CN113453700A - 拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，如抗体和片段，以及方法、用途和组合。

Description

拮抗剂
技术领域
本发明涉及骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，如抗体和片段，以及方法、用途和组合。
背景技术
骨形态发生蛋白6(BMP6)为铁调素(hepcidin)的关键调节因子，铁调素为肝脏分泌的小肽，其为哺乳动物中铁代谢的主要调节因子。正在开发用于治疗或预防贫血的方法中的抗BMP6拮抗剂，如抗体(参见例如WO2016098079、US20160176956A1)。也参见WO2017191437，其公开抗BMP6拮抗剂与红细胞生成素刺激剂(ESA)的组合。
贫血为一种严重疾病，影响全球人口的25％，或超过17亿人，确切地说怀孕女性、新生儿和儿童。超过40％的贫血反映出铁摄取、储备和再循环的稳态控制中的功能失调。所述失调为包括感染(例如HIV、肝炎)、炎症(例如类风湿性关节炎)、癌症和肾病的多种慢性疾病的结果。在美国可见导致铁稳态失调的疾病的巨大影响，其中在4千万年龄＞65岁的成人中，10％罹患贫血且其中1/3是由慢性病症引起。
护理标准着重于输血和用ESA如EPO或
Figure BDA0002991179750000011
(安进公司(Amgen，Inc))治疗。
hamp基因编码铁调素，一种由肝脏产生的具25个氨基酸的肽激素。铁调素主要通过调节铁运输中涉及细胞的细胞表面上存在的铁转运蛋白膜铁转运蛋白(ferroportin)的量来控制细胞的铁流出而起作用。铁调素与膜铁转运蛋白相互作用，主要于巨噬细胞和十二指肠肠细胞上表达，导致膜铁转运蛋白的内化和降解(Ganz和Nemeth，2011；Ramey等，2010)。BMP6在涉及若干受体和辅因子的机制中触发铁调素表达。这些受体包括BMP I类和II类受体，其为触发hamp表达所必需，以及排斥性导向分子家族RGM的成员如RGMc(血幼素，HJV)和RGMb(DRAGON)、蛋白裂解酶-2、再生蛋白(neogenin)、HFE以及转铁蛋白受体1和2。SMAD路径可能由BMP6与可能还涉及HJV的I类BMP受体的初始相互作用触发。这导致与自磷酸化的BMPR II的结合和BMPRI磷酸化的激活，从而触发SMAD级联。磷酸化的SMAD1、5和8以及最终SMAD4易位到细胞核以与hamp基因控制区中的BMP响应元件相互作用以触发铁调素表达。在小鼠中，SMAD4信号传导分子或I型受体Alk2和ALk3的肝特异性破坏降低铁调素表达，与BMP6敲除类似，证实所述因子也是相关路径的一部分(Steinbicker等，2011；Wang等，2005)。
·Ganz，T.，Nemeth，E.，2011.铁调素-膜铁转运蛋白系统作为贫血和铁超负荷病症的治疗靶标(The Hepcidin-Ferroportin System as a Therapeutic Target inAnemias and Iron Overload Disorders).《血液学(Hematology)》2011，538-542.
·Ramey，G.，Deschemin，J.C.，Durel，B.，Canonne-Hergaux，F.，Nicolas，G.，Vaulont，S.，2010.铁调素靶向膜铁转运蛋白以在肝细胞中降解(Hepcidin targetsferroportin for degradation in hepatocytes).《血液学(Haematologica)》95，501-504.
·Steinbicker，A.U.，Bartnikas，T.B.，Lohmeyer，L.K.，Leyton，P.，Mayeur，C.，Kao，S.M.，Pappas，A.E.，Peterson，R.T.，Bloch，D.B.，Yu，P.B.，Fleming，M.D.，Bloch，K.D.，2011.BMP I型受体缺失对铁调素表达的干扰诱导小鼠铁超负荷(Perturbation ofhepcidin expression by BMP type I receptor deletion induces iron overload inmice).《血液(Blood)》118，4224-4230.
·Wang，R.-H.，Li，C.，Xu，X.，Zheng，Y.，Xiao，C.，Zerfas，P.，Cooperman，S.，Eckhaus，M.，Rouault，T.，Mishra，L.，2005.SMAD4通过正向调控铁调素的表达在铁代谢中的作用(A role of SMAD4 in iron metabolism through the positive regulation ofhepcidin expression).《细胞代谢(Cell Metab.)》2，399-409.
发明内容
本发明提供以下：
一种抗体或片段，其包含特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)的结合位点，其中所述结合位点包含VH结构域，其中所述VH结构域包含包括SEQ ID NO：114的VH结构域的CDRH3序列。
一种抗体或片段，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO：114或与其具有至少70％一致性的氨基酸。
一种抗体或片段，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包含VL结构域，其中所述VL结构域包含包括SEQ ID NO：123的VL结构域的CDRL3序列。
一种抗体或片段，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包含VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO：123或与其具有至少70％一致性的氨基酸。
一种抗体或片段，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含(i)重链氨基酸序列，其包含SEQ ID NO：116或与其具有至少70％一致性的氨基酸；和/或(ii)轻链序列，其包含SEQ ID NO：125或与其具有至少70％一致性的氨基酸。
一种抗体或片段，其(i)特异性结合人类BMP6抗原决定基，所述抗原决定基与本发明抗体结合的抗原决定基一致；和/或(ii)与本发明抗体竞争结合人类BMP6。
本发明还提供以下配置。
在第一配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其包含特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)的结合位点，其中所述结合位点包含由源自人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组的核苷酸序列编码的VH结构域，其中所述VH基因区段选自IGHV3-11和IGHV1-3。
在第二配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其特异性结合BMP6且包含根据本发明的抗BMP6抗体的CDRH3序列，或所述CDRH3序列包含3、2或1个氨基酸取代。
在第三配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其特异性结合BMP6且包含VH结构域，所述VH结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的CDRH3序列；或所述序列包含3、2或1个氨基酸取代。
在第四配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包含VH结构域，所述VH结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的VH结构域的氨基酸序列；或与其具有至少70％一致性的氨基酸。
在第五配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包含由源自人类VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码的VL结构域，其中所述VL基因区段选自IGKV3-20、IGKV1-5和IGKV3-15。
在第六配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其特异性结合BMP6且包含本发明的抗BMP6抗体的CDRL3序列，所述CDRL3序列包含3、2或1个氨基酸取代。
在第七配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其特异性结合BMP6且包含VL结构域，所述VL结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或所述序列各包含3、2或1个氨基酸取代。
在第八配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包含VL结构域，所述VL结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的VL结构域的氨基酸序列；或与其具有至少70％一致性的氨基酸。
在第九配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其特异性结合BMP6且包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的重链氨基酸序列；或与其具有至少70％一致性的氨基酸。
在第十配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其特异性结合BMP6且包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的轻链氨基酸序列；或与其具有至少70％一致性的氨基酸。
在第十一配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其特异性结合人类BMP6抗原决定基，所述人类BMP6抗原决定基与本发明抗体(例如CL-58838)结合的抗原决定基一致。
在第十二配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其与本发明抗体竞争结合人类BMP6。
在第十三配置中，本发明提供：
一种本发明的抗BMP6抗体或片段，其用于治疗或预防个体中的BMP6介导的疾病或病状(任选地贫血)。
在第十四配置中，本发明提供：
一定量的抗BMP6抗体或片段和一定量的ESA的组合(任选地包含多个剂量的所述抗体和/或ESA)，其中所述抗体或片段是根据本发明。
在第十五配置中，本发明提供：
一种本发明的抗体、片段或组合的用途，其用于制造供施用到个体以治疗或预防BMP6介导的疾病或病状、任选地贫血的药物。
在第十六配置中，本发明提供：
一种治疗或预防个体中的BMP6介导的疾病或病状(任选地贫血)的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的抗体、片段或组合，其中借此治疗或预防所述BMP6介导的疾病或病状。
在第十七配置中，本发明提供：
一种医药组合物，其包含本发明的抗体、片段或组合和医药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
在第十八配置中，本发明提供：
一种核酸，其编码本发明的抗体或片段的VH结构域和/或VL结构域。
在第十九配置中，本发明提供：
一种核酸，其编码VH结构域，所述VH结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的VH结构域的氨基酸序列；或与其具有至少70％一致性的氨基酸。
在第二十配置中，本发明提供：
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：115、520或521的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：124、522或523的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：115的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：124的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：520的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：522的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：521的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：523的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
在第二十一配置中，本发明提供：
第一核酸和第二核酸的组合(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其分别包含
(a)与SEQ ID NO：115、520或521的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：124、522或523的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
第一核酸和第二核酸的组合(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其分别包含
(a)与SEQ ID NO：115的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：124的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
第一核酸和第二核酸的组合(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其分别包含
(a)与SEQ ID NO：520的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：522的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
第一核酸和第二核酸的组合(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其分别包含
(a)与SEQ ID NO：521的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：523的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
在第二十二配置中，本发明提供：
一种核酸，其编码本发明的抗体或片段的重链和/或轻链。
在第二十三配置中，本发明提供：
一种核酸，其编码包含与SEQ ID NO：116具有至少70％一致性的氨基酸序列的重链。
在第二十四配置中，本发明提供：
一种核酸，其编码包含与SEQ ID NO：125具有至少70％一致性的氨基酸序列的轻链。
在第二十五配置中，本发明提供：
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的所选重链序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的所选序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与选自SEQ ID NO：512、514、516、518和519的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与选自SEQ ID NO：513、515和517的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：512具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：513具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：516具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：517具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：518具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：513具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：519具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：513具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：518具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：517具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(如如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：519具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：517具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：514具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：515具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：516具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：517具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：518具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：513、515或517具有至少70％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如，在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：519具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：513、515或517具有至少70％一致性的核苷酸序列。
在第二十六配置中，本发明提供：
一种载体，其包含所述核酸；任选地其中所述载体为CHO或HEK293载体。
在第二十七配置中，本发明提供：
一种宿主细胞，其包含所述核酸或所述载体。
在第二十八配置中，本发明提供：
一种如本文所述的抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、用途或方法。
在第二十九配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其特异性结合骨形态发生蛋白(BMP)，其用于治疗或预防人类或动物个体中由血幼素(HJV)缺乏的BMP-BMP受体(BMPR)复合物引起的疾病或病状的方法中，其中所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段以在所述个体中抑制所述复合物的形成和/或抑制所述复合物对细胞内信号传导的触发，借此治疗或预防HJV非依赖性BMP-BMPR介导的疾病或病状。
一种抗体或片段，其特异性结合骨形态发生蛋白(BMP)，其用于治疗或预防人类或动物个体中的HJV非依赖性贫血或骨质疏松症的方法中，其中所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段以在所述个体中抑制血幼素(HJV)缺乏的BMP-BMP受体(BMPR)复合物的形成和/或抑制所述复合物对细胞内信号传导的触发，借此治疗或预防HJV非依赖性贫血或骨质疏松症。
一种抗体或片段，其特异性结合骨形态发生蛋白(BMP)，其用于治疗或预防人类或动物个体中的血幼素(HJV)非依赖性贫血或骨质疏松症的方法中，其中所述方法包括向所述个体施用所述抗体，借此治疗或预防HJV非依赖性贫血或骨质疏松症。
本发明还提供所述用于治疗疾病或病状例如贫血或骨质疏松症的方法。
附图说明
图1：
使用HepG2 hamp荧光素酶报道基因细胞系和各种人类BMP配体作为刺激剂建立检定窗口。通过用递增浓度添加的各种人类BMP蛋白(R&D Systems或Peprotech)刺激细胞，测试HepG2细胞中人类铁调素启动子调节元件控制下的红萤火虫荧光素酶基因的功能。在两种不同的培养基设置即含有1％FBS的MEM(A)和含有25％MEM的融合瘤培养基(B；细节参见实施例1)中测试检定的性能。
图2：
使用以递增浓度添加的各种人类或小鼠BMP6配体作为刺激剂(R&D Systems或Peprotech)评估HepG2 hamp荧光素酶报道基因细胞检定窗口。将BMP6稀释于含有1％FBS的MEM中。使用25％HMM，总检定体积为60μl(更多细节和所用试剂参见实施例1)。
图3：
使用于含1％FBS的MEM中固定浓度为1nM的人类BMP6(Peprotech)或小鼠BMP6(R&DSystems)和稀释于融合瘤维持培养基(HMM)中的来自R&D Systems的商业小鼠抗BMP6单克隆抗体MAB507(A)和MAB2365(B)，评估HepG2 hamp荧光素酶报道基因细胞检定窗口；(更多细节和试剂参见实施例1)。
图4：
使用五个bmp6-/-Kymice通过反向
Figure BDA0002991179750000091
检定(珀金埃尔默(Perkin Elmer))进行免疫化方案KM089的血清滴度测定，其中用抗小鼠IgG(山羊抗小鼠IgG；SouthernBiotech1030-01)经由Fc结构域捕获以各种连续稀释添加的血清中包含的IgG抗体，随后与生物素化的BMP6一起温育，且使用DELFIA Eu-N1铕标记的抗生蛋白链菌素(珀金埃尔默)检测。截止值(低于所述值的任何信号判为阴性)定义为所有重复物的阴性对照平均值+3x标准差。图例中的KMBM代码是指个别KymouseTM bmp6-/-动物。
图5：
通过SDS-PAGE分离2μg/泳道纯化人类BMP6(Peprotech)且在还原(R)和非还原(NR)条件下用考马斯蓝(A)染色，且将来自所述凝胶的蛋白质印迹印迹到膜上，随后用纯化的人类抗BMP6抗体作为标记进行检测。通过增强化学发光用抗人类K轻链-辣根过氧化物酶(HRP)和过氧化物酶(CL-58838和抗体A)或用抗人类Fc-碱性磷酸酶(AP)和磷酸酶5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)和硝基蓝四唑鎓(NBT)比色底物转化(抗体B)检测结合抗体。
图6：
基于用BMPRIA(ALK3、CD292)和BMPRII(T-ALK；图A)或BMPRIA(ALK6)和BMPRII(T-ALK；图B)转染的U2OS细胞的受体二聚化检定。用BMP6(Peprotech 120-06SEQ ID NO：2)的配体驱动的二聚化产生化学发光信号。人类抗BMP6 IgG4抗体CL-58838和抗BMP6抗体A、B(A)，人类抗BMP6 IgG4抗体1-8(B)和鼠类单克隆抗体MAB507(R&D Systems；A和B)以递增浓度添加(11点稀释)。各情况下两个实验的代表性数据。在两个实验中皆使用适当的同种型对照IgG。
图7：
纯化的CL-58838IgG4(SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：125)与人类BMP2(A)、BMP4(B)、BMP5(C)、BMP7(D)和BMP9(E；细节描述于实施例7中)的交叉反应性概况。通过添加递增量的CL-58838来研究抗BMP6抗体CL-58838对HepG2细胞中BMP驱动的hamp荧光素酶报道基因激活的影响。作为阳性对照，添加相关的BMP特异性抗体(均来自R&D Systems)以干扰相关BMP激活。
图8：
在单次静脉内注射抗BMP-6或同种型IgG对照抗体后，根据表12(对于图8A-D)、表13(对于图8E-G)和表14(对于图8H和I)绘制的正常大鼠中的绘制转铁蛋白饱和度％(TSAT)。
图9：
在单次静脉内注射不同剂量的CL-58838(A)或1mg/kg的CL-58838和抗体A(B；表15)后的正常大鼠中的转铁蛋白饱和度％(TSAT)的结果。
图10：
在单次皮下注射不同剂量的CL-58838(A)或1mg/kg的CL-58838和抗体A和B(B；表16)后的正常大鼠中的转铁蛋白饱和度％(TSAT)的结果。
图11：
人类抗BMP6 IgG4抗体CL-58838在不同剂量下单次静脉内注射后(A)或在1mg/kg剂量下与抗体A进行比较(B)的药物动力学(PK)曲线。单次皮下(sc)注射不同剂量的CL-58838(C)或1mg/kg剂量的抗体A和B(D)后的PK曲线。结果以随时间[小时(h)]变化的IgG[ng/ml]IgG绘制。
图12：
ACD的大鼠PG-PS模型的结果。转铁蛋白饱和度TSAT(A)，血红蛋白[g/dL](B)，MCH[pg](C)，以及在开始治疗后第0周(D)、第1周(E)和第2周(F)的血清铁调素含量[ng/mL](*ρ＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
图13：
在食蟹猴中单次静脉内施用3mg/kg的CL-58838以及抗体A和B(A)和不同剂量的CL-58838(B)之后的转铁蛋白饱和度％(TSAT)，以及在食蟹猴中单次静脉内施用3mg/kg的CL-58838以及抗体A和B(C)和不同剂量的CL-58838(D)之后的血浆铁调素含量。
图14：
在食蟹猴中在不同剂量下单次静脉内注射后CL-58838的PK曲线(A)和3mg/kg的CL-58838与抗体A和B的PK曲线比较(B)。
图15：
基于V区使用和CDRH3的与CL-58838高度相关的抗体Vh和Vk序列(表6)的氨基酸序列比对。顶线显示出在本发明中使用的bmp6-/-Kymouse中编码的IMGT V区基因IGHV3-11和IGKV3-20的生殖系序列。将下文所选抗体序列中与生殖系V区序列不同的氨基酸位置加框。选择用于体内评估的抗体以粗体显示(表6)。
图16：
均相时间分辨式FRET(HTRF)检定显示基于V区使用与CL-58838高度相关的抗体和通过NGS序列鉴定的CDRH抗体(表6)与经标记的CL-58838(10nM)竞争结合以32nM存在的人类BMP6的能力。竞争抗体以起始于3μM最终浓度在11点稀释范围内的一系列浓度添加。
图17：
实验设置和从实施例17获得的结果。实验时程的图解说明(A)，纳入大鼠和施用EPO的决定图(B)，血红蛋白[g/dL](C)，MCV[fL](D)，MCH[pg](E)和施用的EPO剂量[％](F)。使用基线作为协变数(C-E)和使用Fishers精确检验(F)的关于第4周相比于基线的变化的ANCOVA分析。数据显示为平均值±SEM(*ρ＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
图18：
实验设置和实施例18的结果。实验时程的图解说明(A)，血红蛋白[g/dL](B)，MCV[fL](C)，MCH[pg](D)，肝脏Hamp mRNA含量[表达倍数]，血浆铁含量[μg/dL](F)和TSAT值[％]。应用Dunnett校正与EPO进行多重比较的方差分析。显示出EPO与EPO+CL-58838的比较结果。数据显示为平均值±SEM(*ρ＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
图19：
从实施例19获得的结果。比较在施用1μg/kg EPO与不同CL-58838浓度的组合后治疗组的血红蛋白值[g/dL](A)，在施用10mg/kg CL-58838与不同EPO剂量的组合后的血红蛋白值[g/dL](B)，在施用1μg/kg EPO与不同CL-58838浓度的组合后小鼠的MCV值[fL](C)和TSAT[％](D)，在施用1mg/kg CL-58838与不同EPO剂量的组合后小鼠的MCV值[fL](E)，所有治疗组中的肝脏Hamp mRNA含量[表达倍数](F)。应用Dunnett校正与II组进行多重比较的方差分析。数据显示为平均值±SEM(*ρ＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。
具体实施方式
定义
除非本文另有定义，否则科学和技术术语应具有一般技术者通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。
除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一”和“所述”包括复数个指示物。类似地，除非上下文另有明确说明，否则词语“或”旨在包括“和”。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料可用于本公开案的实践或测试，但合适的方法和材料于下文描述。缩写“例如”源自拉丁语exempli gratia且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如”与术语“举例来说”同义。
在本说明书和权利要求书中，术语“约”用于修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、工艺温度、工艺时间、产率、流速、压力和其类似值，以及其范围，用于描述本公开案的实施方案。术语“约”是指例如经由用于制备化合物、组合物、浓缩物或使用调配物的典型测量和处理程序；经由这些程序中的无意误差；经由用于实施所述方法的起始物质或成分的制造、来源或纯度的差异以及类似考虑因素而可能发生的数量变化。术语“约”还涵盖由于具有特定初始浓度或混合物的调配物的老化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的调配物而不同的量。在由术语“约”修饰的情况下，随附权利要求书包括所述量的等效物。
如本文所用，“施用”或“投与”是指将存在于体外的物质(例如，本文提供的抗hBMP6抗体)注射或以其它方式物理传递到患者体内的行为，如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内传递和/或本文所述或本领域中已知的任何其它物理传递方法。当治疗疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作之后施用所述物质。当预防疾病或其症状时，物质的施用通常在疾病或其症状发作之前进行。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并且意指经由免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂质或前述的组合的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体，完整单克隆抗体，抗体片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)，单链Fv(scFv)突变体，多特异性抗体如双特异性抗体(包括双重结合抗体)，嵌合抗体，人源化抗体，人类抗体，包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其它修饰免疫球蛋白分子，只要所述抗体展现所需生物活性即可。术语“抗体”还可指分子量为约150kDa的Y形糖蛋白，其由四条多肽链组成：两条轻(L)链和两条重(H)链。存在五种类型的哺乳动物Ig重链同种型，由希腊字母α、δ、ε、γ和μ表示。重链的类型分别限定抗体的类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。基于恒定结构域序列和功能的差异将γ和α类进一步分为亚类，例如IgG1、hIgG2、mIgG2A、mIgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在哺乳动物中，存在两种类型的免疫球蛋白轻链，λ和κ。抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。所述结构域通常为抗体的最可变部分(相对于同一类别的其它抗体)且含有抗原结合位点。抗体的一个实例为仅重链(即H2)抗体，其包含重链的二聚体(5′-VH-(任选的铰链)-CH2-CH3-3′)且无轻链。
本文所述的抗体可为寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、骆驼化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体(包括双重结合抗体)、催化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人类抗体、抗独特型抗体，包括可以可溶性或结合形式标记的抗体以及其片段、变异体或衍生物，单独或与通过已知技术提供的其它氨基酸序列组合。抗体可来自任何物种。本文所述的抗体可为裸抗体或与其它分子如毒素、放射性同位素等结合。
术语“抗原结合位点”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”、“抗原结合片段”和类似术语是指包含与抗原相互作用且赋予结合剂对抗原(例如互补决定区(CDR))的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体部分。抗原结合区可源自任何动物物种，如啮齿动物(例如兔、大鼠或仓鼠)和人类。优选地，抗原结合区将为人类来源。
本文所述的抗原结合片段可包括单链Fv(scFv)，单链抗体，单结构域抗体，结构域抗体，Fv片段，Fab片段，F(ab′)片段，F(ab′)2片段，展现所需生物活性的抗体片段，二硫键稳定的可变区(dsFv)，二聚体可变区(双功能抗体)，抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗体的抗Id抗体)，胞内抗体，线性抗体，单链抗体分子和由上述任何一种抗体片段和抗原决定基结合片段形成的多特异性抗体。确切地说，本文所述的抗体和抗体片段可包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。用酶木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，也称为“Fab”片段，和不具有抗原结合活性但具有结晶能力的“Fc”片段。当在本文中使用时，“Fab”是指包括重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域的抗体片段。本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。“Fc片段”是指通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应功能由Fc区中的序列决定，所述区域也由某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。用酶胃蛋白酶消化抗体产生F(ab′)2片段，其中抗体分子的两个臂保持连接且包含两个抗原结合位点。F(ab′)2片段具有交联抗原的能力。
与基因区段相关的术语“源自……的重组”对于本领域技术人员来说为显而易见的，其应理解为B细胞将其可变区基因区段重组以产生可变结构域的编码序列。举例来说，“源自人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组”涉及一个人类VH基因区段与一个DH基因区段和一个JH基因区段重组在一起以形成编码重链抗体可变结构域的重排VDJ序列。连接和体细胞超突变也可为所述过程的特征，借此所得重组VDJ序列包括生殖系V、D和J序列所不包含的一个或多个核苷酸添加、取代或缺失(例如，p添加和/或n添加)。对于κ轻链可变结构域，等效物被称为Vκ和Jκ基因区段，而对于λ轻链可变结构域，称为Vλ和Jλ。意指任何翻译后修饰可另外涵盖于可变结构域中。
