完全阻断。
上述数据显示，经典补体途径抑制剂可用于在遭受迟发性溶血性输血反应的患者中治疗活跃溶血。此外，该数据证实了补体介导的溶血在DHTR病理发生中发挥重要作用。
参考文献
1.Matsui SM,Kiang D,Ginzton N,Chew T和Geigenmuller-Gnirke U，(2001)星状病毒的分子生物学：精选亮点(Molecular biology of astroviruses:selectedhighlights)，Novartis Found Symp 238:219-233；讨论233-216.
2.Sebire NJ,Malone M,Shah N,Anderson G,Gaspar HB等，(2004)，在儿科骨髓移植接受者中与星状病毒相关的腹泻的病理学(Pathology of astrovirus associateddiarrhoea in a paediatric bone marrow transplant recipient)，J Clin Pathol 57:1001-1003.
3.Bonaparte RS,Hair PS,Banthia D,Marshall DM,Cunnion KM等，(2008)人类星状病毒外壳蛋白通过经典途径的第一个组分C1抑制血清补体激活(Human astroviruscoat protein inhibits serum complement activation via C1,the first componentof the classical pathway)，J Virol 82:817-827.
4.Frank MM,Miletic VD和Jiang H，(2000)免疫球蛋白控制补体的作用(Immunoglobulin in the control of complement action)，Immunol Res 22:137-146.
5.Gronemus JQ,Hair PS,Crawford KB,Nyalwidhe JO,Cunnion KM等，(2010)补体经典途径被源自于人类星状病毒外壳蛋白的新的结合C1q的肽的强力抑制(Potentinhibition of the classical pathway of complement by a novel C1q-bindingpeptide derived from the human astrovirus coat protein)，Mol Immunol 48:305-313.
6.Sharp JA,Hair PS,Pallera HK,Kumar PS,Mauriello CT等，(2015)补体C1的肽抑制剂(PIC1)在大鼠中血管内注射后快速抑制补体激活(Peptide Inhibitor ofComplement C1(PIC1)Rapidly Inhibits Complement Activation after IntravascularInjection in Rats)，PLoS One 10:e0132446.
7.Hair PS,Sass LA,Krishna NK和Cunnion KM，(2017)囊性纤维化痰液中髓过氧化物酶活性被补体C1的肽抑制剂(PIC1)抑制(Inhibition of Myeloperoxidase Activityin Cystic Fibrosis Sputum by Peptide Inhibitor of Complement C1(PIC1))，PLoSOne 12:e0170203.
8.Hair PS,Cunnion KM和Krishna NK，(2017)补体C1的肽抑制剂抑制血红蛋白和肌红蛋白的过氧化物酶活性(Peptide Inhibitor of Complement C1 Inhibits thePeroxidase Activity of Hemoglobin and Myoglobin)，Int J Pept 2017:9454583.
9.Hair PS,Enos AI,Krishna NK和Cunnion KM，(2018)通过补体C1的肽抑制剂抑制免疫复合物补体激活和嗜中性粒细胞细胞外阱的形成(Inhibition of Immune ComplexComplement Activation and Neutrophil Extracellular Trap Formation by PeptideInhibitor of Complement C1)，Front Immunol 9:558.
10.Gregory Rivera M,Hair PS,Cunnion KM和Krishna NK，(2018)补体C1的肽抑制剂(PIC1)通过单电子传输(SET)和氢原子转移(HAT)表现出抗氧化活性(PeptideInhibitor of Complement C1(PIC1)demonstrates antioxidant activity via singleelectron transport(SET)and hydrogen atom transfer(HAT))，PLoS One 13:e0193931.
11.Hair PS,Rivera MG,Enos AI,Pearsall SE,Sharp JA等，(2017)补体C1的肽抑制剂(PIC1)抑制病原细菌生长(Peptide Inhibitor of Complement C1(PIC1)InhibitsGrowth of Pathogenic Bacteria)，International Journal of Peptide Research andTherapeutics DOI101007/s10989-017-9651-z.
12.Cunnion KM,Lee JC和Frank MM，(2001)荚膜产生和生长阶段影响补体与金黄色葡萄球菌的结合(Capsule production and growth phase influence binding ofcomplement to Staphylococcus aureus)，Infect Immun 69:6796-6803.
