CN113456626B - 一种黄嘌呤氧化酶抑制剂及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种黄嘌呤氧化酶抑制剂及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂及其提取方法和应用，属于医药技术领域。本发明提供的黄嘌呤氧化酶抑制剂，包括泽兰色原烯、枯醇和1,5,8‑对薄荷三烯中的至少两种。本发明提供的XO抑制剂能够与XO的活性中心形成Pi‑烷基以及Pi‑Pi共轭双键，泽兰色原烯和枯醇能够与XO的活性中心形成范德华力，在上述分子间作用力存在的情况下，XO抑制剂被插入XO的疏水间隙中以占据其催化活性中心，从而阻碍了底物的进入并导致其失去原有的功能，具有抑制尿酸产生的作用，说明，泽兰色原烯、枯醇和1,5,8‑对薄荷三烯具有抑制XO的功能。为从天然产物中筛选XO抑制剂制备治疗XO介导的疾病的药物提供了新思路。

Description

一种黄嘌呤氧化酶抑制剂及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种黄嘌呤氧化酶抑制剂及其筛选方法和应用。
背景技术
痛风是一种嘌呤代谢紊乱或尿酸体内生成过多，而体外排泄减少引起的代谢性疾病。临床表现为高尿酸血症、痛风性关节炎、尿酸结石、痛风结石形成等。高尿酸血症是痛风疾病发展过程中的一个阶段；痛风性关节炎是血清尿酸水平增高后，尿酸沉积于关节组织引发的一系列炎症反应。
痛风的主要起因是：当体内尿酸生成增加或排泄减少时，可导致尿酸水平增加，当超过其溶解限度时，尿酸会沉积在关节和软组织，引起炎症反应。尿酸是人体嘌呤代谢的最终产物，黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase from buttermilk，XO)作为嘌呤代谢过程中的关键酶，先将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，再进一步氧化为尿酸。XO抑制剂一般与钼铁中心的催化活性位点结合，可逆或不可逆地抑制XO活性，防止底物发生羟化反应，减少尿酸生成，降低血清中尿酸的浓度，达到治疗高尿酸的效果。
葵花盘提取物具有降尿酸、抗痛风作用。然而，葵花盘提取物的化学成分复杂，目前还没有关于葵花盘提取物中化学成分为降尿酸、抗痛风的活性物质的研究。因此从葵花盘提取物中寻找疗效好、毒性小的降尿酸、抗痛风天然活性物质，是目前科研工作者亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黄嘌呤氧化酶抑制剂及其筛选方法和应用，本发明提供的黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制活性高且毒副作用小。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，包括泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯中的至少一种。
本发明提供了上述技术方案所述黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
将葵花盘挥发油进行气相色谱-质谱分析鉴定，得到葵花盘挥发油的化学成分；
利用AutoDockVina软件将所述化学成分的三维结构分别与黄嘌呤氧化酶的三维结构中的钼铁活性中心进行分子对接，计算对接能量，得到黄嘌呤氧化酶抑制剂；所述黄嘌呤氧化酶抑制剂的对接能量为-6.6～-6.9Kcal/mol。
优选的，所述气相色谱-质谱分析鉴定的条件包括：色谱柱为HP-INNOWax毛细管柱；载气为氦气；进样器的温度为250～260℃；检测器的温度为280～300℃；烘箱在60～70℃下保持3～5min，然后以5～6℃/min的速度升至240～260℃后保温10～15min；电子离子模式为70～85eV；质谱记录范围为50～550amu；离子源温度为230～240℃。
本发明还提供了上述技术方案所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂或上述技术方案所述筛选方法得到的黄嘌呤氧化酶抑制剂在制备治疗黄嘌呤氧化酶介导的疾病的药物中的应用。