当在本文中使用时，“Fv”是指保留抗原识别和抗原结合位点的抗体的最小片段。所述区域由紧密的非共价或共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在所述配置中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总共六个CDR赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具特异性的CDR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，但其亲和力低于整个结合位点。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指由基本上均质抗体的群体获得的抗体，即除了可能的天然发生突变和/或可能少量存在的翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成所述群体的个别抗体相同。单克隆抗体具高度特异性且针对单一抗原决定子或抗原决定基。相反，多克隆抗体制剂通常包括针对不同抗原决定子(或抗原决定基)的不同抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)，单链(scFv)突变体，包含抗体部分的融合蛋白，和包含抗原识别位点的任何其它修饰免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以多种方式制备的这些抗体，所述方式包括但不限于融合瘤、噬菌体选择、重组表达和转殖基因动物。本文的单克隆抗体可包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，而所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，以及展现所需生物活性的所述抗体片段。
术语“人源化抗体”是指其中来自非人类免疫球蛋白(供体抗体)的“高变区”替代人类免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区的残基的嵌合抗体子集。一般来说，人源化抗体将包括基本上全部的至少一种且通常两种可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的高变环，并且全部或基本上全部的构架区为人类免疫球蛋白序列的构架区，尽管所述构架区可包括改良抗体性能的一个或多个取代，如结合亲和力、异构化、免疫原性等。
术语“双特异性抗体”是指包含对两种靶分子的特异性的抗体，且包括但不限于如以下形式：DVD-Ig(参见DiGiammarino等，“设计和生成用于双特异性靶向的DVD-IgTM分子(Design and generation of DVD-IgTM molecules for dual-specific targeting)”，《分子生物学方法(Meth.Mo.Biol.)》，2012，889，145-156)，mAb2(参见WO2008/003103，mAb2形式的描述以引用的方式并入本文)，FIT-Ig(参见WO2015/103072，FIT-Ig支架的描述以引用的方式并入本文)，mAb-dAb，对接和锁定(dock and lock)，Fab臂交换，SEEDbody，Triomab，LUZ-Y，Fcab，κλ体，正交Fab，单链双功能抗体-Fc，双功能抗体-Fc，串联scFv-Fc，Fab-scFv-Fc，Fab-scFv，胞内抗体，BiTE，双功能抗体，DART，TandAb，单链双功能抗体，单链双功能抗体-CH3，双功能抗体-CH3，三功能抗体，微型抗体，微抗体，TriBi微抗体，scFv-CH3 KIH，scFv-CH-CL-scFv，F(ab′)2-scFv，scFv-KIH，Fab-scFv-Fc，四价HCab，ImmTAC，旋钮入孔(knobs-in-holes)，具有共同轻链的旋钮入孔，具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔，电荷对，具有共同轻链的电荷对，DT-IgG，DutaMab，IgG(H)-scFv，scFv-(H)IgG，IgG(L)-scFv，scFv-(L)IgG，IgG(L，H)-Fv，IgG(H)-V，V(H)-IgG，IgG(L)-V，V(L)-IgG，KIH IgG-scFab，2scFv-IgG，IgG-2scFv，scFv4-Ig和zybody。关于双特异性形式的综述，参见Spiess，C.等，《分子免疫学(Mol.Immunol.)》(2015)。在另一实施方案中，双特异性分子包含与另一种非Ig形式融合的抗体，例如T细胞受体结合结构域；免疫球蛋白超家族结构域；无颌类可变淋巴细胞受体；纤维结合蛋白结构域(例如AdnectinTM)；抗体恒定结构域(例如CH3结构域，例如，FcabTM的CH2和/或CH3)，其中恒定结构域并非功能性CH1结构域；scFv；(scFv)2；单链双功能抗体；scFab；Centyrin和源自选自CTLA-4(EvibodyTM)的支架的抗原决定基结合结构域；脂质运载蛋白结构域；蛋白质A，如蛋白质A的Z结构域(例如AffibodyTM或SpA)；A结构域(例如AvimerTM或MaxibodyTM)；热休克蛋白(如源自GroEI和GroES的抗原决定基结合结构域)；转铁蛋白结构域(例如穿膜抗体(trans-body))；锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM)；肽适体；C型凝集素结构域(例如TetranectinTM)；人类γ-晶体蛋白或人类泛素(affilin)；PDZ结构域；蝎子毒素；和人类蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域。
在一个实施方案中，双特异性抗体为mAb2。mAb2包含来自完整抗体的VH和VL结构域，其与已经工程改造以形成抗原结合位点的修饰恒定区(称为“Fcab”)融合。在WO2008/003103中更详细描述Fcab/mAb2形式背后的技术，且mAb2形式的描述以引用的方式并入本文。
在另一实施方案中，双特异性抗体为“双重结合抗体”。如本文所用，术语“双重结合抗体”为双特异性抗体，其中两个抗原结合结构域由VH/VL对形成，且包括FIT-Ig(参见WO2015/103072，其以引用的方式并入本文)，mAb-dAb，对接和锁定，Fab臂交换，SEEDbodv，Triomab，LUZ-Y，Fcab，κλ体，正交Fab，单链双功能抗体-Fc，双功能抗体-Fc，串联scFv-Fc，Fab-scFv-Fc，Fab-scFv，胞内抗体，BiTE，双功能抗体，DART，TandAb，单链双功能抗体，单链双功能抗体-CH3，双功能抗体-CH3，三功能抗体，微型抗体，微抗体，scFv-CH3 KIH，scFv-CH-CL-scFv，F(ab′)2-scFv，scFv-KIH，Fab-scFv-Fc，四价HCab，ImmTAC，旋钮入孔，具有共同轻链的旋钮入孔，具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔，电荷对，具有共同轻链的电荷对，DT-IgG，DutaMab，IgG(H)-scFv，scFv-(H)IgG，IgG(L)-scFv，scFv-(L)IgG，IgG(L，H)-Fv，IgG(H)-V，V(H)-IgG，IgG(L)-V，V(L)-IgG，KIH IgG-scFab，2scFv-IgG，IgG-2scFv和scFv4-Ig。
术语“高变区”、“CDR区”或“CDR”是指在序列上高变和/或形成结构限定环的抗体可变结构域的区域。通常，抗体的抗原结合位点包括六个高变区：VH中的三个(CDRH1、CDRH2、CDRH3)和VL中的三个(CDRL1、CDRL2、CDRL3)。抗体的重链和轻链的这些区域赋予抗体以抗原结合特异性。CDR可根据Kabat系统定义(参见Kabat，E.A.等，1991，“《免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》”，第5版，NIH出版物编号91-3242，美国卫生与公众服务部(U.S.Department ofHealth and HumanServices))。其它系统可用于定义CDR，其为由Chothia等设计的系统(参见Chothia，C.和Lesk，A.M.，1987，“免疫球蛋白超变区的典型结构(Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins)”，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，196，901-917)和IMGT系统(参见Lefranc，M.P.，1997，“免疫基因分析的独特数据库编号系统(Unique database numbering system for immunogenetic analysis)”，《当今免疫学(Immunol.Today)》，18，50)。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。术语CDR或CDRs在此用于表示这些区域中的一个或几个。本领域技术人员能够容易地比较不同的命名系统并确定特定序列是否可定义为CDR。
“人类抗体”为具有与由人类产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或使用任何制备人类抗体的技术制备的抗体，并且特别地排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。术语“特异性结合”是指可测量且可再现的相互作用，如靶标与抗体之间的结合，其决定在包括生物分子的异质分子群体存在下靶标的存在。举例来说，特异性结合靶标(其可为抗原决定基)的抗体为结合所述靶标相比于其结合其它靶标具有更大亲和力、亲合力、更容易和/或具有更长持续时间的抗体。在一个实施方案中，抗体与不相关靶标的结合程度小于抗体与靶标的结合的约10％，如例如通过放射免疫检定(RIA)所测量。
特异性结合hBMP6抗原的抗体或其片段可与相关抗原交叉反应。优选地，特异性结合hBMP6抗原的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应(但可任选地与不同物种例如恒河猴或鼠类的BMP6交叉反应)。可例如通过免疫检定、BIAcoreTM或本领域技术人员已知的其它技术鉴定特异性结合hBMP6抗原的抗体或其片段。抗体或其片段与BMP6抗原特异性结合，当其与hBMP6抗原结合时具有比使用实验技术测定的任何交叉反应性抗原更高的亲和力，所述实验技术如放射免疫检定(RIA)和酶联免疫吸附检定(ELISA)。通常，特异性或选择性反应将为背景信号或噪音的至少两倍，且更通常为背景的超过10倍(如超过15倍，超过20倍，超过50倍或超过100倍)。关于抗体特异性的讨论，参见例如保罗(Paul)编，1989，基础免疫学(Fundamental Immunology)，第二版，Raven Press，纽约(New York)，第332-336页。
术语“脂肪族氨基酸”是指氨基酸R基团为非极性且疏水的。疏水性随着烃链中C原子数增加而增加。甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族氨基酸。
术语“芳香族氨基酸”意指氨基酸R基团含有芳香族环系。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸为芳香族氨基酸。
术语“含羟基的氨基酸”意指氨基酸R基团含有羟基且为亲水的。丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸为含羟基氨基酸。
术语“碱性氨基酸”意指氨基酸R基团含氮且在中性pH下为碱性。组氨酸、赖氨酸和精氨酸为碱性氨基酸。
术语“环状氨基酸”意指氨基酸R基团具有脂肪族环状结构。脯氨酸为唯一环脂肪族氨基酸。
术语“酸性氨基酸”意指氨基酸R基团为极性的且在生理pH下带负电荷。天冬氨酸和谷氨酸为酸性氨基酸。
术语“酰胺氨基酸”意指氨基酸R基团含有酰胺基团。天冬酰胺和谷氨酰胺为酰胺氨基酸。
如本文所用，“许可号”或“上市许可号”是指由监管机构发布的号码，所述机构确定特定医疗产品和/或组合物可在所述机构的管辖下在所述区域内行销和/或提供销售。如本文所用，“监管机构”是指负责评估例如医疗产品和/或组合物的安全性和功效以及控制所述产品和/或组合物在给定区域内的销售/行销的机构之一。美国的食品药品管理局(FDA)和欧洲的欧洲药品管理局(EPA)仅为这类监管机构的两个实例。其它非限制性实例可包括SDA、MPA、MHPRA、IMA、ANMAT、香港卫生署药物事务处、CDSCO、Medsafe和KFDA。
如本文所用，“缓冲液”是指能够吸收一定量的酸或碱而不经历强烈pH变化的化学试剂。
如本文所用，术语“载剂”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂或媒剂。所述医药载剂可为无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当经静脉内施用医药组合物时，水为优选载剂。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载剂，确切地说用于可注射溶液。
术语“化学治疗剂”或“化学疗法”是指主要目的为通常通过干扰肿瘤细胞的生长或繁殖能力来破坏癌细胞的治疗剂。存在许多不同类型的化学治疗剂，其中有超过50种批准的化学治疗药物可用。化学治疗药物可基于其作用方式进行分类。烷基化药物通过直接攻击基因的遗传物质DNA来杀死癌细胞。环磷酰胺为一种烷基化药物。抗代谢物会干扰DNA的产生且使细胞不会生长和繁殖。抗代谢物的实例为5-氟尿嘧啶(5-FU)。抗肿瘤抗生素由天然物质如土壤中的真菌制成。它们干扰重要的细胞功能，包括DNA和细胞蛋白的产生。小红莓(doxorubicin)和博莱霉素(bleomycin)属于所述组化学治疗药物。植物生物碱可防止细胞正常分裂。长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)为从长春花植物获得的植物生物碱。类固醇激素减缓一些依赖激素的癌症的生长。举例来说，他莫昔芬(tamoxifen)用于治疗依赖于激素雌激素生长的乳癌。DNA损伤反应(DDR)抑制剂，如PARP抑制剂，阻断单链或双链断裂后的DNA修复机制。
化学治疗剂的实例包括阿霉素(Adriamycin)，小红莓，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷(Ara-C)，环磷酰胺，塞替派(Thiotepa)，泰索帝(Taxotere)(多西紫杉醇(docetaxel))，白消安(Busulfan)，癌得星(Cytoxin)，泰素(Taxol)，甲氨喋呤，顺铂，美法仑(Melphalan)，长春碱，博莱霉素，依托泊苷(Etoposide)，异环磷酰胺，丝裂霉素C，米托蒽醌(Mitoxantrone)，长春新碱，长春瑞滨(Vinorelbine)，卡铂(Carboplatin)，替尼泊苷(Teniposide)，道诺霉素(Daunomycin)，卡米诺霉素(Carminomycin)，氨基喋呤(Aminopterin)，放线菌素(Dactinomycin)，丝裂霉素(Mitomycins)，埃斯培拉霉素(Esperamicins)(参见美国专利No.4,675,187)，美法仑和其它相关氮芥。合适的毒素和化学治疗剂描述于《雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，第19版(Mack Publishing Co.1995)；以及Goodman和Gilman，《治疗学的药理基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)》，第7版(麦克米伦出版公司(MacMillanPublishing Co.)1985)中。化学治疗剂的另一实例为抗体结合毒素的类别，包括但不限于吡咯并苯并二氮杂卓、美登木素(maytansanoid)、卡奇霉素(calicheamicin)等。其它合适的毒素和/或化学治疗剂为本领域技术人员已知。
如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖含有任选地指定量的指定成分(例如本发明的抗体)的产品，以及直接或间接由任选地指定量的指定成分的组合产生的任何产品。
如本文所用，术语“包含”涉及抗体、片段、用途、组合物、方法和其相应组分使用，其对于方法或组合物来说为必要的，但仍然包含未指明的要素，无论是否必要。
术语“由……组成”是指如本文所述的抗体、片段、用途、组合物、方法和其相应组分，其不包括在所述实施方案的描述中未列举的任何要素。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。所述术语允许存在不会基本上影响所述实施方案的基本且新颖或功能特征的要素。
在多肽的上下文中，如本文所用的术语“衍生物”包括包含hBMP6多肽、hBMP6多肽片段、或通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的特异性结合hBMP6多肽的抗体或片段的氨基酸序列的多肽。如本文所用的术语“衍生物”还包括hBMP6多肽，hBMP6多肽片段，或已例如通过任何类型的分子与多肽的共价连接而化学修饰的特异性结合hBMP6多肽的抗体。举例来说，但并非作为限制，hBMP6多肽、hBMP6多肽片段或hBMP6抗体可例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白质的连接等进行化学修饰。衍生物以在连接分子的类型或位置上不同于天然存在或起始肽或多肽的方式进行修饰。衍生物进一步包括天然存在于肽或多肽上的一个或超过一个化学基团的缺失。可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰对hBMP6多肽、hBMP6多肽片段或hBMP6抗体的衍生物进行化学修饰，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、调配、衣霉素的代谢合成等。此外，hBMP6多肽、hBMP6多肽片段或hBMP6抗体的衍生物可含有一种或超过一种非经典氨基酸。多肽衍生物具有与本文所述的hBMP6多肽、hBMP6多肽片段或hBMP6抗体相似或相同的功能。
如本文所用的术语“效应功能”(或“效应子启用”)是指抗体依赖性细胞介导细胞毒性活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性(CDC)介导的反应、Fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和经由FcRn受体的抗体再循环中的一种或超过一种。
“有效量”是指在必要的剂量和时段内有效实现所需作用(包括治疗或预防结果)的量。“治疗有效量”是指实现特定病症的可测量改善或预防所需的最小浓度。本文的治疗有效量可根据如以下因素而改变：疾病状态，患者的年龄、性别和体重，以及抗体在个体中引发所需反应的能力。治疗有效量也是其中抗体的毒性或有害作用超过治疗有益作用的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时段内有效实现所需预防结果的量。在一些实施方案中，本发明抗体的有效量为约0.1mg/kg(mg抗体/kg个体体重)到约100mg/kg。在某些实施方案中，其中提供的抗体的有效量为约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg(或其中的范围)。在一些实施方案中，如本文所用的“有效量”也指本发明抗体实现指定结果(例如抑制细胞的hBMP6生物活性)的量。
如本文所用的术语“抗原决定基”是指抗原如hBMP6多肽或hBMP6多肽片段的表面上的局部区域，其能够与抗体的一个或超过一个抗原结合区结合，并且在动物、优选哺乳动物且最优选人类中具有抗原或免疫原活性，其能够引发免疫应答。具有免疫原活性的抗原决定基为多肽的一部分，其在动物中引发抗体应答。具有抗原活性的抗原决定基为抗体特异性结合的多肽的一部分，如通过本领域中熟知的任何方法，例如通过本文所述的免疫检定所测定。抗原性抗原决定基不一定具免疫原性。抗原决定基通常由分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团组成，且具有特定三维结构特性以及特定电荷特性。有助于抗原决定基的多肽区域可为多肽的连续氨基酸，或者抗原决定基可由多肽的两个或两个以上非连续区域聚集在一起。抗原决定基可能为或可能不为抗原的三维表面特征。在某些实施方案中，hBMP6抗原决定基为hBMP6多肽的三维表面特征(例如以hBMP6多肽的三聚体形式)。在其它实施方案中，hBMP6抗原决定基为hBMP6多肽的线性特征(例如以hBMP6多肽的三聚体形式或单体形式)。本文提供的抗体可特异性结合hBMP6的单体(变性)形式的抗原决定基，hBMP6的三聚体(天然)形式的抗原决定基，或hBMP6的单体(变性)形式与三聚体(天然)形式。在特定实施方案中，本文提供的抗体特异性结合hBMP6的三聚体形式的抗原决定基，但不特异性结合hBMP6的单体形式。
如本文所用的术语“赋形剂”是指通常用作稀释剂、媒剂、防腐剂、粘合剂或药物稳定剂的惰性物质，且包括但不限于蛋白质(例如血清白蛋白等)，氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)，脂肪酸和磷脂(例如烷基磺酸酯、辛酸酯等)，表面活性剂(例如SDS、聚山梨醇酯、非离子型表面活性剂等)，糖类(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇等)。也参见《雷明顿药物科学》(1990)MackPublishing Co.，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，Pa.)，其以引用的方式整体并入本文。
在肽或多肽的上下文中，如本文所用的术语“片段”是指包含少于全长氨基酸序列的肽或多肽。所述片段可例如由在氨基末端的截短，在羧基末端的截短，和/或来自氨基酸序列的残基的内部缺失而产生。片段可例如由替代RNA剪接或体内蛋白酶活性产生。在某些实施方案中，BMP6片段包括包含hBMP6多肽或特异性结合hBMP6多肽的抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。在一个特定实施方案中，hBMP6多肽片段或特异性结合hBMP6抗原的抗体保留所述多肽或抗体的至少1个、至少2个或至少3个功能。
术语“游离”可以指与缓冲液组合的多肽，例如BMP6或片段和其变异体，其中所述多肽不与细胞表面或细胞膜结合。因而，术语“游离”可以指能够表面表达(即包括一个或超过一个跨膜结构域或膜结合结构域)，但在目前状态下不表达在细胞表面上或结合于细胞表面上表达的蛋白质的多肽。游离多肽也可指游离的重组或天然或未结合的多肽。在噬菌体呈现的上下文中，游离抗原可以在溶液中选择(在本文中称为“可溶性选择”)或吸附到表面，例如吸附到96孔板的表面(在本文中称为“生物淘选选择”)。
如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含抗体的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(即通常并非抗体的一部分的多肽或蛋白质(例如非抗BMP6抗原抗体))的氨基酸序列的多肽。当与BMP6或抗BMP6抗体一起使用时，术语“融合”是指肽或多肽或其片段、变异体和/或衍生物与异源肽或多肽的连接。优选地，融合蛋白保留BMP6或抗BMP6抗体的生物活性。在某些实施方案中，融合蛋白包含BMP6抗体VH结构域、VL结构域、VH CDR(一个、两个或三个VHCDR)和/或VL CDR(一个、两个或三个VL CDR)，其中所述融合蛋白特异性结合BMP6抗原决定基。
当关于抗体使用时，术语“重链”是指基于重链恒定结构域的氨基酸序列的五种不同类型，称为α、δ、ε、γ和μ。所述不同类型的重链为众所周知的，且分别产生五类抗体，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。优选地，重链为人类重链。在人类群体中，存在各免疫球蛋白或免疫球蛋白亚类的多个重链恒定区等位基因。所述等位基因变异体的核苷酸和氨基酸序列可在公开可用的数据库如IMGT、ENSEMBL Swiss-Prot和Uniprot上获得。也可在各种基因组测序计划中鉴定等位基因变异体。在一个实施方案中，本文公开的抗体和抗体片段包含由IgG1恒定区等位基因编码的重链，其包括但不限于人类IGHG1*01(Seq ID No：340、341和537)、IGHG1*02(Seq ID No：340、341和537)、IGHG1*03(Seq ID No：523和524)、IGHG1*04(Seq ID No：525和526)和IGHG1*05(Seq IDNo：340、341和537)。在一个实施方案中，本文公开的抗体和抗体片段包含由IgG2恒定区等位基因编码的蛋白质，其包括但不限于人类IGHG2*01(Seq ID No：527和528)、IGHG2*02(Seq ID No：529和530)、IGHG2*03(Seq ID No：527和528)、IGHG2*04(Seq ID No：531和532)、IGHG2*05(Seq ID No：527和528)和IGHG2*06(Seq ID No：533和534)。在一个实施方案中，本文公开的抗体或抗体片段包含由IgG3恒定区等位基因编码的蛋白质，其包括但不限于人类IGHG3*01、IGHG3*02、IGHG3*03、IGHG3*04、IGHG3*05、IGHG3*06、IGHG3*07、IGHG3*08、IGHG3*09、IGHG3*10、IGHG3*11、IGHG3*12、IGHG3*13、IGHG3*14、IGHG3*15、IGHG3*16、IGHG3*17、IGHG3*18和IGHG3*19。在一个实施方案中，本文公开的抗体或抗体片段包含由IgG4恒定区等位基因编码的蛋白质，其包括但不限于人类IGHG4*01(参见例如本文的序列表)、IGHG4*02(参见例如本文的序列表)、IGHG4*03(参见例如本文的序列表)和IGHG4*04(参见例如本文的序列表)。在另一实例中，重链为禁用IgG同种型，例如禁用IgG4。在某些实施方案中，本发明的抗体包含人类γ4恒定区。在另一实施方案中，重链恒定区不结合Fc-γ受体，并且例如包含Leu235Glu突变。在另一实施方案中，重链恒定区包含Ser228Pro突变以增加稳定性。在另一实施方案中，重链恒定区为IgG4-PE(参见例如本文的序列表)。在另一实施方案中，本文公开的抗体和抗体片段包含由鼠类IgG1恒定区等位基因编码的重链恒定区，其包括但不限于小鼠IGHG1*01或IGHG1*02。在一个实施方案中，本文公开的抗体和抗体片段包含由鼠类IgG2恒定区等位基因编码的重链恒定区，其包括但不限于小鼠IGHG2A*01、IGHG2A*02、IGHG2B*01、IGHG2B*02、IGHG2C*01、IGHG2C*02或IGHG2C*03。在一个实施方案中，本文公开的抗体或抗体片段包含由鼠类IgG3恒定区等位基因编码的蛋白质，其包括但不限于小鼠IGHG3*01。
如本文所用的术语“宿主”是指动物，优选为哺乳动物，且最优选为人类。
如本文所用的术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的特定个体细胞和这种细胞的后代或潜在后代。由于可能在后代中发生的突变或环境影响或核酸分子整合到宿主细胞基因组中，这种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不同。
在施用其它疗法的情形下，术语“组合”是指使用一种以上的疗法。术语“组合”的使用并不限制对患有疾病的个体施用疗法的顺序。第一疗法可在向患有、具有或易患BMP6介导疾病的个体施用第二疗法之前(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)，同时或之后(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。任何额外疗法可与其它额外疗法以任何顺序施用。在某些实施方案中，本发明的抗体可与一种或超过一种疗法(例如，并非本发明抗体的疗法，其目前施用用于预防、治疗、管理和/或改善BMP6介导疾病)组合施用。可与本发明的抗体组合施用的疗法的非限制性实例包括镇痛剂、麻醉剂、抗生素或免疫调节剂或美国药典和/或医师案头参考中列出的任何其它药剂。
如本文所用，“注射装置”是指设计用于进行注射的装置，注射包括将注射装置暂时流体连接到人体组织(通常为皮下组织)的步骤。注射进一步包括将一定量的液体药物施用到组织中且将注射装置与组织分离或移除。在一些实施方案中，注射装置可为静脉内装置或IV装置，其为当靶组织为循环系统内的血液(例如静脉中的血液)时使用的一种注射装置。注射装置的常见但非限制性实例为针和针筒。
如本文所用，“说明书”是指在物品的直接容器上显示书面、印刷或图形物质，例如在含有医药活性剂的小瓶上显示的书面材料，或者关于含有相关组合物的试剂盒中包括的相关产品的组成和用途的细节。说明书阐述预期施用或进行的治疗方法。
“分离的”或“纯化的”抗体或蛋白质为已从其生产环境的组分(例如天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的抗体或蛋白质。举例来说，抗体或蛋白质基本上不含来自抗体来源的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白质，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括其中抗体与从中分离或重组产生的细胞的细胞组分分离的抗体制剂。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％、20％、10％或5％(干重)异源蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)的抗体制剂。当重组产生抗体时，其也优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％或5％。当抗体通过化学合成产生时，其优选基本上不含化学前体或其它化学物质，即，其与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，所述抗体制剂具有小于约30％、20％、10％、5％(干重)的化学前体或除相关抗体之外的化合物。在一个优选实施方案中，本发明的抗体为分离或纯化的。
术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中为公认的，且是指比抗体或其抗原结合部分的重链可变区中的其它氨基酸残基更可变(即高变)的氨基酸残基的编号系统(Kabat等，(1971)《纽约科学院年报(Ann.NY Acad.Sci.)》，190：382-391；和Kabat等，(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质序列》，第五版，美国卫生与公众服务部，NIH出版物编号91-3242)。对于重链可变区，高变区通常在CDR1的氨基酸位置31到35，CDR2的氨基酸位置50到65，以及CDR3的氨基酸位置95到102范围内。
如本文所用，“标记”或“经标记的”是指向多肽添加可检测部分，例如放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或生物素化基团或金。放射性同位素或放射性核素可包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、115In、125I、131I，荧光标记可包括罗丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体或FITC，且酶标记可包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶。其它标记包括(作为说明而非限制)：酶，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶；染料(例如花青染料，例如Cy5TM、Cy5.5TM或Cy7TM)；额外的荧光标记或荧光剂包括如荧光素和其衍生物，荧光染料，GFP(GFP为“绿色荧光蛋白”)，其它荧光蛋白(例如mCherry、mTomato)，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，藻红蛋白(phycoerythrin)，藻蓝蛋白(phycocyanin)，别藻蓝蛋白(allophycocyanin)，邻苯二甲醛和荧光胺；荧光团，如镧系元素的穴状化合物和螯合物，例如铕等(珀金埃尔默和Cisbio检定)；化学发光标记或化学发光剂，如异鲁米诺(isoluminol)、鲁米诺(luminol)和二氧杂环丁烷；增敏剂；辅酶；酶底物；颗粒，如乳胶或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可以用染料、催化剂或其它可检测基团进一步标记；分子如生物素、地高辛(digoxygenin)或5-溴去氧尿苷；毒素部分，例如选自以下组的毒素部分：假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒性片段或突变体)，白喉毒素或其细胞毒性片段或突变体，肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F，蓖麻毒素或其细胞毒性片段例如蓖麻毒素A，相思子毒素或其细胞毒性片段，皂草素或其细胞毒性片段，美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段，以及异株泻根毒蛋白1或其细胞毒性片段。
当关于抗体使用时，术语“轻链”是指免疫球蛋白轻链，其中在哺乳动物中存在两种类型，λ和κ。优选地，轻链为人类轻链。优选地，轻链恒定区为人类恒定区。在人类群体中，存在多个轻链恒定区等位基因。所述等位基因变异体的核苷酸和氨基酸序列可于公开可用的数据库如IMGT、ENSEMBL、Swiss-Prot和Uniprot上获得。在一个实施方案中，本文公开的抗体或抗体片段包含由人类κ恒定区等位基因编码的蛋白质，其包括但不限于IGKC*01(参见例如本文的序列表)，IGKC*02(参见例如本文的序列表)，IGKC*03(参见例如本文的序列表)，IGKC*04(参见例如本文的序列表)和IGKC*05(参见例如本文的序列表)。在一个实施方案中，本文公开的抗体或抗体片段包含由人类λ恒定区等位基因编码的蛋白质，其包括但不限于IGLC1*01(参见例如本文的序列表)，IGLC1*02(参见例如本文的序列表)，IGLC2*01(参见例如本文的序列表)，IGLC2*02(参见例如本文的序列表)，IGLC2*03(参见例如本文的序列表)，IGLC3*01(参见例如本文的序列表)，IGLC3*02(参见例如本文的序列表)，IGLC3*03(参见例如本文的序列表)，IGLC3*04(参见例如本文的序列表)，IGLC6*01(参见例如本文的序列表)，IGLC7*01(参见例如本文的序列表)，IGLC7*02(参见例如本文的序列表)，IGLC7*03(参见例如本文的序列表)。在另一实施方案中，本文公开的抗体和抗体片段包含由小鼠κ恒定区等位基因编码的轻链恒定区，其包括但不限于IGKC*01、IGKC*03或IGKC*03。在另一实施方案中，本文公开的抗体和抗体片段包含由小鼠λ恒定区等位基因编码的轻链恒定区，其包括但不限于IGLC1*01、IGLC2*01或IGLC3*01。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列和必要时引入缺口以实现最大百分比序列一致性并且不考虑任何保守取代作为序列一致性的一部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对可以本领域范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEG ALIGNTM(DNASTAR)软件。在一个实施方案中，同源性％为约70％。在一个实施方案中，同源性％为约75％。在一个实施方案中，同源性％为约80％。在一个实施方案中，同源性％为约85％。在一个实施方案中，同源性％为约90％。在一个实施方案中，同源性％为约92％。在一个实施方案中，同源性％为约95％。在一个实施方案中，同源性％为约97％。在一个实施方案中，同源性％为约98％。在一个实施方案中，同源性％为约99％。在一个实施方案中，同源性％为100％。
