CN113454118A - 修饰的抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了抗体构建体分子，其包含(i)Fc受体结合位点、(ii)抗原结合位点和(iii)位于(i)与(ii)之间的间隔区部分，其中该间隔区部分用来增加(i)与(ii)之间的距离，以便与缺乏(iii)的抗体变体相比降低该分子的激动活性。公开了可以通过引入间隔区部分来去激动的各种抗体。特别感兴趣的是通过引入间隔区部分而去激动的激动性检查点靶向抗体。

Description

修饰的抗体
交叉引用
本申请要求2018年12月17日提交的第1820547.6号英国申请的权益，该英国申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及降低抗体或其抗原结合片段的激动活性的方法和途径，以及此类修饰的抗体。
背景技术
导致淋巴细胞激活和存活的决定不仅取决于抗原识别，还取决于来自使细胞适应其环境的激活或抑制性共受体的信号的整合。对这些过程的了解导致了免疫抑制抗体的开发，这些抗体掩盖了激活受体的配体，如CD28，以及“检查点抑制剂”，其通过与抑制性受体如PD-1结合，从而阻断天然配体的接合，来增强抗肿瘤反应。阻断配体接合被认为能阻止检查点受体引起的信号传导。
然而，在动物肿瘤模型中发现，阻断免疫检查点抗体在阻止肿瘤生长方面不如完全删除PD-1基因那样有效(US7,595,048)，这提示抗体在阻止信号传导方面并不完全有效。
观察到针对人PD-1制备的第一种阻断抗体具有有效的激动活性(参见WO/2004/056875；Bennett等人,J Immunol.170,711-8,2003)。然而，在某些情况下，激动性抗体会过度激活靶受体信号传导，如在抗CD28抗体TGN1412的情况下所发生的(Attarwala,J YoungPharm.2,332-6,2010)。因此，需要具有减弱的激动活性的修饰抗体。
发明内容
本公开尤其基于以下意外发现：抗体的激动活性至少部分是由抗体介导的从淋巴细胞与靶细胞之间形成的接触区排除磷酸酶所介导的。发明人进一步发现，抗体的激动活性可以通过增加抗体的大小，从而较少排除或不再排除大磷酸酶来降低。此类抗体修饰尤其可用于降低阻断抗体的激动活性。
在某些情况下，激动剂抗体可过度激活靶受体信号传导，如在抗CD28抗体TGN1412的情况下所发生的(Attarwala,J Young Pharm.2,332-6,2010)。在这些情况下，激动性抗体在排除磷酸酶方面过于有效。这种“超激动剂”效应可以通过增加抗体的整体尺寸以避免排除磷酸酶并抑制抗体的激动活性来减弱。
本文公开了延伸的抗体，其允许磷酸酶有限地重新进入含有受体结合的抗体的接触中，从而以受控方式减少信号传导量。因此，本公开允许设计具有最佳治疗活性的延伸抗体。
本文公开的延伸抗体的Fc受体(FcR)结合形式将主动地隔离受体，使其远离由其他分子形成的紧密接触，通常完全消除激动作用，而使用仅消除FcR结合的方法不可能做到这一点。通过FcR(或其他工程化配体)与细胞表面结合的检查点阻断抗体，在阻断的特异性或半衰期方面，或者因为它们可以用来例如从紧密接触中排除抑制性FcR，还可以导致显著的额外益处。
本公开进一步尤其基于以下发现：激活性(例如抗CD28)和抑制性(例如抗PD-1)抗体的配体非依赖性激动活性可通过在抗原结合位点与Fc受体结合位点之间(例如在抗原结合片段(Fab)可变/恒定区界面、Fab恒定区或铰链区中)插入间隔区部分使抗体变大而显著降低。在某些实施方案中，间隔区部分是采用刚性构象以增加抗体的大小并在空间上分隔抗体的抗原结合位点和Fc受体结合位点的多肽。此类分子可以保留其抗原结合性质，并且如果需要，还可以保留FcR结合性质，但通过增加抗体的大小/长度，这些分子通常具有降低的激动(使用拮抗剂抗体)和超激动(使用激动剂抗体)活性。不希望受理论束缚，一般认为抗体大小的增加意味着与靶受体的结合阻断了配体结合，并导致受体被排除在靶细胞(例如癌细胞)与T细胞之间的紧密接触之外(参见图1)，否则该受体将启动信号传导。以这两种方式减少(最小化或消除)信号传导的能力对于临床使用的抗体来说是非常理想的。
数据表明，如果抗体与足够紧密的细胞-细胞接触(即“紧密接触”)内的受体接合以排除大的膜结合受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶(RPTP)，则所述抗体充当激动剂[https://ora.ox.ac.uk/objects/uuid:1c97e755-e61d-4d55-8b20-b2546c826eee]。这种理解的理论基础来源于动力学分离模型(Davis和van der Merwe,Nat Immunol 7,803-809,2006)。应用于抗体的机制的关键要求是由抗体和受体形成的复合物必须(在垂直于细胞表面平面的方向上)小于由淋巴细胞表达的最小RPTP，例如约
Figure BDA0003215943650000031
的CD45R0(Chang等人,NatImmunol.17,574-82,2016)。如果抗体与Fc受体以及其靶受体结合(图1a)，则预测会发生强信号传导，因为受体将保持在磷酸酶耗尽的接触中。然而，发明人预测，即使不与Fc受体结合的抗体，原则上也可以形成足够小的复合物，以驻留在由其他分子(如小粘附蛋白)创建的排除磷酸酶的间隙中，从而允许持续的信号传导(图1b)。
前面暗示了大多数(如果不是全部)结合小受体(如PD-1)的抗体将具有一定程度的激动活性，因为它们与其靶标形成的复合物(有或没有FcR接合)小于约
Figure BDA0003215943650000032
这将削弱用作信号传导阻断剂的抗体的有效性。
如本文所用的，紧密接触是在两个相互作用的细胞之间的界面处的紧密膜并置区域，由跨接触的局部粘附分子的相互作用创建。膜在紧密接触处的紧密并置负责排除磷酸酶。
我们正在讨论的所有可激动受体都具有含酪氨酸的磷酸化基序(即基于免疫受体酪氨酸的激活基序和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)等)，其包括Fc受体。发明人提出这些都是由磷酸酶排除触发的。延伸抗体还与Fc受体接合的能力意味着这些受体可能会被排除在紧密接触之外，从而双向改变信号传导潜力。
根据本发明的第一方面，提供了一种抗体变体/构建体分子，其包含(i)Fc受体结合位点、(ii)抗原结合位点和(iii)位于(i)与(ii)之间的间隔区部分，其中该间隔区部分用来增加(i)与(ii)之间的距离，从而与缺乏(iii)的抗体变体相比降低所述分子的激动活性。
在特定的实施方案中，所述间隔区部分的引入增加了所述分子的整体尺寸。
在特定的实施方案中，间隔区部分位于抗原结合位点与Fc受体结合位点之间的恒定区中。
在特定的实施方案中，间隔区部分位于所述抗体的铰链区中。
在特定的实施方案中，所述间隔区部分是刚性间隔区部分，如粘蛋白或粘蛋白样多肽序列，并且包含间隔区部分增加了所述抗体的长度和/或整体尺寸。
在特定的实施方案中，当抗体变体与其抗原结合时，由包含间隔区部分引起的抗体变体/构建体的尺寸增加导致该抗体变体的Fc受体结合位点被隔离，而远离紧密接触。换言之，当抗体变体与抗原(例如受体)结合时，它在空间上被排除在细胞之间的接触之外，这导致抗体接合的受体引起的信号传导减少。
在特定的实施方案中，当抗体变体与其抗原结合时，由包含间隔区部分引起的抗体变体/构建体的尺寸增加使该抗体变体的Fc受体结合位点远离膜。
根据本发明的第二方面，提供了一种或多种编码根据本发明第一至第四方面中任一方面的抗体变体/构建体的核酸分子。在该方面的变化形式中，提供了一种核酸分子，其包含编码根据本发明第一至第四方面中任一方面的抗体变体的序列。
根据本发明的第三方面，提供了一种包含本发明第二方面的核酸的载体。
根据本发明的第四方面，提供了一种包含根据本发明第二方面的核酸序列或根据本发明第三方面的载体的宿主细胞。
根据本发明的第五方面，提供了一种产生根据本发明第一方面的抗体变体/构建体的方法，该方法包括在宿主细胞中表达根据本发明第二方面的核酸。
根据本发明的第六方面，提供了一种制备根据本发明第一方面的抗体变体/构建体的方法，其包括鉴定编码目的抗体的核酸序列并修饰所述核酸序列以编码目的抗体的变体，该变体包含引入的多肽间隔区部分以编码根据本发明第一方面的抗体变体。
根据本发明的第七方面，提供了一种降低抗体的激动活性的方法，其包括将间隔区部分引入该抗体中，该间隔区部分增加该分子的Fc受体结合位点与抗原结合位点之间的距离。在特定的实施方案中，该间隔区部分插入抗体铰链区中。在特定的实施方案中，该间隔区部分是刚性间隔区部分。
根据本发明的第八方面，提供了一种包含根据本发明第一方面的抗体变体/构建体和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明的抗体变体或药物组合物可用作药物。
用药物治疗的疾病的合适示例在说明书其他地方列出。
根据本发明的第九方面，提供了用于治疗的根据本发明第一方面的抗体变体或根据本发明第八方面的药物组合物。在特定的实施方案中，该治疗是癌症的治疗。
根据本发明的第十方面，提供了一种治疗有需要的患者的方法，其包括施用根据本发明第一方面的抗体变体或根据本发明第八方面的药物组合物。在特定的实施方案中，该方法用于治疗癌症。在另一个实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用抗体变体分子或其药物组合物，所述抗体变体分子已经被适配成通过分子的延伸以最大化其从紧密接触中的排除，来最小化/缺乏激动活性。在特定的实施方案中，该延伸是由在抗体中包含刚性间隔区部分而引起的。
具体实施方式
除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个分子”任选地包括两个或更多个这样的分子的组合，等等。
应当理解，在本文中用语言“包含”描述方面的任何情况下，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面。
应当理解，除非上下文另有明确规定，否则本文描述的各个实施方案的一个、一些或全部性质可以应用于任何方面。此外，各个实施方案可以组合起来形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。本发明的这些和其他实施方案通过以下详细描述进一步描述。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开相关领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology,修订版,2000,Oxford University Press，为普通技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文提及“约”某个值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
如本领域中已知的，多肽是通过肽(酰胺)键连接的连续的、无分支的氨基酸链。
本发明人已发现，抗体的激动活性是由于其从由淋巴细胞与其靶细胞形成的接触区中排除磷酸酶所致。本文提供了这样的实施方案，其中如果增加抗体分子的大小使得不再排除或较少排除大磷酸酶，则可以降低这种激动活性。预计这会降低阻断抗体的激动活性。
也可能存在已知是激动剂的抗体引起过多信号传导的情况，如在抗CD28抗体TGN1412的情况下所发生的(Attarwala,J Young Pharm.2,332-6,2010)。在这种情况下，激动剂在排除磷酸酶方面可能过于有效。
本发明人提供了用于抗体修饰的结构特征和技术，以通过增加抗体的整体尺寸来再次避免排除磷酸酶，从而减弱这种“超激动剂”效应。
通过创建允许磷酸酶有限地重新进入含有受体结合的抗体的接触的抗体，可以以受控方式减少信号传导量。本发明因此提供用于设计具有最佳治疗活性的抗体的方法和组合物。
在一些实施方案中，本发明的延伸抗体的Fc受体(FcR)结合形式可以主动地隔离受体，使其远离由其他分子形成的紧密接触，通常完全消除受体的信号传导(参见图1)，而使用仅消除FcR结合的方法不可能做到这一点。通过FcR(或其他工程化配体)与细胞表面结合的检查点阻断抗体，在阻断的特异性或半衰期方面，或者因为它们可以用来例如从紧密接触中排除抑制性FcR，还可以导致显著的额外益处。
抗体
抗体是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变域中的至少一个抗原识别位点与诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等靶标特异性结合。有五种主要的免疫球蛋白类别(即同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中若干个可被进一步分为亚类(亚型)，例如，IgG1、lgG2、lgG3、lgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。除非上下文的限制另有规定，否则该术语还包括抗体的所有类别和亚类。对应于不同抗体类别的重链恒定域一般分别用相应的小写希腊字母α、δ、ε、γ和μ来表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链，基于其恒定域的氨基酸序列，可以归为两种截然不同的类型(称为κ(kappa)和λ(lambda))之一。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体Y形糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接到重链上，而二硫键的数目随着不同免疫球蛋白同种型的重链而有所不同。每条重链和轻链也具有规律间隔的链内二硫键。每条重链在一个末端具有可变域(VH)，随后是多个恒定域。每条轻链在一个末端具有可变域(VL)且在另一末端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一个恒定域对齐，而轻链可变域与重链的可变域对齐。特定氨基酸残基被认为形成轻链与重链可变域之间的界面。每条重链包含一个可变域(VH)和恒定区，在IgG、IgA和IgD抗体的情况下，恒定区包含三个结构域，分别被称为CH1、CH2和CH3(IgM和IgE具有第四个结构域——CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区隔开，该柔性铰链区是可变长度(在各种IgG亚类中为约10个至约60个氨基酸)的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。轻链和重链中的可变域都通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定域连接，并且重链还具有约10个额外氨基酸的“D”区。每种类别的抗体进一步包含由成对的半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。重链可变区(YH)和轻链可变区(YL)可以各自进一步细分为超变区，被称为互补决定区(CDR)，其中散布有更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个YH和YL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