优选的，所述制备黄嘌呤氧化酶介导的疾病包括高尿酸血症、痛风、2-型糖尿病和肿瘤中的一种或几种。
本发明提供了一种黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂，包括泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯中的至少两种。本发明提供的黄嘌呤氧化酶抑制剂中，泽兰色原烯能够与XO活性中心的Val 1011、Phe 1013、Leu 648、Phe 649、Leu 1014和Leu 873附近的关键残基形成Pi-烷基；泽兰色原烯的苯环与XO活性中心Phe 1009和Phe 914形成Pi-Pi共轭双键；泽兰色原烯与XO活性中心Ser 876、Thr 1010、Arg 880、Ala 1079、Ala 1078和Glu 802形成范德华力。枯醇能够与XO活性中心的Ala 1078和Ala 1079附近的关键残基形成Pi-烷基；枯醇的苯环与XO活性中心的Phe 914和Phe 1009形成Pi-Pi共轭双键；枯醇与XO中的Val 1011形成范德华力。1,5,8-对薄荷三烯与XO活性中心的Val 1011、Phe 1009、Leu 1014和Leu 873附近的关键残基形成Pi-烷基；1,5,8-对薄荷三烯的苯环与XO活性中心的Phe 914与形成Pi-Pi共轭双键。这些分子间作用力在泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯与XO活性中性的结合中起着重要的稳定作用。竞争性抑制剂被插入XO的疏水间隙中以占据其催化活性中心，从而阻碍了黄嘌呤的进入并导致其失去原有的功能。泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯作为黄嘌呤的竞争性抑制剂，具有抑制尿酸产生的作用，具有抑制XO的功能。
本发明提供了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选方法。本发明提供的方法，利用分子对接的方式从葵花盘挥发油的众多化学组成中筛选出与XO的钼铁活性中性对接能量低的泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯，即筛选出具有XO抑制活性的化学组成，降低了泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯的生产成本，而且以葵花盘作为原料，原料来源广泛，为从天然产物中筛选XO抑制剂以治疗XO介导的疾病提供了更广阔的思路；本发明提供的制备方法，操作简单，适宜工业化生产。
附图说明
图1为食葵LD5009葵花盘挥发油的气相色谱图；
图2为食葵SH363葵花盘挥发油的气相色谱图；
图3为油葵S606葵花盘挥发油的气相色谱图；
图4为泽兰色原烯与XO活性中心之间的作用力二维示意图；
图5为泽兰色原烯与XO活性中心之间的作用力三维示意图；
图6为枯醇与XO活性中心之间的作用力二维示意图；
图7为1,5,8-对薄荷三烯与XO活性中心之间的作用力二维示意图；
图8为葵花盘挥发油的化学成分与抗氧化活性和XO抑制活性关联性分析结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，包括泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯中的至少一种，优选包括泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯中的至少两种；其中，泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯的结构式如下：
Figure BDA0003213542470000041
在本发明中，当所述黄嘌呤氧化酶抑制剂为泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯中的两种以上的混合物时，本发明对于所述泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯的质量比没有特殊限定，任意比例均可。