当结合生物材料如核酸分子、多肽、宿主细胞等使用时，术语“天然存在的”或“天然的”是指在自然界中发现且不受人类操纵的那些。
如本文所用，“包装”是指如何将组分组织化和/或约束成适于分配和/或使用的单元。包装可包括例如盒、袋、针筒、安瓿、小瓶、管、蛤壳包装、屏障和/或容器，以保持无菌性、标记等。
如本文所用的术语“医药学上可接受”意指由联邦或州政府的管理机构批准，或在美国药典、欧洲药典或其它公认的药典中列出，供用于动物，更确切地说人类。
如本文所用，术语“聚核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”和其它类似术语可互换使用，且包括DNA、RNA、mRNA等。
如本文所用，术语“预防”是指hBMP6介导的疾病和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的全部或部分抑制，其由施用本文提供的疗法或疗法组合(例如预防或治疗剂如本发明抗体的组合)产生。
术语“可溶性”是指以天然或膜结合形式存在的多肽，如BMP6和其变异体或片段，其缺少一个或超过一个的跨膜或细胞质结构域。在一个实施方案中，BMP6的“可溶性”形式缺乏跨膜结构域与细胞质结构域。
术语“个体”或“患者”是指任何动物，包括但不限于哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指对幼崽哺乳且分娩活体幼崽(真哺乳动物亚纲或胎盘哺乳动物)或产卵(后兽亚纲或非胎盘哺乳动物)的任何脊椎动物。哺乳动物物种的实例包括但不限于人类和其它灵长类动物，包括非人类灵长类动物，如黑猩猩和其它猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如犬和猫；实验动物，包括啮齿动物，如小鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠；鸟类，包括家养、野生和猎鸟，如鸡、火鸡和其它鹑鸡类、鸭、鹅等。
如本文所用，“基本上所有”是指至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。
如本文所用，术语“治疗剂”是指可用于治疗、管理或改善BMP6介导的疾病和/或与其相关的症状的任何药剂。在某些实施方案中，术语“治疗剂”是指本发明的抗体。在某些其它实施方案中，术语“治疗剂”是指除本发明抗体之外的药剂。优选地，治疗剂为已知可用于或已经或目前用于治疗、管理或改善BMP6介导的疾病或与其相关的一种或超过一种症状的药剂。在特定实施方案中，治疗剂为完全人类抗BMP6抗体，如完全人类抗BMP6单克隆抗体。
如本文所用，术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善BMP6介导的疾病(例如癌症)的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方案中，术语“疗法”是指生物疗法、支持疗法和/或其它可用于预防、管理、治疗和/或改善本领域技术人员如医师已知的BMP6介导疾病的疗法。
术语“治疗”是指由施用一种或超过一种疗法(包括但不限于施用一种或超过一种预防或治疗剂，如本发明的抗体)引起的hBMP6介导疾病(例如癌症)的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。在特定实施方案中，所述术语是指hBMP6与BMP受体或HJV的结合的减少或抑制，和/或与BMP6介导疾病如贫血相关的一种或超过一种症状的抑制或减少。
术语“可变区”或“可变结构域”是指轻链和重链的一部分，通常大约为重链中的氨基末端120到130个氨基酸以及轻链中约100到110个氨基酸，其在抗体中的序列方面广泛不同且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的可变性集中于称为互补决定区(CDR)的那些区域，而可变结构域中的更高保守区域称为构架区(FR)。BMP6和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。本文使用的氨基酸位置的编号是根据EU索引，如Kabat等，(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质序列》.(美国卫生与公众服务部，华盛顿特区(Washington，D.C.))第5版(“Kabat等”)中。在优选实施方案中，可变区为人类可变区。
细胞生物学和分子生物学中常见术语的定义可见于“《默克诊断与治疗手册(TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy)》”，第19版，由默克研究实验室(MerckResearch Laboratories)出版，2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等(编)，《分子生物学百科全书(The Encyclopedia of Molecular Biology)》，由Blackwell ScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；Benjamin Lewin，《基因X(Genes X)》，由Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10：0763766321)；Kendrew等(编)，《分子生物学和生物技术：综合案头参考资料(Molecular Biology and Biotechnology：a ComprehensiveDesk Reference)》，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及《蛋白质科学的当前方案(Current Protocols in Protein Sciences)》2009，WileyIntersciences，Coligan等编。
除非另有说明，否则本发明使用标准程序进行，如例如以下文献中所述：Sambrook等，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》(第4版)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，美国纽约冷泉港(Cold SpringHarbor，N.Y.，USA)(2012)；Davis等，《分子生物学基本方法(Basic Methods in MolecularBiology)》，爱思唯尔科学出版公司(Elsevier Science Publishing，Inc.)，美国纽约(NewYork，USA)(1995)；或《酶学方法：分子克隆技术指南(Methods in Enzymology：Guide toMolecular Cloning Techniques)》，第152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel编，学术出版社有限公司(Academic Press Inc.)，美国圣地亚哥(San Diego，USA)(1987)；《蛋白质科学的当前方案(CPPS)》(John E.Coligan等编，约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons，Inc.))；《细胞生物学的当前方案(Current Protocols in Cell Biology)(CPCB)》(JuanS.Bonifacino等编，约翰·威利父子出版公司)；以及《动物细胞的培养：基本技术手册(Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique)》，R.Ian Freshney，出版商：Wiley-Liss；第5版(2005)；《动物细胞培养方法(Animal Cell Culture Methods)》(《细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)》，第57卷，Jennie P.Mather和David Barnes编辑，学术出版社有限公司，第1版，1998)，所述文献全部以引用的方式整体并入本文。
其它术语在本文中本发明的各个方面的描述中定义。
BMP6和铁
由于铁为所有生命形式的基础且必须来源于环境，因此严格控制在体内的可用性和用量。铁稳态的关键调节因子为具25个氨基酸的肽激素，称为铁调素。铁调素由肝脏产生且通过控制铁转运蛋白分子膜铁转运蛋白的表达，使主要的铁摄取和储备隔室即十二指肠肠细胞和巨噬细胞保留铁。在感染和/或炎症期间激活免疫系统后以及通过红细胞生成，铁调素本身经由稳态控制机制由铁含量调节。重要的是，铁调素含量在慢性炎症状况、感染以及某些癌症中升高。升高的铁调素含量螯合肠细胞、巨噬细胞和肝细胞中的铁，从而抑制血红蛋白合成和红细胞生成。这导致尽管铁储备量正常但贫血。铁调素基因表达由称为BMP6(骨形态发生蛋白6)的可溶性因子控制。BMP6被视为主要调节因子，因为在不存在BMP6的情况下，单独的细胞因子(或其它BMP)不能克服BMP6信号的缺陷。因此，本发明人关注于BMP6为用于控制贫血中的铁稳态异常失调的关键药物靶标，例如，在慢性疾病贫血(ACD)中。
BMP6为一种高度保守的可溶性蛋白因子，其视为小鼠和人类中铁调素产生的“主要”调节因子。因此，向小鼠施用BMP6会增加铁调素含量且降低血液和血清铁，而BMP6的抑制剂则相反。此外，BMP6路径内小鼠BMP6基因的敲除或人类突变支持BMP6在控制铁调素和血液和血清铁含量中的关键作用。此外，靶向BMP6的临床前和临床验证来自于通过在I期研究中分别将抗BMP6抗体施用到啮齿动物或食蟹猴或者使用HJV-Fc(FMX-8，Ferrumax Inc)进行BMP6中和来增加可用铁含量。参考Andriopoulos Jr.B，Corradini E，Xia Y，FaasseSA，Chen S，Grgurevic L，Knutson MD，Pietrangelo A，Vukicevic S，Lin HY和Babitt.2009。BMP-6为铁调素表达和铁代谢的关键内源调节因子。《自然·遗传学(Nat.Genet.)》41(4)，482-487；WO2016098079和US8980582。
抗BMP6抗体和片段
本发明提供各种抗BMP6抗体和片段(如Fab或scFv片段)、用途、方法和组合(例如与ESA组合)。实例在以下编号条款中列出。
1.一种抗体或片段，其包含特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)的结合位点，其中所述结合位点包含由源自人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组的核苷酸序列编码的VH结构域，其中所述VH基因区段选自IGHV3-11和IGHV1-3。
举例来说，所述VH基因区段为IGHV3-11且所述DH基因区段和JH基因区段为人类基因区段。举例来说，所述VH基因区段为IGHV1-3且所述DH基因区段和JH基因区段为人类基因区段。任选地，所述VH区段为人类IGHV3-11*01基因区段。或者，任选地所述VH区段为人类IGHV1-3*01基因区段。
在一个实例中，特异性结合具有如下文进一步描述的KD、Koff和/或Kon。在一个实例中，特异性结合具有1pM到5nM的KD。
本领域技术人员熟悉人类和其它物种的抗体基因区段的数据库和其它来源。举例来说，IMGT数据库(www.IMGT.org)为合适来源，例如2018年9月1日的版本。
参考表7和表8，显示基于IGHV1-3的抗体。令人惊讶地，所述人类VH基因区段产生具有所需抗BMP6特性的抗BMP6抗体，如在例如实施例中描述的那些。
参考表9，显示基于IGHV3-11的抗体。令人惊讶地，所述人类VH基因区段产生具有所需抗BMP6特性的抗BMP6抗体，如在例如实施例中描述的那些。因此，例如，所述抗体或片段包含选自SEQ ID NO：110、113、290、293、308、311、272和275的CDRH3序列。举例来说，所述抗体或片段包含选自SEQ ID NO：119、122、299、302、317、320、281和284的CDRL3序列。举例来说，所述抗体或片段分别包含选自SEQ ID NO：110、113、290、293、308、311、272和275的CDRH3序列以及选自SEQ ID NO：119、122、299、302、317、320、281和284的CDRL3序列。
举例来说，所述抗体或片段包含选自SEQ ID NO：110和113的CDRH3序列；和选自SEQ ID NO：119和122的CDRL3序列。举例来说，所述抗体或片段包含抗BMP6结合位点，其中所述结合位点包括包含SEQ ID NO：110的VH结构域，其与包含SEQ ID NO：119的VL结构域配对。举例来说，所述抗体或片段包含抗BMP6结合位点，其中所述结合位点包括包含SEQ IDNO：113的VH结构域，其与包含SEQ ID NO：122的VL结构域配对。
举例来说，所述抗体或片段包含选自CL-58838、CL-58835、CL-58756和CL-58722的抗体的CDRH3序列和任选地所述所选抗体的CDRL3。举例来说，所述抗体或片段包含选自CL-58838、CL-58835、CL-58756和CL-58722的抗体的CDRH1和CDRH3序列以及任选地所述所选抗体的CDRL2。举例来说，所述抗体或片段包含选自CL-58838、CL-58835、CL-58756和CL-58722的抗体的CDRH1和CDRH2序列。举例来说，所述抗体或片段包含选自CL-58838、CL-58835、CL-58756和CL-58722的抗体的CDRH2和CDRH3序列。举例来说，所述抗体或片段包含抗BMP6结合位点，其中所述结合位点包括包含CL-58838的CDRH3序列的VH结构域，其与CL-58838的VL结构域配对。
举例来说，所述抗体或片段包含抗BMP6结合位点，其中所述结合位点包括包含SEQID NO：114、294、312或276的VH结构域，其任选地与分别包含SEQ ID NO：123、303、321或285的VL结构域配对。举例来说，所述抗体或片段包含抗BMP6结合位点，其中所述结合位点包括包含SEQ ID NO：114的VH结构域，其与包含SEQ ID NO：123的VL结构域配对。
举例来说，所述抗体或片段包含抗BMP6结合位点，其中所述结合位点包括选自CL-58838、CL-58835、CL-58756和CL-58722的抗体的VH结构域，其任选地与所选抗体的VL结构域配对。举例来说，所述抗体或片段包含抗BMP6结合位点，其中所述结合位点包含CL-58838的VH结构域，其与CL-58838的VL结构域配对。
2.根据条款1的抗体或片段，其中所述DH基因区段为选自IGHD3-10、IGHD6-19、IGHD7-27、IGHD4-23、IGHD5-18、IGHD3-22和IGHD3-16的人类基因区段。
任选地，所述DH基因区段选自IGHD3-10*01、IGHD6-19*01、IGHD7-27*02、IGHD4-23*01、IGHD5-18*01、IGHD3-22*01和IGHD3-16*02。
3.根据条款1或2的抗体或片段，其中所述JH基因区段为选自IGHJ3、IGHJ4和IGHJ5的人类基因区段。
任选地，所述JH基因区段选自IGHJ3*02、IGHJ4*02和IGHJ5*02。
4.一种抗体或片段，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含根据任何前述条款的抗BMP6抗体的CDRH3序列。
5.一种抗体或片段，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含VH结构域，所述VH结构域包含本文公开的任何抗BMP6抗体(例如，选自本文表4到11中任一者列出的抗体或片段的任何抗体)的CDRH3序列，或所述CDRH3序列包含3、2或1个氨基酸取代。
6.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含VH结构域，所述VH结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的CDRH3序列；或所述序列包含3、2或1个氨基酸取代。
任选地，所述VH结构域包含选自SEQ ID NO：110或113的CDRH3序列，或所述所选序列包含3、2或1个氨基酸取代。
7.根据条款6的抗体或片段，其中所述VH结构域包含(i)选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的CDRH3序列；或所述CDRH3序列包含3、2或1个氨基酸取代；和(ii)所述所选抗体的CDRH1序列；或所述CDRH1序列包含3、2或1个氨基酸取代。
任选地，所述抗体或片段的VH结构域包含(a)SEQ ID NO：110或113的CDRH3序列；或所述CDRH3序列包含3、2或1个氨基酸取代；和(b)SEQ ID NO：108或111的CDRH1序列，或所述CDRH1序列包含3、2或1个氨基酸取代。
8.根据条款6或7的抗体或片段，其中所述VH结构域包含(iii)选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的CDRH3序列；或所述CDRH3序列包含3、2或1个氨基酸取代；和(iv)所述所选抗体的CDRH2序列；或所述CDRH2序列包含3、2或1个氨基酸取代。
任选地，所述抗体或片段的VH结构域包含(c)SEQ ID NO：110或113的CDRH3序列；或所述CDRH3序列包含3、2或1个氨基酸取代；和(d)SEQ ID NO：109或112的CDRH2序列，或所述CDRH2序列包含3、2或1个氨基酸取代。
任选地，所述抗体或片段的VH结构域包含(e)SEQ ID NO：110或113的CDRH3序列；或所述CDRH3序列包含3、2或1个氨基酸取代；(f)SEQ ID NO：108或111的CDRH1序列，或所述CDRH1序列包含3、2或1个氨基酸取代；和(g)SEQ ID NO：109或112的CDRH2序列，或所述CDRH2序列包含3、2或1个氨基酸取代。
9.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其包含特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)的结合位点，其中所述结合位点包含VH结构域，所述VH结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的VH结构域的氨基酸序列；或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。
举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
任选地，所述抗体或片段的VH结构域包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列，或与SEQID NO：114具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的重链可变结构域氨基酸序列。举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
10.根据任何前述条款的抗体或片段，其包含所述VH结构域的第一和第二拷贝。
在一个实例中，所述抗体或片段包含包括本发明的VH结构域与本发明的VL结构域配对的结合位点，其中所述结合位点能够特异性结合BMP6(例如成熟BMP6，例如人类和/或食蟹猴BMP6)。举例来说，所述抗体或片段包含这些结合位点中的两者。
11.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其包含特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)的结合位点，其中所述结合位点包含由源自人类VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码的VL结构域，其中所述VL基因区段选自IGKV3-20、IGKV1-5和IGKV3-15。
举例来说，所述VL基因区段为IGKV3-20，例如IGKV3-20*01。举例来说，所述VL基因区段为IGKV1-5，例如IGKV1-5*03。举例来说，所述VL基因区段为IGKV3-15，例如IGKV3-15*01。
12.根据条款11的抗体或片段，其中所述VL为Vκ且所述JL基因区段为选自IGKJ1和IGKJ3的人类基因区段。
任选地，所述JL基因区段选自IGKJ1*01和IGKJ3*01。
13.一种抗体或片段，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含根据条款11或12的抗BMP6抗体的CDRL3序列。
14.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含VL结构域，所述VL结构域包含本文公开的任何抗BMP6抗体(例如，选自本文表4到11中任一者列出的抗体或片段的任何抗体)的CDRL3序列，或所述所选CDRL3序列包含3、2或1个氨基酸取代。
15.根据条款14的抗体或片段，其包含VH结构域，所述VH结构域包含所述所选抗体的CDRH3序列。
16.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含VL结构域，所述VL结构域包含选自SEQ ID NO：119或122的CDRL3序列，或所述所选CDRL3序列包含3、2或1个氨基酸取代。
17.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含VL结构域，所述VL结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或所述序列各包含3、2或1个氨基酸取代。
任选地，所述VL结构域包含选自SEQ ID NO：119或122的CDRL3序列，或所述所选序列包含3、2或1个氨基酸取代，和/或任选地，所述VH结构域包含选自SEQ ID NO：119或122的CDRH3序列，或所述所选序列包含3、2或1个氨基酸取代。
18.根据条款17的抗体或片段，其中所述VL结构域包含(i)选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的CDRL3序列(和任选地CDRH3)；或所述CDR3序列各包含3、2或1个氨基酸取代；和(ii)所述所选抗体的CDRL1(和任选地CDRH1)序列；或所述CDR1序列各包含3、2或1个氨基酸取代。
任选地，所述抗体或片段的VL结构域包含(a)SEQ ID NO：119或122的CDRL3序列；或所述CDRL3序列包含3、2或1个氨基酸取代；和(b)SEQ ID NO：117或120的CDRL1序列，或所述CDRL1序列包含3、2或1个氨基酸取代。
19.根据条款17或18的抗体或片段，其中所述VL结构域包含(iii)选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75320、CL-75539、CL-75565、CL-75/14、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或所述CDR3序列各包含3、2或1个氨基酸取代；和(iv)所述所选抗体的CDRL2(和任选地CDRH2)序列；或所述CDR2序列各包含3、2或1个氨基酸取代。
任选地，所述抗体或片段的VL结构域包含(c)SEQ ID NO：119或122的CDRL3序列；或所述CDRL3序列包含3、2或1个氨基酸取代；和(d)SEQ ID NO：118或121的CDRL2序列，或所述CDRL2序列包含3、2或1个氨基酸取代。
任选地，所述抗体或片段的VL结构域包含(e)SEQ ID NO：119或122的CDRL3序列；或所述CDRL3序列包含3、2或1个氨基酸取代；(f)SEQ ID NO：117或120的CDRL1序列，或所述CDRL1序列包含3、2或1个氨基酸取代；和(g)SEQ ID NO：118或121的CDRL2序列，或所述CDRL2序列包含3、2或1个氨基酸取代。
20.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其包含特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)的结合位点，其中所述结合位点包含VL结构域，所述VL结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的VL结构域的氨基酸序列；或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。
举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
任选地，所述抗体或片段的VL结构域包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列，或与SEQID NO：123具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的重链可变结构域氨基酸序列。举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
21.根据任何前述条款的抗体或片段，其包含所述VL结构域的第一和第二拷贝。
在一个实例中，所述抗体或片段包含包括本发明的VL结构域与VH结构域配对的结合位点，其中所述结合位点能够特异性结合BMP6(例如成熟BMP6，例如人类和/或食蟹猴BMP6)。举例来说，所述抗体或片段包含所述结合位点中的两者。
22.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75300、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的重链氨基酸序列；或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。
举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
23.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的轻链氨基酸序列；或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。
举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
24.根据条款23的抗体或片段，其包含所述所选抗体的轻链氨基酸序列；或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。
举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
25.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其特异性结合与根据任何前述条款的抗体所结合的抗原决定基一致的人类BMP6抗原决定基。
26.根据条款25的抗体或片段，其中所述抗原决定基是通过不相关氨基酸扫描或通过X射线结晶学鉴定。
参与抗体与抗原相互作用的接触氨基酸残基可通过本领域技术人员已知的各种方法测定。
在一个实施方案中，依序替代抗原序列的氨基酸(使用标准分子生物学技术来突变抗原编码序列的DNA)，在所述情况下BMP6用丙氨酸(又名丙氨酸扫描)或另一种不相关氨基酸替代，可提供如下残基，其突变会降低或消除抗体识别所述抗原的能力。可使用标准技术评估结合，如但不限于SPR、HTRF、ELISA(其在本文别处描述)。可进行其它取代以增强结合的破坏，如改变抗原序列氨基酸侧链上的电荷(例如赖氨酸变为谷氨酸)，切换极性和非极性残基(例如丝氨酸变为亮氨酸)。丙氨酸扫描或其它氨基取代方法可用重组可溶性抗原进行，或者当靶标为细胞膜靶标时，使用突变形式的暂态或稳定表达直接于细胞上进行。
在一个实施方案中，蛋白质结晶学可用于确定抗体与抗原之间的接触残基(即确定抗体所结合的抗原决定基)，结晶学允许直接显示参与抗体-抗原相互作用的接触残基。除了标准X射线结晶学外，低温电子显微镜已用于确定抗体与HIV衣壳蛋白之间的接触残基(参见Lee，Jeong Hyun等，“gp41上一个构象表位的抗体通过破坏Env尖峰的稳定来中和HIV-1Antibodies to a conformationa1 epitope on gp41 neutralize HIV-1 bydestabilizing the Env spike”，《自然通讯(Nature communications)》，6，(2015))。
在一个实施方案中，如果抗体识别线性抗原决定基，则可以产生基于抗原序列的短肽，且可以使用标准技术评估抗体与这些肽的结合，所述技术如但不限于SPR、HTRF、ELISA(其在本文别处描述)。可通过对任何显示结合的肽进行丙氨酸扫描来提供抗原决定基的进一步研究。作为线性肽的替代，可使用Pepscan技术(http：//www.pepscan.com/)使用肽在支架上的化学连接进行构象扫描，其已用于确定CD20靶向抗体上的不连续抗原决定基(Niederfellner，Gerhard等，“GA101的表位表征和晶体结构为CD20抗体I/II型区分的分子基础提供了见解(Epitope characterization and crystal structure of GA101provide insights into the molecular basis fortype I/II distinction of CD20antibodies.)”，《血液(Blood)》，118.2，(2011)，358-367)。
在一个实施方案中，有限的蛋白水解消化和质谱分析可用于鉴定结合抗原决定基。抗体-抗原复合物由蛋白酶消化，如但不限于胰蛋白酶。将消化的复合物肽与仅抗体和仅抗原消化质谱分光光度法进行比较，以确定特定抗原决定基是否受到复合作用的保护。随后可采用涉及氨基酸取代、竞争结合的进一步研究来缩小范围到参与相互作用的个别氨基酸残基(参见例如Suckau，Detlev等，“通过固定抗原-抗体复合物的有限蛋白溶解和质谱肽图谱鉴定分子表位(Molecular epitope identification by limited proteolysis ofan immobilized antigen-antibody complex and mass spectrometric peptidemapping.)”，《美国国家科学院院刊(Proceedings of the NationalAcademy ofSciences)》，87.24，(1990)，9848-9852)。
因此，在一个实施方案中，抗原决定基的接触残基用不相关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)鉴定。在另一实施方案中，使用选自SPR、HTRF、ELISA、X射线结晶学、低温电子显微镜以及有限蛋白水解消化与质谱分析的组合的技术进行不相关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)。在一个实施方案中，使用HTRF进行不相关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)。在一个实施方案中，使用ELISA进行不相关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)。
当用ELISA或HTRF进行丙氨酸扫描时，如果信号减少为至少25％，则氨基酸残基鉴定为对抗原决定基有贡献。在一个实施方案中，所述信号减少为至少30％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少35％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少40％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少45％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少50％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少55％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少60％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少70％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少75％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少80％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少85％。在一个实施方案中，所述信号减少为至少90％。
当用SPR进行丙氨酸扫描时，如果亲和力降低至少10倍，则氨基酸残基鉴定为对抗原决定基有贡献。在一个实施方案中，亲和力降低至少15倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少20倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少30倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少40倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少50倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少100倍。
在一个实施方案中，抗原决定基的接触残基通过X射线结晶学鉴定。在一个实施方案中，抗原决定基的接触残基通过低温电子显微镜鉴定。在一个实施方案中，抗原决定基的接触残基通过有限蛋白水解消化与质谱分析的组合鉴定。
27.根据条款26的抗体或片段，其中抗原决定基的接触残基由不相关氨基酸扫描，例如通过SPR确定的丙氨酸扫描中亲和力降低至少10倍来限定。
在一个实施方案中，亲和力降低至少15倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少20倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少30倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少40倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少50倍。在一个实施方案中，亲和力降低至少100倍。
SPR可如本文所述进行。
28.一种抗体或片段(任选地根据任何前述条款)，其与根据任何前述条款的抗体竞争结合人类BMP6。
任选地，竞争是通过表面等离子体共振(SPR)或ELISA确定。举例来说，本领域技术人员将熟悉所述技术和标准条件。
在一个实施方案中，所述抗体或片段与hBMP6(或其融合蛋白)竞争(例如以剂量依赖性方式)结合细胞表面表达的hBMP6。在一个实施方案中，所述抗体或片段与hBMP6(或其融合蛋白)竞争(例如以剂量依赖性方式)结合可溶性hBMP6。
任选地，使用SPR进行与hBMP6结合的竞争。SPR可如本文所述进行。