如本文所用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。该术语还涵盖包含抗体的抗原结合位点和Fc受体结合位点的任何多肽或蛋白质，其可能有功能也可能没有功能。本发明的抗体变体是已被修饰从而具有如本文所述的间隔区部分的抗体变体。
本发明的抗体变体可以来自任何动物种，包括鼠、大鼠、人或其他任何来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实施方案中，该抗体变体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体变体是人或人源化抗体。非人抗体变体可以通过降低其在人体内的免疫原性的重组方法进行人源化。
虽然有可能选择现有的“亲本”抗体(例如单克隆抗体)进行修饰以创建本发明的抗体变体，但应当理解，可以设计具有所需抗原结合性质的合成抗体，其可能例如已使用噬菌体展示或其他抗原结合选择或淘选方法进行选择，并入抗体框架中(例如与例如IgG1或IgG4分子的恒定区和铰链区融合)，并且其中已经引入了间隔区部分。
如本文所用的术语“单克隆抗体”(“mAb”)是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，例如，除了可能少量存在的可能的突变，例如天然发生的突变外，构成该群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为不是离散抗体的混合物。mAb是高度特异性的，其针对单个抗原位点/表位。
mAb可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术产生。例如，根据本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可以通过由Kohler和Milstein(Nature 256:495,1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过如美国专利4,816,567和6,331,415描述的重组DNA方法制备。例如，还可以使用Clackson等人,Nature 1991；352:624-628和Marks等人,J.Mol.Biol.1991；222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
“人”抗体(HuMAb)是指具有以下可变区的抗体，在该可变区中，框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的，术语“人抗体”并非旨在包括其中来源于另一哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。
可以通过向转基因动物施用免疫原/抗原来制备人抗体，该转基因动物已经被修饰为响应于抗原攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体，但其内源基因座已被禁用，例如经免疫的异种小鼠(xenomice)(参见，例如，关于XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584)。另见，例如，Li等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562,2006)，其涉及通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体。此类动物一般包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，这些基因座代替内源免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，请参见Lonberg(Nat.Biotech.23:1117-1125,2005)。另见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584；描述HUMABTM技术的美国专利5,770,429；描述K-M MOUSETM技术的美国专利7,041,870，和描述VELOCIMOUSETM技术的公开号为US2007/0061900的美国专利申请。来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合。
还可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor,J.Immunol,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括，例如，美国专利7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤(Trioma)技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文所用的，“人源化抗体”是指其中非人抗体的CDR结构域外的一些、大部分或全部氨基酸被来源于人免疫球蛋白的相应氨基酸替换的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的CDR的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。人源化抗体可包含在接受体抗体中和输入的CDR或框架序列中均未发现但被包括以进一步改进并优化抗体性能的残基。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域外的一些、大部分或全部氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸替换，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或全部氨基酸未改变。氨基酸的小添加、缺失、插入、置换或修饰是允许的，前提是它们不会消除抗体与特定抗原结合的能力。“人源化”抗体保留了与原始抗体相似的抗原特异性。通常，人源化抗体将包含基本上全部至少一个、通常两个可变域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见，例如，Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。另见，例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利6,982,321和7,087,409。
“嵌合抗体”是指可变区来源于一个物种而恒定区来源于另一个物种的抗体，例如可变区来源于小鼠抗体而恒定区来源于人抗体的抗体，反之亦然。该术语还包括包含来自一个物种的一个个体(例如第一小鼠)的可变区和来自同一物种的另一个个体(例如第二小鼠)的恒定区的抗体。
术语“抗原(Ag)”是指用于对免疫活性脊椎动物进行免疫以产生识别Ag的抗体(Ab)或筛查表达文库(例如噬菌体、酵母或核糖体展示文库等)的分子实体。在本文中，Ag被更广泛地命名，通常旨在包括被Ab特异性识别的靶分子，因此包括在用于产生Ab的免疫过程或用于选择Ab的文库筛查中使用的分子的部分或模拟物。
“双特异性”或“双功能性”抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537-539(1983))。制备双特异性抗体的方法在本领域技术人员的能力范围内。例如，双特异性抗体可通过包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接在内的多种方法产生。参见，例如，Songsivilai等人,(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321，Kostelny等人,(1992)J Immunol.148:1547-1553。另外，双特异性抗体可以形成为“双抗体”(Holliger等人,(1993)PNAS USA 90:6444-6448)或“Janusins”(Traunecker等人,(1991)EMBO J.10:3655-3659和Traunecker等人,(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:51-52)。
抗原结合位点是指分子中与全部或部分靶抗原结合并与之互补的部分。在抗体分子中，它被称为抗体的抗原结合位点，并且包括抗体中与全部或部分靶抗原特异性结合并与之互补的部分。当抗原很大时，抗体可能仅与抗原的特定部分结合，该部分被称为表位。抗体的抗原结合位点可由一个或多个抗体可变域提供。优选地，抗体的抗原结合位点包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
通常，术语“表位”是指抗体特异性结合的抗原区域或部分，即与抗体物理接触的区域或部分。因此，术语“表位”是指能够在抗体的一个或多个抗原结合区被抗体识别并结合的分子部分。通常，表位是在抗体或其抗原结合部分(Ab)与其相应抗原之间的分子相互作用的背景下定义的。表位通常由分子的表面分组如氨基酸或糖侧链组成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在一些实施方案中，表位可以是蛋白质表位。蛋白质表位可以是线性的或构象的。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(如抗体)之间的所有相互作用点都沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。“非线性表位”或“构象表位”包含抗原性蛋白质内的非连续多肽(或氨基酸)，对该表位具有特异性的抗体与之结合。如本文所用的术语“抗原表位”被定义为抗体可以特异性结合的抗原的一部分，如通过本领域公知的任何方法确定的，例如通过常规免疫测定确定的。
与表位“特异性结合”的抗体是本领域公知的术语，并且确定这类特异性结合的方法也是本领域公知的。如果与其他细胞或物质相比，分子与特定细胞或物质的反应或缔合更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更高，则称该分子表现出“特异性结合”。
多种测定形式可用来选择特异性结合目的分子的抗体或肽。例如，固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BiacoreTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)、KinExA、荧光激活细胞分选(FACS)、OctetTM(ForteBio,Inc.，Menlo Park，CA)和Western印迹分析属于可用于鉴定与抗原或受体或其配体结合部分特异性反应的抗体的许多测定，所述抗体与同源配体或结合配偶体特异性结合。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更通常是背景的10倍以上，甚至更通常是背景的50倍以上，更通常是背景的100倍以上，更通常是背景的500倍以上，更通常是背景的1000倍以上，甚至更通常是背景的10,000倍以上。此外，当平衡解离常数(KD)<7nM时，抗体被称为“特异性结合”抗原。
本发明的抗体变体分子
根据本发明的第一方面，提供了一种抗体变体分子，其包含(i)Fc受体结合位点、(ii)抗原结合位点和(iii)位于(i)与(ii)之间的间隔区部分，其中该间隔区部分增加(i)与(ii)之间的距离，从而与缺乏(iii)的抗体变体相比降低所述分子的激动活性。
如上所述，所述抗体可以来自任何动物。在特定的实施方案中，所述抗体变体是人抗体。
在某些实施方案中，所述抗体变体选自人抗体、完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。
本发明的抗体变体分子可以是IgG，例如IgG1、IgG2(或无糖基IgG2)、IgG3或IgG4。
在某些实施方案中，所述抗体变体是单克隆抗体。
分子长度的增加仅指抗体多肽链中氨基酸数目的增加。分子整体尺寸的增加是指分子在其完全折叠状态下的大小增加，特别是抗体的长度(从N末端到C末端)增加。
可以使用本领域公知的测定，例如在体外对T细胞活化剂的响应，例如在混合淋巴细胞反应中观察到的，或在体内对免疫原如卵白蛋白的响应，来确定具有或缺乏间隔区部分的抗体的激动性质。
应当理解，抗体的关键结构域(例如，CDR、CH1、CH2、CH3、铰链结构域、Fc受体结合位点等)在多肽一级结构序列内的精确位置将因抗体和抗体的特定类别而异。然而，鉴定抗体的这些不同部分的位置对本领域技术人员来说是常规的。为了进一步促进这一点，我们还将在本公开中提及参考人IgG1重链多肽的多肽序列，其如SEQ ID NO:1所示，并且也被称为“参考多肽”。参考鼠IgG1重链多肽序列(“参考鼠多肽”)也在本文中公开，SEQ ID NO:2，其对应于在EP2342228B1中作为克隆2公开的抗体。当然，可以理解，这些参考序列中的残基编号和其中关键结构域的位置可能与另一种抗体中的不同，然而，可以使用这些参考序列作为指导来定位另一种抗体重链多肽中的关键抗体结构域的位置。
对于SEQ ID NO:1中公开的参考多肽，关键抗体结构域位于SEQ ID NO:1中的如下位置：
CDR1：位置31-35(含)
CDR2：位置50-66(含)
CDR3：位置99-116(含)
CH1：位置128-225(含)
铰链：位置226-240(含)
CH2：位置241-350(含)
CH3：位置351-457(含)
Fc受体结合区*：位置241-249(含)；274-280(含)；304-309(含)；335-342(含)。
通过由SabPred服务器提供的ABodyBuilder工具(Dunbar等人,SabPredstructure-based antibody prediction serve.Nucleic Acids Res.2016Jul 8；44(W1):W474-8)，使用‘Kabat’设置预测CDR的位置。
*为了确定Fc受体结合位点，使用以下蛋白质数据库(PDB)文件：4X4M(与hIgG1 Fc复合的FcγRI)、3RY6(与hIgG1 Fc复合的FcγRIIA)、3WJJ(与具有点突变P238D的hIgG1 Fc复合的FcγRIIB)、3WJL(与V12突变的hIgG1 Fc复合的FcγRIIC)、3SGJ(与hIgG1 Fc复合的FcγRIIIA)和1T83(与hIgG1 Fc复合的FcγRIIIB)。使用PISA(Krissinel和Henrick.J.Mol.Biol.372:774-797,2007)预测形成单个Fc受体结合位点的残基的位置。