本发明提供了上述技术方案所述黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
将葵花盘挥发油进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析鉴定，得到葵花盘挥发油化学成分；
利用AutoDockVina软件将所述化学成分的三维结构分别与黄嘌呤氧化酶的三维结构中的钼铁活性中心进行分子对接，计算对接能量，得到黄嘌呤氧化酶抑制剂；所述黄嘌呤氧化酶抑制剂的对接能量为-6.6～-6.9Kcal/mol。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，所述葵花盘挥发油优选自制得到，所述葵花盘挥发油的制备方法，优选包括以下步骤：将葵花盘粉末、氯化钠和水混合，进行提取，得到葵花盘挥发油。
在本发明中，所述葵花盘粉末和氯化钠的质量比优选为1：0.5～1，更优选为1：0.75；所述葵花盘粉末和水的质量比优选为1：10～20，更优选为1：15。在本发明中，所述葵花盘粉末优选由葵花盘粉碎后干燥得到；本发明对于所述葵花盘的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的葵花盘即可，具体如来源于食葵LD5009、食葵SH363和油葵S606中的至少一种；本发明对于所述粉碎的方式没有特殊限定，粉碎至葵花盘粉末粒径≤20目即可；在本发明中，所述干燥的温度优选为25～40℃，更优选为30℃，所述干燥的时间优选为5～10h，更优选为7.5h。
在本发明中，所述混合的方式为超声混合，所述超声混合的温度优选为15～30℃，更优选为20～25℃；所述超声混合的时间优选为0.01～2h，更优选为1h；所述超声混合的功率优选为100～300W，更优选为150～200W；所述超声混合优选在超声锅中进行。
在本发明中，所述提取的方式优选为蒸馏，所述蒸馏的温度优选为70～110℃，更优选为90～100℃；所述蒸馏的时间优选为4～10h，更优选为时间为5～8h；所述提取优选在挥发油提取器中进行。
蒸馏后，本发明优选还包括将所述蒸馏得到的蒸馏物进行萃取，将所得有机相干燥后浓缩，得到葵花盘挥发油。在本发明中，所述萃取用的萃取剂优选包括石油醚、乙酸乙酯和氯仿中的至少一种。在本发明中，所述干燥的方式优选为干燥剂干燥，所述干燥剂优选包括无水硫酸钠。在本发明中，所述浓缩的方式优选为减压蒸馏；所述减压蒸馏优选利用旋转蒸发仪进行；本发明对于所述减压蒸馏的条件没有特殊限定，能够将蒸馏物中的萃取剂除去即可。在本发明中，所述葵花盘挥发油的保存方式优选为置于棕色瓶内避光密封，低温保存；所述低温保存的温度优选为-10～10℃，更优选为4℃；所述低温保存优选在冰箱中进行。
本发明优选将所述葵花盘挥发油进行稀释后再进行GC-MS分析鉴定。在本发明中，所述稀释用稀释剂优选包括正己烷；所述葵花盘挥发油和稀释剂的体积比优选为1：5～20，更优选为1：10～15。
在本发明中，所述GC-MS分析鉴定的条件优选包括：色谱柱优选为HP-INNOWax毛细管柱；载气优选为氦气，所述氦气的流速优选为氦气以1mL/min；进样器的温度优选为250～260℃；检测器的温度优选为280～300℃；烘箱在60～70℃下保持3～8min，以5～6℃/min的速度升至240～260℃，然后在240～260℃条件下保温10～15min；电子离子模式优选为70～85eV；质谱记录范围优选为50～550amu；离子源温度优选为230～240℃。在本发明中，所述GC-MS分析优选利用Agilent 5975(美国安捷伦)进行。
在本发明中，所述食葵LD5009的葵花盘挥发油的化学成分优选包括α-蒎烯、甲苯二烯、崖柏烯、萜品油烯、1-乙酰基-2-甲基-1-环戊烯、1,8-脱氢桉树脑、1,5,8-对薄荷三烯、d-柠檬烯、γ-松油烯、(1R)-cis-马鞭烯酮、1-甲基-2-苯基环丙烷、龙脑烯醛、樟脑酮、邻伞花烃、乙基苯乙醇、trans-沙宾醇、醋酸戊酯、trans-马鞭草酚、对薄荷1,5-二烯-8-醇、3,5-二羟基苯乙酮、异松樟酮、匹诺酮、(e)-柠檬醛、2-戊基-2-环戊烯-1-酮、(-)-4-萜品醇、α-松油醇、桃金娘烯醛、马鞭烯酮、trans-香芹醇、L-乙酸冰片酯、枯醇、2-烯-2-乙酸甲酯、1,4-对薄荷二烯-7-醇、马兜铃烯、β-广藿香烯、2-十三烷酮、β-双沙丁烯、桉油烯醇、d-卡丁烯、β-炉甘石烯、α-榄香烯、去甲氧基英西卡林、大根香叶三烯-1-醇、泽兰色原烯、8,9-脱氢新异长叶烯、正十六烷酸、邻苯二甲酸二丁酯、环氧丙烷、共轭亚油酸、镰叶芹醇、异海藻酸甲酯、贝壳杉16烯、贝壳杉醛和贝壳杉烯酸。