29.根据任何前述条款的抗体或片段，其特异性结合包含SEQ ID NO：562的人类BMP6；和/或包含SEQ ID NO：564的食蟹猴BMP6；和/或包含SEQ ID NO：563的大鼠BMP6。
任选地，本发明的抗体或片段特异性结合SEQ ID NO：562的氨基酸序列。任选地，本发明的抗体或片段特异性结合SEQ ID NO：563的氨基酸序列。任选地，本发明的抗体或片段特异性结合SEQ ID NO：564的氨基酸序列。
在一个实例中，本文的BMP6为人类、小鼠或食蟹猴BMP6。
在一个实施方案中，所述抗体或片段以小于1nM(例如1nM到0.01pM、或1nM到0.1pM、或1nM到1pM)的亲和力与食蟹猴BMP6结合。在一个实施方案中，所述抗体或片段以小于10nM(例如10nM到0.01pM、或10nM到0.1pM、或10nM到1pM)的亲和力与食蟹猴BMP6结合。在一个实施方案中，所述抗体或片段以小于0.1nM(例如0.1nM到0.01pM、或0.1nM到0.1pM、或0.1nM到1pM)的亲和力与食蟹猴BMP6结合。在一个实施方案中，所述抗体或片段以小于0.01nM(例如0.011nM到0.01pM或0.01nM到0.1pM)的亲和力与食蟹猴BMP6结合。
在一个实施方案中，所述抗体或片段与食蟹猴BMP6的结合亲和力在其与hBMP6的结合亲和力的2倍内。在一个实施方案中，所述抗体或片段与食蟹猴BMP6的结合亲和力在其与hBMP6的结合亲和力的4倍内。在一个实施方案中，所述抗体或片段与食蟹猴BMP6的结合亲和力在其与hBMP6的结合亲和力的5倍内。在一个实施方案中，所述抗体或片段与食蟹猴BMP6的结合亲和力在其与hBMP6的结合亲和力的6倍内。在一个实施方案中，所述抗体或片段与食蟹猴BMP6的结合亲和力在其与hBMP6的结合亲和力的8倍内。在一个实施方案中，所述抗体或片段与食蟹猴BMP6的结合亲和力在其与hBMP6的结合亲和力的10倍内。
本文“hBMP6”为人类BMP6，例如包含SEQ ID NO：562的本文公开的人类BMP6。
在一个实施方案中，所述抗体或片段不可检测地与食蟹猴BMP6结合。在一个实施方案中，所述抗体或片段不可检测地与鼠类(例如小鼠和/或大鼠)BMP6结合。
在一个实施方案中，所述抗体或片段与鼠类(例如小鼠和/或大鼠)BMP6的结合亲和力小于1nM(例如1nM到0.01pM、或1nM到0.1pM、或1nM到1pM)。在一个实施方案中，所述抗体或片段与鼠类BMP6的结合亲和力小于10nM(例如10nM到0.01pM、或10nM到0.1pM、或10nM到1pM)。在一个实施方案中，所述抗体或片段与鼠类BMP6的结合亲和力小于0.1nM(例如0.1nM到0.01pM、或0.1nM到0.1pM、或0.1nM到1pM)。在一个实施方案中，所述抗体或片段与鼠类BMP6的结合亲和力小于0.01nM(例如0.011nM到0.01pM或0.01nM到0.1pM)。
任选地，所述抗体或片段包括效应子启用或效应子禁用恒定区，如人类恒定区，例如效应子空人类恒定区，例如IgG4恒定区或IgG1恒定区，任选地其中所述恒定区为IgG4-PE，或禁用IgG1。任选地，所述抗体或片段包括鼠类(例如小鼠和/或大鼠)恒定区。任选地，所述抗体或片段包括本文所述的任何重链恒定区序列。
任选地，所述恒定区具有CDC和/或ADCC活性。
30.根据任何前述条款的抗体或片段，其中所述抗体或片段包括人类恒定区，例如IgG4恒定区或IgG1恒定区。
举例来说，所述恒定区包括重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO：429、431、433、435、437、439、440、442、444、446、448、450、454或456的氨基酸序列。任选地，所述重链恒定区为包含SEQ ID NO：429、431、433、435或437的氨基酸序列的IGHG1恒定区。任选地，所述重链恒定区为包含SEQ ID NO：439、440、442或444的氨基酸序列的IGHG2恒定区。任选地，所述重链恒定区为包含SEQ ID NO：446、448、450、454或456，优选地SEQ ID NO：454，优选地SEQ ID NO：456的氨基酸序列的IGHG4恒定区。在一个实例中，所述重链恒定区由包含SEQ ID NO：451、452或453的核酸编码。
在一个实例中(任选地除了按照上面段落的重链区之外)，所述恒定区包括轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO：458、460、462、464、466、468、470、473、476、478、480、482、484、486、488或490的氨基酸序列。任选地，所述轻链恒定区为包含SEQ ID NO：458、460、462、464或466，优选地SEQ ID NO：458的氨基酸序列的IGKC恒定区。任选地，所述轻链恒定区为包含SEQ ID NO：468、470、473、476、478、480、482、484、486、488或490的氨基酸序列的IGLC恒定区。
31.根据条款30的抗体或片段，其中所述恒定区为IgG4-PE恒定区。
任选地，所述抗体或片段包括重链恒定区，其中所述恒定区包含SEQ ID NO：454的氨基酸序列。
根据本发明的抗BMP6抗体或片段可包括恒定区，如人类恒定区，例如效应子空人类恒定区，例如IgG4恒定区或IgG1恒定区，任选地其中所述恒定区为IgG4-PE，或如本文序列表中所定义的禁用IgG1。
在其它实施方案中，所述抗体或片段为如本文所定义的任何同种型或恒定区。在一个实施方案中，所述恒定区为野生型人类IgG1。举例来说，所述恒定区为效应子启用IgG1恒定区，任选地具有ADCC和/或CDC活性。在一个实施方案中，所述恒定区经设计用于增强ADCC和/或CDC和/或ADCP。在另一实施方案中，所述恒定区经设计用于增强效应功能。
所述IgG4恒定区可为任何IgG4恒定区氨基酸序列或由本文序列表的任何核酸序列编码。重链恒定区可为包含Leu235Glu突变与Ser228Pro突变的IgG4。所述“IgG4-PE”重链恒定区(实例参见序列表)为效应子空。
替代效应子空人类恒定区为禁用IgG1，其为包含L235A和/或G237A突变的IgG1*01等位基因(例如LAGA，参见序列表)。在一个实施方案中，本文公开的抗体或抗体片段包含IgG1重链恒定区，其中所述序列在位置235和/或237(EU索引编号)含有丙氨酸。
通过本领域技术人员显而易见的任何技术工程改造Fc结构域，可增强Fc介导效应的性能。在另一实施方案中，本文公开的抗体和片段可包含增强与FcRn结合的三重突变(M252Y/S254T/T256E)。
32.根据任何前述条款的抗体或片段(例如双特异性抗体)，其进一步包含特异性结合另一靶抗原(例如人类血幼素、转铁蛋白受体(例如TFR2)或BMP受体(例如BMPRI或BMPRII))或者结合BMP6和另一BMP(例如BMP2、4、7或9)的抗原结合位点。
举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和BMP2。举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和HJV。举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和BMPRI(即BMPR1，例如BMPR1A或BMPR1B)。举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和BMPRII。举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和BMP2。举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和BMP4。举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和BMP9。举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和BMP7。举例来说，所述双特异性抗体特异性结合BMP6和TFR2。
在一个实例中，另外的结合位点为针对所述另一抗原的激动剂结合位点。在一个实例中，另外的结合位点为针对所述另一抗原的拮抗剂结合位点。
在一个实例中，另外的结合位点为包含VH和VL的抗体结合位点；由抗体的恒定结构域包含的结合位点(例如Fcab结合位点)或非免疫球蛋白结合位点(例如纤维结合蛋白结构域)。任选地，所述抗原结合位点为本文公开的任何抗原结合位点。
举例来说，所述抗体或片段为双特异性抗体或片段。举例来说，所述抗体或片段为双重结合抗体或片段，或包含如任何前述条款中所定义的抗体或其片段的融合蛋白。双重结合抗体具有如上文所述的含义。
在一个实例中，条款24或24a的抗体、片段或融合蛋白包含选自以下的双特异性形式：DVD-Ig、mAb2、FIT-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、SEEDbody、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、单链双功能抗体、单链双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、微抗体、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对，确切地说mAb2、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔和FIT-Ig，例如mAb2和FIT-Ig。
在一个实施方案中，所述双特异性形式选自DVD-Ig、mAb2、FIT-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、Fab臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ体、正交Fab、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、单链双功能抗体、单链双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、三功能抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L，H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody。
在一个实施方案中，所述双特异性形式选自DVD-Ig、FIT-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、Fab臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ体、正交Fab、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、单链双功能抗体、单链双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、三功能抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L，H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody，例如DVD-Ig、FIT-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、SEEDbody、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、单链双功能抗体、单链双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、微抗体、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对，确切地说旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔和FIT-Ig，例如FIT-Ig。
在一个实施方案中，所述双特异性形式选自DVD-Ig、mAb2、mAb-dAb、对接和锁定、Fab臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ体、正交Fab、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、单链双功能抗体、单链双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、三功能抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L，H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody，例如DVD-Ig、mAb2、mAb-dAb、对接和锁定、SEEDbody、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、单链双功能抗体、单链双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、微抗体、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对，确切地说mAb2、旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔和具有共同轻链的旋钮入孔，例如mAb2。
在一个实施方案中，所述双特异性形式选自DVD-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、Fab臂交换、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ体、正交Fab、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、单链双功能抗体、单链双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、三功能抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L，H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIHIgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zybody，例如DVD-Ig、mAb-dAb、对接和锁定、SEEDbody、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、单链双功能抗体、单链双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、微抗体、旋钮入孔、具有共同轻链的旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔、电荷对、具有共同轻链的电荷对，确切地说旋钮入孔、具有共同轻链和电荷对的旋钮入孔和具有共同轻链的旋钮入孔。
33.根据任何前述条款所定义的抗BMP6抗体或片段，其用于治疗或预防个体中BMP6介导的疾病或病状(例如贫血)。
在一个实例中，所述个体为人类。在替代方案中，所述个体为非人类动物。在一个实例中，所述个体为成人。在一个实例中，所述个体为小儿。在一个实例中，所述个体为进行透析治疗的人类CKD患者。在一个实例中，所述个体为具有终末期肾病的人类。
在一个实例中，本文的抗体或片段用于治疗或预防个体(例如人类)中的疾病或病状，其选自贫血，肺动脉高压(PAH)(例如原发性PAH或继发性PAH)，脑海绵状血管畸形(CCM)(例如家族性CCM或偶发性CCM)，不宁腿综合征(RLS)，癌症(例如乳癌、胰腺癌、结肠直肠癌、唾液腺癌、食道癌或黑素瘤)，癌症转移，系统性硬化症，干燥综合征(
Figure BDA0002991179750000431
Syndrome)，内皮细胞-间质转化(EndoMT)，心血管疾病，动脉粥样硬化，系统性硬化症相关的肺纤维化和心脏纤维化。
由EndoMT介导的疾病或病状的实例为心血管疾病，动脉粥样硬化，系统性硬化症相关的肺纤维化，心脏纤维化，PAH，肿瘤形成，肿瘤侵袭，肿瘤转移，纤维化疾病和癌相关成纤维细胞的产生(例如在胰腺癌中)。
在一个实例中，所述疾病或病状是在人类中。在一个实例中，所述疾病或病状是在动物中。
在一个实例中，本发明的抗体或片段是用于治疗或预防人类中的TIGIT介导疾病或病状，例如选自肿瘤性或非肿瘤性疾病、慢性病毒感染和恶性肿瘤，如黑素瘤、Merkel细胞癌、非小细胞肺癌(鳞状和非鳞状)、肾细胞癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、间皮瘤、病毒性诱发癌症(如子宫颈癌和鼻咽癌)、软组织肉瘤，血液系统恶性肿瘤如霍奇金病和非霍奇金病以及弥漫性大B细胞淋巴瘤(例如黑素瘤、Merkel细胞癌、非小细胞肺癌(鳞状和非鳞状)、肾细胞癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌和间皮瘤或例如病毒性诱发癌症(如子宫颈癌和鼻咽癌)和软组织肉瘤)。
在一个实例中，所述BMP6介导的疾病或病状为神经退行性疾病、病症或病状，例如选自阿尔茨海默氏症，肌萎缩性侧索硬化症，帕金森氏症，亨廷顿氏病，原发性进行性多发性硬化症，继发性进行性多发性硬化症，皮质基底核退化症，Rett综合征，选自年龄相关性黄斑变性和色素性视网膜炎的视网膜变性病症；前部缺血性视神经病变，青光眼，葡萄膜炎，抑郁症，创伤相关的应激或创伤后应激障碍，额颞叶痴呆，路易体痴呆，轻度认知障碍，后皮质萎缩，原发性进行性失语和进行性核上性麻痹或年龄相关性痴呆，确切地说，选自阿尔茨海默氏症、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏症和亨廷顿氏病的神经退行性疾病、病症或病状，例如阿尔茨海默氏症。
在一个实例中，本发明的抗体、片段、组合经静脉内施用到个体；或者用于经静脉内施用到个体。在一个实例中，本发明的抗体、片段、组合经皮下施用到个体；或者用于经皮下施用到个体。
34.根据条款33的抗体或片段，其中所述抗体或片段与红细胞生成素刺激剂(ESA)同时或依序施用到个体。
35.一定量的抗BMP6抗体或片段和一定量的ESA的组合(例如包含多个剂量的所述抗体和/或ESA)，其中所述抗体或片段是根据条款1到34中的任一条款。
还提供：一种医疗试剂盒，其包括所述组合，包含所述量的抗体或片段的第一无菌容器，和包含所述量的ESA的第二无菌容器，以及任选地关于使用所述组合来治疗个体中的贫血的说明书。
在一个实例中，所述组合是用于治疗或预防个体中的贫血，其中在连续4周的时期内，所述抗体的总剂量与ESA的总剂量以X：Y的比率施用到所述个体，其中X为10到2×106且Y＝4，例如，X为10到2×106微克且Y＝4微克。
在一个实例中，治疗增加(或用于增加)个体中Hb浓度、平均红细胞血红蛋白(MCH)和转铁蛋白饱和度中的一者、多者或全部。本领域技术人员将熟悉所述参数以及如何确定它们，例如，使用个体的一个或超过一个血清样品。举例来说，转铁蛋白饱和度(以百分比测量)为血清铁除以总铁结合能力的值。
在一个实例中，所述个体在治疗开始时罹患慢性疾病贫血(ACD)，且任选地其中所述贫血与慢性炎症(例如个体罹患关节炎)或细菌感染(例如链球菌感染)相关，或其中所述个体为慢性肾病(CKD)患者。
36.根据条款1到34中任一条款的抗体、片段或组合，其用于以下的方法中：
(a)预防个体的血液血红蛋白含量降低到小于10g/dL，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和红细胞生成刺激剂(ESA)；
(b)在罹患贫血的个体中将血液血红蛋白升高到至少10g/dL的含量，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗；
(c)治疗或预防罹患发炎性疾病或病状的个体中的贫血，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防；
(d)消除或减少向罹患贫血的个体施用铁或输血的需要，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述需要得以消除或减少；
(e)治疗或预防罹患微生物感染的个体中的贫血，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)；
(f)减少向罹患贫血的个体施用红细胞生成刺激剂(ESA)以治疗贫血，所述方法包括施用所述抗体或片段和所述ESA，其中所述个体中的贫血得以治疗；或
(g)治疗或降低罹患贫血或有贫血风险的个体中的贫血风险，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和低剂量的红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述个体中的贫血得以治疗或贫血风险得以降低。
37.根据条款1到34和36中任一条款的抗体、片段或组合，其中所述ESA为
a.依泊汀α(epoetin alfa)且以小于1000、1500、2500、5000、11000、18000、34000或90000单位的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周＜1500、1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90000单位的依泊汀α治疗；
b.达贝泊汀α(darbepoetin alfa)或
Figure BDA0002991179750000451
且以小于6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000453
治疗；或
c.达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000452
且以小于6.25、10、20、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90,000单位的依泊汀α治疗。
38.根据条款1到34、36和37中任一条款的抗体、片段或组合，其用于在所述个体已接受所述抗BMP6抗体或片段和ESA之后至少13或14天维持或提高所述个体中的血液血红蛋白含量到至少10g/dL。
39.一种根据任何前述条款中所定义的抗体、片段或组合的用途，其用于制造供施用到个体以治疗或预防BMP6介导的疾病或病状例如贫血的药物。
40.一种治疗或预防个体中的BMP6介导的疾病或病状(例如贫血)的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据条款1到38中任一条款中所定义的抗体、片段或组合，其中所述BMP6介导的疾病或病状由此得以治疗或预防。
所述疾病或病状可为本文公开的任何疾病或病状。
41.根据条款39的用途或根据条款40的方法，其中所述BMP6介导的疾病或病状为贫血。
42.根据条款33到41中任一条款的抗体、片段、组合、用途或方法，其进一步包括向所述个体施用另一疗法，例如另一治疗剂，任选地其中所述另一治疗剂选自由以下组成的组：
(a)静脉内铁；
(b)ESA(例如EPO)；
(c)ActRIIa抑制剂；
(d)ActRIIb抑制剂；
(e)IL-6或IL-6受体抑制剂(例如抗IL-6或IL-6受体抗体)；
(f)TNF-α或TNF-α受体抑制剂(例如抗TNF-α或TNF-α受体抗体)；
(g)HJV抑制剂(例如抗HJV抗体)；
(h)BMP抑制剂(例如另一抗BMP抗体或片段)，例如，其中所述BMP为BMP2、4、5、6、7或9；
(i)蛋白裂解酶-2(MTP2)激动剂(例如蛋白裂解酶-2(MTP2)激动剂抗体)；
(j)HIF-PH抑制剂；
(k)转铁蛋白受体2(TFR2)抑制剂；
(l)HFE抑制剂；
(m)NRf2抑制剂；
(n)转化生长因子β超家族I型激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂；
(o)激活素受体抑制剂(例如激活素受体Fc融合体)；
(p)GDF11抑制剂；和
(q)肌肉生长抑制素抑制剂。
任选地，所述另一药剂为LuspaterceptTM或SotaterceptTM。任选地，所述另一药剂为TGF-β超家族抑制剂。在一个实例中，所述另一药剂为转化生长因子β超家族I型激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂；ALK2抑制剂、ALK3抑制剂；ALK4抑制剂；ALK5抑制剂；或ALK7抑制剂。
在一个实例中，所述另一药剂为IL-6或IL-6R抑制剂，例如沙利鲁单抗(Sarilumab)、伏巴珠单抗(Vobarilizumab)或托珠单抗(tocilizumab)(例如
Figure BDA0002991179750000461
或
Figure BDA0002991179750000462
)。
在一个实例中，所述另一药剂为TNF-α或TNF-α受体抑制剂，例如阿达木单抗(adalimumab)、
Figure BDA0002991179750000471
或
Figure BDA0002991179750000472
在一个实施方案中，NRf2抑制剂通过打破更多铁的反馈回路来提高抗BMP6抗体或片段的功效，从而在所治疗的个体中诱导更多BMP6表达。
本公开案包括品牌药物的仿制形式，并且所述仿制药物的公开内容以引用的方式包括于本文中以可能用于本发明，例如作为组合的一部分。
在一个实例中，所述组合包含以下的抑制剂：BMP6和HJV；或BMP6和HFE；或BMP6和TFR2；或BMP6和BMP2；或BMP6和BMP4；或BMP6和ALK2，其中所述BMP6抑制剂包含本发明的抗体或片段。
43.一种医药组合物，其包含根据条款1到38和42中任一条款中所定义的抗体、片段或组合和医药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂且任选地与选自上述(例如在条款42中)那些的另一治疗剂组合。
44.根据条款43的医药组合物，其用于治疗和/或预防BMP6介导的病状或疾病，例如贫血。
合适的疾病和病状包括贫血，肺动脉高压(PAH)(例如原发性PAH或继发性PAH)，脑海绵状血管畸形(CCM)(例如家族性CCM或偶发性CCM)，不宁腿综合征(RLS)，癌症(例如乳癌、胰腺癌、结肠直肠癌、唾液腺癌、食道癌或黑素瘤)，癌症转移，系统性硬化症，干燥综合征，内皮细胞-间质转化(EndoMT)，心血管疾病，动脉粥样硬化，系统性硬化症相关性肺纤维化和心脏纤维化。
由EndoMT介导的疾病或病状的实例为心血管疾病，动脉粥样硬化，系统性硬化症相关的肺纤维化，心脏纤维化，PAH，肿瘤形成，肿瘤侵袭，肿瘤转移，纤维化疾病和癌相关成纤维细胞的产生(例如在胰腺癌中)。
45.根据条款43或44的医药组合物，其与标签或使用说明书组合用于治疗和/或预防人类中的所述疾病或病状；任选地其中所述标签或说明书包括上市许可号(例如，FDA或EMA许可号)；任选地其中所述试剂盒包括包含所述抗体或片段的IV或注射装置。
46.一种核酸，其编码根据条款1到32中任一条款中所定义的抗体或片段的VH结构域和/或VL结构域。
47.一种核酸，其编码包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的VH结构域的氨基酸序列的VH结构域；或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。
举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
任选地，提供一种核酸，其编码包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列的VH结构域，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
48.一种核酸，其编码VL结构域，所述VL结构域包含选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的VL结构域的氨基酸序列；或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。
任选地，所述核酸还编码VH结构域，所述VH结构域包含所选抗体的VH结构域的氨基酸序列；或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
任选地，提供一种核酸，其编码VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸。举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
49.一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：115、520或521的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：124、522或523的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
在替代方案中，提供：
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：115的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：124的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：520的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：522的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：521的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：523的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
第一核酸和第二核酸的组合(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其分别包含
(a)与SEQ ID NO：115、520或521的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：124、522或523的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
第一核酸和第二核酸的组合(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其分别包含
(a)与SEQ ID NO：115的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：124的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
第一核酸和第二核酸的组合(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其分别包含
(a)与SEQ ID NO：520的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：522的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
第一核酸和第二核酸的组合(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其分别包含
(a)与SEQ ID NO：521的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：523的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
举例来说，对于(a)，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
举例来说，对于(b)，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
本文中，在提及一致性％的任何情况下，在一个实例中存在100％一致性。
50.一种核酸，其编码根据条款1到32中任一条款中所定义的抗体或片段的重链和/或轻链。
51.一种核酸，其编码包含与SEQ ID NO：116具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的重链。
举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
52.一种核酸，其编码包含与SEQ ID NO：125具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的轻链。
举例来说，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
53.一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的所选重链序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713的抗体的所选序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
优选地，(a)和(b)中的所选抗体为相同抗体，例如CL-58838。在替代方案中，第一核酸包含(a)且第二核酸包含(b)，例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中。
本文中的所有本发明核酸均可在宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞中表达，如用于表达本发明的抗体或片段的可变结构域或链。
举例来说，提供：
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与选自SEQ ID NO：512、514、516、518和519的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与选自SEQ ID NO：513、515和517的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：512具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：513具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：514具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：515具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：516具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：517具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：518具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：513、515或517具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
一种核酸(例如在宿主细胞，例如CHO或HEK293或Cos细胞中)，其包含
(a)与SEQ ID NO：519具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列；和/或
(b)与SEQ ID NO：513、515或517具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核苷酸序列。
举例来说，对于(a)，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
举例来说，对于(b)，所述一致性为至少85％。举例来说，所述一致性为至少90％。举例来说，所述一致性为至少95％。