SEQ ID NO:2是参考鼠IgG1多肽序列(参考鼠多肽)，其对应于EP2342228B1中的克隆2。
Fc受体结合位点是被表面缔合的Fc受体结合的抗体区域，通常位于抗体Fc区的CH2结构域中，与铰链C末端相邻的位置处。举例来说，在参考多肽(SEQ ID NO:1)中，Fc受体结合位点/区域包含从位置241到342(含)的残基。
本发明的抗体变体分子可以是分离/纯化的形式。本发明的分离/纯化的抗体变体将不含或基本上不含与其天然缔合的物质，例如在其天然环境或制备它们的环境(例如细胞培养物)——当这种制备通过体外或体内实施的重组DNA技术进行时——中发现的其他蛋白质或核酸。
在特定实施方案中，本发明的抗体变体是大于80％，如大于90％、大于95％、大于97％和大于99％纯的。
间隔区部分或去激动剂部分
间隔区部分或去激动剂部分可以是任何可以被引入抗体的结构，它增加抗体的整体尺寸，即通过增加抗原结合区与Fc受体结合区之间的距离，可测量为抗体的Stoke半径增加(最大的尺寸增加)例如
Figure BDA0003215943650000151
(参见Erickson,Size and Shape of Protein Moleculesat the Nanometer Level Determined by Sedimentation,Gel Filtration,andElectron Microscopy.Biol Proced Online.11:32–51,2009)。适当地，这是通过包含多肽序列而实现的，在某些实施方案中，间隔区部分可以在溶液中采用刚性空间构象或具有有限柔性的构象。在特定的实施方案中，间隔区部分是多肽序列(多肽间隔区)，例如采用刚性构象的序列。
适当地，多肽序列由天然氨基酸组成，然而也可以使用非天然氨基酸，或者间隔区部分可以是拟肽部分。迄今为止，超过100种不同的非天然氨基酸已被放入蛋白质中，并且超过30种非天然氨基酸已被共翻译地掺入蛋白质中(参见Xie等人,Curr Opin ChemBiol.9:548-554,2005；以及Lu和Freedland Genome Biology.7(1):102,2006)。
合适的示例性多肽序列包含粘蛋白或粘蛋白样序列，其含有高比例的氨基酸丝氨酸和苏氨酸并且用高密度的O-连接的寡糖修饰。在特定的实施方案中，多肽间隔区序列是在免疫球蛋白中天然不存在的序列。
间隔区部分可以是任何可以增加抗体的整体尺寸的部分。在特定的实施方案中，间隔区部分是多肽(多肽间隔区)。适当地，多肽间隔区的长度为至少20个氨基酸，例如至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少90或至少100个氨基酸的长度。在一些实施方案中，多肽间隔区包含约10-100个氨基酸、10-90个氨基酸、10-80个氨基酸、10-70个氨基酸、10-60个氨基酸、10-50个氨基酸、10-40个氨基酸、10-30个氨基酸、20-100个氨基酸、20-90个氨基酸、20-80个氨基酸、20-70个氨基酸、20-60个氨基酸、20-50个氨基酸、20-40个氨基酸或20-30个氨基酸。100个氨基酸(残基)的增加相当于蛋白质的粘蛋白样区段持续长度的大约两倍。
如本文所用的术语“去激动的”是指与未根据本发明(通过插入间隔区部分)修饰的分子相比具有较低的激动剂活性。
在特定的实施方案中，间隔区部分是刚性间隔区。刚性间隔区是具有降低的或最小的柔性以使其采取刚性构象的间隔区。在某些实施方案中，间隔区部分被设计成具有有限的柔性以适应激动作用的定制降低。
所谓“刚性构象”是指采用坚硬和延伸构象的构象，即缺乏显著的柔性。例如，刚性构象将类似于蛋白质的粘蛋白样区段采用的构象。
粘蛋白包含由10到80个残基序列的多个串联重复形成的大中心区域，其中可达一半的氨基酸是丝氨酸或苏氨酸，它们被O-连接的寡糖饱和(Perez-Vilar和Hill,TheStructure and Assembly of Secreted Mucins.J Biol Chem 274,31751-31754,1999)。粘蛋白的高度糖基化结构域是长延伸结构，比未糖基化的无规卷曲具有低得多的柔性，并且没有二级结构(Jentoft,Trends Biochem.Sci.15:291–294,1991)。寡糖通过限制围绕肽键的旋转和通过相邻的带负电荷的寡糖基团之间的电荷排斥而导致这种刚度。这些采用刚性结构的串联重复因此适用于本发明。
在特定实施方案中，多肽间隔区是粘蛋白或粘蛋白样多肽。
在特定实施方案中，多肽间隔区中至少25％，例如至少30％或至少40％的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸残基。如此数量的丝氨酸和苏氨酸残基的存在导致刚性构象，尤其是当一定数目的丝氨酸和苏氨酸残基被O-连接的寡糖饱和时。在一些情况下，散布的脯氨酸残基也可能有助于结构的刚性。
如本文所用的，粘蛋白多肽序列是包含在粘蛋白中发现的重复序列的序列，其具有高比例的能够被O-连接的寡糖饱和的丝氨酸和苏氨酸残基，并且可以包含散布的脯氨酸残基(例如在SEQ ID No:3、4、5或6中)。
可以使用的粘蛋白重复序列的实例在Perez-Vilar和Hill,The Structure andAssembly of Secreted Mucins.J Biol Chem 274,31751-31754,1999的补充信息的表L中给出。粘蛋白样蛋白的一个实例是CD43，它是一种膜锚定蛋白质，其胞外区包含高比例的被O-连接的寡糖饱和的丝氨酸和苏氨酸残基，并且散布有脯氨酸残基。
来自许多物种(例如人、小鼠、狗、大鼠、青蛙等)的粘蛋白的氨基酸序列，包括串联重复结构域，是已知的。来自这些重复结构域的序列可在本发明中用作间隔区部分的全部或部分，以延伸抗体的长度。
来自小鼠CD43的合适的序列包括SEQ ID NO:3(RTTMLPSTPHITAPSTSEAQNASPSVSVGSGTVDSKETISPWGQTTIPVS)中公开的50个氨基酸的序列或SEQ ID NO:4(RTTMLPSTPHITAPSTSEAQNASPSVSVGS)中公开的30个氨基酸的序列。
对于人抗体，为了降低免疫原性，可以使用人CD43的等效序列。因此，来自人CD43的合适的序列包括SEQ ID NO:5(STTAVQTPTSGEPLVSTSEPLSSKMYTTSITSDPKADSTGDQTSALPPST)或SEQ ID NO:6(STTAVQTPTSGEPLVSTSEPLSS)的序列。
粘蛋白样多肽是与野生型粘蛋白重复序列不同但与其具有显著同一性(例如至少70％，如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％的同一性)的多肽，或者它是这样的序列，其中多肽中至少25％，如至少30％，或至少35％，或至少40％，或至少45％的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸残基。在特定的实施方案中，这些丝氨酸和/或苏氨酸残基中的某些残基能够被O-连接的寡糖饱和。
在特定实施方案中，多肽间隔区包含作为SEQ ID NO:3、4、5或6公开的氨基酸序列。
抗体的Fc受体结合位点和抗原结合(或组合)区是抗体的锚定点，它们在两个并置细胞之间建立间隙并确定复合物是否被排除。因此，该区域长度的增加(由于存在间隔区部分)和/或该间隔区对这两个结合位点之间的总距离的影响决定了复合物是否被排除。
本发明人已经认识到，通过增加抗体的长度或整体尺寸，可以将抗体变体/受体复合物排除在紧密接触之外(参见图1)。因此，在特定实施方案中，间隔区部分是将抗体的长度和/或整体尺寸增加至少
Figure BDA0003215943650000181
如至少
Figure BDA0003215943650000182
至少
Figure BDA0003215943650000183
至少
Figure BDA0003215943650000184
至少
Figure BDA0003215943650000185
至少
Figure BDA0003215943650000186
至少
Figure BDA0003215943650000187
至少
Figure BDA0003215943650000188
至少
Figure BDA0003215943650000189
或至少
Figure BDA00032159436500001810
的部分。在特定的实施方案中，整体尺寸的增加意味着至少一个抗原结合位点与Fc受体结合位点之间的间距增加。
在特定实施方案中，与缺乏间隔区部分的抗体相比，间隔区部分的存在使抗体变体的整体尺寸或其中抗原结合位点与Fc受体结合位点之间的间距增加至少
Figure BDA00032159436500001811
如至少
Figure BDA00032159436500001812
至少
Figure BDA00032159436500001813
至少
Figure BDA00032159436500001814
至少
Figure BDA00032159436500001815
至少
Figure BDA00032159436500001816
至少
Figure BDA00032159436500001817
或至少
Figure BDA00032159436500001818
已显示
Figure BDA00032159436500001819
的大小增加是足以在接触处实现受体重组的大小差异(Schmid等人,Size-dependent protein segregation at membrane interfaces.Nat Phys.2016年7月；12(7):704-711.Epub 2016年3月7日)。
在特定的实施方案中，多肽间隔区具有长的持续长度，如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或20nm的长度。通过将抗体的长度增加例如4nm或更多，变体抗体能够引起受体在界面处的自发重组(见图1)。
粘蛋白样蛋白的持续长度为
Figure BDA0003215943650000191
即，增加了约50个残基(参见，例如，Jentoft,Why are proteins O-glycosylated？Trends Biochem Sci 15:291–294,1990)。
持续长度是量化聚合物刚度的基本机械性能。非正式地，它提供了聚合物方向在改变方向之前所保持的距离的度量(Trachtenberg和Hammel.Determining thepersistence length of biopolymers and rod-like macromolecular assemblies fromelectron microscope images and deriving some of their mechanical properties.于Microscopy:Science,Technology,Applications and Education A.Méndez-Vilas andJ.Díaz,Eds.2010)。
间隔区部分的位置
间隔区部分可以位于抗体中不干扰抗体与其抗原结合的能力的任何位置。因此，在理想情况下，间隔区部分不位于Fab顶部的抗原结合区(互补决定区(CDR))内。
在某些实施方案中，在抗体的抗原结合位点与Fc受体结合位点之间引入间隔区部分。
IgG Fc区包含不同的Fc受体结合位点(例如，参见Wines等人,The IgG Fccontains distinct Fc receptor(FcR)binding sites:the leukocyte receptors Fcgamma RI and Fc gamma RIIa bind to a region in the Fc distinct from thatrecognized by neonatal FcR and protein A.J Immunol.164,5313-8,2000)。
参考SEQ ID NO:1中公开的示例性抗体重链多肽(参考多肽)序列，间隔区部分可以位于由位置128(CH1结构域的开始处，标志着抗原结合区的碱基)和240(含)界定的区域内的位点处。
如果使用鼠IgG1重链参考序列(SEQ ID NO:2)来定位间隔区部分插入位点的位置，则间隔区部分可以位于位置残基121(CH1结构域的开始处，标志着抗原结合区的碱基)与262(形成小鼠IgG的Fc受体结合区的一部分的残基)(Baudino等人,Crucial role ofaspartic acid at position 265in the CH2 domain for murine IgG2a and IgG2b Fc-associated effector functions.J.Immunol.181,6664–6669,2008)(含)之间的位点处。如上所述，应当理解，包括示例性序列仅用于指导间隔区部分的定位，并且不同抗体中的精确氨基酸位置将不同。
在某些实施方案中，在抗体的Fab区与FcR结合区之间引入间隔区部分。
在某些实施方案中，向铰链域中引入间隔区部分。相对于参考多肽(SEQ ID NO:1)，这将是位置226至240(含)。
在某些实施方案中，向CH1结构域中引入间隔区部分。相对于参考多肽，这将是位置128至225(含)。
在某些实施方案中，在抗体的第一恒定域(也称为CH1)的起点与FcR结合区之间的位点处引入间隔区部分。相对于参考多肽，这将是位置128至240(含)。
因此，在特定的实施方案中，间隔区部分位于SEQ ID NO:1中公开的参考多肽中由位置128和240(含)界定的区域内的位点处。
在某些实施方案中，在第一恒定域(也称为CH1)的起点与铰链结构域的终点之间的位点处引入间隔区部分。相对于参考多肽，这将是位置128至240(含)。
在特定的实施方案中，间隔区部分位于Fab区内。为了实现这一点，可以将间隔区部分引入抗体轻链和重链(例如CH1/Cκ1或Cλ1区)多肽的恒定区中，如编码这些多肽链的核酸中。
在特定的实施方案中，间隔区部分仅被引入重链恒定区，如铰链区中。应当理解，通过仅向重链中引入间隔区部分，无需(通过包含间隔区部分)修饰当与重链偶联时产生抗原结合位点的伴随轻链。因此，产生本发明的抗体变体的“修饰”仅需要被工程化到重链中，如重链编码核酸中。以这种方式，间隔区部分仅需要可从编码重链多肽链的核酸表达。
因此，如果间隔区部分是仅引入到抗体重链中的多肽，则可以产生抗体变体，其中相对于亲本抗体分子，仅重链抗体多肽通过包含多肽间隔区而被调整。轻链多肽不需要调整。
在某些实施方案中，间隔区部分位于恒定区中并用来延伸恒定区。
在某些实施方案中，间隔区部分位于抗体铰链区中的位点处。参考SEQ ID NO:1中公开的参考多肽序列，铰链区位于氨基酸位置226至240(含)。因此，在特定的实施方案中，间隔区部分位于SEQ ID NO:1中公开的参考多肽中由位置226和240(含)界定的区域内的位点处。
使用重组/分子生物学技术将间隔区部分引入亲本抗体分子所需的方法是本领域技术人员所熟知的常规方法。