在本发明中，所述食葵SH363的葵花盘挥发油的化学成分优选包括α-蒎烯、崖柏烯、1,8-脱氢桉树脑、1,3,8-对戊三烯、顺1,4-二羟基环辛烷、4-异丙基甲苯、γ-松油烯、马鞭草烯醇、1-甲基-2-苯基环丙烷、龙脑烯醛、1-甲基-2-苯基环丙烷、2-甲基-1-亚甲基-环丙烷、苄丁醚、醋酸戊酯、反式马鞭草酚、对薄荷1,5-二烯-8-醇、1,4-二甲基-酰基-1-环己烯、(E)-柠檬醛、α-叔丁基甲酸酯、α-松油醇、马鞭烯酮、(1R,5S)-rel-香芹醇、反式菊酯、冰片烯、5,7-二亚甲基双环-辛-2-烯、左旋乙酸冰片酯、枯醇、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、1,4-对薄荷二烯-7-醇、丁香酚、马兜铃烯、Β-倍半水芹烯、(+)-β-柏木烯、古芸烯、2-十三烷酮、双环倍半萜烯、双沙丁烯、α-丁二烯、桉油烯醇、d-卡丁烯、β-炉甘石烯、松烷醇、α-榄香烯、去甲氧基英西卡林、9-羟基异丁香烯、顺式杉烯、大根香叶三烯-1-醇、长叶醛、泽兰色原烯、1-十六烷醇、正十六烷酸、棕榈酸甲酯、环十二烷甲醇、二氢脱氢肋内酯、邻苯二甲酸二丁酯、环氧丙烷、亚油酸、共轭亚油酸、异海藻酸甲酯、贝壳杉醛和贝壳杉烯酸。
在本发明中，所述油葵S606的葵花盘挥发油的化学成分优选包括α-蒎烯、甲苯二烯、崖柏烯、1,8-脱氢桉树脑、1,3,8-对戊三烯、顺1,4-二羟基环辛烷、马鞭草烯醇、1-甲基-2-苯基环丙烷、龙脑烯醛、樟脑酮、邻伞花烃、苄氧基丙烷、醋酸戊酯、四甲基环戊烯、反式马鞭草酚、对薄荷1,5-二烯-8-醇、3,5-二羟基苯乙酮、(E)-柠檬醛、2-戊基环戊酮、(-)-4-萜品醇、桃金娘烯醛、马鞭烯酮、(1R,5S)-rel-香芹醇、榄香烯、左旋乙酸冰片酯、乙酸冰片酯、枯醇、马榄烯、广藿香烯、古芸烯、2-十三烷酮、双沙丁烯、桉油烯醇、刺柏烯醇、去甲氧基苯甲酚、反式白菖烯、松烷醇、α-榄香烯、去甲氧基英西卡林、依兰酚、异藿香烯醇、大根香叶三烯-1-醇、反式戊烯基乙酸酯、泽兰色原烯、马兜铃酮、8,9-脱氢新异长叶烯、正十六烷酸、二氢脱氢肋内酯、邻苯二甲酸二丁酯、13-环氧异丙醇、亚油酸甲酯、降油酸二烯、十八碳二烯酸、顺十八烯酸、异丙二酸甲酯、20-甲基-5-孕烯-3,20-二醇、贝壳杉醛和贝壳杉烯酸。
得到化学成分后，本发明利用AutoDockVina软件将所述化学成分的三维结构分别与黄嘌呤氧化酶的三维结构中的钼铁活性中心进行分子对接，计算对接能量，得到黄嘌呤氧化酶抑制剂。
在本发明中，所述黄嘌呤氧化酶抑制剂的对接能量优选为-6.5～-6.9Kcal/mol，本发明提供的黄嘌呤氧化酶抑制剂的对接能量低，与XO分子结合能力越强，对XO的抑制作用优异。
在本发明的实施例中，所述化学成分的三维结构优选由有机小分子生物活性数据(Pubchem)提供；所述XO的三维结构优选由蛋白质数据库(Protein DataBank，PDB)提供。在本发明中，所述分子对接过程中，化学成分中的每一种化学成分分别与XO的钼铁活性中心进行分子对接，能量越低的化学成分对XO有越强的抑制作用。
本发明提供了上述技术方案所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂或上述技术方案所述提取方法得到的黄嘌呤氧化酶抑制剂在制备治疗黄嘌呤氧化酶介导的疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述黄嘌呤氧化酶介导的疾病优选包括高尿酸血症、痛风、2-型糖尿病和肿瘤中的一种或几种。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)葵花盘挥发油的提取
将食葵LD5009的葵花盘粉碎后干燥，得到葵花盘粉末。将100g葵花盘粉末放入2000mL烧杯中，加入1500mL水和75gNaCl，将烧杯置于超声锅内超声1h后，转入挥发油提取器内，蒸馏提取8h，得到提取物；将所述提取物用石油醚萃取将所得有机相用硫酸钠干燥后旋转蒸发仪浓缩至除去石油醚，得到食葵LD5009葵花盘挥发油(棕黄色)，食葵LD5009葵花盘挥发油的提取率为0.42％，将葵花盘挥发油置于4℃冰箱保存待用。