54.一种载体，其包含核酸(例如根据条款46到53中任一条款的核酸)；任选地其中所述载体为CHO或HEK293载体。
55.一种宿主细胞，其包含核酸(例如根据条款46到53中任一条款的核酸)或根据条款54的载体。
任选地，所述VH基因区段选自IGHV1-3*01和IGHV3-11*01。任选地，所述VL基因区段选自IGKV1-5*03、IGKV3-20*01和IGKV3-15*01。
在一个实例中，所述VH、DH和JH为IGHV1-3、IGHD3-10和IGHJ4(例如IGHV1-3*01、IGHD3-10*01和IGHJ4*02)。
在一个实例中，所述VH、DH和JH为IGHV1-3、IGHD3-10和IGHJ3，例如IGHV1-3*01、IGHD3-10*01和IGHJ3*02。
在一个实例中，所述VH、DH和JH为IGHV3-11、IGHD6-19和IGHJ4，例如IGHV3-11*01、IGHD6-19*01和IGHJ4*02。
在一个实例中，所述VH、DH和JH为IGHV1-3、IGHD7-27和IGHJ4，例如IGHV1-3*01、IGHD7-27*02和IGHJ4*02。
在一个实例中，所述VH、DH和JH为IGHV1-3、IGHD4-23和IGHJ4，例如IGHV1-3*01、IGHD4-23*01和IGHJ4*02。
在一个实例中，所述VH、DH和JH为IGHV1-3、IGHD5-18和IGHJ4，例如IGHV1-3*01、IGHD5-18*01和IGHJ4*02。
在一个实例中，所述VL和JL为IGKV1-5和IGKJ1，例如IGKV1-5*03和IGKJ1*01。
在一个实例中，所述VL和JL为IGKV3-20和IGKJ1，例如IGKV3-20*01和IGKJ1*01。
在一个实例中，所述VL和JL为IGKV3-15和IGKJ3，例如IGKV3-15*01和IGKJ3*01。
在一个实例中，所述VL和JL为IGKV3-20和IGKJ3，例如IGKV3-20*01和IGKJ3*01。
在一个实例中，所述抗体或片段包含9、10、11或12个残基，例如10个残基，例如11个残基的HCDR3长度。在一个实例中，所述抗体或片段包含7、8或9个残基，例如8个残基，例如9个残基的LCDR3长度。在一个实例中，所述抗体或片段的各VH结构域包含1-11个非生殖系残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个非生殖系残基。在一个实例中，所述抗体或片段的各VL结构域包含3-8个非生殖系残基，例如3、4、5、6、7或8个非生殖系残基。
在一个实施方案中，本文中CDR序列是根据Kabat确定。在替代方案中，所述CDR序列是根据IMGT确定。
在一个实例中，所述所选抗体为CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680或CL-58713。在一个实例中，所述所选抗体为CL-58838。
在一个实例中，所述所选抗体包含CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680或CL-58713的重链。在一个实例中，所述所选抗体包含CL-58838的重链。
在一个实例中，本发明的抗体或片段的重链为人类γ-1、γ-2、γ-3、γ-4、μ、δ、ε或α同种型，优选为γ同种型(例如IgG4同种型)。在一个实例中，本发明的抗体或片段的轻链包含人类κ恒定区。或者，在一个实例中，本发明的抗体或片段的轻链包含人类λ恒定区。
任选地，所述抗体为包含重链二聚体与轻链二聚体结合的4链抗体。在一个实例中，重链包含如本文所公开的一个或重链CDR或CDR组合和/或轻链包含如本文所公开的一个或重链CDR或CDR组合，如来自相同的所选抗体。在一个实例中，重链包含如本文所公开的VH结构域和/或轻链包含如本文所公开的VL，如来自相同的所选抗体。在一个实例中，重链和轻链来自相同的所选抗体，例如本文的序列表或本文实施例中的表格中所公开的任何抗体。
在一个实例中，所选抗体包含CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680或CL-58713的轻链。在一个实例中，所选抗体包含CL-58838的轻链。
在一个实例中，所选抗体包含CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680或CL-58713的可变结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-58838的可变结构域。
在一个实例中，所选抗体包含CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680或CL-58713的VH结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-58838的VH结构域。
在一个实例中，所选抗体包含CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680或CL-58713的VH和VL结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-58838的VH和VL结构域。
任选地，VH区段为人类IGHV3-11基因区段，例如，VH由源自人类IGHV3-11和IGHJ4(例如人类基因区段IGHV3-11*01和IGHJ4*02；IGHV3-11、IGHD6-19、IGHJ4；或IGHV3-11*01、IGHD6-19*01和IGHJ4*02)的重组的核苷酸序列编码。任选地，JH为IGHJ4*02。任选地，VL由源自人类VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码，其中所述VL基因区段选自IGKV1-5、IGKV3-20和IGKV3-15。任选地，VL为人类IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)。任选地，JL为IGKJ1(例如IGKJ1*01)。举例来说，所述VL由源自人类IGKV3-20(例如IGKV3-20*01)和人类IGKJ1(例如IGKJ1*01)的重组的核苷酸序列编码。
在一个实例中，所述结合位点包含特异性结合人类BMP6(例如包含本文序列表中的SEQ ID NO：1的粗体序列或由本文序列表中的SEQ ID NO：1的粗体序列组成的人类BMP6)的VH/VL对。在一个实例中，所述抗体或片段包含结合位点的2个(例如2个和不超过2个)拷贝。
在一个实例中，所述抗体或片段包含9-12个残基的HCDR3长度和/或所述抗体或片段包含7-9个残基的LCDR3长度。在一个实例中，所述抗体或片段包含9、10、11或12个残基，例如10个残基，例如11个残基的HCDR3长度。在一个实例中，所述抗体或片段包含7、8或9个残基，例如8个残基，例如9个残基的LCDR3长度。在一个实例中，所述抗体或片段的各VH结构域包含1-11个非生殖系残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个非生殖系残基。在一个实例中，所述抗体或片段的各VL结构域包含3-8个非生殖系残基，例如3、4、5、6、7或8个非生殖系残基。
任选地，所述抗体或片段与CL-58838(例如，呈IgG形式的CL-58838，例如IgG-PE)竞争结合BMP6(例如人类BMP6，例如成熟人类BMP6，例如包含本文序列表中所公开的成熟BMP6的序列或由本文序列表中所公开的成熟BMP6的序列组成的BMP6，即SEQ ID NO：1的粗体序列)，如通过SPR所测定。
任选地，所述氨基酸取代为保守氨基酸取代，任选地其中各保守取代是来自群组(1)到(6)：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文中的任何SPR为例如在37℃和pH 7.6下的表面等离子体共振(SPR)。
任选地，本文中的任何BMP6(例如，在体外测试)为人类BMP6，例如hBMP6(Peprotech120-06)。
在一个实例中，本发明的抗体或片段在例如5×106M-1x s-1；或约5×106M-1x s-1的Ka下与人类BMP6结合。在一个实例中，本发明的抗体或片段在例如4或5s-1；或约4或5s-1的Kd下与人类BMP6结合。在一个实例中，本发明的抗体或片段在例如0.07或0.14nM；或约0.07或0.14nM的KD下与人类BMP6结合。在一个实施方案中，所述片段为Fab片段。在一个实施方案中，所述片段为scFv。
在一个实例中，所述抗体包含重链，其中各重链包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列或由SEQ ID NO：116的氨基酸序列组成；并且轻链各包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列或由SEQ ID NO：125的氨基酸序列组成。
在一个实例中，所述抗体或片段包含重链VH结构域，其中各VH包含SEQ ID NO：418的氨基酸序列或由SEQ ID NO：418的氨基酸序列组成；并且轻链VL结构域各包含SEQ IDNO：426的氨基酸序列或由SEQ ID NO：426的氨基酸序列组成。
替代抗体或片段：
在任何本发明的配置中，本发明可能涉及如下抗体或片段(替代抗体或片段)。
任选地(选项1)，所述抗体或片段包含
a.各包含SEQ ID NO：403或566的氨基酸序列或由SEQ ID NO：403或566的氨基酸序列组成的重链，和各包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列或由SEQ ID NO：411的氨基酸序列组成的轻链；或
b.各包含SEQ ID NO：419的氨基酸序列或由SEQ ID NO：419的氨基酸序列组成的重链，和各包含SEQ ID NO：427的氨基酸序列或由SEQ ID NO：427的氨基酸序列组成的轻链。
任选地(选项2)，所述抗体或片段包含
a.各包含SEQ ID NO：402或565的VH结构域氨基酸序列或由SEQ ID NO：402或565的VH结构域氨基酸序列组成的重链，和各包含SEQ ID NO：410的VL结构域氨基酸序列或由SEQ ID NO：410的VL结构域氨基酸序列组成的轻链；或
b.各包含SEQ ID NO：418的VH结构域氨基酸序列或由SEQ ID NO：418的VH结构域氨基酸序列组成的重链，和各包含SEQ ID NO：426的VH结构域氨基酸序列或由SEQ ID NO：426的VH结构域氨基酸序列组成的轻链；和
c.任选地所述重链包含人类γ-1(例如IGHG1*01)或γ-4(例如IGHG4*01或IGHG4*01-PE)恒定区，或SEQ ID NO：429、437、446、454或456的氨基酸序列。
任选地，所述抗体或片段与参考抗体竞争结合BMP6，其中所述参考抗体为mAb507(R&D Systems)或替代抗体(例如如本文所定义的选项1或选项2抗体)。竞争可通过SPR或ELISA，例如，或在功能性检定如本文所述的检定中(例如在实施例中)。BMP6可以是人类BMP6(例如包含SEQ ID NO：562的序列的成熟BMP6)，大鼠BMP6(例如包含SEQ ID NO：56的序列的成熟BMP6)或食蟹猴BMP6(例如包含SEQ ID NO：564的序列的成熟BMP6)。
人类IgG重链基因天然编码C端赖氨酸。所述残基在从血清分离的抗体中大部分缺失，且在哺乳动物细胞培养系统中表达的治疗性抗体上以低但可变的量存在。由于C端赖氨酸在血清中天然发生剪切且未知是否影响整体抗体功能，因此其可从重链编码序列中除去以提供同源“赖氨酸剪切”重链以及因此同源药物产品。因此，本文所示的在C端用G封端的任何IgG抗体、恒定区或重链可以替代地以GK(即，在所示G的C端侧键合的赖氨酸)终止的形式提供。
选项1和2的实例为：
选项1a：在一个实例中，所述抗体包含重链，其中各重链包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列或由SEQ ID NO：403的氨基酸序列组成；和轻链，各轻链包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列或由SEQ ID NO：411的氨基酸序列组成。
选项1b：在一个实例中，所述抗体包含重链，其中各重链包含SEQ ID NO：566的氨基酸序列或由SEQ ID NO：566的氨基酸序列组成；和轻链，各轻链包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列或由SEQ ID NO：411的氨基酸序列组成。
选项1c：在一个实例中，所述抗体包含重链，其中各重链包含SEQ ID NO：419的氨基酸序列或由SEQ ID NO：419的氨基酸序列组成；和轻链，各轻链包含SEQ ID NO：427的氨基酸序列或由SEQ ID NO：427的氨基酸序列组成。
选项2a：在一个实例中，所述抗体或片段包含重链VH结构域，其中各VH包含SEQ IDNO：402的氨基酸序列或由SEQ ID NO：402的氨基酸序列组成；和轻链VL结构域，各VL包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列或由SEQ ID NO：410的氨基酸序列组成。
选项2b：在一个实例中，所述抗体或片段包含重链VH结构域，其中各VH包含SEQ IDNO：565的氨基酸序列或由SEQ ID NO：565的氨基酸序列组成，和轻链VL结构域，各VL包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列或由SEQ ID NO：410的氨基酸序列组成。
在一个实例中，所述抗体或片段包含重链VH结构域，其中各VH包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列或由SEQ ID NO：114的氨基酸序列组成；和轻链VL结构域，各VL包含SEQ IDNO：123的氨基酸序列或由SEQ ID NO：123的氨基酸序列组成。
任选地，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：1的氨基酸序列。另外或其它，任选地，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：492的氨基酸序列。另外或其它，任选地，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：491的氨基酸序列。另外或其它，任选地，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：4的氨基酸序列。另外或其它，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合所述中的任何一者或一者以上的成熟形式。
任选地，所述抗体或片段竞争性抑制可溶性血幼素(HJV)与BMP6的结合。任选地，本文中的HJV为人类HJV。
任选地，所述抗体或片段不竞争性抑制可溶性血幼素(HJV)与BMP6的结合。
如本文所用，“抑制”等是指拮抗剂(例如抗体或其片段)与抗原决定基(例如hBMP6的抗原决定基)结合的能力，其部分地或完全地阻止另一抗原的结合。如果拮抗剂结合的抗原决定基完全地阻断配体的结合位点，则完全阻止配体结合(其可为物理阻断，在重叠抗原决定基的情况下；或空间阻断，其中拮抗剂很大，使得其可阻止配体与其独特的抗原决定基结合)，并且配体不从循环中移除。因此，循环配体的浓度似乎会增加。如果拮抗剂结合的抗原决定基部分地阻断配体的结合位点，则配体可能能够结合，但仅较弱(在部分抑制的情况下)，或以不同于自然结合相互作用的定向。在所述情况下，一些配体可从循环中移除，但不会与配体结合位点完全自由且可用于结合时一样多。因此，抑制是指配体与受体的物理相互作用。抑制可通过HTRF测量，HTRF在本文别处和Mathis(1995)《临床化学(ClinicalChemistry)》41(9)，1391-1397中更详细地描述。抑制还可通过流式细胞术测量，其中受体在细胞上表达，或通过ELISA测量，其中受体被吸附到培养板上。
任选地，所述抗体包含由VDJ区域序列编码的VH结构域，其中所述VDJ源自VH基因区段、D基因区段和JH基因区段的重组，其中所述VH为人类生殖系(i)VH1-3、(ii)VH2-5或(iii)VH3-15基因区段。另外或其它，任选地所述抗体包含由VJ区域序列编码的VL结构域，其中所述VJ源自VL基因区段和JL基因区段的重组，其中所述VL为人类生殖系(iv)Vκ3-20、(v)Vλ3-1、(vi)Vκ1-17或(vii)Vλ1-40。
任选地，所述抗体或片段与BMP6结合的亲和力强于(通过SPR测定的较低KD)与BMP7结合的亲和力；和/或任选地与BMP6结合的亲和力强于与BMP5结合的亲和力。
举例来说，
(a)所述抗体或片段与BMP6结合的亲和力强于(通过SPR测定的较低KD)与BMP7结合的亲和力；和任选地与BMP6结合的亲和力强于与BMP5结合的亲和力；和
(b)所述抗体或片段与参考抗体竞争结合BMP6，其中所述参考抗体为mAb507(R&DSystems)或替代抗体(例如选项1抗体或选项2抗体)。
任选地，本发明的抗体与BMP6结合的亲和力(KD)为1pM到5nM，任选地其中结合是通过SPR使用所述抗体的Fab在37℃下在pH 7.6下测定。
任选地，所述抗体与BMP6结合的解离速率(Koff)为1×10-5到1×10-3 S-1，任选地其中结合是通过SPR使用所述抗体的Fab在37℃下在pH 7.6下测定。
任选地，所述抗体与BMP6结合的结合速率(Kon)为1×105到1×107M-1S-1，任选地其中结合是通过SPR使用所述抗体的Fab在37℃下在pH 7.6下测定。
在一个实例中，所述抗体(例如呈Fab形式)或片段与BMP6(例如人类BMP6)结合的亲和力(KD)为
(a)2、3、4、5或10pM到3、4或5nM；
(b)1-10pM到5nM；
(c)10pM到3、4或5nM；
(d)50或80pM到200nM；
(e)50或80pM到150nM；或
(f)50或80pM到100nM。
在一个实例中，KD为(或为约)5-15pM(例如10pM)。在一个实例中，KD为(或为约)2-5nM(例如3nM)。在一个实例中，KD为(或为约)100-400pM(例如140或390pM)。
在一个实例中，所述抗体(例如呈Fab形式)或片段与BMP6(例如人类BMP6)结合的解离速率(Koff)为
(a)1×10-5到5×10-4S-1；
(b)1×10-5到6×10-4S-1；
(c)1×10-5到7×10-4S-1；
(d)1×10-5到8×10-4S-1；
(e)2×10-5到1×10-3S-1；
(f)2×10-5到5×10-4S-1；
(g)2×10-5到6×10-4S-1；
(h)2×10-5到7×10-4S-1；或
(i)2×10-5到8×10-4S-1。
在一个实例中，Koff为(或为约)5×10-4S-1(例如当KD为(或为约)2nM到400pM；当KD为(或为约)2-5nM(例如3nM)时；或当KD为(或为约)100-400pM(例如140或390pM)时)。在一个实例中，Koff为(或为约)3×10-5 S-1(例如当KD为(或为约)5-15pM(例如10pM)时)。
在一个实例中，所述抗体(例如呈Fab形式)或片段与BMP6(例如人类BMP6)结合的结合速率(Kon)为
(a)1×105到1×106M-1S-1；
(b)1×105到2×106M-1S-1；
(c)1×105到3×106M-1S-1；
(d)1×105到4×106M-1S-1；
(e)1×105到5×106M-1S-1；
(f)2×105到5×106M-1S-1；
(g)3×105到5×106M-1S-1；
(h)4×105到5×106M-1S-1；
(i)5×105到5×106M-1S-1；或
(i)6×105到5×106M-1S-1。
在一个实例中，Kon为(或为约)1或2×10-5M-1S-1(例如当KD为2-5nM(例如3nM)时)。在一个实例中，Kon为(或为约)1-4、1、2、3或4×10-6M-1S-1(例如当KD为(或为约)5-400pM(例如140或390pM)或5-15pM(例如10pM)时)。
如本文的条款或其它方面所提供，抗BMP6抗体或片段可与BMP6、例如人类BMP6结合，其KD小于50nM，小于40nM，小于30nM，如通过表面等离子体共振所测定。另一个实施方案，抗BMP6抗体或片段可与BMP6、例如人类BMP6结合，其KD小于20nM，小于15nM，小于10nM，如通过表面等离子体共振所测定。抗BMP6抗体或片段可与BMP6、例如人类BMP6结合，其KD小于8nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，小于2nM或小于1 nM，如通过表面等离子体共振所测定。KD可为0.9nM或更小，0.8nM或更小，0.7nM或更小，0.6nM或更小，0.5nM或更小，0.4nM或更小，0.3nM或更小，0.2nM或更小，或0.1nM或更小。
在另一实施方案中，KD在0.01到1nM范围内，或0.05到2nM范围内，或0.05到1nM范围内。KD可能关于hBMP6、食蟹猴(即“cyno”)BMP6和/或小鼠BMP6。
在另一实施方案中，本文所述的抗BMP6抗体的KON速率(例如如通过SPR所测量，例如在25℃下或在37℃下)为约0.5到10μM，例如约1到8μM或约1到7μM。在另一实施方案中，KON速率为约1到5μM，例如约1μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM或约3μM。在另一实施方案中，KON速率为约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM或约5.5μM。
在另一实施方案中，本文所述的抗BMP6抗体的KOFF速率(例如如通过SPR所测量，例如在25℃下或在37℃下)为约0.01到100mM，例如约0.1到50mM或约0.5到50mM。在另一实施方案中，KOFF速率为约0.5到10mM，或约0.5到10mM，例如约1mM、约2mM、约3mM、约4mM或约5mM。在另一实施方案中，KOFF速率为约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM或约0.9mM。
本发明还提供以下方法(或用于所述方法中的本发明的抗体或片段)：
一种治疗个体中的贫血的方法，所述方法包括
(a)在初始日(D0)，向所述个体施用抗BMP6抗体或片段；以及
(b)在连续至少3周的时期内，所述时期起始于D0，施用多个剂量的红细胞生成素刺激剂(ESA)，其中在所述时期的整个持续时间内，所述个体中的血液血红蛋白(Hb)浓度相比于D0时的基线浓度升高，
(c)使得对于所述时期的整个持续时间：
(i)Hb浓度不低于基线Hb浓度的100％；并且在所述时期内Hb浓度达到基线的至少120％；和/或
(ii)Hb浓度相比于基线增加至少1g/dl。
任选地，所述抗体、片段或组合抑制人类肝细胞释放铁，例如，在体外检定中或在人体内。本领域技术人员将了解标准检定，如本文实施例中提及的那些。
任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中如本文所公开的BMP6介导的疾病或病状，其通过抑制人体内人类肝细胞的铁释放。任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中的贫血、PAH或纤维化，其通过抑制人体内人类肝细胞的铁释放。
任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中如本文所公开的BMP6介导的疾病或病状，其通过抑制人体内人类肝细胞中的hamp基因表达。任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中的贫血、PAH或纤维化，其通过抑制人体内人类肝细胞中的hamp基因表达。
任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中如本文所公开的BMP6介导的疾病或病状，其通过抑制人体内人类肝细胞中的铁调素或其表达。任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中的贫血、PAH或纤维化，其通过抑制人体内人类肝细胞中的铁调素或其表达。
任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中如本文所公开的BMP6介导的疾病或病状，其通过抑制人类中(例如在其肝细胞中)hamp基因表达的BMP6激活。任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中的贫血、PAH或纤维化，其通过抑制人类中(例如在其肝细胞中)hamp基因表达的BMP6激活。
任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中如本文所公开的BMP6介导的疾病或病状，其通过抑制人类中(例如在其肝细胞中)hamp基因表达的HJV介导性激活。任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中的贫血、PAH或纤维化，其通过抑制人类中(例如在其肝细胞中)hamp基因表达的HJV介导性激活。在一个实例中，所述抗体或片段竞争性抑制体外和/或人类中HJV与BMP6结合。体外竞争可通过例如标准SPR或ELISA测定。
在一个实例中，所述抗体或片段在体外hamp调节区域的控制下抑制HepG2细胞中人类BMP6诱导的荧光素酶表达。
任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中如本文所公开的BMP6介导的疾病或病状，其通过抑制人类中(例如在其肝细胞中)的BMP结合。任选地，所述抗体、片段或组合用于治疗或预防人类中的贫血、PAH或纤维化，其通过抑制人类中(例如在其肝细胞中)的BMP结合。在一个实例中，所述抗体或片段与抗原决定基结合，其中HJV接触BMP6以形成HJV-BMP6复合物，其能够激活人类肝细胞中的hamp基因表达。
在一个实例中，所述人类细胞为体外HepG2细胞。在本文实施例中提供更多细节。在一个实例中，抑制为体外HepG2细胞检定中的抑制，例如，如通过在体外一个或超过一个人类hamp调节元件控制下的报道基因抑制所测定。例如，所述调节元件包含对pSMAD(BMP)和pSTAT(IL6)的响应元件。在一个实例中，使用人类BMP6、食蟹猴BMP6、大鼠BMP6或小鼠BMP6进行检定；和/或使用人类HJV、食蟹猴HJV、大鼠HJV或小鼠HJV进行检定。在一个实例中，报道基因为荧光素酶基因。在一个实例中，所述抗体或片段在检定中中和报道基因表达的BMP激活，例如，中和为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或为完全中和。
在一个实例中，所述抗体或片段与参考抗体竞争结合BMP6，例如如通过SPR、ELISA或在HepG2检定(例如如本文所述的HepG2检定)中所测定，例如在体外使用经标记的参考抗体测定。在一个实例中，竞争使所述结合降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％或者完全抑制结合。举例来说，所述参考抗体为MAb507或MAb2365；例如所述参考抗体为替代抗体(例如选项1或选项2抗体)。
在一个实例中，本文的BMP6为人类BMP6(Peprotech#120-06)(SEQ ID NO：2)。在一个实例中，本文的BMP6为本文公开的任何其它人类BMP6。
在一个实例中，所述抗体或片段与人类BMP6结合的解离速率为1×10-4S-1或更低，如通过表面等离子体共振(SPR)例如在室温或rtp下测定。参见实施例。
在一个实例中，所述抗体与参考抗体竞争结合人类BMP6，所述参考抗体选自CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756；例如，选自CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102和CL-57945；例如，选自CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756。
在替代方案中，本文的参考抗体选自CL-58838、CL-66833、CL-57931、CL-57945、CL-58102、CL-58252、CL-58851、CL-75183、CL-75500、CL-75506、CL-75520、CL-75539、CL-75565、CL-75714、CL-58722、CL-58835、CL-58756、CL-58650、CL-58679、CL-58680和CL-58713。任选地，所述参考抗体为CL-58838。
在一个实例中，所述抗体与参考抗体竞争结合人类BMP6，所述参考抗体包含选自SEQ ID No：24、42、114、132、96、78、60、258、240、222、204、186、168、150、276、384、366、348、294、330和312C；例如选自SEQ ID No：24、42、114、132、96、78和60；例如选自SEQ ID No：276、384、366、348、294、330和312的VH氨基酸序列；和/或所述参考抗体包含(例如分别包含)选自SEQ ID No：33、51、123、141、105、87、69、267、249、231、213195、177、159、285、393、375、357、303、339和321；例如选自SEQ ID No：33、51、123、141、105、87和69；例如选自SEQID No：285、393、375、357、303、339和321的VL氨基酸序列。在一个实例中，所述参考抗体为IgG4(例如IgG4-PE)抗体。在一个实例中，所述参考抗体为IgG1抗体。在一个实例中，本发明的抗体为IgG4(例如IgG4-PE)抗体。在一个实例中，本发明的抗体为IgG1抗体。在一个实例中，本发明的抗体优先结合人类BMP6而非人类BMP5和/或人类BMP7。可例如通过如本领域技术人员已知的SPR或ELISA测定结合或竞争。
在一个实例中，所述抗体与参考抗体竞争结合人类BMP6，所述参考抗体包含以下抗体的VH的VH氨基酸序列，所述抗体选自本文的序列表；或选自实施例中的表格；或选自CL-66833、CL-57890、42CL-57931、114CL-58838、132CL-58851、96CL-58252、78CL-58102、CL-57859、CL-58832、60CL-57945、258CL-75714、CL-75605、240CL-75565、222CL-75539、204CL-75520、CL-75519、CL-75511、186CL-75506、168CL-75500、CL-75496、CL-75194、150CL-75183、276CL-58722、384CL-58713、366CL-58680、348CL-58679、CL-58921、CL-58676、294CL-58835、330CL-58650和312CL-58756；和/或所述参考抗体包含所选抗体的VH的VL氨基酸序列。在一个实例中，所述参考抗体为IgG4(例如IgG4-PE)抗体。在一个实例中，所述参考抗体为IgG1抗体。在一个实例中，本发明的抗体为IgG4(例如IgG4-PE)抗体。在一个实例中，本发明的抗体为IgG1抗体。在一个实例中，本发明的抗体优先结合人类BMP6而非人类BMP5和/或人类BMP7。可例如通过如本领域技术人员已知的SPR或ELISA测定结合或竞争。
在一个实例中，本发明抗体或片段包含CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650或CL-58756的VH和VL结构域。
在一个实例中，本发明抗体或片段包含CL-66833的VH和VL结构域。在一个实例中，本发明抗体或片段包含CL-57931的VH和VL结构域。在一个实例中，本发明抗体或片段包含CL-58838的VH和VL结构域。在一个实例中，本发明抗体或片段包含CL-58851的VH和VL结构域。在一个实例中，本发明抗体或片段包含CL-58252的VH和VL结构域。在一个实例中，本发明抗体或片段包含CL-58102的VH和VL结构域。在一个实例中，本发明抗体或片段包含CL-57945的VH和VL结构域。
在一个实例中，所选抗体为CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252或CL-58102。在一个实例中，所选抗体为CL-66833。在一个实例中，所选抗体为CL-58838。
在一个实例中，所选抗体包含CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252或CL-58102的可变结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-66833的可变结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-58838的可变结构域。
在一个实例中，所选抗体包含CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252或CL-58102的VH结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-66833的VH结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-58838的VH结构域。
在一个实例中，所选抗体包含CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252或CL-58102的VH和VL结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-66833的VH和VL结构域。在一个实例中，所选抗体包含CL-58838的VH和VL结构域。
在一个实例中，本发明的抗体或片段包含由核苷酸序列编码的VH结构域，所述核苷酸序列为人类基因区段IGHV3-11和IGHJ4(例如人类基因区段IGHV3-11*01和IGHJ4*02；IGHV3-11、IGHD6-19、IGHJ4；或IGHV3-11*01、IGHD6-19*01和IGHJ4*02)的重组体。另外或其它，任选地本发明的抗体或片段包含由核苷酸序列编码的VL结构域，所述核苷酸序列为人类基因区段IGKV3-20和IGKJ1(例如IGKV3-20*01和IGKJ1*01)的重组体。另外或其它，任选地本发明的抗体或片段包含CL-58835的HCDR3。
任选地，本发明的抗体或片段包含选自CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756；例如选自CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102和CL-57945的抗体的HCDR3。任选地，本发明的抗体或片段包含所述所选抗体的HCDR1和/或HCDR2。
任选地，本发明的抗体或片段包含选自CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756；例如选自CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102和CL-57945的抗体的HCDR1。任选地，本发明的抗体或片段包含所述所选抗体的HCDR2和/或HCDR3。
任选地，本发明的抗体或片段包含选自CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756；例如选自CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102和CL-57945的抗体的HCDR2。任选地，本发明的抗体或片段包含所述所选抗体的HCDR1和/或HCDR3。
任选地，本发明的抗体或片段包含选自CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756；例如选自CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102和CL-57945；例如选自CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756的抗体的VH。任选地，本发明的抗体或片段包含所述所选抗体的VL。