在某些实施方案中，在间隔区的一端或两端使用连接体序列将多肽间隔区部分引入抗体多肽链中。可以使用任何合适的连接体序列。连接体序列通常是短肽。因此，间隔区多肽可包含连接体/间隔区-多肽/连接体。合适的连接体序列是甘氨酸-丝氨酸(GS)或甘氨酸-甘氨酸(GG)。因此，间隔区多肽可在每个末端包含连接体，如GS或GG。合适的实例包括GS/间隔区-多肽/GS、GG/间隔区-多肽/GG、GS/间隔区-多肽/GG和GG/间隔区-多肽/GS。
与缺乏间隔区部分的相应抗体相比，间隔区部分的存在降低了抗体的激动活性。在特定的实施方案中，与缺乏间隔区部分的抗体/抗体变体相比，间隔区部分的引入使激动活性降低至少25％，例如至少50％、至少60％、至少75％、至少85％或至少90％。
在特定的实施方案中，与缺乏间隔区部分的抗体/抗体变体相比，间隔区部分的引入(或存在)基本上消除了(>95％)激动活性。
可以使用常规试验，如T细胞转移试验，在体内评估分子的激动活性。在该试验中，将包含人源化和野生型细胞混合物的T细胞转移到宿主中，然后对小鼠进行免疫，然后给予激动性抗人受体抗体。在之后的某个时间，测量两个细胞群体相对于彼此的扩充。结合抗人受体抗体的人源化细胞群体相对于野生型对照的缩小反映了抗体的激动潜力。
在特定实施方案中，当本发明的抗体变体分子与其抗原结合时，抗体与受体的复合物在空间上被排除在紧密接触(例如靶细胞与T细胞之间的接触——参见图1)之外。
在空间上被排除在紧密接触之外是指抗体与受体的复合物不能被容纳在细胞之间的浅间隙中，因此该复合物被从接触中逐出。
核酸分子
本发明的抗体变体/构建体将由核酸编码。该抗体变体/构建体可以由单个核酸分子编码，或者它可以由两个或更多个核酸分子编码。例如，因为抗原结合位点通常由重链可变多肽区和轻链可变多肽区组合在一起形成，所以这两个可变(重链和轻链)多肽区可以由单独的核酸分子编码。或者，在其他情况下，它们可以由相同的核酸分子编码。
根据本发明的第二方面，提供了一种或多种编码根据本发明第一至第四方面中任一方面的抗体变体的核酸分子。
如上所述，多肽间隔区可以仅位于重链多肽内。因此，根据该方面的变化，提供了编码根据本发明第一方面的抗体变体的重链多肽的核酸。特别地，该重链多肽已被工程改造为包括如本文所述的多肽间隔区。
核酸分子之一可以仅编码抗体变体的VL多肽序列。核酸分子之一可以仅编码抗体变体的VH多肽序列。然而，核酸分子也可以编码VH和VL抗体变体序列。
编码本发明的抗体变体的核酸分子，例如根据本发明的第一方面，可以是质粒载体或者可以是质粒载体的一部分，例如可包含其他功能区(元件)的表达载体，该功能区(元件)例如是一个或多个启动子、一个或多个复制起点、一个或多个选择标记以及一个或多个通常在表达载体中发现的其他元件。编码蛋白质(包括抗体)的核酸的克隆和表达已经完善，并且在本领域技术人员的技术范围内。
根据本发明的第三方面，提供了一种包含本发明第二方面的核酸的载体。在特定实施方案中，该载体是质粒载体、粘粒载体、病毒载体或人工染色体。
本发明的核酸，包括包含编码能够形成本发明抗体变体的多肽的核苷酸序列的载体核酸，可以是纯化/分离的形式。
编码本发明抗体变体的分离的核酸将不含或基本上不含与其天然缔合的物质，例如在其天然环境或制备它们的环境(例如细胞培养物)——当这种制备通过体外或体内实施的重组DNA技术进行时——中发现的其他蛋白质或核酸。
在特定实施方案中，本发明的核酸是大于80％，如大于90％、大于95％、大于97％和大于99％纯的。
因此，根据本发明第三方面的另一个变化，提供了一种包含编码本发明抗体变体的重链可变多肽或轻链可变多肽的核酸或核苷酸序列的载体。在特定的实施方案中，该载体包含编码重链和轻链可变区的核酸。在特定实施方案中，所述多肽还可包含其他结构域，如恒定域、铰链区和Fc区，例如包含一个或多个Fc受体结合位点的区域。
本发明的核酸和/或载体可以被引入宿主细胞中。该引入可采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染，以及使用逆转录病毒或其他病毒例如牛痘病毒或对于昆虫细胞使用杆状病毒的转导。在宿主细胞，特别是真核细胞中引入核酸可以使用病毒系统或基于质粒的系统。质粒系统可以附加型地保持，或者可以并入宿主细胞或人工染色体中。并入可以通过在单个或多个基因座处随机或靶向整合一个或多个拷贝来完成。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。
在一个实施方案中，本发明的核酸整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可按照标准技术通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。
宿主细胞
本发明的另一方面提供了一种包含本文公开的核酸的宿主细胞。这样的宿主细胞可以在体外并且可以在培养中。
本发明的第四方面提供了一种包含本文公开的核酸的宿主细胞。这样的宿主细胞可以在体外并且可以在培养中。
宿主细胞可以来自任何物种，如细菌或酵母，但合适地，宿主细胞是动物细胞，如人细胞，如人胚胎肾细胞，或非人类哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞。
引入核酸之后可以例如通过在用于基因表达的条件下培养宿主细胞引起或允许从核酸表达。表达产物的纯化可以通过本领域技术人员已知的方法实现。
因此，本发明的核酸，包括包含编码能够形成本发明抗体变体的多肽的核苷酸序列的载体核酸，可以存在于分离的宿主细胞中。宿主细胞通常是宿主细胞克隆群体的一部分。如本文所用的，提及宿主细胞还包括所述细胞的克隆群体。克隆群体是从单个亲本宿主细胞生长出来的群体。宿主细胞可以来自任何合适的生物体。合适的宿主细胞包括细菌、真菌或哺乳动物细胞。
宿主细胞可用于辅助扩增载体核酸(例如采用质粒)，或者其可充当表达形成本发明抗体变体的本发明多肽的生物工厂。用于扩增载体核酸的合适的宿主可以是细菌或真菌细胞，如大肠杆菌细胞或酿酒酵母细胞。用于表达本发明蛋白质(即构成本发明的抗体变体的多肽)的合适的宿主是哺乳动物细胞，如人胚胎肾(HEK)293或中国仓鼠卵巢(CHO)K1细胞。在特定的实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如HEK 293或CHO-K1细胞。
多种宿主表达载体系统可用于表达本文所述的抗体变体分子(参见例如美国专利5,807,715)。例如，哺乳动物细胞如CHO与载体如来自人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件一起是CEA蛋白的有效表达系统(Foecking等人,Gene,45:101,1986；和Cockett等人,Bio/Technology,8:2,1990)。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以确保对本公开的蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、HEK 293、VERY、BHK、Hela、COS-7、MDCK、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0、CRL7O3O以及HsS78Bst细胞。
抗体变体的产生
根据本发明的第五方面，提供了一种产生根据本发明第一方面的抗体变体的方法，该方法包括在宿主细胞中表达根据本发明第二方面的一种或多种核酸。
可以使用本领域已知的方法制备本发明的抗体变体，例如，通过包括以下步骤的过程：在适合产生这样的抗体变体的条件下培养以适合表达的形式含有编码抗体变体的核酸的宿主细胞，并回收该抗体变体。
在一个实施方案中，产生抗体变体的方法包括引起从编码核酸表达。这样的方法可包括在用于产生所述抗体变体的条件下培养宿主细胞。
根据本发明第五方面的变化，提供了一种产生本发明的抗体变体的方法，其包括以下步骤：在用于产生所述抗体变体的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码形成本发明抗体变体的多肽的核酸，任选地进一步包括分离/纯化本发明的所述抗体变体。
合成抗体分子可以通过从借助于在合适的表达载体中合成并装配的寡核苷酸生成的基因表达来产生，例如，如Knappik等人(J Mol Biol 296,57–86,2000)或Krebs等人(JImmunol Methods 254,67–84,2001)所述。
用于产生本发明的抗体变体并纯化所述分子的条件是本领域公知的。解决该问题的一种方式是制备能够表达本发明的抗体变体的细胞克隆群体，并将这些细胞在合适的生长培养基中在有利于细胞群体扩充/生长和目的蛋白质表达的温度下培养一段时间。如果目的蛋白质(例如本发明的抗体变体)分泌到生长培养基中，则对培养基进行纯化过程。抗体纯化通常涉及使用确立的方法从例如培养基中或从杂交瘤细胞系的培养上清液中分离抗体，所述方法通常涉及色谱法(例如使用亲和色谱法、阴离子和/或阳离子交换色谱法或其他分离技术)，以从不需要的宿主或组织培养基衍生的蛋白质和其他细胞污染物(例如核酸、碳水化合物等)中分离目的蛋白质。纯化的蛋白质也可以经历病毒灭活步骤。最后，例如可以将纯化的目的蛋白质冻干或配制以备储存、运输和后续使用。优选地，目的蛋白质(例如本发明的抗体或其抗原结合片段)在表达后基本上不含最初存在于培养基中的污染蛋白质。
生产方法可包括分离/纯化抗体变体/构建体(产物)的步骤。生产方法可包括将产物配制成包含至少一种附加组分如药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在特定实施方案中，本发明的抗体变体蛋白质(产物)是大于80％，如大于90％、大于95％、大于97％和大于99％纯的。
根据本发明的第六方面，提供了一种制备根据本发明第一方面的抗体变体的方法，其包括鉴定编码目的抗体的核酸序列，并修饰所述核酸序列以编码目的抗体的变体，该变体包含引入的多肽间隔区部分以编码根据本发明第一方面的抗体变体。
在特定的实施方案中，制备抗体变体分子的方法包括(i)鉴定编码目的抗体的一个或多个核酸序列；(ii)修饰所述核酸序列以编码目的抗体的变体，该变体包含引入的多肽间隔区部分以编码根据本发明第一方面的抗体变体；(iii)将来自步骤(ii)的所述修饰的核酸引入宿主细胞中；以及(iv)表达所述抗体变体分子。
根据本发明的第七方面，提供了一种降低抗体的激动活性的方法，其包括将间隔区部分引入抗体分子中，该间隔区部分增加分子的Fc受体结合位点与抗原结合位点之间的距离。在特定的实施方案中，该间隔区部分是多肽。在特定的实施方案中，该间隔区部分插入抗体铰链区中。在特定的实施方案中，该间隔区部分是刚性间隔区部分。
在本发明第六或第七方面的特定实施方案中，用于通过包含间隔区部分来降低激动作用的抗体或目的抗体选自：纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或cemiplimab、MEDI0680、dostarlimab、pidilizumab、AMP-224、camrelizumab、tislelizumab、genolimzumab、JS001-PD-1、伊匹木单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimimab)、tiragolumab、etigilimab、BMS-986207、Ab154、cobolimab、BMS-986258、MBG453、LY3321367、Sym023、muromab、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab)和foralumab。
药物组合物
虽然本文所述的抗体构建体分子可以单独施用，但在某些实施方案中，施用是药物组合物的施用，其中抗体变体分子用至少一种药学上可接受的赋形剂配制。
根据本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明第一方面的抗体变体/构建体或根据本发明第三至第五方面中任一方面产生的抗体变体以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
“药物组合物”是指这样的制品，其形式使得活性成分的生物活性是有效的，并且不包含对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。药物组合物将包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。本文中的术语赋形剂是指任何添加剂，如填充剂、增溶剂、载体、媒介物、添加剂等。
“药学上可接受的”赋形剂是可以合理地施用于受试哺乳动物，以提供所用活性成分的有效剂量的那些赋形剂。本发明的药物组合物通过将组合物与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))混合而以冻干制剂或水溶液的形式制备以供储存。可接受的赋形剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN(TM)、PLURONICS(TM)或聚乙二醇(PEG)。冻干的HER2抗体制剂在WO 97/04801中描述。
用于体内给药的组合物必须是无菌的。这可以通过穿过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
抗体变体分子或包含它的药物组合物的给药途径可以是，例如，口服、肠胃外、吸入或局部。如本文所用的术语肠胃外包括，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。
用于口服给药的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可包含固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。需要时，可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液，或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
用于肠胃外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液，和悬浮液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、水溶液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏(Ringers’)右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)，等等。
还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。另外，在人来源的某些实施方案中，所述组合物可包含蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白。对于静脉内注射，或在患处注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。如上所述，这些在本文中都称为赋形剂。