13.Mauriello CT,Pallera HK,Sharp JA,Woltmann JL,Jr.,Qian S等，(2013)经典和包括ABO不相容性的凝集素补体激活的新的肽抑制剂(A novel peptide inhibitorof classical and lectin complement activation including ABO incompatibility)，Mol Immunol 53:132-139.
14.Maitra D,Shaeib F,Abdulhamid I,Abdulridha RM,Saed GM等，(2013)在稳态催化期间髓过氧化物酶通过反馈抑制途径充当游离铁的来源(Myeloperoxidase actsas a source of free iron during steady-state catalysis by a feedbackinhibitory pathway)，Free Radic Biol Med 63:90-98.
15.Carlin JB和Doyle LW(2001)临床医生统计学：4：统计推理的基本概念：假设检验和t检验(Statistics for clinicians:4:Basic concepts of statisticalreasoning:hypothesis tests and the t-test)，J Paediatr Child Health 37:72-77.
16.Moretto A,Crisma M,Kaptein B,Broxterman QB和Toniolo C(2006)N(α)-酰化、完全C(α)-甲基化、线性、折叠的肽的N-甲基化：合成和构象方面(N-methylation of N(alpha)-acylated,fully C(alpha)-methylated,linear,folded peptides:syntheticand conformational aspects)，Biopolymers 84:553-565.
17.Merle NS,Church SE,Fremeaux-Bacchi V和Roumenina LT(2015)补体系统第一部分——激活和调控的分子机制(Complement System Part I-Molecular Mechanismsof Activation and Regulation)，Front Immunol 6:262.
18.Stanworth SJ,Navarrete C,Estcourt L和Marsh J.，血小板不应性——患者管理中的实用方法和持续困境(Platelet refractoriness--practical approaches andongoing dilemmas in patient management)，Br J Haematol 2015；171:297-305.
19.Slichter SJ,Davis K,Enright H,Braine H,Gernsheimer T,Kao KJ,Kickler T,Lee E,McFarland J,McCullough J,Rodey G,Schiffer CA和Woodson R，在血小板减少症患者中影响输注后血小板增多、血小板不应性和血小板输注间隔的因素(Factors affecting posttransfusion platelet increments,plateletrefractoriness,and platelet transfusion intervals in thrombocytopenicpatients)，Blood 2005；105:4106-14.
20.Jackman RP,Lee JH,Pei R,Bolgiano D,Lebedeva M,Slichter SJ和NorrisPJ，在降低对血小板的同种免疫试验的研究参与者中结合C1q的抗HLA抗体不预测血小板输注失败(C1q-binding anti-HLA antibodies do not predict platelet transfusionfailure in Trial to Reduce Alloimmunization to Platelets study participants)，Transfusion 2016；56:1442-50.
21.降低对血小板的同种免疫试验研究组(Trial to Reduce Alloimmunizationto Platelets Study Group)，淋巴细胞减少和血小板的紫外线B辐照阻止对血小板输注的同种免疫和不应性(Leukocyte reduction and ultraviolet B irradiation ofplatelets to prevent alloimmunization and refractoriness to platelettransfusions)，N Engl J Med 1997；337:1861-9.
22.Pavenski K,Freedman J和Semple JW，针对血小板输注的HLA同种免疫：病理生理学、重要性、预防和管理(HLA alloimmunization against platelet transfusions:pathophysiology,significance,prevention and management)，Tissue Antigens 2012；79:237-45.
23.Moncharmont P.，血小板组分输注和同种免疫：我们处于哪里？(Plateletcomponent transfusion and alloimmunization:Where do we stand？)，Transfus ClinBiol 2018；25:172-8.
24.Forest SK和Hod EA，血小板不应患者的管理(Management of the PlateletRefractory Patient)，Hematol Oncol Clin North Am 2016；30:665-77.
25.Liu W,Wu D,Hu T和Ye B，在血小板输注不应性中使用利妥昔单抗治疗的效率：7个病例的研究(Efficiency of treatment with rituximab in platelettransfusion refractoriness:a study of 7cases)，Int J Clin Exp Med 2015；8:14080-4.