(2)葵花盘挥发油化学成分鉴定
将葵花盘挥发油用正己烷进行稀释，然后用Agilent5975(美国安捷伦)进行GC-MS分析。其中，GC-MS分析的条件：使用HP-INNOWax毛细管柱(美国安捷伦)(内径30mm×0.25mm，膜厚0.25μm)进行分离；氦气以1mL/min的流速用作载气；进样器温度为250℃；检测器温度为280℃；烘箱在60℃下保持3min，然后以5℃/min的速度升至240℃，然后在240℃条件下保温15min；电子离子模式优选为70eV；质谱记录范围优选为50～550amu；离子源温度优选为230℃。HP-INNOWax毛细管柱上分离出的化合物的保留指数是根据一系列正构烷烃(C9～C30)确定的。挥发油的化合物是根据其保留指数和质谱与公开数据进行比较，并与计算机相匹配的，与美国国家标准与技术研究院(NIST，15.0)库进行了比较。葵花盘挥发油的化学成分的相对比例表示为通过峰面积归一化获得的百分比，所有相对响应因子均设置为1，以十五烷用作内标。食葵LD5009葵花盘挥发油的化学成分分析结果如图1和表1所示。
实施例2
按照实施例1的方法制备葵花盘挥发油并分析鉴定其化学成分，与实施例1的区别在于将食葵LD5009替换为食葵SH363，食葵SH363葵花盘挥发油的化学成分分析结果结果如图2和表1所示。
实施例3
按照实施例1的方法制备葵花盘挥发油并分析鉴定其化学成分，与实施例1的区别在于将食葵LD5009替换为油葵S606，油葵S606葵花盘挥发油的化学成分分析结果结果如图3和表1所示。
表1实施例1～3中葵花盘挥发油的化学成分分析结果
Figure BDA0003213542470000091
Figure BDA0003213542470000101
Figure BDA0003213542470000111
Figure BDA0003213542470000121
其中，“-”表示未检测出该成分。
由表1和图1可以看出，食葵LD5009葵花盘挥发油通过GC-MS分析鉴定出54种化学成分，占其总含量的96.48％，其葵花盘挥发油大多为萜类化合物，其中单萜类化合物占35.31％，含氧单萜占41.54％，倍半萜占4.46％，其它成分为15.17％；食葵LD5009葵花盘挥发油中主要化学成分为α-蒎烯(29.93％)，对薄荷1,5-二烯-8-醇(10.54％)，龙脑烯醛(5.52％)，α-松油醇(3.42％)，马鞭烯酮(3.07％)和萜品油烯(2.92％)等单萜类化合物。
由表1和图2可知，食葵SH363葵花盘挥发油通过GC-MS分析鉴定出61种化学成分，占其总含量的94.75％。葵花盘挥发油大多为萜类化合物，其中单萜类化合物占18.50％，含氧单萜占33.76％，倍半萜占38.57％，其它成分为3.92％。从GC-MS分析鉴定结果上看，食葵SH363葵花盘挥发油中主要成分为α-蒎烯15.33％，古芸烯11.90％，去甲氧基英西卡林6.89％，马鞭烯酮3.07％，对薄荷1,5-二烯-8-醇10.54％，龙脑烯醛5.25％。
由表1和图3可以看出，油葵S606葵花盘挥发油通过GC-MS分析鉴定出57种化学成分，占其总含量的93.76％。葵花盘挥发油的主要化学成分为萜类化合物，挥发性单萜成分占12.18％，含氧单萜类占13.54％，倍半萜类占62.05％，其他成分为5.99％。S606葵花盘挥发油中主要成分为去甲氧基英西卡林28.49％，古芸烯19.91％，α-蒎烯10.34％，邻苯二甲酸二丁酯5.12％，龙脑烯醛2.23％，马鞭烯酮1.61％。
三种葵花盘挥发油共101种成分，三种葵花盘挥发油成分和含量有很大的差异，其中食葵LD5009鉴定出54种成分，食葵SH363鉴定出61种成分，油葵S606鉴定出57种成分。食葵SH363和油葵S606有28种相同成分，主要相同成分有α-蒎烯、古芸烯和去甲氧基英西卡林；食葵LD5009和油葵S606有32种相同成分，主要成分有α-蒎烯、桃金娘烯醛和马鞭烯酮；食葵LD5009和食葵SH363有34种相同成分，主要成分有α-蒎烯和马鞭烯酮。食葵LD5009、食葵SH363和油葵S606有24种相同成分，主要有α-蒎烯、龙脑烯醛、对薄荷1,5-二烯-8-醇、崖柏烯和香芹醇等单萜类成分，另外也有少部分倍半萜成分如泽兰色原烯。