注射用组合物可以用本领域已知的医疗装置来施用，例如，采用皮下注射针。还可以使用无针注射装置，例如在美国专利6620135和5312335中公开的那些。
本发明的药物组合物可以单独施用，或根据待治疗的病况同时或依次与其他治疗联合施用。
本发明的抗体变体可以根据分子的物理化学性质和递送途径配制成液体、半固体或固体形式。制剂可包含赋形剂或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可具有宽范围的抗体浓度和pH。例如，固体制剂可以通过冻干、喷雾干燥或通过超临界流体技术的干燥来生产。
药物组合物可以作为单剂量、多剂量或在确定的时间段内输注施用。还可以调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗或预防反应)。特别地，肠胃外制剂可以是单次团注剂量、输注或加载团注剂量，然后是一个或多个维持剂量。这些组合物可以以特定的固定或可变间隔施用，例如每天一次，或“按需”施用。
剂量
治疗上有效的抗体变体分子或含有这类分子的药物制剂的量可以通过标准临床技术，例如通过剂量范围确定临床试验来确定。另外，可以任选地利用体外试验来帮助确定最佳剂量范围。将在制剂中使用的确切剂量还将取决于给药途径以及疾病或病症的严重性，并应根据医师的判断和每个患者的情况来确定。可以由得自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线外推得出有效剂量。待施用的组合物的剂量可由技术人员结合标准剂量响应研究来确定，而无需过度实验。在作出这些决定时要考虑的相关情况包括待治疗的一种或多种病况，待施用的组合物的选择，个体患者的年龄、体重和反应，以及患者症状的严重程度。例如，实际患者体重可用于计算待施用的以毫升(mL)为单位的制剂剂量。可能没有向下调整到“理想”重量。在这样的情况下，可以通过以下公式计算适当的剂量：
剂量(mL)＝[患者体重(kg)x剂量水平(mg/kg)/药物浓度(mg/mL)]
用于治疗特定疾病或病症的药物组合物的治疗有效剂量根据许多不同的因素而不同，包括给药方式、靶位点、患者的生理状态、患者的体重、患者的性别、患者的年龄、患者是人还是动物、所施用的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。治疗有效剂量可能是从临床试验中确定的，可由主治医生使用治疗指南来确定。通常，患者是人，但也可以治疗非人类哺乳动物。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量，以优化安全性和功效。
在各个实施方案中，抗体变体分子以约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg或约20mg/kg的浓度施用。
治疗/医学用途
本发明的抗体变体或包含所述本发明的抗体变体的药物组合物可用于治疗，通常用作药物。
根据本发明的第九方面，提供了用于治疗的根据本发明第一方面的抗体变体/构建体或根据本发明第八方面的药物组合物。
应当理解，本发明通常适用于任何抗体，因此本发明的抗体变体或包含它们的药学上可接受的制剂可用于治疗任何可能或需要抗体治疗的疾病。
在特定的实施方案中，该治疗是癌症的治疗。
在特定的实施方案中，该抗体变体与检查点抑制剂结合并且可用于治疗癌症。
根据本发明的第九方面，提供了一种治疗有需要的患者的方法，其包括向该患者施用根据本发明第一方面的抗体变体或根据本发明第八方面的药物组合物。在特定的实施方案中，该方法用于治疗癌症。在另一个实施方案中，治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用抗体变体分子或其药物组合物，该抗体变体分子已经被适配成通过分子的延伸以最大化其从紧密接触中的排除，来最小化/缺乏激动活性。在特定的实施方案中，该延伸是由在抗体中包含刚性间隔区部分而引起的。在特定的实施方案中，将根据本发明第一方面的抗体变体或根据本发明第八方面的药物组合物以药学上可接受的量施用于有需要的患者。
在该第九方面的变化中，提供了根据本发明第一方面的抗体变体或根据本发明第八方面的药物组合物，其在治疗有需要的患者的方法中使用。在特定的实施方案中，该方法用于治疗癌症。
在该第九方面的进一步变化中，提供了根据本发明第一方面的抗体变体或根据本发明第八方面的药物组合物在制备用于治疗有需要的患者的药物中的用途。在特定的实施方案中，该患者患有癌症并且该药物用于治疗所述癌症。
术语“有效量”是指足以改善患者症状或达到诸如T细胞的细胞溶解活性增加、肿瘤细胞死亡增加、肿瘤大小缩小等所需生物学结果的药物剂量或量。如果疾病是癌症，则有效量的药物可以减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓并优选地停止)癌细胞浸润到外周器官；抑制(即在一定程度上减缓并优选地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。就药物可以阻止肿瘤生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可能是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。有效量可以延长无进展生存期，导致客观反应(包括部分反应，PR，或完全反应，CR)，延长总生存时间，和/或改善癌症的一种或多种症状。
Fc受体(FcR)结合位点
在某些实施方案中，所述抗体变体具有功能性Fc受体(FcR)结合位点。
所述Fc受体可以是任何类别，特别是Fc-γ、Fc-ε和Fc-α受体。在特定的实施方案中，功能性Fc受体结合位点与选自Fc-gamma(Fcγ)、Fc-epsilon(Fcε)和Fc-alpha(Fcα)受体的Fc受体结合。应当理解，为了维持功能性Fc受体结合位点，优选地间隔区部分位于Fc受体结合位点的N末端。
在特定实施方案中，抗体变体能够与被酪氨酸激酶磷酸化的Fc受体结合。在特定实施方案中，抗体变体能够与仅具有一个或两个结构域的Fc受体结合，因此预期相对较小(因此与较大受体相比，从细胞表面突出得更少)，因此特别适合于用本文所述的抗体变体靶向。在上下文中，特别适合是指当结合时，抗体/Fc受体复合物远离紧密接触(由于抗体中的延伸)，因此使通过排除磷酸酶触发的对受体的激动作用最小化。
在特定实施方案中，抗体变体能够与选自但不限于以下的受体结合：CLEC12A、CLEC12B、CLEC1A、CLEC1B、CLEC4A、BDCA2(CLEC4C)、MINCLE(CLEC4E)、Dectin-2(CLEC6A)、Dectin-1(CLEC7A)、氧化的低密度脂蛋白受体1(CLEC8A)、DNGR-1(CLEC9A)、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKG2A、NKG2B、CD300a、CD300b、CD300c、CD300d、CD300e、CD300f、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、免疫球蛋白αFc受体、FcεRIα/β复合物、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、NKp46、NKp44、NKp30、CD33(SIGLEC-3)、SIGLEC-15、SLAMF1、2B4(SLAMF4)、SLAMF5、SLAMF6、SLAMF7(CRACC)、CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA、CD200R1、CD200R2、LAIR1、糖蛋白VI(GPVI)和OSCAR。
在其他实施方案中，所述抗体变体具有功能失调的或失能的Fc受体(FcR)结合位点。生成具有功能失调的或失能的Fc受体结合位点的抗体的能力是众所周知的，并且本领域技术人员无需创造性劳动即可实现这一点。实例包括将氨基酸置换引入Fc受体结合位点中。
通过包含间隔区进行修饰以产生抗体变体的抗体可以是激动性分子或拮抗性分子。
如本文所述，如果抗体是激动性分子，则抗体变体将降低抗体的超激动活性。当需要改变/降低超激动性分子的激动活性时，这可能是合乎需要的。
因此，在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是激动性抗体。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体分子与CD28结合。
发现被称为TGN1412的分子具有极强的毒性，由于其超激动性质，会引发细胞因子风暴。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是TGN1412抗体，或与TGN1412相比可以结合相同表位的抗体，其包含本文所述的间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体与TGN1412相比能够结合相同的表位。
免疫检查点途径
预期激动剂活性降低的治疗性抗体特别适用于治疗各种形式的癌症。
最近证明涉及靶向检查点蛋白质的癌症治疗特别有前途。
术语“免疫检查点”、“免疫检查点受体/配体轴”和“免疫检查点途径”在本文中可互换使用，是指在T细胞中传递负信号并减弱T细胞受体(TCR)介导的信号的受体/配体信号传导轴(途径)。在正常生理条件下，免疫检查点在维持自身耐受性和保护组织在免疫应答如病原体感染过程中免受损伤方面起着至关重要的作用。免疫检查点传递的T细胞中的负信号可导致，例如，减少的细胞增殖、细胞因子产生和/或细胞周期进程。可以使用本文公开的方法靶向的示例性免疫检查点途径包括但不限于PD-1/PD-L1免疫检查点途径和细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4、CD152)免疫检查点途径。
可以使用本文公开的抗体变体和方法靶向的其他免疫检查点途径包括但不限于选自以下的免疫检查点途径：BTLA(B和T淋巴细胞衰减物；也称为CD272)、TIGIT(也称为具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)、PD-1H(也称为T细胞活化的V结构域Ig阻抑物；VISTA)、TLT2(也称为TREML2)和TIM-3(T细胞免疫球蛋白粘蛋白3；也称为HAVcr2)。具体地，抗体，包括文献中已知的结合BTLA、TIGIT、PD-1H、TLT2或TIM3的激动性抗体，可以如本文所述通过并入本文所述的间隔区部分来修饰，以降低抗体的激动活性。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是与选自下组的免疫检查点途径分子结合的抗体变体：PD-1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、BTLA、PD-1H和TLT2。
结合免疫检查点途径的受体或配体并减弱免疫检查点途径的信号传导的拮抗剂组合物在本文中被称为“免疫检查点拮抗剂”(ImCpAnt)。
PD-1/PD-L1免疫检查点途径
PD-1/PD-L1免疫检查点轴被认为参与维持外周耐受性并限制组织内的T细胞效应物功能。已经报道，PD-1表达的破坏会在小鼠中引起自身免疫病样症状，例如迟发型进行性关节炎和狼疮样肾小球肾炎。PD-1在胸腺发育过程中主要在CD4-CD8-T细胞上表达，而在激活后在外周T细胞、B细胞和单核细胞上被诱导。PD-1/PD-L1免疫检查点途径的成员包括例如PD-1以及PD-1配体PD-L1(B7-H1、CD274)和PD-L2(B7-DC、CD273)。PD-L1在淋巴样细胞如T和B细胞以及非淋巴器官(包括心脏、肝脏、肺、胰腺、肌肉和胎盘)上表达。相比之下，PD-L2表达仅限于树突细胞和巨噬细胞。
在一些实施方案中，治疗用途和治疗方法使用抗体变体拮抗剂，如特异性结合PD-1、PD-L1和/或PD-L2的单克隆抗体。特异性结合PD-1、PD-L1和/或PD-L2的拮抗剂是已知的，并且/或者可以使用本领域已知的技术容易地鉴定和制备。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是拮抗性抗体，其中如本文所述并入间隔区部分以降低或消除激动活性。
检查点抑制剂拮抗性抗体如纳武单抗和派姆单抗被证明在癌症治疗中具有特别的治疗益处。抑制此类分子可能具有的任何残留的固有激动活性的能力可导致分子具有增加的益处。
因此，根据本发明的进一步实施方案，所述抗体变体是检查点抑制剂。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体结合PD-1。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是纳武单抗抗体，或与纳武单抗相比可以结合相同表位的抗体，其包含如本文所述的间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是派姆单抗抗体，或与派姆单抗相比可以结合相同表位的抗体，其包含如本文所述的间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是cemiplimab抗体，或与cemiplimab相比可以结合相同表位的抗体，其包含如本文所述的间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体与纳武单抗、派姆单抗或cemiplimab相比能够结合PD-1上的相同表位。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是选自下组的抗体：MEDI0680、dostarlimab、pidilizumab、AMP-224、camrelizumab、tislelizumab、genolimzumab和JS001-PD-1，或与这些抗体中的任一种相比可以结合相同表位的抗体，其包含如本文所述的间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体与选自下组的抗体相比能够结合PD-1上的相同表位：MEDI0680、dostarlimab、pidilizumab、AMP-224、camrelizumab、tislelizumab、genolimzumab和JS001-PD-1。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体结合CTLA-4。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是伊匹木单抗抗体，或与伊匹木单抗相比可以结合相同表位的抗体，其包含如本文所述的间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是tremelimumab抗体，或与tremelimumab相比可以结合相同表位的抗体，其包含如本文所述的间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体与伊匹木单抗或tremelimumab相比能够结合CTLA-4上的相同表位。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体结合TIGIT。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是选自下组的抗体：tiragolumab、etigilimab、BMS-986207和Ab154。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体与选自下组的抗体相比能够结合TIGIT上的相同表位：tiragolumab、etigilimab、BMS-986207和Ab154。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体结合TIM-3。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是选自下组的抗体变体：cobolimab、BMS-986258、MBG453、LY3321367和Sym023，其中所述变体并入如本文所述的间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体与选自下组的抗体相比能够结合TIM-3上的相同表位：cobolimab、BMS-986258、MBG453、LY3321367和Sym023。
