CN113461820A - 抗cd3人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的抗CD3人源化抗体。所述抗CD3人源化抗体可以特异的结合人和猴CD3蛋白，构建的双特异抗体有更高的肿瘤杀伤活性。

Description

抗CD3人源化抗体
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种抗CD3人源化抗体。
背景技术
T细胞的活化对刺激免疫应答至关重要。T细胞表现出免疫特异性并指导大部分细胞免疫应答。尽管T细胞不分泌抗体，但它们是B淋巴细胞分泌抗体所必需的。
CD3是与T细胞受体复合物(TCR)缔合的在T细胞上表达的同型二聚体或异二聚体抗原，并且为T细胞活化所必需的。功能性CD3是由四种不同链(ε、ζ、δ和γ)中的两种形成的二聚体。CD3二聚体排列包括γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。已证实CD3的抗体在T细胞上聚集CD3，从而以类似于由肽负荷的MHC分子参与TCR的方式引起T细胞活化。因此，抗CD3抗体具有涉及T细胞活化作用的治疗目的。此外，能与CD3和靶抗原结合的双特异性抗体己被提出作为涉及将T细胞免疫反应靶向表达靶抗原细胞的组织和细胞的治疗用途。
当前正处于癌症治疗临床试验阶段的现有结合CD3的双特异性抗体因其半衰期短和/或功效不定而受限制。尽管已进行许多尝试来获得具有特别有利性质的抗CD3抗体，但迄今为止这些尝试已取得的成功是有限的。
因此，本领域中仍然急需开发一种新型抗CD3人源化抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型抗CD3人源化抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种抗CD3人源化抗体，所述抗体包含：
(1) 重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO. 2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO. 3所示的VH-CDR3；和
(2) 轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 4所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO. 5所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO. 6所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体包含重链和轻链，其中所述的抗体的重链包括所述的三个重链CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区，和所述的抗体的轻链包括所述的三个轻链CDR以及用于连接轻链CDR的轻链框架区。
在另一优选例中，所述重链可变区序列如SEQ ID NO. 7所示。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。
在另一优选例中，所述轻链可变区序列如SEQ ID NO. 8所示的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。
在另一优选例中，所述的抗体为人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体与人CD3ε多肽结合的Kd≤250nM，较佳地，≤100nM；较佳地；≤15nM；较佳地，≤10nM；更佳地，≤5nM。
在另一优选例中，所述的抗体特异性结合CD3。
在另一优选例中，所述的CD3来自人或食蟹猴。
在另一优选例中，所述的CD3为CD3ε、CD3ζ、CD3δ或CD3γ；较佳地，所述的CD3为CD3ε或CD3γ。
在另一优选例中，所述的抗体特异性结合人CD3ε或食蟹猴CD3ε；或所述的抗体特异性结合人CD3γ或食蟹猴CD3γ。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体（scFv）。
在另一优选例中，所述的抗体为单链抗体，其中所述单链抗体包括
(1) 重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO. 2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO. 3所示的VH-CDR3；和
(2) 轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 4所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO. 5所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO. 6所示的VL-CDR3。
在另一优选例中，所述的单链抗体依次包括轻链可变区、接头和重链可变区，或依次包括重链可变区、接头和轻链可变区。
在另一优选例中，所述的接头为(G4S)n，其中n为1-5的整数，优选接头为（G4S）3。
在另一优选例中，所述的抗体的重链可变区含有SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列；和所述的抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO. 8所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括单特异性、双特异性、或三特异性抗体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体，包括：
(1)如本发明的第一方面中所述的抗CD3抗体或其抗原结合片段；
(2)结合其他靶点的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述其他靶点选自下组：BCMA、EGFR、CD38、CD123、CD19、CD20、CD22、B7-H3、GPC3、HER2、PMSA、CD28、4-1BB、OX40、CD40、CD27、CD47、CTLA4、PD1、PDL1。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含：
第一抗原结合结构域（D1）；和
第二抗原结合结构域（D2）；
其中，D1特异性结合靶分子CD3蛋白；
D2特异性结合靶分子CD19蛋白；
其中，所述D1为特异性结合CD3蛋白的抗体或其抗原结合片段；