26.Bordin JO,Bardossy L和Blajchman MA，对供体血小板的不应性的实验动物模型：血浆去除和白细胞减少程度对同种异体的同种免疫的影响(Experimental animalmodel of refractoriness to donor platelets:the effect of plasma removal andthe extent of white cell reduction on allogeneic alloimmunization)，Transfusion 1993；33:798-801.
27.Muench MO,Heitman JW,Inglis H,Fomin ME,Marschner S,Goodrich RP,Norris PJ和Jackman RP，在反复输注减病原体血小板后小鼠中同种免疫降低(Reducedalloimmunization in mice following repeated transfusion with pathogen-reducedplatelets)，Transfusion2016；56:1419-29.
28.Sharp JA,Whitley PH,Cunnion KM和Krishna NK，补体c1的肽抑制剂，经典途径激活的一种新的抑制剂：机理研究和临床潜力(Peptide inhibitor of complement c1,a novel suppressor of classical pathway activation:mechanistic studies andclinical potential)，Front Immunol 2014；5:406.
29.Kumar PS,Pallera HK,Hair PS,Rivera MG,Shah TA,Werner AL,LattanzioFA,Cunnion KM和Krishna NK，在大鼠中补体C1的肽抑制剂调节错配红细胞的急性血管内溶血(Peptide inhibitor of complement C1 modulates acute intravascularhemolysis of mismatched red blood cells in rats)，Transfusion 2016；56:2133-45.
30.Kumar PS,Mauriello CT,Hair PS,Rister NS,Lawrence C,Raafat RH和Cunnion KM，基于葡萄糖的透析液抑制针对金黄色葡萄球菌的先天性防御(Glucose-baseddialysis fluids inhibit innate defense against Staphylococcus aureus)，MolImmunol 2015；67:575-83.
31.Shah TA,Mauriello CT,Hair PS,Sharp JA,Kumar PS,Lattanzio FA,WernerAL,Whitley PH和Maes LA,Cunnion KM,Krishna NK，在急性血管内溶血的大鼠模型中补体抑制显著减少红细胞裂解(Complement inhibition significantly decreases redblood cell lysis in a rat model of acute intravascular hemolysis)，Transfusion2014；54:2892-900.
32.Rand ML,Wang H,Mody M,Chu I,Treutiger I,Nguyen A,Packham MA和Freedman J，用两种PKH亲脂性染料或两种浓度的生物素标记的兔血小板的两个群体的存活率的同时测量(Concurrent measurement of the survival of two populations ofrabbit platelets labeled with either two PKH lipophilic dyes or twoconcentrations of biotin)，Cytometry 2002；47:111-7.
33.Pirenne F和Yazdanbakhsh K，我如何安全地为镰状细胞病患者输血并管理迟发性溶血性输血反应(How I safely transfuse patients with sickle-cell diseaseand manage delayed hemolytic transfusion reactions.Blood)，Blood.2018；131(25):2773-2781.
34.Silvergleid AJ，溶血性输注反应(Hemolytic transfusion reactions)，最新，公开于2018年12月31日.
35.Zimring JC和Spitalnik SL，输注反应的病理生物学(Pathobiology oftransfusion reactions)，Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2015；10:83–110.