检查点抑制抗体是众所周知的。关于免疫检查点阻断的综述和正在开发用于临床应用的抗体的示例，请参见Park等人,Exp lMol Med.50,109.2018年8月22日在线发表.doi:[10.1038/s12276-018-0130-1]。
降低固有激动剂活性的能力也可以应用于抗CD3抗体，这些CD3抗体在临床上用于通过TCR的弱触发来诱导T细胞无反应性。目前，这些抗体被工程改造以最小化FcR结合，使得它们仅具有弱激动剂作用，但是降低TCR激动作用的替代或补充方法是根据本文所述的发明引入刚性间隔区部分。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体结合CD3。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体是选自下组的抗体：muromab、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗和foralumab。
在特定的实施方案中，本发明的抗体变体与选自下组的抗体相比能够结合CD3上的相同表位：抗CD3抗体：muromab、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗和foralumab。
关于CD3抗体的综述，请参见Kuhn和Weiner,Immunology 8,889-906,2016.doi:10.2217/imt-2016-0049.Epub 2016年5月10日。
在特定实施方案中，本发明的抗体变体分子允许大的膜结合RPTP围绕抗体结合受体移动。
在本申请的整篇说明书和权利要求书中，词语“包含”和“含有”及其变化形式是指“包括但不限于”，并且它们并非旨在(也不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本申请的整篇说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则单数包括复数。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则该描述应被理解为考虑复数和单数。
结合本发明的特定方面、实施方案或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应被理解为适用于本文所述的其他任何方面、实施方案或实例，除非与其不相容。本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征，和/或所公开的任何方法或过程的所有步骤，都可以以任意组合的方式组合，但这类特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何随附的权利要求书、摘要和附图)中公开的任何新颖的一个特征或任何新颖的特征组合，或如此公开的任何方法或过程的任何新颖的一个步骤或任何新颖的步骤组合。
读者的注意力集中在与本申请相关说明书同时提交或在此之前提交的所有论文和文件，对本说明书而言这些论文和文件是公开的以供公众查阅，并且所有这些论文和文件的内容均通过引用并入本文。
现在将参考以下实施例和附图进一步描述本发明。
附图说明
图1。抗体引起的激动性信号传导。T细胞与靶细胞之间的接触导致“紧密接触”的形成，这排除了受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶(RPTP)，从而增强了激酶的活性。在(a)中，阻断抗体同时与信号受体(例如PD-1)和Fc受体(FcR)的结合使信号受体保持于排除磷酸酶的紧密接触中，从而导致信号传导，即使受体的配体结合位点被抗体阻断。在(b)中，FcR不存在(例如因为靶细胞是肿瘤细胞)或者抗体不能结合FcR，但抗体/受体复合物在形成时仍可进入或保持于紧密接触中，从而导致信号传导。在(c)中，抗体如本文所述被延伸，并且抗体创建了足够大以供RPTP进入的紧密接触。然后RPTP阻断由受体引起的信号传导。在(d)中，小的粘附蛋白创建紧密接触，导致延伸抗体的空间排斥，其携带结合的FcR。这阻止了由信号受体和FcR两者引起的信号传导。
图2显示了克隆2的重链的序列。
图3。JJ316激动作用是Fc依赖性的，但JJ316的去糖基化和Fc灭活(Fc SilentTM)形式具有活性。玻璃表面用100μg/mL抗IgG kappa轻链第二(2°)抗体(Ab)包被，或仅用包被缓冲液(无2°Ab)包被。在(a)中，BW5147细胞与无花果蛋白酶生成的F(ab’)2或未消化的抗体一起孵育，然后使其与包被的玻璃表面相互作用。在(b)和(c)中，细胞分别与PNGase F或Fc灭活形式的JJ316一起孵育。请注意，在(a)中，细胞表达的CD28水平高于(b)和(c)中的细胞，使它们对可溶性JJ316抗体更敏感。24小时后通过ELISA测定(eBioscience)评估IL-2的产生。
图4。在铰链区延伸的JJ316抗体的设计。(a)IgG抗体的四级结构的概述。(b)IgG铰链区的详细视图，显示了半胱氨酸C1和C2之间的插入点，用于添加30或50个残基的CD43衍生的粘蛋白样序列以延伸该抗体。
图5。JJ316抗体的工程化、延伸形式的分析。(a)延伸抗体的图示。(b)色谱分析。对50μg未修饰的JJ316、JJ316+30和JJ316+50进行大小排阻色谱分析。显示了分别注射不同抗体或注射约20μg每种抗体的混合物的色谱图。
Figure BDA0003215943650000381
FPLC系统(GE Healthcare)用于色谱分析，其配备有10/300 Sepharose 200柱；进样量为0.5mL。将抗体注射到磷酸盐缓冲盐水中并在其中洗脱。(c)延伸的JJ316抗体结合细胞表面表达的CD28。将CD28转染的BW5147细胞与未修饰或延伸的JJ316抗体(5μg/mL)一起孵育或不与抗体一起孵育，随后与
Figure BDA0003215943650000382
偶联的抗小鼠第二抗体(2μg/mL)一起孵育。通过流式细胞术测量结合。
图6。延伸的JJ316抗体具有结合能力，但表现出显著降低的信号传导能力。(a)将表达CD28的BW5147细胞与10μg/mL JJ316、JJ316+30、JJ316+50或JJ319(非超激动性抗CD28抗体)一起孵育，然后放置在用500μg/mL驴抗小鼠IgG(DAM)第二抗体和所示滴度的KT3抗CD3ε抗体包被的玻璃表面上。24小时后评估IL-2分泌。在(b)中，KT3抗体离开玻璃表面，而添加到细胞中的JJ316抗体则如所示进行滴定。
图7。激动性抗CD28抗体接触比同一抗体的延伸形式更有效地排除CD45。(a)对于与驴抗小鼠抗体包被的玻璃盖玻片相互作用的表达CD28的细胞，显示抗体(红色)和CD45(绿色)荧光分布的复合图像。上图和下图分别显示了用超激动剂JJ316和延伸抗体JJ316+50标记的细胞。在(b)中显示了对应于(a)中绘制的白色虚线的强度线轮廓。比例尺：2μm。
图8。克隆2结合性质。(a)PD-1上的克隆2表位的突变分析。显示了小鼠PD-1(用作人PD-1的模型)的配体结合域晶体结构的正交视图，其具有人类等效残基，所述残基的突变破坏了克隆2的结合，颜色为黑色，即N41、K53和A56。其突变没有影响的残基为灰色。圈出了由Almo和同事定义的PD-1的配体结合区的位置。(b)克隆2阻断配体结合。在注射接近饱和水平的克隆2抗体(0.1mg/ml；注射2)之前(注射1)和之后(注射2)，将PD-L1(0.35mg/ml)注射到含有固定化PD-1的BiacoreTM流动池中。显示了代表性的传感图。获得了PD-L2的等效数据，它与PD-1和PD-L1上的相似位置结合。(c)可溶性PD-1与固定化克隆2抗体结合的单循环动力学分析，KD为37nM。
图9。抗PD-1抗体(克隆2、克隆10和克隆19)对用OVA免疫后表达hPD-1的与野生型OT1转基因T细胞的体内扩充的影响(平均值±SEM)。
图10。通过插入本文所述的间隔区(50个残基)消除克隆2对PD-1的部分激动作用。(a)抗PD-1抗体对转基因CD8 T细胞的影响，和(b)对转基因CD4 T细胞的影响。
图11。PD-1阻断抗体纳武单抗的工程变体(D265A或50个残基的延伸)对用MVA-OVA免疫后表达hPD-1的与野生型OT1转基因CD8T细胞的体内扩充的影响(平均值±SEM)。
图12(a)通过表面等离子体共振(SPR)评估的mIgG1和延伸铰链(50个残基)mIgG1抗体与FcγRIIB的结合。(b)从SPR分析中获得的解离常数。
图13。克隆2与延伸的(50个残基)克隆2在MC38癌症模型中的有效性。C57BL/6雌性小鼠在胁腹皮下注射1x106个同基因结肠癌MC38细胞。当肿瘤达到100mm3的平均大小时，小鼠不再接受治疗，或每周两次注射指定的抗体，持续2周(箭头)。(a)和(b)显示了两个独立重复实验的结果。
实施例
在随后的实施例中，表明可能难以去除抗体的Fc受体结合活性。对于激活(抗CD28)和抑制性(抗PD-1)抗体的情况，还表明，通过使抗体更大，可以显著降低抗体的激动活性。在一些示例性实施方案中，这通过将刚性间隔区插入抗体的铰链区中以延伸恒定区来实现(图1c，d)。示例抗体克隆2的序列显示了相对于序列其他区域的插入点，在图2中示出。通过在抗体中引入间隔区部分以增加抗体的大小，这些示例性方法可用于拮抗任何抗体。
1.方法概述
为了研究CD28超激动性信号传导，使用抗大鼠CD28抗体JJ316(从BD Biosciences获得；目录号554992)(Tacke等人,Eur J Immunol.27:239-47,1997)。其他抗体由AbsoluteAntibody Ltd.制备。在一些实验中，还使用了非超激动性抗CD28抗体JJ319(eBioscienceUK Ltd；目录号16-0280-85)。为了测定抗体的激动活性，用溶液中的抗体预处理表达CD28的BW5147 T细胞杂交瘤(美国典型细胞培养物保藏中心，目录号TIB-47)，然后让细胞沉降到用500μg/ml驴抗小鼠IgG(DAM)抗体(Stratech Scientific 715-001-003-JIR)包被的玻璃表面上。第一抗体与DAM的结合模拟了抗体在体内的FcR结合。为了研究由抗体引起的“共刺激”信号传导，将抗CD3抗体KT3与DAM旁边的玻璃表面直接偶联。72小时后测量的IL-2产量用作信号传导的读数。
实施例1.JJ316的信号传导效应是Fc依赖性的；消除Fc效应物活性的常规方法对 信号传导的影响最小。
在300mM磷酸钾、12.5mM L-半胱氨酸、12.5mM EDTA中使用无花果蛋白酶(0.012-0.032单位/毫升；Sigma-Aldrich)制备JJ316抗体的缺乏Fc的F(ab’)2片段。将表达CD28的BW5147T细胞与指定量的F(ab’)2或完整抗体一起孵育，并测量IL-2的产生(图3a)。通常，使用40μl琼脂糖固定的无花果蛋白酶(1.2mg/ml的沉降珠子)在37℃下消化在5mM EDTA、4mM半胱氨酸、10mM柠檬酸盐pH6.0中为1.2mg/ml的0.5mg IgG1，持续4小时。
完全去除JJ316的Fc部分显著降低了抗体的超激动活性，表明该抗体的激动活性是Fc依赖性的。
这里显示的是，抗体的激动活性依赖于桥接表达PD-1的细胞与带有Fc受体的细胞之间的间隙的抗体(图1a)，并且通过灭活抗体的Fc受体结合活性难以阻止这种桥接效应。
消除抗体与FcR结合的两种广泛使用的方法是(1)酶促去糖基化(Mimura等人,J.Biol.Chem.276,45539-45547,2001)和(2)CH2恒定域的突变以破坏Fc受体结合(Duncan等人,Nature 332,563–564,1988)。超激动性抗体JJ316(1mg/mL)用PNGase F(New EnglandBiolabs，500,000U/mL)在50mM磷酸钠pH 7.5中消化，PNGase F从糖蛋白中去除N-聚糖。PNGase F处理对用固定化和可溶形式的抗体刺激的BW5147小鼠T细胞杂交瘤产生IL-2几乎没有影响(图3b)。类似地，经突变从而无法与CD16/CD32 Fc受体结合的JJ316的工程化形式(Hezareh等人,J Virol 75,12161–12168,2001)在杂交瘤中也仅产生轻微减弱的信号传导，这被测量为IL-2产生(图3c)。这些数据表明，用于消除整个小鼠抗体中Fc功能的常规方法并非完全有效。这些发现与Lux等人(J.Immunol.190,4315-23,2013)的发现一致，他们发现，对于人抗体，Fc受体结合位点的突变和抗体Fc区糖基化的改变不能完全消除所有IgG亚类与细胞Fc受体的相互作用。他们得出以下结论：IgG亚类特异性策略对于完全干扰人FcγR结合是必要的。
实施例2.具有延伸的铰链区的抗CD28抗体的设计。
设计了JJ316衍生的抗体，其通过在铰链结构域中的插入而延伸(图1c，d；图4)。选择源自鼠CD43的粘蛋白样胞外域N末端区域的重度糖基化序列，以创建刚性、很大程度上非柔性的插入，从而延伸抗体的整体尺寸。基于每个氨基酸添加
Figure BDA0003215943650000411
延伸结构的预测(Jentoft,Trends Biochem Sci 15:291–294,1990)，预期30个氨基酸的延伸将使抗体的大小增加
Figure BDA0003215943650000421
(沿着与Fc结构域的长轴平行的轴)。第二种更大形式的抗体是通过插入鼠CD43的N末端区域的50个氨基酸而生成的。
在小鼠IgG1中，重链铰链区中有四个半胱氨酸参与二硫键的形成。这四个中处于最N末端的(即C1；图4)与轻链中的半胱氨酸配对，并且对抗体四级结构的稳定性至关重要。为了使工程抗体变体的链能够正确二聚化并折叠，紧接在该半胱氨酸之后进行插入，从非常短的甘氨酸-丝氨酸连接体开始，允许形成CD43插入的二硫化物和O连接的糖基化。