所述D2为特异性结合CD19蛋白的抗体或其抗原结合片段；
其中，所述D1包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO. 2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO. 3所示的VH-CDR3；和
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 4所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO. 5所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO. 6所示的VL-CDR3；
其中，所述抗原结合片段的结构选自下组：(i)Fab 片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd 片段；(iv) Fv 片段；(v) scFv分子；或(vi) dAb 片段。
在另一优选例中，所述D1和/或所述D2为单链抗体(scFv)。
在另一优选例中，所述D1和所述D2通过接头相连，优选地，所述接头为柔性接头。
在另一优选例中，所述接头为(GGGGS)n，其中n为1-5的整数，较佳地连接肽为GGGGS。
在另一优选例中，所述D1为抗CD3单链抗体，和D2为抗CD19单链抗体。
在另一优选例中，所述的双特异性抗体的序列如SEQ ID NO. 9所示。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i) 如本发明的第一方面所述的抗体；以及
(ii) 任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单特异性、双特异性、或三特异性重组蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白还包括与所述元件(i)融合在一起的额外的融合元件(或融合多肽片段)。
在另一优选例中，所述重组蛋白包括：
(i)抗体的重链可变区含有SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列；和所述的抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO. 8所示的氨基酸序列，
以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第三方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv区段为特异性结合于CD3的结合区，并且所述scFv区段具有重链可变区和轻链可变区，其中，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO. 2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO. 3所示的VH-CDR3；和
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 4所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO. 5所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO. 6所示的VL-CDR3。
在本发明的第四方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明的第三方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
(a) 抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体、或如本发明的第二方面所述的重组蛋白、或其组合；和
(b) 与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第六方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体、或本发明的第二方面所述的重组蛋白、如本发明的第三方面所述的CAR构建物、如本发明的第四方面所述的免疫细胞、如本发明的第五方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于：
(a)制备检测试剂或试剂盒；
(b)制备预防和/或治疗CD3相关疾病的药物或制剂；和/或
(c)制备预防和/或治疗CD3相关癌症或肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自下组：肺癌、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、肝癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病。
在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i) 活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体、或本发明的第二方面所述的重组蛋白、如本发明的第三方面所述的CAR构建物、如本发明的第四方面所述的免疫细胞、如本发明的第五方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii) 药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：肺癌、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、肝癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病。
在本发明的第八方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1) 如本发明的第一方面所述的抗体；
(2) 如本发明的第二方面所述的重组蛋白；或
(3) 如本发明的第三方面所述的CAR构建物。
在本发明的第九方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明的第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第十方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明的第九方面所述的载体或基因组中整合有如本发明的第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞、或原核细胞。