实施例4
利用AutoDock Vina软件将101种化学成分分别与XO的三维结构中的钼铁活性中心进行分子对接后计算对接能量，计算对接能量，得到低对接能量的化学成分，即为XO抑制剂。具体步骤如下：利用Openbabel软件批量对配体sdf结构信息进行处理，转化为3D的PDB文件，再批量转化为适用于分子对接的PDBqt文件。于PDB数据库获得XO蛋白的PDB结构(PDBID：3nvw)。将受体(化学成分)转化为PDBqt文件格式，XO与化学成分的结合位点为钼铁活性中心。利用AutoDockVina软件对葵花盘挥发油的化学成分分别进行分子对接，寻找小分子化合物与XO作用的最佳构象，对其进行打分，得到低对接能量的化学成分(泽兰色原烯的对接能量为-6.9Kcal/mol、枯醇的对接能量为-6.6Kcal/mol和1,5,8-对薄荷三烯的对接能量为-6.6Kcal/mol)。
本发明选用AutoDock Vina软件对目标抑制剂和XO进行了分子对接，用DiscoveryStudio 3.5显示结果并进行分析。从PDB数据库中下载XO的PDB文件，应用拉马克(Lamarckian GA)遗传算法，计算蛋白质受体与抑制剂可能出现的构象，从葵花盘挥发油中筛选出的分子对接能量较好的部分化学成分的分子对接结果如表2和图4～7所示。
表2葵花盘挥发油中筛选出的分子对接能量较好的化学成分
Figure BDA0003213542470000141
图4为泽兰色原烯与XO活性中心之间的作用力二维示意图，图5为泽兰色原烯与XO活性中心之间的作用力三维示意图，由图4～5可知，泽兰色原烯与XO活性中心的Val 1011、Phe 1013、Leu 648、Phe 649、Leu 1014和Leu 873附近的关键残基形成了Pi-烷基；Phe1009和Phe 914与泽兰色原烯的苯环形成了Pi-Pi共轭双键；Ser 876、Thr 1010、Arg 880、Ala 1079、Ala 1078和Glu 802与泽兰色原烯形成了范德华力。
图6为枯醇与XO活性中心之间的作用力二维示意图，由图6可知，枯醇与XO活性中心的Ala 1078和Ala1079附近的关键残基形成了Pi-烷基；Phe 914和Phe1009与枯醇的苯环形成了Pi-Pi共轭双键；Val 1011与枯醇形成了范德华力。
图7为1,5,8-对薄荷三烯与XO活性中心之间的作用力二维示意图，由图7可知，1,5,8-对薄荷三烯与XO活性中心的Val 1011、Phe 1009、Leu 1014和Leu 873附近的关键残基形成了Pi-烷基；Phe 914与1,5,8-对薄荷三烯的苯环形成了Pi-Pi共轭双键。
图4～7中，Val 1011、Phe 1013、Leu 648、Phe 649、Leu 1014、Leu 873、Phe 1009、Phe 914、Ser 876、Thr 1010、Arg 880、Ala 1079、Ala 1078和Glu 802为XO钼铁中心疏水部位的蛋白位点。
这些分子间作用力在泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯与XO活性中心的结合中起着重要的作用。竞争性抑制剂被插入XO的疏水间隙中以占据其催化活性中心，从而阻碍了底物的进入并导致其失去原有的功能。泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯作为黄嘌呤的竞争性抑制剂，具有抑制尿酸产生的作用。因此，分子模拟结果可以看出泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯作为葵花盘挥发油的主要化合物，在葵花盘挥发油对XO的抑制过程中起到重要作用。
通过高通量筛选在葵花盘挥发油化学成分中筛选出泽兰色原烯与别嘌醇高度类似。三种葵花盘挥发油对XO的抑制能力为：食葵LD5009>食葵SH363>油葵S606，并且泽兰色原烯在三种葵花盘挥发油化学成分中的的含量分别为2.74％(食葵LD5009)，1.35％(食葵SH363)和0.92％(油葵S606)。葵花盘挥发油抑制XO的能力与泽兰色原烯在葵花盘挥发油化学成分中的含量呈正相关。这种正相关现象与分子模拟的结果相对应。说明，葵花盘挥发油对XO的抑制作用可能是由泽兰色原烯引起的。