添加第二个甘氨酸-丝氨酸连接体以将CD43插入连接到Fc序列的其余部分，其中包括参与重链间二硫键形成的其余三个半胱氨酸。这两种抗体在HEK 293T细胞中瞬时产生。这些抗体是通过本领域公知的方法创建的(参见
Figure BDA0003215943650000422
等人的综述,High leveltransient production of recombinant antibodies and antibody fusion proteinsin HEK 293T cells.BMC Biotechnol.13:52,2013；Vink等人,A simple,robust andhighly efficient transient expression system for producing antibodies.Methods65,5-10,2014；Kunert和Reinhart,Advances in recombinant antibodymanufacturing.Appl Microbiol Biotechnol.100,3451-61,2016)。概括地说，使用寡核苷酸完整合成编码抗体变体形式的基因。将这些基因插入到表达载体中，然后用来瞬时转染人胚胎肾细胞。分泌的抗体通过本领域公知的常规色谱程序纯化(参见Arora等人的综述，Affinity chromatography:A versatile technique for antibodypurification.Methods.116,84-94,2016)。
插入区域的氨基酸序列(另见图2)。
50个氨基酸的插入(斜体)：
Figure BDA0003215943650000423
PCICT(SEQ ID NO:7)
30个氨基酸的插入(斜体)：
Figure BDA0003215943650000424
(SEQ ID NO:8)
备注：
铰链区序列：下划线
铰链区半胱氨酸残基：粗体
GS连接体：正常字体
插入的CD43粘蛋白样序列：斜体。
实施例3.延伸的抗CD28抗体的表征。
通过大小排阻色谱法分析具有30和50个氨基酸的插入的JJ316的延伸形式(图5a，b)。对应于三种抗体的重叠色谱图显示，JJ316+50先被洗脱，然后是JJ316+30，然后是未修饰的JJ316(图5a，b)。当将抗体合并并重新运行时，蛋白质在两个峰中洗脱下来，第一个对应于延伸的抗体，其形成宽峰，第二个对应于未修饰的JJ316。因此，与未修饰的JJ316相比，CD43插入成功地增加了抗体的大小。流式细胞术分析证实，延伸的和原始的JJ316抗体同样好地结合细胞表面表达的CD28(图5c)。
实施例4.延伸的抗CD28抗体的信号传导性质。
当延伸的JJ316抗体与抗TCR抗体KT3联合用于刺激表达CD28的BW5147细胞时，它们与第二种非超激动性抗体JJ319(AbCam；目录号ab35024)在减少诱导半数最大信号传导所需的KT3量方面一样有效，从而满足了共刺激活性的定义(图6a)。这证实了，抗体的CD28结合性质，以及它们与驴抗小鼠抗体(DAM)[https://www.abcam.com/donkey-mouse-igg-hl-ab6707.html]结合的能力，不受铰链区延伸的影响。与未修饰的JJ316相比，这两种延伸抗体未能在不存在抗CD3抗体KT3(https://www.abcam.com/cd3-antibody-kt3-ab33429.html)的情况下诱导IL-2响应，后者是超激动作用的定义(图6b；参见Lin和Hünig,Efficient expansion of regulatory T cells in vitro and in vivo with a CD28superagonist.Eur J Immunol.33,626-38,2003)。用30或50个氨基酸的粘蛋白样插入物延伸JJ316显著降低了抗体的信号传导活性，但没有改变其结合活性。
实施例5.延伸抗CD28抗体超激动剂对RPTP(例如CD45)排除的影响。
为了显示延伸激动性抗体对在细胞与抗体接合时CD45局部排除的影响，使用了全内反射荧光(TIRF)成像。超激动性抗体JJ316和抗体的延伸形式JJ316+50用荧光染料(Alexa-647)标记。将50μg/ml的经标记抗体与表达CD28的细胞以及20μg/ml荧光标记的抗小鼠CD45抗体的Fab片段(YW62.3.20，获自Sir William Dunn School，Oxford，用Alexa-488荧光染料标记)一起孵育，然后放置在盖玻片上(用500μg/ml驴抗小鼠抗体包被过夜)，并使用TIRF进行成像(图7a；示出的复合图像是100帧的平均值，以50ms曝光拍摄)。成像清楚地表明，超激动性抗体JJ316比延伸抗体JJ316+50更有效地排除CD45，正如与JJ316+50孵育的细胞下的Alexa-488(即CD45)荧光大于Alexa-647(即抗体)荧光所证实的(图7a，b)。
实施例6.抗PD-1抗体克隆2的结合性质。
识别抗癌靶标PD-1的抗体是通过用表达的PD-1的胞外区与小鼠IgG1的Fc区的融合蛋白免疫小鼠而生成的。这些抗体之一——克隆2(如EP2342228B1中所述)——的表位通过对PD-1的细胞外免疫球蛋白超家族结构域中推定为表面暴露的残基进行剧烈突变，然后在HEK293T细胞表面上表达突变蛋白来定位。然后通过流式细胞术评估克隆2(如EP2342228B1中所述)结合突变蛋白的能力。该分析表明，克隆2与Almo及其同事证明与其天然配体PD-L1和PD-L2结合的PD-1区域结合(Zhang等人,Immunity.2004 20,337-47；图8a)。使用基于表面等离子体共振的分析，通过将抗体和配体依次注射到含有固定化PD-1的流动池中，测试了PD-1结合克隆2和配体PD-L1和PD-L2的能力(图8b)。PD-L1(和PD-L2)在结合接近饱和水平的克隆2抗体后未能与PD-1结合，证实克隆2是阻断抗体。单循环动力学分析(图8c)显示，克隆2与PD-1结合的解离常数(KD)为37nM，仅仅是纳武单抗与PD-1结合的解离常数(16nM)的约1/2。
实施例7.PD-1阻断抗体克隆2是激动性的。
使用灵敏的T细胞转移试验来测量克隆2抗体在体内的激动作用与拮抗作用。在该试验中，将5x105个T细胞转移到野生型(C57BL/6)接受体中，这些T细胞包含纯化的卵白蛋白(OVA)特异性OT1(TCR转基因的)CD8+T细胞的混合物，这些细胞来自表达纯合人PD-1(hPD-1)的小鼠和表达野生型PD-1受体的OT1小鼠(获自Jackson Laboratories)。使用CD45.2(相对于CD45.1)同种异型标志物将转移的细胞与宿主细胞区分开。第二天，用表达OVA的改良痘苗安卡拉病毒(MVA-OVA；108pfu)对接受小鼠进行免疫，以诱导T细胞的扩充(获自Jenner Institute,University of Oxford)。第二天，向小鼠腹膜内给予200μg抗体。T细胞初始转移后8天，确定了表达PD-1的与野生型OVA特异性T细胞之比。通过这种方式，可以跟踪与抗人PD-1抗体结合的人源化细胞相对于不与抗人PD-1抗体结合的野生型对照的扩充或减少。
在T细胞转移试验中，相对于在同种型对照处理或未治疗的小鼠中所观察到的，PD-1阻断抗体克隆2(如EP2342228B1中所述)抑制了hPD-1细胞的扩充(图9；平均值±SEM)。另外两种抗体也表现出激动活性。这包括第二阻断抗体，克隆10(一种抗PD-1抗体。参见EP2342228B1)，其以相对较低的亲和力与PD-1结合(6.2±0.3μM)，以及非阻断抗体，克隆19(如EP2342228B1中所述)，其结合完全不同的表位。这表明，激动性信号传导能力是抗PD-1抗体的固有性质，与亲和力或表位位置无关。
实施例8.通过延伸抗体的铰链区可以消除克隆2的激动活性。
为了消除克隆2(如EP2342228B1中所述)的激动性信号传导能力，完全如实施例3中所示并使用图2所示的序列，将CD43的粘蛋白样胞外区的50个氨基酸的区段插入到抗体的铰链区中，从而创建了抗体的延伸形式。该抗体在HEK 293T细胞中瞬时表达。将延伸抗体的激动活性与亲本抗体、非阻断性激动剂克隆19和抗hPD-1检查点阻断抗体纳武单抗的激动活性进行比较，该纳武单抗在D265A处突变以降低Fc受体结合(Nivo 265A)。纳武单抗可从诸如Absolute Antibody等许多供应商处商购获得。D265A突变降低了FcR结合，从而增强了抗体的阻断活性。
在抗体激动作用的T细胞转移试验中，克隆19和克隆2抗体表现出激动性信号传导效应，抑制表达人PD-1的CD8 T细胞相对于小鼠细胞以及小鼠注射抗NP同种型对照抗体的情况的扩充(图10a)。抗hPD-1检查点阻断抗体纳武单抗是无活性的，这大概是因为D265A突变降低了FcR结合，因而支持图1a中显示的激动性信号传导的解释。在CD4T细胞转移试验中观察到类似的结果，其中转移的OTII(OVA特异性的)CD4细胞用明矾(Alum)中的OVA刺激，之后用抗体处理(图10b)。从数据中可以看出，尽管保留了FcR结合能力，但延伸的克隆2抗体不再是激动剂，并且具有与D265A突变形式的纳武单抗相似的阻断活性。实施例9.通过延伸 抗体的铰链区可以消除PD-1阻断抗体纳武单抗的激动活性。
纳武单抗是一种在临床上用于治疗癌症患者的PD-1阻断抗体。临床使用的该抗体是人IgG4同种型。为了在人源化PD-1小鼠中评估该抗体，将其表达为包含与鼠IgG1同种型重链和轻链恒定区融合的纳武单抗可变域的嵌合体。当在实施例8中描述的灵敏CD8 T细胞转移试验中测试时，该嵌合抗体抑制表达人PD-1的细胞的扩充，提示它通过受体来传递激动信号(图11；平均值±SEM)。相反，当该嵌合抗体表达有降低FcR结合的D265A突变时，它导致表达人PD-1的CD8 T细胞的扩充，正如从检查点阻断抗体所预期的那样(图11)。该嵌合抗体也以包含实施例3中描述的50个残基的延伸的延伸形式表达。该抗体的这种延伸形式还增加了表达人PD-1的CD8 T细胞的扩充，提示铰链延伸消除了该抗体的激动潜力，从而导致更有效地阻断了该途径(图11)。
临床纳武单抗化合物的人IgG4同种型确实显示出Fc受体结合，提示该药物具有通过PD-1受体传递激动信号的潜力。虽然该药物在转移性恶性肿瘤背景下的净效应显然是PD-1途径阻断，但通过用恒定区的延伸去除任何激动活性，这种阻断的功效可能会增加。这可以导致有反应的患者出现更显著的肿瘤排斥，或者可以增加有反应的患者的比例。
实施例10.铰链延伸不改变mIgG1抗体与FcγRIIB的结合。
SPR用来评估50个残基的延伸是否显著影响Fc受体结合。鼠FcγRIIB胞外域通过胺偶联与CM5-系列-S传感器芯片共价偶联。类似大小的蛋白质(小鼠CD200胞外域)与参考通道偶联。在37℃下将浓度逐渐增加的mIgG1抗体或延伸铰链mIgG1抗体注射到芯片上，并测量平衡时的结合。对每种抗体，将平衡时减去参考的结合相对于浓度作图(图12a；插图Scatchard图显示数据的拟合质量)，并计算解离常数(图12b)。每种抗体的延伸铰链形式以与亲本抗体相等的亲和力与FcγRIIB结合。
实施例11.提高抗PD-1检查点阻断在癌症中的功效。
为了测试消除克隆2的激动性信号传导活性是否改善其作为治疗癌症的阻断性抗PD-1抗体的性能，使用了MC38同基因结肠癌模型，该模型先前曾用来证明抗小鼠PD-1检查点阻断的功效(US 2014/0348743)。成组的表达hPD-1的成年雌性C57BL/6雌性小鼠在胁腹皮下注射1x106个同基因结肠癌MC38细胞(获自Crown-Bio，Loughborough，UK)。当肿瘤达到100mm3的平均大小时，小鼠不再接受治疗，或每周两次注射10mg/kg的抗NP同种型对照NivoD265A，或完整的克隆2抗体或延伸的(50个残基)克隆2抗体，持续2周。克隆2和延伸的克隆2抗体的这种功效分析表明，在两个独立的重复实验中，延伸抗体的活性与Nivo D265A的活性无法区分(图13a，b)。相比之下，克隆2在抑制MC38肿瘤生长的能力方面表现出相当大的实验间差异。在一项实验中，克隆2几乎没有表现出阻断活性，而在第二项实验中，它与延伸的克隆2抗体一样有效。在这两项实验中，延伸的克隆2抗体阻断了肿瘤生长。
序列表
SEQ ID NO:1
取自蛋白质数据库(PDB)文件1HZH(hIgG1重链)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIHWVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEFSAKFQDRVTFTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYSWDDSPQDNYYMDVWGKGTTVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CDR1的位置：31-35(含)
CDR2的位置：50-66(含)
CDR3的位置：99-116(含)
CH1的位置：128-225(含)
铰链的位置：226-240(含)
CH2的位置：241-350(含)
CH3的位置：351-457(含)
Fc受体结合区的位置：241-249(含)；274-280(含)；304-309(含)；335-342(含)。
CDR的位置通过ABodyBuilder使用Kabat设置来预测(Dunbar等人,SAbPred:astructure-based antibody prediction server,Nucleic Acids Res.44:474-8,2016)。与Fcγ受体形成接触区的残基的位置使用PISA来预测(Krissinel和Henrick,J.Mol.Biol.372:774-797,2007)。
SEQ ID NO:2
(来自EP2342228B1中的克隆2的小鼠IgG1重链)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYYLYWVRQRPGQGLEWIGGINPSNGGTNFNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCTRRDYRYDRGFDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
CDR1的位置：31-35(含)
CDR2的位置：50-66(含)
CDR3的位置：99-109(含)
CH1的位置：121-217(含)
铰链的位置：218-230(含)
CH2的位置：231-337(含)
CH3的位置：338-444(含)
Fc受体结合区的位置：262(通过诱变确定)。
CDR的位置通过ABodyBuilder使用Kabat设置来预测(Dunbar等人,SAbPred:astructure-based antibody prediction server,Nucleic Acids Res.44,474-8,2016)。
SEQ ID NO:3