在另一优选例中，所述的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在另一优选例中，所述的原核细胞为大肠杆菌。
在本发明的第十一方面，提供了一种体外非诊断的检测样品中CD3蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1) 在体外，将所述样品与如本发明的第一方面所述的抗体接触；
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD3蛋白。
在本发明的第十二方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第一方面所述的抗体或如本发明的第五方面所述的抗体药物偶联物。
在本发明的第十三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1) 第一容器，所述第一容器中含有如本发明的第一方面所述的抗体；和/或
(2) 第二容器，所述第二容器中含有针对如本发明的第一方面所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如本发明的第十二方面所述的检测板。
在本发明的第十四方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a) 在适合表达的条件下，培养如本发明的第十方面所述的宿主细胞；
(b) 从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第一方面所述的抗体或如本发明的第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十五方面，提供了一种治疗与CD3分子相关的病症的方法，包括步骤：给需要抑制或需要治疗的对象施用如本发明的第一方面所述的抗体或如本发明的第二方面所述的重组蛋白或如本发明的第七方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的与CD3分子相关的疾病包括肿瘤或拮抗器官移植免疫排斥反应。
在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了ELISA测定的CD3抗体与重组人CD3亲和图。
图2显示了ELISA测定的CD3抗体与重组猴CD3亲和图。
图3显示了fortebio检测CD3全长抗体CQ54与人CD3E蛋白亲和图。
图4显示了ELISA检测CD3抗体与猴CD3E蛋白亲和图。
图5显示了CD3抗体与Jurkat细胞亲和图。
图6显示了CD3抗体诱导CD69表达变化图，其中NC为阴性对照。
图7显示了CD3抗体诱导PBMC活化分泌IFNγ图，其中NC为阴性对照。
图8显示了CQ54和OKT3的竞争ELISA检测图。
图9显示了fortebio检测双特异抗体与人CD3E（A）和CD19（B）蛋白亲和图。
图10显示了ELISA检测双特异抗体（SC30A和BLMOA）与猴CD3E蛋白亲和图。
图11显示了CD3抗体诱导CD69表达变化图，其中NC为阴性对照。
图12显示了流式检测双特异抗体（SC30A和BLMOA）对肿瘤细胞的杀伤效率图。
图13显示了荧光扫孔显示的Raji-GFP的残留图。
图14显示了双特异抗体介导的PBMC肿瘤细胞直接杀伤效率图。
图15显示了PBMC增殖实验图。
图16显示了报告基因检测SC30A信号对靶细胞的依赖，RLU为相对光单位。
图17显示了报告基因检测SC30A的活性图，RLU为相对光单位。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，意外地获得了高生物活性的CD3抗体。实验表明，本发明的CD3抗体能够与人和猴CD3特异性地结合。此外，本发明还提供了能与CD3和靶抗原CD19结合的双特异性抗体，具有更高的肿瘤杀伤活性，进而实现将T细胞免疫反应靶向表达靶抗原细胞的组织和细胞的治疗用途。此外，本发明的双特异性抗体的活化依赖于靶细胞，具有安全性。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括CD3抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种CD3抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
抗体
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR),指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区，即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v) scFv分子；(vi) dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，独立的互补性决定区(CDR)如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。如本文所用，表述“抗原结合片段”内部也涵盖其他工程化分子，如结构域特异性抗体，单结构域抗体，结构域缺失抗体，嵌合抗体，CDR移植抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、微型抗体、纳米体(例如单价纳米体、双价纳米体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR域。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。
如本文所用，术语“人源化抗体”，是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表 A
Figure 135433DEST_PATH_IMAGE001
抗CD3抗体
如本文所用，术语“CD3”一般是指天然的或重组的人CD3，以及人CD3的非人同源物。CD3是与T细胞受体复合物(TCR)缔合的在T细胞上表达的同型二聚体或异二聚体抗原，并且为T细胞活化所必需的。功能性CD3是由四种不同链(ε、ζ、δ和γ)中的两种形成的二聚体。CD3二聚体排列包括γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。因此，除非明确地指出是来自非人类物种，例如“小鼠CD3”、“猴CD3”等，否则“CD3”一词指人类CD3。
如本文所用，“CD3E”指CD3ε胞外区(Extracellular domain)。