实验结果和分子模拟对接结果表明，泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯作为主要化合物在葵花盘挥发油抑制XO过程中起到重要作用，同时也表明泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯具有抑制XO的功能。这为从天然产物中筛选XO抑制剂以治疗高尿酸血症或痛风提供了更广阔的思路。
测试例1
实施例1～3得到的葵花盘挥发油的化学成分与抗氧化活性和XO抑制活性的关联性分析。
(1)ABTS自由基抗氧化实验：用精准天平秤取ABTS 50mg，加入12.31mL去离子水，得到浓度为7.4mmoL/L的ABTS储备液。用精密天平称取24.57mg过硫酸钾药品，用34.14mL去离子水溶解，得到浓度为2.6mmoLL/的过硫酸钾储备液。分别取12.31mLABTS储备液和12.31mL过硫酸钾储备液混合，处于黑暗条件下，室温孵育12h。对ABTS混合液用无水乙醇稀释40～45倍，得到ABTS工作液。设置葵花盘挥发油和维生素E(trolox)的浓度分别为：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1mg/mL。将0.5mL上述样品添加至2mLABTS工作溶液中，黑暗室温反应6min，紫外分光度计于734nm下测定吸光度，以维生素E用作阳性对照。ABTS清除率计算式如式(2)所示：
ABTS自由基清除率＝[(A0-A1)/A0]×100％ 式(2)；
其中A0是不含葵花盘挥发油的阴性对照的吸光度，A1是含葵花盘挥发油的测试样品的吸光度。
(2)DPPH自由基抗氧化实验：称取DPPH 20.0mg，用无水乙醇进行溶解，500mL进行定容，得到浓度为0.08mmoL/L的DPPH工作液。配制不同浓度葵花盘挥发油和阳性对照溶液(Trolox)：1、2、3、4、5、6、7、8、9和10mg/mL。取1mL上述样本溶液置于10mL试管内，加入3.0mLDPPH工作液，室温避光孵育30～35min，在510nm处测定溶液吸光值。DPPH清除率计算式如式(3)所示：
DPPH自由基清除率＝[(A0-A1)/A0]×100％ 式(3)；
其中A0是不含葵花盘挥发油的阴性对照的吸光度，A1是含葵花盘挥发油的测试样品的吸光度。
(3)铁离子还原能力测定：根据普鲁士蓝的方法，使用聪羿生物试剂盒(中国上海)测定葵花盘挥发油对铁离子的还原能力。铁氰化钾在遇到抗氧化剂时会被还原，当遇到亚铁离子会生成普鲁士蓝，普鲁士蓝溶液在700nm处有最大吸光值。根据吸光值的大小，判断物质还原能力的强弱。
(4)按照测试例1测试3.6葵花盘挥发油对XO的抑制作用
皮尔森相关性系数，广泛应用于精油成分与生物活性关联性分析，皮尔森系数越大，表明两者相关程度越高。三种葵花盘挥发油的化学成分与抗氧化活性和XO抑制活性关联性分析结果如表3和图8所示，图8中，红色表示正相关，蓝色表示负相关；圆圈越大，关联性越强。
表3葵花盘挥发油化学成分与生物活性的皮尔森系数(r)
Figure BDA0003213542470000161
其中，ABTS为ABTS自由基清除能力，DPPH为DPPH自由基清除能力，Fe3+为铁离子还原能力，XO为XO抑制能力。
通过分子对接方法高通量筛选出的5种化合物与生物活性进行关联性分析，由表3和图8可以看出泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯与抗氧化活性和XO抑制活性有很大的关联值，与XO关联系数均为0.99。因此证明了葵花盘挥发油对XO抑制活性与泽兰色原烯、枯醇和1,5,8-对薄荷三烯有关，也进一步证明了这三种化合物具有抑制XO氧化酶的活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.泽兰色原烯或1,5,8-对薄荷三烯在制备治疗黄嘌呤氧化酶介导的疾病的药物中的应用；所述黄嘌呤氧化酶介导的疾病为高尿酸血症或痛风。
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