任选地，本发明的抗体或片段包含选自CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756；例如选自CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102和CL-57945；例如选自CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756的抗体的VL。任选地，本发明的抗体或片段包含所述所选抗体的VH。
任选地，本发明的抗体或片段包含选自CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756；例如选自CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102和CL-57945；例如选自CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756的抗体的重链。任选地，本发明的抗体或片段包含所述所选抗体的轻链。
任选地，本发明的抗体或片段包含选自CL-66833、CL-57890、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102、CL-57859、CL-58832、CL-57945、CL-75714、CL-75605、CL-75565、CL-75539、CL-75520、CL-75519、CL-75511、CL-75506、CL-75500、CL-75496、CL-75194、CL-75183、CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756；例如选自CL-66833、CL-57931、CL-58838、CL-58851、CL-58252、CL-58102和CL-57945；例如选自CL-58722、CL-58713、CL-58680、CL-58679、CL-58921、CL-58676、CL-58835、CL-58650和CL-58756的抗体的轻链。任选地，本发明的抗体或片段包含所述所选抗体的重链。
在一个实例中，所述所选抗体为CL-58835。
任选地，本发明的抗体包含人类IgG4恒定区。
优选地，特异性结合hBMP6的抗体或其片段不会与其它抗原交叉反应(但可任选地与不同的BMP6物种例如恒河猴、食蟹猴或鼠类交叉反应；和或可能任选地与不同的BMP例如BMP2、4或9交叉反应)。例如，通过免疫检定、BIAcoreTM或本领域技术人员已知的其它技术，可鉴定特异性结合BMP6抗原的抗体或其片段。如使用如放射免疫检定(RIA)和酶联免疫吸附检定(ELISA)的实验技术所测定，当抗体或其片段与hBMP6抗原结合的亲和力高于与任何交叉反应性抗原结合的亲和力时，所述抗体或其片段与hBMP6抗原特异性结合。通常，特异性或选择性反应将为背景信号或噪音的至少两倍并且更通常为背景的10倍以上。关于抗体特异性的讨论，参见例如Paul编，1989，《基础免疫学》，第二版，Raven Press，纽约，第332-336页。
参与抗体与抗原相互作用的接触氨基酸残基，如BMP6，可通过本领域技术人员已知的各种方法测定。
在一个实施方案中，如果抗体识别线性抗原决定基，则可以产生基于抗原序列的短肽，并且可以使用标准技术评估抗体与所述肽的结合。
在一个实施方案中，有限的蛋白水解消化和质谱分析可用于鉴定结合抗原决定基。
在一个实施方案中，通过X射线结晶学鉴定抗原决定基的接触残基。在一个实施方案中，通过低温电子显微镜鉴定抗原决定基的接触残基。在一个实施方案中，通过有限蛋白水解消化与质谱分析的组合鉴定抗原决定基的接触残基。
在另一实施方案中，本文所述的抗BMP6抗体(和片段)提供比其它抗BMP6抗体和片段改良的暂态表达量。因此，在一个实施方案中，所述抗BMP6抗体(或片段)在HEK293细胞(例如HEK293T细胞)中表达，表达量为约100μg/mL，或在约100到350μg/mL的范围内。在另一实施方案中，表达量高于约350μμ/mL。
在另一实施方案中，所述抗BMP6抗体(或片段)在CHO细胞(例如Expi-CHO细胞)中表达，表达量为约100μg/mL，或在约100到350μg/mL的范围内。在另一实施方案中，表达量高于约350μg/mL。
在另一实施方案中，所述抗BMP6抗体(或片段)在CHO细胞(例如Expi-CHO细胞或CHO-E7 EBNA细胞)中表达，表达量为约100μg/mL，或在约100到350μg/mL的范围内。在另一实施方案中，表达量高于约350μg/mL。所述抗体例如包含CL-58838中的任一者的VH和VL结构域，形式为人类IgG1或人类IgG4(例如IgG4-PE)。
在任何所述表达系统中，表达在约0.5mL到3mL、例如约0.5mL到2mL之间的范围内进行。在任何所述表达系统中，所述抗BMP6抗体(或片段)可从pTT5载体表达。在任何所述表达系统中，所述抗BMP6抗体(或片段)可结合脂质转染试剂表达，并且可任选地在CHO细胞(例如Expi-CHO细胞)中表达。在任何所述表达系统中，所述抗BMP6抗体(或片段)可结合PEI转染试剂表达，并且可任选地在CHO细胞(例如CHO-E7 EBNA细胞)中表达。在任何所述表达系统中，所述抗BMP6抗体(或片段)可结合辅助质粒(例如AKT辅助质粒)表达，并且可任选地在CHO细胞(例如CHO-E7 EBNA细胞)中表达。
在任何所述表达系统中，表达量介于约100μg/mL与约1500μg/mL之间，例如介于约100μg/mL与约1000μg/mL之间，或介于约200μg/mL与约1000μg/mL之间，或介于约350μg/mL与约1000μg/mL之间。在任何所述表达系统中，表达的下限可为约100μg/mL、约200μg/mL、约300μg/mL或约400μg/mL。在另一实施方案中，表达的下限可为约500μg/mL、约600μg/mL、约700μg/mL或约800μg/mL。在任何所述表达系统中，表达的下限可为约2000μg/mL、约1800μg/mL、约1600μg/mL或约1500μg/mL。在另一实施方案中，表达的下限可为约1250μg/mL、约1000μg/mL、约900μg/mL或约800μg/mL。
在另一实施方案中，所述表达系统为Lonza表达系统，例如Lonza
Figure BDA0002991179750000681
系统。在Lonza表达系统中，表达可在约30mL到2L、例如50mL到1L、或1L到2L的范围内进行。在Lonza表达系统中，所述抗BMP6抗体(或片段)可结合电穿孔表达，并且任选地不存在任何辅助质粒。在Lonza表达系统中，所述抗BMP6抗体(或片段)可以约1g/L、或约900mg/L、或约800mg/L或约700mg/L的量表达。在另一实施方案中，在Lonza表达系统中，所述抗BMP6抗体(或片段)可以约600mg/L或约500mg/L或约400mg/L的量表达。在Lonza表达系统中，所述抗BMP6抗体(或片段)可以介于约400mg/L与约2g/L之间，例如介于约500mg/L与约1.5g/L之间，或介于约500mg/L与约1g/L之间的量表达。在另一实施方案中，表达量高于1g/L。在另一实施方案中，所述抗BMP6抗体相比于其它抗BMP6抗体提供改良的半衰期。
在一个实施方案中，所述抗体或片段为人类抗体或片段。在一个实施方案中，所述抗体或片段为完全人类抗体或片段。在一个实施方案中，所述抗体或片段为完全人类单克隆抗体或片段。
在一个实施方案中，所述抗体或片段为人源化抗体或片段。在一个实施方案中，所述抗体或片段为人源化单克隆抗体或片段。
参与抗体与抗原相互作用的接触氨基酸残基可通过本领域技术人员已知的各种方法来确定，如丙氨酸扫描、蛋白质结晶学、质谱分析或本领域技术人员显而易见的任何其它技术。
在一个实施方案中，所述CDR包含一个氨基酸取代，其可为保守氨基酸取代。在一个实施方案中，所述CDR包含两个氨基酸取代，其可为保守氨基酸取代。在一个实施方案中，所述CDR包含三个氨基酸取代，其可为保守氨基酸取代。在一个实施方案中，所述CDR包含四个氨基酸取代，其可为保守氨基酸取代。在一个实施方案中，所述CDR包含五个氨基酸取代，其可为保守氨基酸取代。在一个实施方案中，所述CDR包含六个氨基酸取代，其可为保守氨基酸取代。
氨基酸取代包括其中氨基酸被不同的天然存在氨基酸残基替代的改变。所述取代可被分类为“保守性”，在这种情况下，多肽中包含的氨基酸残基被在极性、侧链官能度或大小方面具有相似特性的另一种天然存在的氨基酸替代。所述保守取代为本领域中众所周知。本发明所涵盖的取代还可为“非保守性”，其中存在于肽中的氨基酸残基被具有不同性质的氨基酸取代，如来自不同群组的天然存在氨基酸(例如用丙氨酸取代带电荷或疏水性氨基酸)，或者，其中天然存在的氨基酸用非常规氨基酸取代。
在一个实施方案中，保守氨基酸取代如本文所述。举例来说，取代可为用F取代Y，用S或K取代T，用A取代P，用D或Q取代E，用D或G取代N，用K取代R，用N或A取代G，用S或K取代T，用N或E取代D，用L或V取代I，用Y取代F，用T或A取代S，用K取代R，用N或A取代G，用R取代K，用S、K或P取代A。在另一实施方案中，保守氨基酸取代可为其中用F取代Y，用A或S取代T，用L或V取代I，用Y取代W，用L取代M，用D取代N，用A取代G，用A或S取代T，用N取代D，用L或V取代I，用Y或L取代F，用A或T取代S以及用S、G、T或V取代A。
组合
本发明的抗体或片段可与ESA一起由组合疗法包含，用于治疗或预防贫血，特别是中度到重度贫血(即由血液血红蛋白小于9.5g/dL指示)。所述组合可有效治疗贫血如ACD(慢性疾病贫血)、炎症或感染并且所述组合疗法可产生血液血红蛋白浓度的维持和升高，其与单独使用抗BMP6抗体相比具有统计学意义。此外，所述作用可持续数周(甚至在单剂量施用抗BMP6抗体后)。此外，本发明的组合疗法可用于ESA节减贫血疗法，即能够以低于标准剂量的ESA进行ESA治疗。鉴于ESA的潜在有害副作用，这是有用的。本发明还可用于ESA难治性个体或对标准ESA疗法响应不良的个体的贫血治疗。本发明可有用地维持血液血红蛋白超出中度到重度贫血范围之外和/或防止血液血红蛋白降到这种范围。因此，本发明可用于减少对铁或输血疗法的需要。
本发明可用于发炎性疾病环境和微生物感染环境中的贫血治疗。
为此，本发明提供以下配置1-13：
1.一种维持个体中的血液血红蛋白含量为至少10g/dL的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
2.一种防止个体的血液血红蛋白含量降到小于10g/dL的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
3.一种在罹患贫血的个体中将血液血红蛋白升高到至少10g/dL的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗。
4.一种治疗或预防个体的中度或重度贫血的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。
5.一种治疗或预防罹患发炎性疾病或病状的个体的贫血的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。
6.一种消除或减少对罹患贫血的个体施用铁或输血的需要的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述需要得以消除或降低。
在一个实例中，个体中不稳定血浆铁(LPI)、增强型LPI(eLPI)和非转铁蛋白结合铁(NTBI)中的一者、多者或全部减少。在一个实例中，个体中不稳定血浆铁(LPI)、增强型LPI(eLPI)和非转铁蛋白结合铁(NTBI)中的一者、多者或全部减少。
7.一种治疗或预防罹患微生物感染的个体的贫血的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
8.一种减少罹患贫血的个体的红细胞生成刺激剂(ESA)施用以治疗贫血的方法，所述方法包括施用抗BMP6拮抗剂和所述ESA，其中所述个体中的贫血得以治疗。
9.一种治疗或降低罹患贫血或有贫血风险的个体中的贫血风险的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和低剂量的红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述个体中的贫血得以治疗或贫血风险得以降低。
10.一种治疗或预防罹患贫血或有贫血风险的个体中的贫血的治疗方案，所述方案包括向所述个体同时或依序施用抗BMP6拮抗剂和ESA，其中
a.在第0天向所述个体施用所述拮抗剂；并且不迟于第7天(例如第1天)向所述个体施用所述ESA；或
b.在第0天向所述个体施用所述ESA；并且不迟于第7天(例如第1天)向所述个体施用所述拮抗剂；或
c.在第0天向所述个体同时施用所述拮抗剂和所述ESA；或
d.在第0天所述个体已接受所述ESA，并且在第0天向所述个体施用所述拮抗剂；或
e.在第0天所述个体已接受所述拮抗剂，并且在第0天向所述个体施用所述ESA；
借此，在第14天或之后，所述个体中的血液血红蛋白含量为至少10g/dL，其中所述贫血得以治疗或预防。
11.一种用于治疗或预防个体中的贫血的组合疗法，其用于任何前述技术方案的方法或方案中，所述组合包括
a.抗BMP6拮抗剂；
b.ESA；和
c.任选地在所述方法或方案中使用的说明书。
12.一种用于治疗或预防个体中的贫血的抗BMP6拮抗剂，其用于任何前述配置的方法或方案中。
13.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于治疗或预防个体中的贫血的方法中，所述方法包括向所述个体施用所述抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。
当本文提及“抗BMP6拮抗剂”时，所述拮抗剂可为本文公开的任何抗BMP6抗体或片段，如替代抗体或片段(如本文别处所述)或如所主张或在本发明陈述中或在实施例中(如在表4到11中)提及的任何抗体或片段。
在一方面中，所述拮抗剂包含抗BMP6抗体或片段或由抗BMP6抗体或片段组成，所述方法包括
(a)在初始日(D0)向所述个体施用所述抗BMP6抗体或片段；和
(b)在连续至少3周的时期内，所述时期起始于D0，施用多个剂量的ESA，其中在所述时期的整个持续时间内，所述个体中的血液Hb浓度相比于D0时的基线浓度升高，
使得：
(i)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度不低于基线Hb浓度的100％；并且在所述时期内，Hb浓度达到基线的至少120％；和/或
(ii)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度相比于基线增加至少1g/dl。
本发明的方面如下，并且所述方面(和任何未编号的段落)可与如本文所述的本发明的任何其它配置、实施例、特征、方面或条款组合；本发明的拮抗剂(例如抗BMP6抗体或片段)或ESA可提供用于(或可用于)以下方面中的方法：
1.一种维持个体中的血液血红蛋白含量为至少10、10.5、11、11.5、12、12.5或13g/dL的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
在一个实例中，所述个体中的Hb含量不大于11、11.5或12g/dl。
2.一种防止个体的血液血红蛋白含量降到小于10、10.5、11、11.5、12、12.5或13g/dL的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
3.一种将罹患贫血的个体中的血液血红蛋白含量提高到至少10、10.5、11、11.5、12、12.5或13g/dL的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗。
在任何方面的实例中，在施用所述BMP6拮抗剂之前所述个体罹患中度或重度贫血。在一个实施方案中，所述方法的结果为所述个体不具有贫血或具有轻度(并非中度或重度)贫血。
4.一种治疗或预防个体中的中度或重度贫血的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。
5.一种治疗或预防罹患发炎性疾病或病状的个体中的贫血的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。
在一个实例中，所述发炎性疾病或病状选自由微生物感染(例如细菌感染)或类风湿性关节炎的炎症组成的组。在一个实例中，所述贫血为炎症贫血(也称为慢性疾病贫血，ACD)。
6.一种消除或减少对罹患贫血的个体施用铁或输血的需要的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述需要得以消除或减少。
在一个实施方案中，所述方法降低铁的剂量(例如，每周、每两周或每月剂量)或给药频率。
7.一种治疗或预防罹患微生物(例如细菌)感染的个体中的贫血的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
8.一种减少向罹患贫血的个体施用红细胞生成刺激剂(ESA)以治疗贫血的方法，所述方法包括施用抗BMP6拮抗剂和所述ESA，其中所述个体中的贫血得以治疗。
9.一种治疗或降低罹患贫血或有贫血风险的个体中的贫血风险的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和低剂量的红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述个体中的贫血得以治疗或贫血风险得以降低。
所述剂量低于通常用于治疗或减少个体(例如人类或成人，如男性或女性)中的贫血的标准剂量。用于治疗或预防的典型剂量对于本领域技术人员来说为显而易见的。举例来说，参见方面10。
Epogen通常调配成多种配方的小瓶。用等张氯化钠/柠檬酸钠缓冲溶液调配的单剂量小瓶以多种强度提供。各1mL小瓶含有于注射用水USP(pH 6.9±0.3)中的2000、3000、4000或10,000单位的依泊汀α、白蛋白(人类)(2.5mg)、柠檬酸(0.06mg)，氯化钠(5.9mg)和柠檬酸钠(5.8mg)。用等张氯化钠/磷酸钠缓冲液调配的单剂量1mL小瓶含有于注射用水USP(pH 6.9±0.3)中的40,000单位的依泊汀α、白蛋白(人类)(2.5mg)、柠檬酸(0.0068mg)、氯化钠(5.8mg)、柠檬酸钠(0.7mg)、无水磷酸氢二钠(1.8mg)和单水合磷酸二氢钠(1.2mg)。多剂量2mL小瓶含有每1mL注射用水USP(pH 6.1±0.3)的10,000单位依泊汀α、白蛋白(人类)(2.5mg)、苯甲醇(1％)、氯化钠(8.2mg)和柠檬酸钠(1.3mg)。多剂量1mL小瓶含有每1mL注射用水USP(pH 6.1±0.3)的20,000单位依泊汀α、白蛋白(人类)(2.5mg)、苯甲醇(1％)、氯化钠(8.2mg)、柠檬酸(0.11mg)和柠檬酸钠(1.3mg)。在本发明的一个实施例中，ESA作为所述调配物之一施用。
10.根据任何前述方面的方法，其中所述ESA为
a.依泊汀α且以小于1000、1500、2500、5000、11000、18000、34000或90000单位的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受＜1500、1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90000单位的每周依泊汀α治疗；
b.达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000731
且以小于6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的每周达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000732
治疗；或
c.达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000733
且以小于6.25、10、20、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90,000单位的每周依泊汀α治疗。
11.根据任何前述方面的方法，其中所述抗BMP6拮抗剂为抗体且以如每1周、2周或3周，或每月、2个月或3个月不超过30mg/kg(例如0.1到30mg/kg)的总剂量施用。投药可为例如静脉内或皮下投药，并且所述个体为人类如成人。
12.一种用于治疗或预防罹患贫血或有贫血风险的个体中的贫血的治疗方案，所述方案包括向所述个体同时或依序施用抗BMP6拮抗剂和ESA，其中
a.在第0天向所述个体施用所述拮抗剂；并且不迟于第56、28、14或7天(例如在第1、6或7天)，向所述个体施用所述ESA；或
b.在第0天向所述个体施用所述ESA；并且不迟于第56、28、14或7天(例如在第1、6或7天)，向所述个体施用所述拮抗剂；或
c.在第0天向所述个体同时施用所述拮抗剂和所述ESA；或
d.在第0天所述个体已接受所述ESA，并且在第0天向所述个体施用所述拮抗剂；或
e.在第0天所述个体已接受所述拮抗剂，并且在第0天向所述个体施用所述ESA；
借此，在第14天或之后(例如在第28、56或70天)，所述个体中的血液血红蛋白含量为至少10、10.5、11、11.5、12、12.5或13g/dL，其中所述贫血得以治疗或预防。
任选地，所述拮抗剂在不迟于第7天施用第二次(例如在第6天施用所述拮抗剂)。
13.根据任何前述方面的方法或方案，其中所述抗BMP6拮抗剂和ESA施用到所述个体间隔不超过7天。
14.根据任何前述方面中任一项的方法或方案，其中所述方法或方案在所述个体中将所述个体中的血液血红蛋白含量维持在大于10g/dL。
15.根据任何前述方面的方法或方案，其中在所述个体已接受所述抗BMP6拮抗剂和ESA后至少13或14天，所述方法或方案将所述个体中的血液血红蛋白含量维持或提高到至少10g/dL。
16.根据方面14或15的方法或方案，其中所述抗BMP6拮抗剂和ESA施用到所述个体间隔不超过1天。
17.根据任何前述方面的方法或方案，其中所述抗BMP6拮抗剂和ESA同时施用到所述个体。
18.根据任何前述方面的方法或方案，其中防止所述个体的血液血红蛋白含量降到小于10、10.5、11、11.5、12、12.5或13g/dL(例如在第14天)。
19.根据任何前述方面的方法或方案，其中所述个体的血液血红蛋白提高到至少10、10.5、11、11.5、12、12.5或13g/dL的含量(例如在第14天)。
20.根据任何前述方面的方法或方案，其中所述个体中的中度或重度贫血得以预防(例如在第14天)。
21.根据任何前述方面的方法或方案，其中所述个体罹患
a.发炎性疾病或病状；或
b.感染；
c.肾病；
d.HIV或进行HIV治疗；或
e.癌症；并且
所述个体中的贫血得以治疗或预防。
在一个实例中，所述个体罹患HIV感染、HIV、肝炎、类风湿性关节炎、慢性肾病或终末期肾病。举例来说，感染为革兰氏阴性细菌感染。举例来说，感染为革兰氏阳性细菌感染。
用抗HIV疗法治疗的HIV感染人类可能会出现贫血。因此，本发明可用于治疗或预防所述患者中的贫血。在一个实例中，所述方法或方案可利用施用抗HIV疗法，例如施用＜4200mg/周齐多夫定(zidovudine)来治疗或预防HIV感染人类中的贫血。
用抗癌化学疗法(例如免疫疗法，例如通过向所述个体施用免疫检查点抑制剂，例如抗CTLA4、抗PD-L1、抗TIGIT、抗ICOS或抗PD1抗体)治疗的癌症患者可能会出现贫血。因此，本发明可用于治疗或预防所述患者中的贫血。在一个实例中，所述方法或方案治疗或预防罹患癌症的人类中的贫血。在本领域中，ESA如红细胞生成素通常最初以每周3次150单位/kg IV或SC的剂量；或者每周一次40,000单位SC施用到所述患者，直到完成化学治疗过程。在一个实例中，本发明治疗或预防人类癌症患者中的贫血，其中所述ESA以每周3次小于150单位/kg经静脉内或皮下施用到人类；或小于450单位/kg的总每周剂量施用到人类；或每周小于40,000单位经皮下施用到人类。
本领域中使用ESA治疗来减少患者中(例如在经历手术的患者中)红细胞(RBC)输注的需要。因此，ESA治疗用于例如围手术期血红蛋白＞10g/dL但≤13g/dL的人类患者，其因如选择性、非心脏、非血管手术的手术而具有高的围手术期失血风险。ESA以每日一次300单位/kg SC施用，连续15天(手术前10天，手术当天，手术后4天)；或者，在手术前21天、14天和7天以及手术当天，以4个剂量施用600单位/kg SC。在一个实例中，本发明治疗或预防人类手术患者中的贫血，其中所述ESA如下施用到人类：以每日一次小于300单位/kg，连续15天(手术前10天，手术当天，手术后4天)；或小于4500单位/kg的15日总剂量；或小于600单位/kg，以3-5或4个剂量，例如，在手术前21天、14天和7天以及手术当天施用。
22.根据方面21的方法，其中所述个体中的中度或重度贫血得以治疗或预防。
23.根据任何前述方面的方法或方案，其中所述个体为哺乳动物。
24.一种组合疗法，其用于根据任何前述方面的方法或方案中以治疗或预防个体中的贫血，所述组合包括
a.抗BMP6拮抗剂；
b.ESA；和
c.任选地所述方法或方案的使用说明书。
25.一种抗BMP6拮抗剂，其用于根据任何前述方面的方法或方案中以治疗或预防个体中的贫血。
26.根据方面24的组合或根据方面25的拮抗剂，其用于治疗或预防中度或重度贫血。
27.根据方面24到26中任一项的拮抗剂与抗发炎剂的组合。
28.根据任何前述方面的方法、方案、组合或拮抗剂，其中所述拮抗剂包含抗BMP6抗体结合位点，例如，其中所述拮抗剂为抗体或抗BMP6捕获剂。
在一个实例中，所述捕获剂包含与人类抗体Fc区融合的人类BMP6受体结构域。在一个实施方案中，Fc包含人类γ-1或γ-4重链恒定区。
29.根据任何前述方面的方法、方案、组合或拮抗剂，其中所述ESA为红细胞生成素。
30.根据方面1到23、28和29中任一项的方法或方案，其中向所述个体施用抗发炎剂。
在一个实例中，本发明使用抗BMP6单克隆抗体(mAb)来动员内源性铁储备且增加血红蛋白合成以及任选地红细胞生成。在一个方面中，本发明可减少在ACD患者中同时和普遍使用静脉内铁或输血的需要。另外或其它，本发明可减少用ESA(例如EPO)进行基础护理标准治疗或使ESA(例如EPO)无响应患者(或具有低响应者)对ESA与抗BMP6拮抗剂共同施用有响应的剂量。另外或其它，本发明可治疗或预防难治性贫血或对ESA护理标准无响应的患者中的贫血。在患有不受控高血压或者患有因接受ESA(例如达贝泊汀α，如
Figure BDA0002991179750000761
或例如依泊汀α，如
Figure BDA0002991179750000762
或
Figure BDA0002991179750000763
)引起的纯红细胞再生障碍(PRCA，一种贫血)的患者中，ESA可能为禁忌的。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述个体(例如人类)为
i.ESA(例如达贝泊汀α或依泊汀α)难治性或对ESA无响应；
ii.罹患或已罹患高血压(例如不受控的高血压)；或
iii.罹患或已罹患纯红细胞再生障碍(例如由接受ESA如达贝泊汀α或依泊汀α引起)。
与药物治疗如ESA治疗相关的“难治性”对于本领域技术人员来说为显而易见的，并且例如意指个体对ESA具有抗性或对ESA的响应较低(即，具有小于平均响应)并且对于通过使用ESA的护理标准进行贫血治疗无效。
ESA通常用于将血红蛋白维持在最低含量，既能最大限度地减少输血，也能最大限度地满足患者的需求。如上所述，本发明在其各种配置、方面、实施例和实施方案中可用于ESA节减贫血疗法，即能够使用低于标准剂量的ESA进行ESA治疗。鉴于ESA的潜在有害副作用，这是有用的。表A-D提供所述方面的相关信息。
表A：
Figure BDA0002991179750000771
给药信息
Figure BDA0002991179750000772
Figure BDA0002991179750000781
在一个实例中，所述个体为未进行透析的慢性肾病(CKD)患者。在一个实例中，所述个体为进行透析的慢性肾病(CKD)患者。在一个实例中，所述个体为化学疗法患者(例如接受或已接受癌症化学疗法治疗)。
[表B如下]
表B：
Figure BDA0002991179750000782
副作用
Figure BDA0002991179750000783
Figure BDA0002991179750000791
Figure BDA0002991179750000801
Figure BDA0002991179750000811
在一个实施方案中，本发明的治疗或预防在个体中降低表B中列出的一种或超过一种副作用(例如，一种或超过一种“常见”、“较常见”或“极常见”副作用)的发生率或风险。
在一个方面中，本发明提供一种罹患贫血或有贫血风险的个体的减副作用ESA疗法的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。任选地，表B中列出的一种或超过一种ESA副作用(例如一种或超过一种“常见”、“较常见”或“极常见”副作用)的发生率或风险降低。在一个实例中，所述疗法为贫血治疗。在一个实例中，所述疗法为贫血预防。在一个实例中，所述贫血为中度或重度贫血。
表C：
Figure BDA0002991179750000812
美国黑框警告
Figure BDA0002991179750000813
在一个实施方案中，本发明的治疗或预防在个体中降低表C中列出的一种或超过一种副作用的发生率或风险，例如，缩短总生存期和/或增加肿瘤进展或复发的风险，其中所述个体为乳癌、非小细胞肺癌、头颈癌、淋巴癌和子宫颈癌患者；或心血管或血栓栓塞反应，如中风。
在一个方面中，本发明提供一种罹患贫血或有贫血风险的个体的减副作用ESA疗法的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。任选地，表C中列出的一种或超过一种ESA副作用的发生率或风险(例如，缩短总生存期和/或增加肿瘤进展或复发的风险，其中个体为乳癌、非小细胞肺癌、头颈癌、淋巴癌和子宫颈癌患者；或心血管或血栓栓塞反应，如中风)降低。在一个实例中，所述疗法为贫血治疗。在一个实例中，所述疗法为贫血预防。在一个实例中，所述贫血为中度贫血。在一个实例中，所述贫血为中度到重度贫血。在一个实例中，所述贫血为重度贫血。在一个实例中，本发明中的贫血为源于骨髓抑制化学疗法的贫血。
表D：基于先前依泊汀α剂量(单位倜)用于透析CKD患者的估计Aranesp起始剂量 (微克/周)
Figure BDA0002991179750000821
*对于每周接受＜1,500单位/周的依泊汀α剂量的儿科患者，现有数据不足以确定Aranesp转化剂量。
本发明的方面提供(i)和(ii)
(i)一种减少红细胞生成刺激剂(ESA)施用到罹患贫血的个体以治疗贫血的方法，所述方法包括施用抗BMP6拮抗剂和所述ESA，其中所述个体中的贫血得以治疗。
(ii)一种治疗或降低罹患贫血或有贫血风险的个体中的贫血风险的方法，所述方法包括将抗BMP6拮抗剂和低剂量的红细胞生成刺激剂(ESA)施用到所述个体，其中所述个体中的贫血得以治疗或贫血风险得以降低。
在所述方面的实例中，所述ESA为
a.依泊汀α且以小于1000、1500、2500、5000、11000、18000、34000或90000单位的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周＜1500、1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90000单位的依泊汀α治疗；
b.达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000822
且以小于6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000823
治疗；或
c.达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000824
且以小于6.25、10、20、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90,000单位的依泊汀α治疗。
在实例中，所述ESA为
(i)依泊汀α且以3000到30000单位范围内的每周剂量施用；或
(ii)达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000831
且以15到100微克范围内的每周剂量施用；并且
其中所述个体为人类，例如成人。
在一个实例中，所述血液血红蛋白升高到或维持在高于10g/dL的含量。
在一个实例中，所述个体为成人。在一个实例中，所述个体为小儿。在一个实例中，所述个体为进行透析治疗的人类CKD患者。在一个实例中，所述个体为具有终末期肾病的人类。
在本发明的方法中将治疗或预防有效量的拮抗剂和ESA施用到个体。在一个实例中，抗BMP6拮抗剂与ESA施用到个体的间隔不超过10、14、21或28天。举例来说，抗BMP6拮抗剂与ESA施用到个体的间隔不超过1或2个月。
红细胞生成刺激剂(ESA)的实例为依泊汀α、
Figure BDA0002991179750000832
红细胞生成素、达贝泊汀α、
Figure BDA0002991179750000833
依泊汀β、
Figure BDA0002991179750000834
甲氧基聚乙二醇-依泊汀β、
Figure BDA0002991179750000835
和
Figure BDA0002991179750000836
在一个实施方案中，本发明的ESA为所述中的任一者或所述中的两者或两者以上的组合。
在一个实例中，所述ESA包含例如选自下表的重组红细胞生成素或由例如选自下表的重组红细胞生成素组成。红细胞生成素具有多种糖基化模式，产生α、β、δ和ω形式：
_______________________
表E：示例性红细胞生成素
Figure BDA0002991179750000841
在一个实例中，本发明的ESA选自由α、β、δ、ζ和ω形式组成的组。
在一个实例中，ESA为缺氧诱导因子-脯氨酰羟化酶(HIF-PH)抑制剂，例如罗沙司他(roxadustat)或FG-4592。HIF为体内红细胞(RBC)产生的主要调节因子和治疗贫血的潜在新机制。所述新作用机制称为缺氧诱导因子-脯氨酰羟化酶(HIF-PH)抑制剂。HIF-PH抑制剂通过模拟人体对贫血的自然反应来起作用。这允许体内红细胞生成系统的受控的适应性刺激。整个系统的这种激活导致红细胞(RBC)产生增加和骨髓铁供应的稳定性提高，其确保所述红细胞产生所需的铁于血红蛋白中的适当并入。这种自适应模拟非常类似于人在海拔上升时引起的自然反应。在较高的海拔高度下，血流中循环的低氧含量导致肾脏和肝脏中相关细胞的HIF-PH活性降低。HIF-PH活性降低稳定且增加细胞内蛋白质HIF1α和HIF2α(统称为HIFα)的含量。对于大多数细胞，HIF2α的稳定化大于HIF1α的稳定化，最终导致红细胞生成素(EPO)分泌增加以及随后RBC产生增加。HIF-PH抑制剂通过阻断脯氨酰羟化酶的作用而起作用，其促进HIFα蛋白的分解。随着分解得到抑制，细胞中所述HIFα蛋白的含量增加。所述HIF为主要的蛋白质介体，使得身体和其所有单个细胞能够适应氧含量的变化。通过HIF-PH酶的活性持续产生HIFα蛋白且调节其在细胞中的含量，所述HIF-PH酶靶向HIFα蛋白以降解。HIF1α有助于细胞在极低氧条件下存活，而HIF2α可帮助细胞和身体适应适度氧变化，从海平面到7500英尺的海拔高度变化会发生这种情况。当HIFα稳定化时，其迁移到细胞的细胞核，在此其与蛋白质HIFβ结合。当结合在一起时，其诱导遗传信号产生EPO和其它几种蛋白质。HIF-PH抑制剂可大大增加HIFα含量，其方式与通过抑制体内HIF-PH酶来降低氧以增加HIFα含量一样。随着HIFα持续稳定化(通过留在更高海拔高度或通过每日给与HIF-PH抑制剂)，为了增加血液中循环的氧量，血红蛋白和RBC的含量将上升。
抗BMP6抗体的实例为MAB507，其可从R&D Systems(单克隆小鼠IgG2B，克隆#74219)商购获得。其它合适的抗体公开于US8980582、WO2016098079和US20160176956A1中，所述文献(以及明确地其中抗体、可变区和CDR的序列)的公开内容以引用的方式并入本文中，以可能用于本发明。