本发明提供一种针对CD3的高特异性的单链抗体（scFv），其包括重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和连接的接头。
本发明还提供一种针对CD3的高特异性的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO. 2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO. 3所示的VH-CDR3；和
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 4所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO. 5所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO. 6所示的VL-CDR3。
优选地，所述的重链可变区的序列包括如SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列；
所述的轻链可变区的序列包括如SEQ ID NO. 8所示的氨基酸序列。
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有CD3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80%，较佳地至少85%，更佳地至少为90%，最佳地至少95%的氨基酸序列。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
如本文所用，术语“scFv”为单链抗体（single chain antibody fragment，scFv），由抗体重链可变区和轻链可变区通常通过15～25个氨基酸的接头（linker）连接而成。
如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。在本发明中，优选的接头是指接头连接单链抗体(scFv)的VH和VL，或用于将scFv与另一抗体的重链进行连接。
合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。例如，(G4S)n，其中n为1-5的整数。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向人CD3的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.3中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD3结合亲和力的序列，位于重链可变区(VH)的CDR区。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.6中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD3结合亲和力的序列，位于轻链可变区(VL)的CDR区。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40%，更优选为不超过35%，更优选为1-33%，更优选为5-30%，更优选为10-25%，更优选为15-20%。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
如本文所用，术语“双特异性抗体（或双抗）”是指能同时特异性结合两种抗原（靶点）或两种表位的抗体分子。根据对称性，双特异性抗体可以分为结构对称的和不对称的分子。根据结合位点的多少，双特异性抗体可以分为二价、三价、四价和多价分子。
本发明的抗体可以是单特异性，双特异性，三特异性或多特异性。例如，本发明的抗体可以与结合其他靶点的抗体或活性片段共同形成双特异性抗体。所述结合其他靶点的抗体可以是靶向CD19、CD47、CD73、CD47、CTLA4、PD-1、PD-L1、CD28的抗体或其活性片段。
在本发明的一个具体实施例中，本发明中的抗CD3抗体与结合CD19的抗体形成双特异性抗体，其中构建靶向CD3和CD19的双特异抗体命名为SC30A，序列如SEQ ID NO. 9所示。
抗体的制备
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗CD3抗体。例如，可以用连接或天然存在的CD3同源二聚体或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
任何合适形式的CD3都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对CD3特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人CD3，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质料和非病毒载体。
生产本发明的抗人CD3抗体的示例性方法描述于实施例1。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。
同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。
人源化本发明的抗人CD3抗体的示例性方法描述于实施例2。
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293细胞。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
应用
本发明提供了本发明抗体的用途，例如用于制备诊断制剂、或制备用于预防和/或治疗IL-36相关疾病的药物。所述IL-36相关疾病包括炎症疾病、自身免疫疾病等，包括但不限于银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症，炎性肠病(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎等)、骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、风湿性关节炎或骨质疏松症、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和硬化)、哮喘(包括变应性哮喘)、变态反应以及癌症。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明的药物组合物可直接用于结合CD3蛋白分子，因而可用于预防和治疗IL-36相关疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点包括