本文中引用的包括出版物、专利申请和专利在内的所有参考文献通过参考并入本文，其程度等同于每个参考文献被单独且具体地指明通过参考并入并整体阐述在本文中。
序列表
<110> 东弗吉尼亚医学院（EASTERN VIRGINIA MEDICAL SCHOOL）
<120> 用于治疗药物诱导的免疫溶血性贫血的PIC1肽组合物及其使用方法
<130> 251110.000076
<150> 62/806432
<151> 2019-02-15
<150> 62/949181
<151> 2019-12-17
<160> 45
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 1
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 肌氨酸
<400> 2
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<212> PRT
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<221> MOD_RES
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<223> 肌氨酸
<400> 3
Ile Xaa Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<223> 肌氨酸
<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<223> 肌氨酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列的描述：合成肽
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<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<400> 8
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 肌氨酸
<400> 9
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Xaa Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 10
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 肌氨酸
<400> 11
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Xaa Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 肌氨酸
<400> 12
Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Xaa Glu Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 肌氨酸
<400> 13
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Xaa Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 肌氨酸
<400> 14
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 肌氨酸
<400> 15
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Xaa Ala
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 肌氨酸
<400> 16
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Xaa
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> N-端dPEG24
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG24
<400> 17
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> N-端dPEG24
<400> 18
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG24
<400> 19
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG20
<400> 20
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG16
<400> 21
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG12
<400> 22
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG08
<400> 23
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG06
<400> 24
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG04
<400> 25
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG03
<400> 26
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG02
<400> 27
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 28
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Ala Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 29
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 30
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Xaa Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG24
<400> 31
Ile Ala Leu Ile Leu Xaa Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG24
<400> 32
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Xaa Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG24
<400> 33
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG24
<400> 34
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Xaa Ala
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> 肌氨酸
<400> 35
Ile Ala Leu Ile Leu Xaa Xaa Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 36
Ile Ala Leu Ile Leu Xaa Pro Ile Xaa Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 肌氨酸
<400> 37
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Cys Cys Xaa Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 肌氨酸
<400> 38
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Cys Xaa Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 肌氨酸
<400> 39
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Cys Cys Gln Glu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 肌氨酸
<400> 40
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Cys Gln Glu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 肌氨酸
<400> 41
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Cys Cys Gln Glu Arg Xaa Ala
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 肌氨酸
<400> 42
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Cys Gln Glu Arg Xaa Ala
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C-端dPEG24
<400> 43
Ile Ala Leu Ile Leu Ala Pro Ile Cys Cys Gln Ala Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 44
Ile Ala Leu Ile Leu Ala Pro Ile Xaa Cys Gln Ala Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<400> 45
Ile Ala Leu Ile Leu Ala Xaa Ile Cys Cys Gln Ala Arg Ala Ala
1 5 10 15

Claims (45)

1.一种在对象中抑制对输注的血小板的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：
a)向需要的对象给药经典补体途径抑制剂；和
b)向所述对象输注血小板。
2.一种在同种免疫对象中抑制对血小板的不应性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)用经典补体途径抑制剂处理血小板；和
b)将处理过的血小板输注到所述对象。
3.一种在接受来自于抗原不匹配供体的血小板的对象中预防血小板不应性的方法，所述方法包括向所述对象给药经典补体途径抑制剂，然后再将所述血小板输注到所述对象。
4.一种在接受来自于抗原不匹配供体的血小板的对象中预防血小板不应性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)用经典补体途径抑制剂处理血小板；和
b)将处理过的血小板输注到所述对象。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中所述方法有效地提高所述输注的血小板在所述对象中的存活率。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中所述方法有效地在所述对象中降低补体介导的对所述输注的血小板的攻击。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中所述方法有效地提高所述输注的血小板在所述对象中的存活率。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中所述对象是人类。
9.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中所述补体介导的抑制剂是PIC1肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述PIC1肽包含与SEQ ID NO：1-45中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述PIC1肽包含与SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
20.一种用于输注到接受者中的血液制品，其中所述血液制品包含血小板和经典补体途径抑制剂。
21.根据权利要求20所述的血液制品，其中所述补体介导的抑制剂是PIC1肽。
22.根据权利要求21所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含与SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求22所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者的氨基酸序列。
24.根据权利要求23所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
25.根据权利要求23所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
26.根据权利要求23所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
27.根据权利要求23所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
28.根据权利要求23所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
29.根据权利要求23所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
30.根据权利要求23所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
31.根据权利要求23所述的血液制品，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
32.一种在对象中治疗迟发性溶血性输血反应(DHTR)的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的经典补体途径抑制剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述经典补体途径抑制剂是肠胃外给药的。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述对象是人类。
35.根据权利要求32至34中的任一项所述的方法，其中所述补体介导的抑制剂是PIC1肽。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述PIC1肽包含与SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3、4、5、6、9、10、19和29中的任一者的氨基酸序列。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
42.根据权利要求37所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
43.根据权利要求37所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
44.根据权利要求37所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
45.根据权利要求37所述的方法，其中所述PIC1肽包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
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