在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段组成，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且所述HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1为SEQ ID NO：2的多肽，LCDR2为SEQ ID NO：3的多肽，LCDR3为SEQ ID NO：4的多肽，HCDR1为SEQ ID NO：5的多肽，HCDR2为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的多肽，且HCDR3为SEQ ID NO：8的多肽。所述段落中的SEQ ID NO为US8980582中公开的那些，并且所述序列以引用的方式明确并入本文中，以可能用于本发明且可能包括于本文一个或超过一个技术方案中。
在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段组成，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1为SEQ ID NO：2的多肽，LCDR2为SEQ ID NO：3的多肽，LCDR3为SEQ ID NO：4的多肽，HCDR1为SEQ ID NO：5的多肽，HCDR2为SEQ ID NO：6的多肽，且HCDR3为SEQ ID NO：8的多肽。所述段落中的SEQ ID NO为US8980582中公开的那些，并且所述序列以引用的方式明确并入本文中，以可能用于本发明且可能包括于本文一个或超过一个技术方案中。
在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段组成，其包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1为SEQ ID NO：2的多肽，LCDR2为SEQ ID NO：3的多肽，LCDR3为SEQ ID NO：4的多肽，HCDR1为SEQ ID NO：5的多肽，HCDR2为SEQ ID NO：7的多肽，且HCDR3为SEQ ID NO：8的多肽。所述段落中的SEQ ID NO为US8980582中公开的那些，并且所述序列以引用的方式明确并入本文中，以可能用于本发明且可能包括于本文一个或超过一个技术方案中。
在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段组成，其包含LCVR和HCVR，其中所述LCVR为SEQ ID NO：9的多肽且所述HCVR为SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11的多肽。在另一实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段组成，其包含LCVR和HCVR，其中所述LCVR为SEQ ID NO：9的多肽且所述HCVR为SEQ ID NO：10的多肽。在另一实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或其抗原结合片段组成，其包含LCVR和HCVR，其中所述LCVR为SEQ ID NO：9的多肽且所述HCVR为SEQ ID NO：11的多肽。所述段落中的SEQ ID NO为US8980582中公开的那些，并且所述序列以引用的方式明确并入本文中，以可能用于本发明且可能包括于本文一个或超过一个技术方案中。
在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体组成，其包含LCVR和HCVR，其中所述LCVR为SEQID NO：9的多肽且所述HCVR为SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的多肽。在另一实施方案中，本发明提供与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体，其包含LCVR和HCVR，其中所述LCVR为SEQID NO：9的多肽且所述HCVR为SEQ ID NO：10的多肽。在另一实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体组成，其包含LCVR和HCVR，其中所述LCVR为SEQ ID NO：9的多肽，且所述HCVR为SEQ ID NO：11的多肽。所述段落中的SEQ ID NO为US8980582中公开的那些，并且所述序列以引用的方式明确并入本文中，以可能用于本发明且可能包括于本文一个或超过一个技术方案中。
在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体组成，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC为SEQ ID NO：12的多肽，且所述HC为SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的多肽。在另一实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或者由与人类BMP-6(SEQ IDNO：1)结合的抗体组成，其包含LC和HC，其中所述LC为SEQ ID NO：12的多肽，且所述HC为SEQID NO：13的多肽。在另一实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体组成，其包含LC和HC，其中所述LC为SEQID NO：12的多肽，且所述HC为SEQ ID NO：14的多肽。所述段落中的SEQ ID NO为US8980582中公开的那些，并且所述序列以引用的方式明确并入本文中，以可能用于本发明且可能包括于本文一个或超过一个技术方案中。
在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体组成，其包含两个轻链和两个重链，其中各轻链为SEQ ID NO：12的多肽，且各重链为SEQ ID NO：13的多肽。在一个实施方案中，所述拮抗剂包含与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体或者由与人类BMP-6(SEQ ID NO：1)结合的抗体组成，其包含两个轻链和两个重链，其中各轻链为SEQ ID NO：12的多肽，且各重链为SEQID NO：14的多肽。所述段落中的SEQ ID NO为US8980582中公开的那些，并且所述序列以引用的方式明确并入本文中，以可能用于本发明且可能包括于本文一个或超过一个技术方案中。
在一个实施方案中，本发明提供一种医药组合物，其包含本发明的抗BMP6拮抗剂(例如抗体或其BMP6结合片段)和可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。更确切地说，本发明的组合物进一步包含一种或超过一种的额外治疗剂，例如ESA和/或抗发炎剂。合适的抗发炎剂可为抗体或抗体片段，例如，抗TNFα抗体(例如阿达木单抗、
Figure BDA0002991179750000871
英夫利昔单抗(infliximab)、
Figure BDA0002991179750000872
戈利木单抗(golimumab)、
Figure BDA0002991179750000873
)；或捕获剂(例如依那西普(etanercept)或
Figure BDA0002991179750000881
)；或抗TNFR抗体或抗体片段，或抗IL6R抗体(例如萨瑞鲁单抗(sarilumab)、托西珠单抗(tocilizumab)或
Figure BDA0002991179750000882
)。
在一个实例中，所述抗BMP6拮抗剂、抗体或片段以小于约1×10-8M、优选小于约1×10-9M的KD与BMP6结合，如通过本领域中已知的常用方法，例如通过使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器在37℃下测定。
“有效量”意指本发明的拮抗剂(例如抗体)或ESA或本发明的医药组合物将引起由研究人员、医生或其它临床医生正在寻求的对个体、哺乳动物或人类的生物或医学反应或期望的治疗效果的量。有效量可根据如疾病状态，个体的年龄、性别和体重以及抗体和/或ESA引发个体中的所需反应的能力等因素而改变。有效量也是治疗有益作用超过任何毒性或有害作用的量。
术语“治疗”等打算包括减缓或逆转病症如贫血、中度贫血、重度贫血或血液血红蛋白减少的进展。所述术语还包括缓解、改善、减弱、消除或减少病症或病状(如贫血、中度贫血、重度贫血或血液血红蛋白减少)的一种或超过一种的症状，即使所述病症或病状实际上并未完全消除。个体或患者是指具有疾病、病症或病状(例如贫血或有贫血风险)的哺乳动物，优选人类，其将受益于BMP-6活性抑制。术语“预防”为例如降低疾病或病状如贫血的风险。
本发明的ESA、抗BMP6拮抗剂抗体或其抗原结合片段，包含其的组合或医药组合物，可通过肠胃外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内或经皮)施用。投药可以单个或多个剂量单独地或与医药学上可接受的载剂和/或稀释剂组合施用到个体。本发明的医药组合物、组合或拮抗剂可通过本领域中众所周知的方法制备(例如，《雷明顿：药学的科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)》，第19版，(1995)，A.Gennaro等，Mack Publishing Co.)并且可包含或组合一种或超过一种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
在一个实例中，个体在施用BMP6拮抗剂之前罹患中度或重度贫血，并且中度或重度贫血得以治疗。在一个实施方案中，个体在投药之前罹患中度贫血并且在治疗后个体具有轻度贫血或无贫血。在一个实施方案中，个体在给药前罹患重度贫血并且在治疗后个体具有轻度、中度贫血或无贫血。在一个实施方案中，在治疗后个体具有轻度贫血或无贫血，而非中度或重度贫血。在另一实施方案中，在治疗后个体不具有贫血。在一个实施方案中，个体在投药前的血液血红蛋白含量小于9.5g/dL，并且在治疗后个体的血液血红蛋白含量为至少10、11、12、13或14g/dL。
当怀孕女性的血红蛋白浓度低于11g/dL，非怀孕女性低于12g/dL，男性低于13g/dL时，通常考虑贫血。
贫血的严重程度按以下血红蛋白浓度范围分类：
·当血红蛋白为9.5-13.0g/dL时，考虑轻度贫血
·当血红蛋白为8.0-9.5g/dL时，考虑中度贫血
·当血红蛋白浓度低于8.0g/dL时，考虑重度贫血
在一个实例中，血红蛋白含量处于或等于海平面的测量结果。
在一个实施方案中，个体为人类男性，例如成人或婴儿。在一个实施方案中，个体为人类女性，例如成人或婴儿，例如非怀孕女性或怀孕女性。例如，人类为透析患者。婴儿可为＞1月龄的人类。
在一个实例中，所述方法为消除或减少对罹患贫血的个体施用铁或输血的需要的方法，例如，用于减少铁对个体的剂量或给药频率。
本发明可包括同时或依序施用抗BMP6拮抗剂和ESA。在一个实例中，拮抗剂和ESA投药间隔不超过1个月、4周、3周、2周、1周、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天。如本文所例示，如果拮抗剂和ESA的投药间隔不超过7天(例如不超过一天)，则可为有效的。在一个实例中，抗BMP6拮抗剂和ESA施用到个体的间隔不超过10、14、21或28天。
在一个实例中，ESA每周施用2、3或4次。在一个实例中，ESA每月或在8周时期内施用1、2、3或4次。在一个实例中，ESA(例如依泊汀α)以每周＜3000、2900、2800、2700、2600、＜2500、2500、2400、2300、2200、2100、＜2000、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100或1000单位/千克的总剂量施用。在另一实例中，ESA每月或在8周时期内施用1、2、3或4次。在一个实例中，ESA(例如达贝泊汀α)以每周＜15、＜30、12、11、10、9、8、7、6或5微克/千克的总剂量施用。
在一个实例中，ESA和/或拮抗剂经静脉内或皮下施用到个体。
在一个实例中，贫血是在接受或已接受齐多夫定治疗的个体中。
任选地，本发明的任何配置也是以下中的一者或一者以上：
(a)增加或维持血铁增加，例如，用于治疗或减少贫血的风险；
(b)治疗铁缺乏；
(c)治疗或降低慢性炎症贫血(ACI)的风险；
(d)治疗或降低慢性疾病贫血(ACD)的风险；
(e)治疗或降低与癌症、肾脏病状或GvHD相关的贫血的风险；
(f)增加血液或血清铁含量；
(g)增加网织红细胞计数；
(h)增加红细胞计数；
(i)增加血红蛋白；和
(j)增加个体(例如人类)中的血细胞比容。
在一个实施方案中，本发明是用于调节(例如增加)个体中的红细胞生成。
在一个实施方案中，所述个体为包含BMP6基因SNP rs111588693的人类。这可能与贫血倾向增加有关。
在一个实例中，贫血为慢性疾病贫血(ACD)，如癌症贫血，或慢性肾病贫血(CKD)。当过度活跃发炎性细胞因子引起铁稳态失调，红细胞生成减少以及红细胞寿命缩短时，某些慢性疾病，如癌症、肾病和自身免疫病症，可导致ACD。铁调素已经鉴定为铁稳态中涉及的一种关键激素；高含量的铁调素与ACD中可见的铁限制性红细胞生成相关。BMP-6已证实增加铁调素表达。在一个实例中，本发明用于降低或维持个体中降低的铁调素含量。
CKD贫血为CKD患者的早期常见并发症的贫血。癌症贫血为由血液系统恶性肿瘤和一些实体肿瘤引起的贫血；然而，化学疗法诱发的(例如免疫疗法诱发的)贫血为由癌症患者用化学治疗剂治疗引起的贫血。CKD中的贫血加重了糖尿病性神经病、心血管疾病和视网膜病以及其它病状。癌症相关的贫血与死亡相对风险增加相关。癌症相关贫血的当前治疗选择仅限于输血，因为红细胞生成刺激剂仅适用于化学疗法诱发的贫血。
在一个实例中，个体罹患慢性疾病，如癌症(例如血液系统恶性肿瘤或实体肿瘤)、肾病、自身免疫病症或化学疗法诱发的贫血。在一个实例中，个体(例如人类)罹患CKD，以及糖尿病性神经病、心血管疾病和视网膜病中的一者或一者以上。
在一个实例中，贫血为铁调素相关的铁限制性贫血。在一个实例中，贫血为铁难治性缺铁贫血(IRIDA)。在一个实施方案中，IRIDA由个体的TMPRSS6基因缺陷引起，例如，其中IRIDA由TMPRSS6基因突变(例如SNP，如rs855791；rs2543519；rs2235324；或rs1421312)引起。
在一个实例中，除了或代替治疗或预防贫血，所述方法为治疗或预防干燥综合征的方法。
在一个实例中，本发明用于增加个体中(例如人类中)的血铁含量、血清铁含量、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容。
在一个实施方案中，本发明提供抗BMP6拮抗剂和ESA用于制造药物的用途。在另一实施方案中，本发明提供抗BMP6拮抗剂和ESA用于制造供治疗或预防贫血(例如中度到重度贫血)的药物的用途。在另一实施方案中，本发明提供抗BMP6拮抗剂和ESA用于制造供治疗慢性疾病贫血的药物的用途。在另一实施方案中，本发明提供抗BMP6拮抗剂和ESA用于制造供治疗慢性肾病贫血的药物的用途。在另一实施方案中，本发明提供抗BMP6拮抗剂和ESA用于制造供治疗癌症贫血的药物的用途。在一个实施方案中，本发明提供抗BMP6拮抗剂和ESA用于制造供治疗IRIDA的药物的用途。在另一实施方案中，本发明提供抗BMP6拮抗剂和ESA用于制造供治疗IRIDA的药物的用途，其中IRIDA由TMPRSS6基因突变(例如SNP，如rs855791；rs2543519；rs2235324；或rs1421312)引起。在一个实施方案中，本发明提供抗BMP6拮抗剂和ESA用于制造供治疗干燥综合征的药物的用途。
实施方案
本发明的实施方案如下，且所述实施方案(和任何未编号的段落)可与如本文所述的本发明的任何其它配置、条款、段落、实例、特征或方面组合；本发明的拮抗剂(例如抗BMP6抗体或片段)或ESA可提供用于(或可用于)以下实施方案中的方法中：
1.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于治疗或预防个体中的贫血的方法中，所述方法包括向所述个体施用所述抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。
在一个实施方案中，所述方法用于治疗个体中的贫血，其中所述贫血得以治疗。
在一个实例中，所述拮抗剂包含以下或由以下组成：抗BMP6抗体或片段，例如人类、人源化或嵌合抗体。作为抗体或片段的替代，本发明涵盖不同的BMP6拮抗剂，例如，抗BMP6捕获剂或HJV-Fc。
2.根据实施方案1的拮抗剂，其中所述拮抗剂包含抗BMP6抗体或片段或由抗BMP6抗体或片段组成，所述方法包括：
(a)在初始日(D0)向所述个体施用所述抗BMP6抗体或片段；和
(b)在连续至少3周的时期内，所述时期起始于D0，施用多个剂量的ESA，其中在所述时期的整个持续时间内，所述个体中的血液Hb浓度相比于D0时的基线浓度升高，
使得：
(i)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度不低于基线Hb浓度的100％；并且在所述时期内，Hb浓度达到基线的至少120％；和/或
(ii)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度相比于基线增加至少1g/dl。
在本文的任何实施方案中，在所述时期的整个持续时间的实例中，Hb浓度相比于基线增加至少1g/dl，例如，至少1.5、2或2.5g/dl。在一个实例中，Hb浓度在个体(例如，成年男性或女性人类)中不超过11、11.5或12g/dl。
Hb浓度和MCH(参见下文)可使用从个体获得的一个或超过一个血液样本来确定。举例来说，如使用在所述时期的每周结束时采集的血液样本(以及使用在D0时获取的样本确定的基线)确定。
3.一定量的抗BMP6抗体或片段和一定量的ESA(例如包含多个剂量的所述ESA)的组合，其用于治疗贫血的方法中，其中所述抗体、片段和方法是根据实施方案2。
4.根据实施方案3的组合，其中所述方法包括从所述量的抗体或片段获得单个剂量，其中在D0时将所述单个剂量施用到所述个体，以及获得多个剂量的所述ESA，其中至少一个剂量从D0起每周施用。
在本文的任何实施方案中，在一个实例中，在D0时施用第一剂量的ESA。
5.根据实施方案3或4的组合，其中所述抗体或片段由医药组合物包含，其中将所述抗体或片段与一定剂量的所述ESA混合以在D0时施用到所述个体。
6.一种医疗试剂盒，其包括根据实施方案3到5中任一项的组合，包含所述量的抗体或片段的第一无菌容器，和包含所述量的ESA的第二无菌容器，以及任选地用于实施所述方法的说明书。
7.根据实施方案1的拮抗剂，其中所述拮抗剂包含红细胞生成素刺激剂(ESA)或由红细胞生成素刺激剂(ESA)组成(例如包含多个剂量的所述ESA)，所述方法包括：
(a)在初始日(D0)向所述个体施用抗BMP6抗体或片段；和
(b)在连续至少3周的时期内，所述时期起始于D0，施用多个剂量的所述ESA，其中在所述时期的整个持续时间内，所述个体中的血液血红蛋白(Hb)浓度相比于D0时的基线浓度升高，
使得：
(i)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度不低于基线Hb浓度的100％；并且在所述时期内，Hb浓度达到基线的至少120％；和/或
(ii)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度相比于基线增加至少1g/dl。
8.根据实施方案2到7中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中
(iii)所述连续周时期的最后一天的Hb浓度为紧接在所述最后一天之前的第7天的Hb浓度的至少120％。
9.根据实施方案2到8中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在施用所述抗BMP6抗体或片段的24小时内向所述个体施用ESA。
10.根据实施方案2到9中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述连续周时期由连续3或4周的时期组成。
11.根据实施方案2到10中任一项(例如实施方案10)的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在所述时期内Hb浓度达到相比于基线增加范围为1到8g/dl。
在本文的任何实施方案中，在所述时期内的实例中，Hb浓度达到相比于基线增加范围为1到3、2.5、2、1.5或1.25g/dl。例如，Hb浓度达到增加1到2g/dl。
12.根据实施方案2到11中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述时期由连续3或4周组成，并且在所述时期结束时Hb浓度达到基线的至少150％。
13.根据实施方案2到12中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述时期由连续3或4周组成，并且
(a)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度不低于基线Hb浓度的110％；并且在所述时期内，Hb浓度达到基线的至少150％；和/或
(b)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度相比于基线增加至少1g/dl，并且在所述时期内Hb浓度达到相比于基线增加范围为1到8g/dl。例如，Hb浓度达到从1g/dl增加到2g/dl。
14.根据实施方案2到13中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在所述时期内，在D0时施用所述抗体或片段。
15.根据实施方案14的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在D0时以单个剂量向所述个体施用所述抗体或片段。
在本文的任何实施方案中，在一个实例中，在D0时以单个剂量向所述个体施用所述抗体或片段，其中所述单个剂量以一个或多个等分剂量施用到所述个体。
16.根据实施方案2到15中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中初始ESA剂量在D0或之后不超过2天施用。
17.根据实施方案2到16中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中ESA剂量在D0之后第4-9天(例如第7天)施用。
18.根据实施方案2到17中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中ESA剂量在D0之后第12-16天(例如第14天)施用。
19.根据实施方案2到18中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中ESA剂量在D0之后第19-23天(例如第21天)施用。
在本文的任何实施方案中，在一个实例中，ESA剂量在D0之后(i)第4-9天(例如第7天)，(ii)第12-16天(例如第14天)和(iii)第19-23天(例如第21天)中的每一者中施用。
20.根据实施方案2到19中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在所述时期内施用等效4个ESA剂量。
这里“等效”意指可以施用多个等分剂量的ESA(例如在同一天或依序)，其中等分剂量总计为ESA的总剂量。在一个实例中，ESA为达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750000941
且剂量范围为15到100mcg(微克)；或者30到100微克。在一个实例中，ESA为依泊汀α且剂量范围为3000到30000单位(即，单位是指国际单位，在各种语言中也称为IU、UI、IE、ME、NE)。
本文中一般来说，(例如抗体、片段或ESA的)剂量可以一个等分剂量或多个等分剂量施用(例如，在同一天，同时，在30、1或24小时窗口内)。
21.根据实施方案2到20中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中ESA在初始ESA剂量后的第一周和第二周中的每一周期间施用到个体。
22.根据实施方案2到21中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中ESA在初始ESA剂量后的第一周、第二周和第三周中的每一周期间施用到个体。
23.根据实施方案21或22的拮抗剂、组合或试剂盒，其中ESA在每个所述周结束时作为单剂量施用，任选地其中所述时期由起始于D0的3或4周组成。
在任何实施方案的实例中，所述时期由起始于D0的4周组成且贫血在第4周得以治疗。
24.根据实施方案2到23中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在所述时期内向所述个体施用不超过4个剂量的ESA和任选地单个剂量的所述抗体或片段。
25.根据实施方案2到24中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在所述时期内(其中所述时期为连续4周时期)，抗体的总剂量和ESA的总剂量以X∶Y的比率施用到所述个体，其中X为10到2×106且Y＝4。
在一个实例中，ESA的每周总剂量(例如其中个体为人类)为10或15到80、100、200或300mcg(微克)。举例来说，每周总剂量为10到80；15到80；或30到80微克。举例来说，ESA包含达贝泊汀α、依泊汀α或本文公开的任何其它ESA或由达贝泊汀α、依泊汀α或本文公开的任何其它ESA组成。在一个实例中，施用到个体的ESA的各剂量(或每周剂量)在1.5到2微克/千克ESA的范围内。
在某些配置中，所述方法涉及减少或节减ESA的施用。在所述情况下，例如，ESA的总每周剂量(例如其中个体为人类)为1到20微克，例如1到15微克。在其中节减或减少ESA的实例中，施用到个体的ESA的各剂量(或每周剂量)在0.01或0.1到0.3或1微克/千克ESA范围内，例如，0.01到0.3；或0.1到0.3；或0.01到1；或0.1到1微克/千克。
26.根据实施方案2到25中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在所述时期(例如连续3或4周时期)结束时的Hb浓度为相同物种的对照贫血患者中的Hb浓度的至少130％，所述对照贫血患者已在与所述个体相同的给药方案中接受抗BMP6抗体或片段施用，其中例外为所述患者在所述时期内未接受ESA施用。
27.根据实施方案26的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在所述时期结束时的所述Hb浓度显著高于所述时期结束时的所述对照，如由p＜0.0001的p值所确定。
28.根据实施方案2到27中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述时期结束时的平均红细胞血红蛋白(MCH)为相同物种的对照贫血患者中MCH的至少109％，所述对照贫血患者已在与所述个体相同的给药方案中接受抗BMP6抗体或片段施用，其中例外为所述患者在所述时期内未接受ESA施用。
平均红细胞血红蛋白(MCH)为血液样本中每个红细胞的血红蛋白的平均质量。
29.根据实施方案2到28中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述时期(例如连续3或4周时期)结束时的Hb浓度为相同物种的对照贫血患者中Hb浓度的至少120％，所述对照贫血患者已在与所述个体相同的给药方案中接受所述ESA施用，其中例外为所述患者在所述时期内未接受抗BMP6抗体或片段施用。任选地，对照患者已接受不会特异性结合BMP6的对照IgG4抗体(例如其中BMP6抗体和对照抗体分别以相同剂量施用到个体和对照患者)。任选地，X为10到2×105、2×104或2×103。
30.根据实施方案29的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述时期结束时的所述Hb浓度显著高于所述时期结束时的所述对照，如由p＜0.0001的p值所确定。
31.根据实施方案2到30中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述时期(例如连续3或4周时期)结束时的平均红细胞血红蛋白(MCH)为相同物种的对照贫血患者中MCH的至少119％，所述对照贫血患者已在与所述个体相同的给药方案中接受所述ESA施用，其中例外为所述患者在所述时期内未接受抗BMP6抗体或片段施用。
32.根据实施方案31的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述时期结束时的所述MCH显著高于所述时期结束时的所述对照，如由p＜0.0001的p值所确定。
33.根据实施方案2到32中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述个体在D0时罹患慢性疾病贫血(ACD)并且任选地其中所述贫血与慢性炎症相关(例如所述个体罹患关节炎)或细菌感染(例如链球菌感染)，或者其中所述个体为慢性肾病(CKD)患者。
34.根据实施方案2到33中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中在所述时期结束时所述个体中的贫血不如D0时严重。
35.根据实施方案1的拮抗剂，其中所述拮抗剂包含抗BMP6抗体或片段或由抗BMP6抗体或片段组成。
36.根据实施方案2到34中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体或片段与参考抗体竞争结合BMP6，其中所述参考抗体为mAb507(R&D Systems)或包含以下的抗体：
a.重链，其各包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成，和轻链，其各包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；或
b.重链，其各包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成，和轻链，其各包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列或由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。
本文的竞争可以例如通过SPR(例如在37℃在pH 7.6下且任选地作为Fab)；通过ELISA；通过荧光激活细胞分选(FACS)；或在均相时间分辨式荧光(HTRF)检定中确定。SPR可以使用BiacoreTM、ProteonTM或另一标准SPR技术进行。在一个实施方案中，通过ForteBio
Figure BDA0002991179750000961
串物层干涉测量术(BLI)确定竞争，所述技术对于本领域技术人员为显而易见的。
在一个替代方案中，参考抗体为WO2016098079中公开的任何抗BMP6抗体(序列和关于所述抗体的公开内容并入本文中以可能用于本发明)。
37.根据实施方案2到36中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：6。所述SEQ ID NO：6可以肽本身，较大肽的一部分或BMP6蛋白(例如野生型人类BMP6或重组产生的BMP6)的一部分的形式使用。
另外或其它，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合选自由SEQ ID NO：7-19组成的组的另一序列。所述另一序列可以肽本身，较大肽的一部分(例如包含SEQ ID NO：6)或BMP6蛋白(例如野生型人类BMP6或重组产生的BMP6，例如包含SEQ ID NO：6)的一部分的形式使用。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：7。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：8。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：9。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ IDNO：10。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：11。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：12。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：13。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQID NO：14。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：15。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：16。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：17。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：18。举例来说，所述抗体或片段与所述参考抗体竞争结合SEQ ID NO：19。所述段落和本文实施方案中的序列ID号为WO2017191437中公开的那些，所述文献的公开内容并入本文中。
38.根据实施方案2到37中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体或片段竞争性地抑制可溶性血幼素(HJV)与BMP6的结合。
39.根据实施方案1到38中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体或片段不会竞争性地抑制可溶性血幼素(HJV)与BMP6的结合(例如如通过SPR、HTRF或ELISA所测定)。
40.根据实施方案2到39中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体包含由VDJ区域序列编码的VH结构域，其中所述VDJ源自VH基因区段、D基因区段和JH基因区段的重组，其中所述VH为人类生殖系(i)VH1-3，(ii)VH2-5或(iii)VH3-15基因区段。
41.根据实施方案2到40中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体包含由VJ区域序列编码的VL结构域，其中所述VJ源自VL基因区段和JL基因区段的重组，其中所述VL为人类生殖系(iv)Vκ3-20，(v)Vλ3-1，(vi)Vκ1-17或(vii)Vλ1-40。
42.根据实施方案2到41中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体或片段与BMP6结合的亲和力强于(通过SPR测定的较低KD)与BMP7结合的亲和力；并且任选地与BMP6结合的亲和力强于与BMP5结合的亲和力。
任选地，所述抗体或片段与BMP6结合的亲和力强于与BMP2、4、5和9中每一者结合的亲和力。
43.根据实施方案2到42中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体或片段与包含SEQ ID NO：6的人类BMP6序列结合。
44.根据实施方案2到43中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体与BMP6结合的亲和力(KD)为1pM到5nM，任选地其中通过SPR使用所述抗体的Fab在37℃下在pH7.6下测定结合。
在一个实例中，所述抗体(例如作为Fab)或片段与BMP6结合的亲和力(KD)为