（1）本发明的CD3抗体特异性结合CD3，具有高生物活性；
（2）本发明的CD3抗体与抗CD19抗体形成的双特异抗体的活化依赖于靶细胞，安全性高；
（3）本发明的CD3抗体与抗CD19抗体形成的双特异抗体具有优异的肿瘤杀伤活性。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1 人源化CD3单克隆抗体的产生
通过重组人CD3E蛋白（C00E，Novoprotein）免疫Balb/C小鼠，免疫完成后，取B细胞构建噬菌体展示库，经过筛选获得候选抗体，利用结构模拟与理性设计，获得一系列人源化抗体。将人源化序列的VH和VL通过（G4S）3 接头连接，C末端添加6HIS标签，构建成单链抗体形式（scFv），通过大肠杆菌表达，镍柱纯化获得单链抗体蛋白。获得的人源化抗体重链可变区（VH）、轻链可变区（VL）序列以及CDR如获得的人源化抗体重链可变区（VH）序列如下：
人源化CD3抗体的VH-CDR1 (SEQ ID NO.1)
GFTFNKYA
人源化CD3抗体的VH-CDR2 (SEQ ID NO. 2)
IRSKYNNYAT
人源化CD3抗体的VH-CDR3 (SEQ ID NO. 3)
HGNLQNSYISYWAY
人源化CD3抗体的VL-CDR1 (SEQ ID NO. 4)
TGPVTGGNY
人源化CD3抗体的VL-CDR2 (SEQ ID NO. 5)
GTK
人源化CD3抗体的VL-CDR3 (SEQ ID NO. 6)
VLWESNRW
人源化CD3抗体的重链可变区，huVH5 (SEQ ID NO. 7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNLQNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
人源化CD3抗体的轻链可变区，huVL5 (SEQ ID NO.8)
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGPVTGGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWESNRWVFGGGTKLTVL
实施例2 CD3抗体的亲和力检测
本实施例主要描述单链抗体形式的CD3抗体与人和猴重组CD3E蛋白的亲和检测情况。
与人CD3蛋白亲和
采用ELISA测定CD3抗体与重组hCD3蛋白（CP19，Novoprotein）的亲和，将重组hCD3包板，CD3抗体做10倍梯度（从20μg/ml开始）稀释，见图1。
计算得EC50为0.3642μg/ml。
与猴CD3蛋白亲和
采用ELISA测定CD3抗体与重组猴CD3蛋白（CW07，Novoprotein）的亲和，将重组猴CD3包板，CD3抗体做10倍梯度（从20μg/ml开始）稀释，见图2。
计算得EC50为0.9381μg/ml。
实施例3 huVH5VL5的双特异抗体及全长抗体构建
CD3抗体目前的主要应用在双特异抗体和激活性抗体上，因此，利用人源化CD3抗体的重链可变区和轻链可变区的序列（huVH5以及huVL5），使用柔性接头（GGGGS）与CD19抗体的scFv连接，构建靶向CD3和CD19的双特异抗体，命名为SC30A。其中，CD19来源于Amgen的上市双特异抗体类药物blinatumomab，同时构建blinatumomab（命名为BLMOA）作为对照抗体。构建CD3的全长抗体CQ54，恒定区选择hIgG1；选择上市药OKT3（CD3抗体）的可变区和hIgG1融合，作为对照抗体。
和CD19的双特异抗体SC30A (SEQ ID NO.9)
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGL EWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNLQNSYISYWAYWGQGTLVT VSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGPVTGGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPG TPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWESNRWVFGGGTKLTVL
BLMOA (SEQ ID NO.10)
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
CD3全长抗体CQ54的重链 (SEQ ID NO.11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNLQNSYISYWAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CD3全长抗体CQ54的轻链 (SEQ ID NO.12)
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OKT3抗体的重链 (SEQ ID NO.13)
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OKT3抗体的轻链 (SEQ ID NO.14)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRADTAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
实施例4 全长抗体亲和力检测
本实施例涉及全长抗体与人猴蛋白的结合，以及与人CD3+细胞系Jurkat的亲和情况。
检测CD3抗体与人CD3E蛋白亲和
采用fortebio的方法，选择protein A传感器，固化CD3抗体，将CD3E做梯度稀释，检测亲和力如图3所示。
计算的亲和力如下表1：
表1. CD3全长抗体与人CD3E蛋白的亲和力检测
Figure 786995DEST_PATH_IMAGE002
计算得亲和力为0.97×10-9M。
用ELISA检测CQ54与猴子CD3E的结合：
结果如图4所示。CQ54检测得EC50=0.375μg/ml。
检测结果显示，CQ54可以与猴子CD3E结合，而OKT3不能结合。
与人CD3阳性细胞结合：
取4×105个细胞Jurkat，加入梯度稀释的CD3抗体，孵育1h后，用PBS清洗3次，加入Anti-hFC-APC（购自Jackson immunology），流式上机检测。结果绘制S曲线见图5。
计算EC50，得CQ54为0.023μg/ml，OKT3为0.01μg/ml。两者与细胞的亲和相差不大。