RTTMLPSTPHITAPSTSEAQNASPSVSVGSGTVDSKETISPWGQTTIPVS
SEQ ID NO:4
RTTMLPSTPHITAPSTSEAQNASPSVSVGS
SEQ ID NO:5
STTAVQTPTSGEPLVSTSEPLSSKMYTTSITSDPKADSTGDQTSALPPST
SEQ ID NO:6
STTAVQTPTSGEPLVSTSEPLSS
SEQ ID NO:7
VPRDCGSRTTMLPSTPHITAPSTSEAQNASPSVSVGSGTVDSKETISPWGQTTIPVSGS GCKPCICT
SEQ ID NO:8
VPRDCGSRTTMLPSTPHITAPSTSEAQNASPSVSVGSGSGCKPCICT。
序列表
<110> 牛津大学科技创新有限公司
<120> 修饰的抗体
<130> P262167WO
<150> GB1820547.6
<151> 2018-12-17
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 457
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDR1的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDR2的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(116)
<223> CDR3的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (128)..(225)
<223> CH1的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (226)..(240)
<223> 铰链的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (241)..(350)
<223> CH2的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (241)..(249)
<223> Fc受体结合区的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (274)..(280)
<223> Fc受体结合区的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (304)..(309)
<223> Fc受体结合区的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (335)..(342)
<223> Fc受体结合区的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (351)..(457)
<223> CH3的位置
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Lys Glu Phe Ser Ala Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Pro Tyr Ser Trp Asp Asp Ser Pro Gln Asp Asn Tyr
100 105 110
Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
210 215 220
Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 2
<211> 444
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(35)
<223> CDR1的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(66)
<223> CDR2的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(109)
<223> CDR3的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (121)..(217)
<223> CH1的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (218)..(230)
<223> 铰链的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (231)..(337)
<223> CH2的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (262)..(262)
<223> Fc受体结合区的位置
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (338)..(444)
<223> CH3的位置
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 3
<211> 50
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 3
Arg Thr Thr Met Leu Pro Ser Thr Pro His Ile Thr Ala Pro Ser Thr
1 5 10 15
Ser Glu Ala Gln Asn Ala Ser Pro Ser Val Ser Val Gly Ser Gly Thr
20 25 30
Val Asp Ser Lys Glu Thr Ile Ser Pro Trp Gly Gln Thr Thr Ile Pro
35 40 45
Val Ser
50
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 4
Arg Thr Thr Met Leu Pro Ser Thr Pro His Ile Thr Ala Pro Ser Thr
1 5 10 15
Ser Glu Ala Gln Asn Ala Ser Pro Ser Val Ser Val Gly Ser
20 25 30
<210> 5
<211> 50
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Ser Thr Thr Ala Val Gln Thr Pro Thr Ser Gly Glu Pro Leu Val Ser
1 5 10 15
Thr Ser Glu Pro Leu Ser Ser Lys Met Tyr Thr Thr Ser Ile Thr Ser
20 25 30
Asp Pro Lys Ala Asp Ser Thr Gly Asp Gln Thr Ser Ala Leu Pro Pro
35 40 45
Ser Thr
50
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Ser Thr Thr Ala Val Gln Thr Pro Thr Ser Gly Glu Pro Leu Val Ser
1 5 10 15
Thr Ser Glu Pro Leu Ser Ser
20
<210> 7
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 并入侧翼为铰链序列的来源于小鼠CD43的序列的合成肽插入序列
<400> 7
Val Pro Arg Asp Cys Gly Ser Arg Thr Thr Met Leu Pro Ser Thr Pro
1 5 10 15
His Ile Thr Ala Pro Ser Thr Ser Glu Ala Gln Asn Ala Ser Pro Ser
20 25 30
Val Ser Val Gly Ser Gly Thr Val Asp Ser Lys Glu Thr Ile Ser Pro
35 40 45
Trp Gly Gln Thr Thr Ile Pro Val Ser Gly Ser Gly Cys Lys Pro Cys
50 55 60
Ile Cys Thr
65
<210> 8
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 并入侧翼为铰链序列的来源于小鼠CD43的序列的合成肽插入序列
<400> 8
Val Pro Arg Asp Cys Gly Ser Arg Thr Thr Met Leu Pro Ser Thr Pro
1 5 10 15
His Ile Thr Ala Pro Ser Thr Ser Glu Ala Gln Asn Ala Ser Pro Ser
20 25 30
Val Ser Val Gly Ser Gly Ser Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
35 40 45

Claims (29)

1.一种抗体变体分子，其包含(i)Fc受体结合位点、(ii)抗原结合位点和(iii)位于(i)与(ii)之间的间隔区部分，其中所述间隔区部分用来增加(i)与(ii)之间的距离，并且与缺乏(iii)的抗体变体相比降低所述分子的激动活性。
2.根据权利要求1所述的抗体变体分子，其中所述间隔区部分增加所述分子的整体尺寸。
3.根据权利要求1或2所述的抗体变体分子，其中所述间隔区部分位于所述抗原结合位点与所述Fc受体结合位点之间的恒定域中。
4.根据权利要求1或2所述的抗体变体分子，其中所述间隔区部分位于所述抗体的铰链区中。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，其中当所述抗体变体与其抗原结合时，由包含所述间隔区部分引起的所述抗体变体的尺寸增加使所述抗体变体的Fc受体结合位点远离膜。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，其中所述间隔区部分是刚性间隔区部分。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，其中所述间隔区部分是多肽序列。
8.根据权利要求7所述的抗体变体分子，其中所述多肽序列具有长持续长度。
9.根据权利要求7或8所述的抗体变体分子，其中所述多肽序列是或包含粘蛋白或粘蛋白样多肽序列。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的抗体变体分子，其中所述多肽间隔区部分的存在使所述抗体的总长度增加了约40个氨基酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，其中所述间隔区部分使所述抗体的整体尺寸增加了至少
Figure FDA0003215943640000011
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，其中所述间隔区部分的存在使所述抗体变体相对于缺乏所述间隔区部分的相同抗体的激动活性降低了至少25％。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，当与其抗原结合时，所述抗体变体分子在空间上被排除在紧密接触之外。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，其中所述抗体变体是人或人源化抗体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，其中根据权利要求所述的抗体变体是人单克隆抗体。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子，其中所述抗体变体是拮抗剂。
17.根据权利要求16所述的抗体变体分子，其为检查点抑制剂，例如与选自下组的分子结合的检查点抑制剂：PD-1、CTLA-4、TIGIT、BTLA、PD-1H、TLT2和TIM-3。
18.一种或多种编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子的核酸分子。
19.一种核酸分子，其包含编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体变体分子的重链多肽的序列。
20.一种产生根据权利要求1至17中任一项所述的抗体变体分子的方法，该方法包括在宿主细胞中表达根据权利要求18或19所述的核酸。
21.一种制备根据权利要求1至17中任一项所述的抗体变体分子的方法，其包括(i)鉴定编码目的抗体的一个或多个核酸序列；(ii)修饰所述核酸序列以编码所述目的抗体的变体，该变体包含引入的多肽间隔区部分以编码根据权利要求1至17中任一项所述的抗体变体；(iii)将来自步骤(ii)的所述修饰的核酸引入宿主细胞中；以及(iv)表达所述抗体变体分子。
22.一种降低抗体分子的激动活性的方法，其包括将间隔区部分引入所述抗体分子中，该间隔区部分增加所述分子的Fc受体结合位点与抗原结合位点之间的距离。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述间隔区部分是根据权利要求3、4和6-11中任一项所述的间隔区部分。
24.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的抗体变体分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。
25.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体变体分子或根据权利要求24所述的药物组合物，其用于治疗，例如用于治疗癌症。
26.一种通过将抗体的总长度增加约40个氨基酸来降低该抗体的激动活性的方法。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述增加包括在所述抗体的Fc受体结合位点与抗原结合位点之间插入多肽序列，其中所述多肽具有至少
Figure FDA0003215943640000033
的持续长度。
28.一种去激动的IgG抗体构建体，其包含抗原结合区、Fcγ受体结合区和长度至少为20个氨基酸的多肽序列，该多肽序列插入该抗体的至少一个重链结构域中，使得在所述去激动的抗体构建体中，所述抗原结合区与所述Fcγ受体结合区之间的距离比相应野生型IgG抗体中的同一距离至少大
Figure FDA0003215943640000031
29.一种多肽构建体，其包含(i)效应细胞结合位点、(ii)抗原结合位点和(iii)去激动剂部分，其中所述去激动剂部分包含持续长度为至少
Figure FDA0003215943640000032
的多肽或拟肽序列，并且与缺乏所述去激动剂部分的相应构建体相比降低所述构建体的激动活性。
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