实施例5 全长抗体诱导PBMC活化
本实施例涉及CD3抗体在活化PBMC培养时，早期T细胞活化标志CD69表达和IFNγ分泌上的变化。具体的，用淋巴细胞分离液分离志愿者PBMC，按照1×106/ml密度接种至96孔板，添加10ng/ml的CD3抗体，培养过夜，流式检测CD69+ T细胞比例。结果见下图6所示。
结果显示，OKT3和CQ54均能活化T细胞，且CD69阳性率上，CQ54激活后阳性率达到65.8%，OKT3达到62.5%，两个抗体在T细胞早期活化上差异不大。
PBMC分离后，加入10ng/ml的CD3抗体，培养24h和48h取样，用IFNγ ELISA Kit检测IFNγ的表达，结果见图7所示。
结果表明，CQ54和OKT3在诱导IFNγ的分泌上，效果相差不大。
实施例6 CQ54的表位初测
鉴于CQ54与OKT3在功能上相差不大，本实施例主要是检测两株抗体结合在CD3E的表位上是否一致。具体的，将CQ54包板，加入一定量的HIS标签的CD3E（C578 Novoprotein）蛋白，参考ELISA检测的EC90值，在加入梯度稀释的OKT3抗体，加入Anti-HIS二抗（购自Biolegend）检测，结果如图8所示。
结果表明，CQ54和OKT3之间并没有竞争关系，两个抗体的表位不一致。
实施例7 双特异抗体的亲和力检测
本实施例涉及双特异抗体与人两个靶点蛋白的结合，与猴CD3蛋白的结合。
采用fortebio的方法，选择protein A传感器，分别固化FC标签的重组人CD3E（CP19 Novoprotein）和人CD19（C572 Novoprotein），将双特异抗体SC30A做梯度稀释，检测亲和力图如图9(A和B)所示。
计算的亲和力如下表2：
表2. 双特异抗体的亲和力检测结果
Figure 534108DEST_PATH_IMAGE003
结果说明，双特异抗体SC30A针对两个靶点均有亲和。
用ELISA检测双特异抗体(SC30A和BLMOA)与猴子CD3E的结合，结果如图10所示。
检测结果显示，SC30A可以与猴子CD3E结合，检测得EC50=1.243μg/ml；而参考分子BLMOA不能结合。
实施例8 双特异抗体诱导PBMC早期活化
本实施例涉及CD3双特异抗体在活化PBMC培养时，早期T细胞活化标志CD69表达变化。具体的，用淋巴细胞分离液分离志愿者PBMC，按照1×106/ml密度接种至96孔板，添加10ng/ml的CD3抗体，培养过夜，流式检测CD69+ T细胞比例。结果见图11所示。
结果显示，SC30A和BLMOA均能活化T细胞，且CD69阳性率上，SC30A激活后阳性率达到20.7%，BLMOA达到21.9%，两个抗体在T细胞早期活化上差异不大。
实施例9 双特异抗体介导的肿瘤细胞杀伤
本实施例涉及在T细胞活化与非活化状态时，双特异抗体介导的T细胞杀伤CD19+肿瘤细胞Raji的情况。具体的，取志愿者全血，利用淋巴细胞分离液分离PBMC，加入10ng/ml的OKT3和100ng/ml的IL-2培养细胞，每3天进行细胞计数，培养到第十天，检测细胞表型，确定CD3+细胞比例大于90%，按照效靶比2：1加入活化的PBMC和Raji-GFP细胞，同时加入梯度稀释的双特异抗体，浓度分别为50ng/ml、5ng/ml和500pg/ml。杀伤过夜，采用流式和荧光扫描的方式，检测杀伤效果。
流式检测
结果如图12和表3所示，在50ng/ml的实验中，三个志愿者实验结果中，BLMOA和SC30A差异不大；但是在500pg/ml的实验中，BLMOA介导的杀伤最终剩余的Raji-GFP的比例分别是6.9%，19.9%，2.8%，而在SC30A组中，Raji-GFP的剩余分别是0.3%，2.0%和0.0%；5ng/ml的实验中，BLMOA介导的杀伤最终剩余的Raji-GFP的比例分别是1.6%，6.8%，0.6%，在SC30A组中，Raji-GFP的剩余分别是0.3%，1.4%和0.0%。
表3. 流式检测结果
Figure 663738DEST_PATH_IMAGE004
综上，说明SC30A在介导的活化的PBMC杀伤肿瘤细胞上，比BLMOA更有优势。
荧光扫描检测
用荧光扫描的全孔，观察Raji-GFP的残留。
结果如图13所示，图中的亮白斑为绿色荧光，可以明显的看出500pg/ml的BLMOA处理下，还残余较多的Raji-GFP的亮白斑，而500pg/ml的SC30A的处理下，几乎观察不到Raji-GFP的亮白斑。因此，SC30A介导的杀伤能力更优于BLMOA。
将分离的PBMC在未经活化时，直接按照效靶比5：1与Raji-GFP混合，加入梯度稀释的同时加入梯度稀释的双特异抗体SC30A，浓度分别为50ng/ml、5ng/ml和500pg/ml。杀伤48h，杀伤效率图如图14所示。
实施例10 B细胞对双特异抗体介导的PBMC活化的影响
本实施例涉及研究双特异抗体的安全性，在靶细胞存在和不存在两种状态下，观察双特异抗体对T细胞活化情况。具体的，分离PBMC，使用包有CD19抗体的磁珠，将PBMC中的CD19+B细胞分离去除，制造B cell-PBMC组，同时在此基础上，加入5%的Raji细胞作为回补，制造B cell-PBMC Raji组，与正常不做任何处理的PBMC组均加入SC30A培养，培养5天后进行细胞计数，检测细胞增殖情况。结果如图15所述。
上述结果显示，SC30A对PBMC的活化依赖于靶细胞。
实施例11 双特异抗体介导的胞内信号依赖于靶细胞
本实施例涉及双特异抗体诱导T细胞中NFAT转录因子下游信号变化情况，以及该信号是否也依赖于CD19+细胞。具体的，构建了一株Jurkat-NFAT-Luc报告基因细胞（XCC20Novoprotein），在该细胞中加入40ng/ml的SC30A，一组加入靶细胞Raji，一组不加靶细胞，反应4h后，裂解细胞检测荧光素酶活性。检测结果如图16所示。
从实验结果可以看出，加入Raji细胞信号明显强于不加Raji的，SC30A的活化信号依赖于靶细胞。
在含有靶细胞的情况下，检测SC30A的活性，结果如图17所示。
通过报告基因法，检测SC30A的活性，计算EC50为1.359ng/ml。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司
<120> 抗CD3人源化抗体
<130> P2021-1971
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 13
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 14
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210

Claims (14)

1.一种抗CD3人源化抗体，其特征在于，所述抗体包含：
(1) 重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO. 2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO. 3所示的VH-CDR3；和
(2) 轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 4所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO. 5所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO. 6所示的VL-CDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包含重链和轻链，其中所述的抗体的重链包括所述的三个互补决定区CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区，和所述的抗体的轻链包括所述的三个互补决定区CDR以及用于连接轻链CDR的轻链框架区。
3.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含：
第一抗原结合结构域D1；和
第二抗原结合结构域D2；
其中，D1特异性结合靶分子CD3蛋白；
D2特异性结合靶分子CD19蛋白；
其中，所述D1为特异性结合CD3蛋白的抗体或其抗原结合片段；所述D2为特异性结合CD19蛋白的抗体或其抗原结合片段；
其中，所述D1包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO. 2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO. 3所示的VH-CDR3；和
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 4所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO. 5所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO. 6所示的VL-CDR3；
其中，所述抗原结合片段的结构选自下组：(i)Fab 片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd 片段；(iv) Fv 片段；(v) scFv分子；或(vi) dAb 片段。
4.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体的序列如SEQID NO. 9所示。
5.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i) 如权利要求1所述的抗体，或如权利要求3所述的双特异性抗体；以及
(ii) 任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
6.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv区段为特异性结合于CD3的结合区，并且所述scFv区段具有重链可变区和轻链可变区，其中，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 1所示的VH-CDR1，
SEQ ID NO. 2所示的VH-CDR2，和
SEQ ID NO. 3所示的VH-CDR3；和
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO. 4所示的VL-CDR1，
SEQ ID NO. 5所示的VL-CDR2，和
SEQ ID NO. 6所示的VL-CDR3。
7.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求6所述的CAR构建物。
8.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a) 抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求3所述的双特异性抗体、或权利要求5所述的重组蛋白、或其组合；和
(b) 与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
9.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求3所述的双特异性抗体、或权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求6所述的CAR构建物、如权利要求7所述的免疫细胞、如权利要求8所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于：
(a)制备检测试剂或试剂盒；
(b)制备预防和/或治疗CD3相关疾病的药物或制剂；和/或
(c)制备预防和/或治疗CD3相关癌症或肿瘤的药物或制剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(i) 活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求3所述的双特异性抗体、或权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求6所述的CAR构建物、如权利要求7所述的免疫细胞、如权利要求8所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii) 药学上可接受的载体。
11.一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1) 如权利要求1所述的抗体；
(2) 如权利要求3所述的双特异性抗体；
(3) 如权利要求5所述的重组蛋白；或
(4) 如权利要求6所述的CAR构建物。
12.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求12所述的载体或基因组中整合有如权利要求11所述的多核苷酸。
14.一种体外非诊断的检测样品中CD3蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1) 在体外，将所述样品与如权利要求1所述的抗体接触；
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD3蛋白。
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