(a)2、3、4、5或10pM到3、4或5nM；
(b)1-10pM到5nM；
(c)10pM到3、4或5nM；
(d)50或80pM到200nM；
(e)50或80pM到150nM；或
(f)50或80pM到100nM。
在一个实例中，KD为(或为约)5-15pM(例如10pM)。在一个实例中，KD为(或为约)2-5nM(例如3nM)。在一个实例中，KD为(或为约)100-400pM(例如140或390pM)。
45.根据实施方案2到44中任一项(例如实施方案44)的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体与结合BMP6的解离速率(Koff)为1×10-5到1×10-3S-1，任选地其中通过SPR使用所述抗体的Fab在37℃下在pH 7.6下测定结合。
在一个实例中，所述抗体(例如作为Fab)或片段与结合BMP6的解离速率(Koff)为
(a)1×10-5到5×10-4S-1；
(b)1×10-5到6×10-4S-1；
(c)1×10-5到7×10-4S-1；
(d)1×10-5到8×10-4S-1；
(e)2×10-5到1×10-3S-1；
(f)2×10-5到5×10-4S-1；
(g)2×10-5到6×10-4S-1；
(h)2×10-5到7×10-4S-1；或
(i)2×10-5到8×10-4S-1。
在一个实例中，Koff为(或为约)5×10-4S-1(例如，当KD为(或为约)2nM到400pM时；当KD为(或为约)2-5nM(例如3nM)时；或当KD为(或为约)100-400pM(例如140或390pM)时)。在一个实例中，Koff为(或为约)3×10-5S-1(例如当KD为(或为约)5-15pM(例如10pM)时)。
46.根据实施方案2到45中任一项(例如实施方案44和/或45)的拮抗剂、组合或试剂盒，其中所述抗体与结合BMP6的结合速率(Kon)为1×105到1×107M-1S-1，任选地其中通过SPR使用所述抗体的Fab在37℃下在pH 7.6下测定结合。
在一个实例中，所述抗体(例如作为Fab)或片段对于结合BMP6的结合速率(Kon)为
(a)1×105到1×106M-1S-1；
(b)1×105到2×106M-1S-1；
(c)1×105到3×106M-1S-1；
(d)1×105到4×106M-1S-1；
(e)1×105到5×106M-1S-1；
(f)2×105到5×106M-1S-1；
(g)3×105到5×106M-1S-1；
(h)4×105到5×106M-1S-1；
(i)5×105到5×106M-1S-1；或
(j)6×105到5×106M-1S-1。
在一个实例中，Kon为(或为约)1或2×10-5M-1S-1(例如当KD为2-5nM(例如3nM)时)。在一个实例中，Kon为(或为约)1-4、1、2、3或4×10-6M-1S-1(例如当KD为(或为约)5-400pM(例如140或390pM)或5-15pM(例如10pM)时)。
47.根据实施方案2到46中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其中
(a)所述时期由连续3或4周组成，并且
(i)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度不低于基线Hb浓度的110％；并且在所述时期内，Hb浓度达到基线的至少120％；和/或
(ii)在所述时期的整个持续时间内，Hb浓度相比于基线增加至少1g/dl，并且在所述时期内，Hb浓度达到相比于基线增加范围为1到8g/dl；
(b)其中在所述时期之前两周或三周内ESA的剂量施用至少两次；
(c)其中所述抗体或片段与BMP6结合的亲和力强于(通过SPR测定的较低KD)与BMP7结合的亲和力；并且任选地与BMP6结合的亲和力强于与BMP5结合的亲和力(并且任选地与BMP6结合的亲和力强于与BMP2、4、5和9中的每一者结合的亲和力)；并且
(d)其中所述抗体或片段与参考抗体竞争结合BMP6，其中所述参考抗体为mAb507(R&D Systems)，或者包含以下的抗体：
I.重链，其各包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成，和轻链，其各包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；或
II.重链，其各包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成，和轻链，其各包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列或由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。
任选地，在I部分中，重链由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成且轻链由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。任选地，在I部分中，重链由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成且轻链由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。任选地，在II部分中，重链由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成且轻链由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。
在一个实例中(根据下面实施例2中使用的抗体)，在(d)部分中，本发明的抗BMP6抗体为在HTRF检定中与I部分或II部分的参考抗体竞争的抗体。举例来说，其中在HTRF检定中，本发明的抗体为用人类BMP6预温育且随后与未标记的参考抗体(根据I或II部分)组合的经标记抗体，其中所述抗体之间的竞争通过检定检测。在一个实例中，检定使用AlexaFluorTM 647标记的本发明抗体。在一种替代方案中，人类BMP6经标记(例如用AlexaFluorTM 647，测试抗体用生物素标记以结合Eu3+穴状化合物-抗生蛋白链菌素，并且参考抗体未经标记)。
任选地，本发明的抗BMP6抗体(测试抗体)在HTRF检定中与参考抗体竞争结合人类BMP6(或与参考抗体结合人类BMP6的相同抗原决定基)，其中所述检定使用直接或间接地利用供体(如例如Eu3+穴状化合物)或受体荧光团(如例如AlexaFluorTM 647)标记的直接或间接标记的测试抗体以及用供体或受体荧光团标记以实现供体与受体之间能量转移的靶BMP6，借此产生并检测荧光信号。在一个实例中，其中使用AlexaFluorTM 647标记，当测试抗体在参考抗体存在下在665nM下的荧光信号相比于不存在参考抗体下的信号降低至少20％时，检测到竞争。任选地，665nM下信号降低为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
任选地，抗BMP6抗体(测试抗体)为一种在HTRF检定中与参考抗体竞争结合人类BMP6(或与参考抗体结合人类BMP6的相同抗原决定基)的抗体，其中所述参考抗体包含各包含SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的重链和各包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的轻链，其中所述检定使用利用供体标记(如例如Eu3+穴状化合物)或受体荧光团标记(如例如AlexaFluorTM 647)直接或间接标记的测试抗体以及分别用受体荧光团或供体标记以实现供体与受体之间能量转移的人类BMP6，其中通过当测试抗体在参考抗体存在下的荧光信号相比于不存在参考抗体下的信号降低至少20％，检测到所述抗体之间的所述竞争。举例来说，测试抗体用AlexaFluorTM647直接或间接标记，且通过当测试抗体在参考抗体存在下在665nM下的荧光信号相比于不存在参考抗体下的信号降低至少20％，检测到竞争。任选地，在665nM下信号降低为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
任选地，所述抗BMP6抗体(测试抗体)在HTRF检定中还与参考抗体竞争结合人类BMP6(或与参考抗体结合人类BMP6的相同抗原决定基)，其中所述参考抗体包含各包含SEQID NO：4的氨基酸序列的重链和各包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链，其中所述检定例如使用利用供体标记(如例如Eu3+穴状化合物)或受体荧光团标记(如例如AlexaFluorTM647)直接或间接标记的测试抗体以及分别用受体荧光团或供体标记以实现供体与受体之间能量转移的人类BMP6，其中通过当测试抗体在参考抗体存在下的荧光信号相比于不存在参考抗体下的信号降低至少20％，检测到所述抗体之间的所述竞争。举例来说，测试抗体用AlexaFluorTM 647直接或间接标记，且通过当测试抗体在参考抗体存在下在665nM下的荧光信号相比于不存在参考抗体下的信号降低至少20％，检测到竞争。任选地，在665nM下信号降低为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
例如，在(b)部分中，在所述时期之前3周内或在所述时期内，ESA的剂量施用2、3或4次。
在一个替代方案中，参考抗体为WO2016098079中公开的任何抗BMP6抗体(序列和关于所述抗体的公开内容并入本文中以可能用于本发明)。
48.根据实施方案1到47中任一项的拮抗剂、组合或试剂盒，其用于
a.治疗个体中的ACD；
b.治疗或预防个体中的中度或重度贫血；
c.治疗或预防个体中的贫血，其中所述个体罹患发炎性疾病或病状；
d.消除或减少向个体施用铁或输血的需要；
e.治疗或预防个体中的贫血，其中所述个体罹患微生物感染；或
f.减少个体的ESA施用。
49.一种治疗个体中的贫血的方法，所述方法包括：
(a)在初始日(D0)向所述个体施用抗BMP6抗体或片段；和
(b)在连续至少3周的时期内，所述时期起始于D0，施用多个剂量的红细胞生成素刺激剂(ESA)，其中在所述时期的整个持续时间内，所述个体中的血液血红蛋白(Hb)浓度相比于D0时的基线浓度升高，
使得对于所述时期的整个持续时间：
(i)Hb浓度不低于基线Hb浓度的100％；并且在所述时期内，Hb浓度达到基线的至少120％；和/或
(ii)Hb浓度相比于基线增加至少1g/dl。
50.根据实施方案49的方法，其中所述方法、抗体片段或ESA如实施方案2到48中任一项所述。
51.根据任何前述实施方案的拮抗剂、组合、试剂盒或方法，其中所述贫血为中度或重度贫血。
52.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于在个体中维持血液血红蛋白(Hb)含量为至少10g/dL的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
本发明的任何抗BMP6抗体或片段均可用作抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂。
53.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于防止个体的血液血红蛋白含量降到小于10g/dL的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
54.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于在罹患贫血的个体中将血液血红蛋白升高到至少10g/dL的含量的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗。
55.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于治疗或预防罹患发炎性疾病或病状的个体中的贫血的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防。
56.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于消除或降低对罹患贫血的个体施用铁或输血的需要的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述需要得以消除或降低。
57.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于治疗或预防罹患微生物感染的个体中的贫血的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)。
58.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于减少向罹患贫血的个体施用红细胞生成刺激剂(ESA)以治疗贫血的方法，所述方法包括施用抗BMP6拮抗剂和所述ESA，其中所述个体中的贫血得以治疗。
59.一种抗骨形态发生蛋白6(BMP6)拮抗剂，其用于治疗或降低罹患贫血或有贫血风险的个体中的贫血风险的方法，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和低剂量的红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述个体中的贫血得以治疗或贫血风险得以降低。
60.根据实施方案52到59中任一项的拮抗剂，其中所述拮抗剂是根据实施方案1到1、2、7到48和51中任一项。
61.根据实施方案52到59中任一项的拮抗剂，其中所述拮抗剂是根据实施方案52到59中任一项。
62.根据任何前述实施方案的拮抗剂、组合、试剂盒或方法，其中所述ESA为
a.依泊汀α且以小于1000、1500、2500、5000、11000、18000、34000或90000单位的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周＜1500、1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90000单位的依泊汀α治疗；
b.达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750001031
且以小于6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750001032
治疗；或
c.达贝泊汀α或
Figure BDA0002991179750001033
且以小于6.25、10、20、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受每周1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90,000单位的依泊汀α治疗。
63.根据任何前述实施方案的拮抗剂、组合、试剂盒或方法，其中所述抗BMP6拮抗剂为抗体且各剂量以不超过30mg/kg的总量施用。
64.一种抗BMP6拮抗剂和/或ESA，其用于治疗或预防罹患贫血或有贫血风险的个体的贫血的治疗方案方法，所述方案包括向所述个体同时或依序施用抗BMP6拮抗剂和ESA，其中
a.第0天向所述个体施用所述拮抗剂；并且不迟于第7天(例如第1天)向所述个体施用所述ESA；或
b.第0天向所述个体施用所述ESA；并且不迟于第7天(例如第1天)向所述个体施用所述拮抗剂；或
c.第0天向所述个体同时施用所述拮抗剂和所述ESA；或
d.第0天所述个体已接受所述ESA且第0天向所述个体施用所述拮抗剂；或
e.第0天所述个体已接受所述拮抗剂且第0天向所述个体施用所述ESA；
借此，在第14天或之后，所述个体中血液血红蛋白含量为至少10g/dL，其中所述贫血得以治疗或预防。
65.根据实施方案64的拮抗剂和/或ESA，其进一步根据实施方案1到1、2、7到48和51中的任一项。
66.根据实施方案64或65的拮抗剂和/或ESA，其中抗BMP6拮抗剂和ESA施用到所述个体的间隔不超过7天。
67.根据实施方案64、65或66的拮抗剂和/或ESA，其中所述方案在所述个体中维持所述个体中的血液Hb含量超过10g/dL。
68.根据实施方案64到67中任一项的拮抗剂和/或ESA，其中所述方法在所述个体接受所述抗BMP6拮抗剂和ESA后至少13或14天在所述个体中维持或升高血液血红蛋白含量到至少10g/dL。
69.根据实施方案67或68的拮抗剂和/或ESA，其中所述抗BMP6拮抗剂和ESA施用到所述个体的间隔不超过1天。
70.根据实施方案64到69中任一项的拮抗剂和/或ESA，其中所述抗BMP6拮抗剂和ESA同时施用到所述个体。
71.根据实施方案64到70中任一项的拮抗剂和/或ESA，其中所述个体的血液血红蛋白含量经防止降低到小于10g/dL(例如在第14天)。
72.根据实施方案64到71中任一项的拮抗剂和/或ESA，其中所述个体的血液血红蛋白升高到至少10g/dL的含量(例如在第14天)。
73.根据实施方案64到72中任一项的拮抗剂和/或ESA，其中所述个体中的中度或重度贫血得以预防(例如在第14天)。
74.根据任何前述实施方案的拮抗剂、组合、试剂盒、ESA或方法，其中所述个体罹患
a.发炎性疾病或病状；或
b.感染；
c.肾病；
d.HIV或进行HIV治疗；或
e.癌症；并且
所述个体中的贫血得以治疗或预防。
75.根据任何前述实施方案的拮抗剂、组合、试剂盒、ESA或方法，其中所述个体为哺乳动物。
76.根据任何前述实施方案的拮抗剂、组合、试剂盒、ESA或方法，其与抗发炎剂组合，或其中向所述个体施用抗发炎剂。
77.根据任何前述实施方案的拮抗剂、组合、试剂盒、ESA或方法，其中所述ESA为红细胞生成素。
在一个实例中，所述个体罹患慢性肾病(CKD)。参考“KDIGO慢性肾脏病贫血临床实践指南(KDIGO Clinical Practice Guideline for Anaemia in Chronic KidneyDisease)”，《国际肾脏病杂志增刊(Kidney International Supplements)》(2012)2，279；doi：10.1038/kisup.2012.37。其讨论慢性肾病的阶段(阶段1-5)、诊断、CKD命名、Hb含量和各种年龄人类中的范围和ESA低响应性。所述参考文献公开：
贫血的诊断
·当男性Hb浓度＜13.0g/dl和女性Hb浓度＜12.0g/dl时，在患有CKD的成人和＞15岁的儿童中诊断出贫血。(未评级)
·如果0.5-5岁儿童的Hb浓度＜11.0g/dl，5-12岁儿童的Hb浓度＜11.5g/dl，和12-15岁儿童的Hb浓度＜12.0g/dl，则在患有CKD的儿童中诊断出贫血。(未评级)
因此，在本发明中，任选地
(a)所述个体为具有CKD的成人或＞15岁的儿童，且在所述时期内(例如在从D0起的第3周开始时)Hb浓度＜13.0g/dl(当个体为男性时)或＜12.0g/dl(当个体为女性时)；或
(b)所述个体具有CKD且在所述时期内(例如在从D0起的第3周开始时)Hb浓度＜11.0g/dl(其中个体年龄为0.5-5岁)，＜11.5g/dl(其中个体年龄5-12岁)，或＜12.0g/dl(其中个体年龄为12-15岁)。
任选地，所述个体为已诊断出恶性肿瘤，已经历一次或一次以上中风和/或已经历恶性肿瘤的CKD患者。ESA疗法在所述患者中通常谨慎(如果存在)进行，且因此本发明(尤其为其ESA减少或节减方面)在所述个体中为有利的。
任选地，所述个体为Hb浓度为9.0到10.0g/dl的CKD 5D患者(例如成人，例如男性或女性)。
任选地，本发明用于在患有CKD的成人患者中维持Hb浓度高于11.5g/dl。
任选地，本发明用于在患有CKD的成人患者中维持Hb浓度为9.0到13g/dl(例如9.0到11.5g/dl)。
任选地，本发明用于在患有CKD的儿科人类患者中维持Hb浓度为11.0到12g/dl。在一个实例中，患者为15岁或15岁以下；或小于15岁；或10岁或10岁以下。
在一个实例中，所述CKD患者为成年男性。在另一实例中，所述CKD患者为成年女性。
任选地，所述个体(例如成人)为CKD 5HD患者，血液滤过患者或血液透析滤过疗法患者，其中所述方法包括静脉内或皮下施用ESA。
任选地，所述个体(例如成人)为CKD ND或CKD 5PD患者，其中所述方法包括皮下施用ESA。
任选地，在施用抗BMP6抗体或片段之前，患者为ESA低响应性，由ESA治疗一个月后(在进行本发明的方法之前)Hb浓度增加小于5％或无增加指示。
关于一般方法和测试，参考WO2017191437(例如参见其中的实施例)。
抑制HJV非依赖性BMP受体二聚化和信号传导
本领域已研究涉及BMP6与HJV复合的信号传导。然而，Latour等人提出一种替代路径，其中发生BMP6介导的BMP受体二聚化而无HJV与BMP6复合(《肝病学(Hepatology)》.2016年1月；63(1)：126-37.doi：10.1002/hep.28254.2015年11月12日电子出版，“血色素沉着病相关分子HFE和转铁蛋白受体-2的缺失对缺乏骨形态发生蛋白6或血幼素的小鼠的铁表型的影响不同(Differing impact of the deletion of hemochromatosis-associatedmolecules HFE and transferrin receptor-2on the iron phenotype of mice lackingbone morphogenetic protein 6or hemojuvelin)”)。如实施例8所示，本发明人惊奇地发现，使用抗BMP6拮抗剂如抗体(例如呈IgG4形式)，可通过BMP6抑制人类细胞中BMP受体的HJV非依赖性二聚化。因此，在一个配置中，本发明涉及抑制缺乏HJV的BMP-BMPR复合物的形成，或由所述复合物触发的细胞内信号传导，用于治疗或预防人类或动物个体中铁调素介导的疾病或病状。
举例来说，提供以下概念：
1.一种特异性结合骨形态发生蛋白(BMP)的抗体或片段，其用于治疗或预防人类或动物个体中由血幼素(HJV)缺乏的BMP-BMP受体(BMPR)复合物引起的疾病或病状的方法，其中所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段以用于在所述个体中抑制所述复合物的形成和/或抑制所述复合物触发细胞内信号传导，借此治疗或预防HJV非依赖性BMP-BMPR介导的疾病或病状。
2.一种特异性结合骨形态发生蛋白(BMP)的抗体或片段，其用于治疗或预防人类或动物个体的HJV非依赖性贫血或骨质疏松症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段以用于在所述个体中抑制血幼素(HJV)缺乏的BMP-BMP受体(BMPR)复合物的形成和/或抑制所述复合物触发细胞内信号传导，借此治疗或预防HJV非依赖性贫血或骨质疏松症。
3.一种特异性结合骨形态发生蛋白(BMP)的抗体或片段，其用于治疗或预防人类或动物个体中血幼素(HJV)非依赖性贫血或骨质疏松症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用所述抗体，借此治疗或预防HJV非依赖性贫血或骨质疏松症。
4.一种抗体或片段，其用于治疗或预防人类或非人类动物个体中的疾病或病状，其中
a.所述疾病或病状由所述个体的肝细胞或骨细胞中的骨形态发生蛋白(BMP)受体多聚化介导；和
b.所述抗体或片段施用到所述个体以用于抑制所述受体多聚化，借此治疗或预防所述疾病或病状。
5.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述BMP为BMP2、4、5、6、7或9。
6.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述BMP为BMP6。
7.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述BMP和受体为人类BMP和BMPR。
8.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述抗体为选自以下的抗BMP6：(i)mAb507，(ii)一种抗体，其包含VH结构域，其中各结构域包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列；和VL结构域，其中各结构域包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列；(iii)一种抗体，其包含VH结构域，其中各结构域包含SEQ ID NO：418的氨基酸序列；和VL结构域，其中各结构域包含SEQID NO：426的氨基酸序列，和(iv)一种抗体，其包含VH结构域，其中各结构域包含SEQ IDNO：114的氨基酸序列；和VL结构域，其中各结构域包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列；或其中所述抗体或片段与选自(i)到(iv)的抗体竞争(如通过SPR测定)结合人类BMP6。
9.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述抗体或片段为IgG4(例如IgG4PE)形式。
10.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述多聚化或复合物形成为(i)I型BMP受体与(ii)II型BMP受体的多聚化。
11.根据概念10的抗体或片段，其中所述I型BMP受体为SKR1、CD292或CDw293。
12.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述个体为人类，其基因组包含含有SNPrs13406336和/或rs188547477的SKR1核苷酸序列；或其中所述人类表达在15位具有丙氨酸和/或在160位具有精氨酸的SKR1；其中所述多聚化为(iii)所述SKR1或由所述核苷酸序列编码的SKR1与(iv)BMP受体的多聚化。
13.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述个体为人类，其基因组包含含有一个、两个或三个选自rs11528010、rs142454490和rs35619497的SNP的CD292核苷酸序列；或其中所述人类表达包含一个、两个或三个选自2位的脯氨酸、33位的苏氨酸和443位的精氨酸的氨基酸的CD292；其中所述多聚化为(v)所述CD292或由所述核苷酸序列编码的CD292与(vi)BMP受体的多聚化。
14.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述个体为人类，其基因组包含含有一个、两个或三个选自rs34231464、rs138801821、rs200035802、rs143554488、rs35973133和rs112111860的SNP的CDw293核苷酸序列；或其中所述人类表达包含一个、两个或三个选自149位的精氨酸、140位的缬氨酸、31位的精氨酸、175位的丝氨酸、224位的精氨酸和297位的天冬氨酸的氨基酸的CDw293；其中所述多聚化为(vii)所述CDw293或由所述核苷酸序列编码的CDw293与(viii)BMP受体的多聚化。
15.根据概念10到14中任一项的抗体或片段，其中所述II型BMP受体或(iv)、(vi)或(viii)的受体为BRK-3、ACVR2A或ACVR2B。
16.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述个体为人类，其基因组包含含有一个、两个或三个选自rs2228545、rs112862820、rs140683387和rs201067849的SNP的BRK-3核苷酸序列；或其中所述人类表达包含一个、两个或三个选自775位的丝氨酸、29位的天冬酰胺、31位的谷氨酰胺和348位的缬氨酸的氨基酸的BRK-3；其中所述多聚化为(ix)所述BRK-3或由所述核苷酸序列编码的BRK-3与(x)BMP受体的多聚化。
根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述个体为人类，其基因组包含含有SNPBrs121434437的ACVR2B核苷酸序列；或其中所述人类表达包含40位的精氨酸的ACVR2B；其中所述多聚化为(xi)所述ACVR2B或由所述核苷酸序列编码的ACVR2B与(xii)BMP受体的多聚化。
17.根据任何前述概念的抗体或片段，其中受体或各受体为BMP6受体、BMP7受体、BMP2受体或BMP9受体。
18.根据任何前述概念的抗体或片段，其用于抑制所述个体的肝细胞或骨细胞中的信号传导，其中所述信号传导由所述受体多聚化介导。
19.根据任何前述概念的抗体或片段，其中所述信号传导为Smad信号传导。
20.根据任何前述概念的抗体或片段，其用于抑制所述个体的肝细胞中Smad mRNA的升高，借此治疗或预防所述疾病或病状。
21.一种治疗或预防人类或非人类动物个体中的疾病或病状的方法，其中
a.所述疾病或病状由所述个体的肝细胞或骨细胞中的HJV非依赖性骨形态发生蛋白(BMP)受体多聚化介导；和
b.所述方法包括向所述个体施用抗BMP抗体或片段以抑制所述受体多聚化，借此治疗或预防所述疾病或病状。
22.根据概念22的方法，其中所述抗体、片段和/或受体是根据概念1到21中的任一项。
ESA节减方面和治疗ESA难治性或低响应受试者
在一个实例中，所述抗体或片段用于增加人类或动物个体中的血浆血红蛋白。
在一个实例中，所述抗体或片段用于增加人类或动物个体中的平均红细胞血红蛋白(MCH)。
在一个实例中，所述抗体或片段用于增加人类或动物个体中的红细胞体积(MCV)(以及任选地平均红细胞血红蛋白(MCH))。
在一个实例中，所述抗体或片段用于增加人类或动物个体中的铁可用性。
在一个实例中，所述抗体或片段用于增加人类或动物个体中的转铁蛋白饱和度。
在一个实例中，所述抗体或片段用于增加人类或动物个体中的转铁蛋白与铁的结合。
在一个实例中，所述抗体或片段用于减少在4周时期内施用到人类或动物个体以治疗或预防贫血、骨质疏松症或本文公开的任何其它疾病或病状的ESA(例如EPO、达贝泊汀α)的总剂量。
在一个实例中，所述抗体或片段用于将对照个体中所需的总剂量降到1/2到1/3，所述对照个体在4周时期内接受相同治疗，其中例外为向人类或动物个体施用ESA而不施用抗BMP6拮抗剂(例如，抗体或片段)以用于治疗或预防贫血、骨质疏松症或本文公开的任何其它疾病或病状。
在一个实例中，所述抗体或片段用于将在治疗时期(例如4周时期)内施用到人类或动物个体以用于治疗或预防贫血、骨质疏松症或本文公开的任何其它疾病或病状的ESA施用节减1/2到1/3。
任选地，所述个体罹患慢性炎症贫血或CKD。任选地，所述贫血为个体中的慢性炎症贫血。
任选地，所述抗体为IgG4抗体。
任选地，当在不存在抗BMP6拮抗剂的情况下施用时，施用到所述个体的ESA剂量无效。
任选地，当在不存在抗BMP6拮抗剂的情况下施用以在个体中产生选自以下的一种、多种或所有作用时，施用到个体的ESA剂量无效：
(a)血红蛋白增加；
(b)平均红细胞体积(MCV)增加；
(c)平均红细胞血红蛋白(MCH)增加；
(d)铁可用性增加；和/或
(e)转铁蛋白的铁饱和度增加；
其中所述ESA和抗BMP6拮抗剂施用到所述个体以产生所述所选作用。
在一个实例中，本发明的抗体或片段用于施用到人类或动物个体以在所述个体中产生选自以下的一种、多种或所有作用：
(a)血红蛋白增加；
(b)平均红细胞体积(MCV)增加；
(c)平均红细胞血红蛋白(MCH)增加；
(d)铁可用性增加；和/或
(e)转铁蛋白的铁饱和度增加；
其中所述ESA和抗BMP6拮抗剂施用到所述个体以产生所述所选作用。
在一个实例中，本文中的个体对于一定剂量的ESA为难治的，但当施用本发明的抗体或片段和ESA剂量时对于贫血、骨质疏松症或另一疾病或病状的治疗有响应。
因此，在一个实例中，本发明的抗体或片段用于与一定剂量的ESA组合施用到人类或动物个体以用于治疗个体中的BMP6相关疾病或病状，其中所述个体用所述组合治疗，但不可通过在不施用所述抗体或片段的情况下施用所述剂量的ESA来治疗所述疾病或病状。
所述疾病或病状可为贫血或本文公开的任何其它疾病或病状。
实施例
实施例1
生成HepG2荧光素酶报道细胞系以用于研究对hamp表达的影响
目的为生成一种人类肝细胞系，其在hamp调节元件的控制下表达报道基因，以允许测试BMP6诱导的铁调素编码(hamp)基因的表达。具有对pSMAD(BMP)和pSTAT(IL6)的响应元件的约3kb的完整调节区域已于文献中表征(Casanovas等，2014)。分离来自HepG2细胞的基因组DNA并进行PCR以扩增hamp调节区域且添加限制性位点Spe1和Xhol(Hep Prom SPE1正向＝AAAAAAACTAGTAAATGGCCCCATGTGGCCCCCGCCTTGTCTGC SEQ ID NO：6)；Hep Prom XHO1反同＝TTTTTTCTCGAGCTGTCTGGCTGTCCCACTGCTGGGTCTTGAGCTT SEQ ID NO：7)。通过标准分子生物学方法将PCR产物克隆到pMCS-红萤火虫Luc(赛默飞世尔(ThermoFisher))质粒载体中。
通过PCR重新扩增红萤火虫luc插入物后的hamp调节区域，且引入Kpn1和AsiS1限制性位点以允许亚克隆到含有内部构筑的嘌呤霉素选择盒的PiggyBac表达载体中(Yusa等，2011)。
使用Freestyle max转染剂(ThermoScientific)，用构筑的含有克隆hamp调节区域的红萤火虫Luc质粒转染HepG2细胞(ATCC)。
确定HepG2 hamp报道细胞系的活性
通过用已知刺激SMAD路径的各种重组人类BMP蛋白刺激细胞，测试带有红萤火虫荧光素酶基因的稳定细胞系在如上所述的整个2.8kB人类铁调素启动子调节元件控制下的功能。图1显示人类BMP2(R&D Systems 355-BM SEQ ID NO：493)、BMP4(R&D Systems 314-BP；SEQ ID NO：494)、BMP5(R&D Systems 615-BMC；SEQ ID NO：495)、BMP6(Peprotech 120-06；SEQ ID NO：2)和BMP7(R&D Systems 354-BP；SEQ ID NO：496)均能够以相似程度诱导克隆的荧光素酶报道基因的表达。即使使用不同的培养基条件，BMP6和BMP7也始终提供最高程度的刺激。对于一些BMP，与具有25％MEM的融合瘤生长培养基相比，在MEM培养基中检定窗口升高(比较图1A/B))。也用不同商业来源批次的人类和小鼠BMP6蛋白(R&D Systems507-BP；SEQ ID NO：3，Peprotech 120-6；SEQ ID NO：2和R&D Systems 6325-BM；SEQ IDNO：5)测试HepG2荧光素酶报道系(图2)。也使用所述细胞系评估BMP6与抗BMP6单克隆抗体MAB507和MAB2365(皆来自R&D Systems)(分别对于小鼠和人类BMP6)的交叉反应性和中和激活作用的能力。这表明尽管市售抗体MAB507和MAB2365分别被制造商描述为人类BMP6和小鼠BMP6特异性单克隆抗体，但它们皆与来自两个物种的BMP6交叉反应，尽管性能略有不同(图3)。
用于刺激检定的材料和方法
将HepG2 hamp荧光素酶报道细胞系接种到两个96孔培养板(2×104个细胞/孔，于50μl MEM培养基(最低基本培养基-#31095-029，Gibco)中；1％v/v FBS)。将上述不同的BMP蛋白质稀释于25μl含有1％FBS的MEM中，且以50nM的浓度起始连续1∶3稀释。随后根据实验将25μl MEM或25μl融合瘤培养基(HMM)添加到每个孔中(相当于最终体积的25％)。随后将25μl各稀释液添加到含有细胞的各孔中，且将培养板在37℃下温育6小时。温育24小时后，向各孔中添加100μl萤火虫荧光素酶发光试剂(Thermo Scientific#16197)。将细胞置于振荡器上三分钟，随后在室温下在黑暗中温育十分钟。使用EnvisionTM读取器(珀金埃尔默)测量发光。在一些情况下，(图2)使用25％HMM以60μl的总体积，或固定最终浓度为1nM的BMP6和于HMM中制备的抗体稀释液(最终浓度为25％HMM)(图3)，进行实验。
实施例2
使用KvmouseTM免疫和生成人类抗BMP6单克隆抗体
所述实施例描述使用KymouseTM平台生成人类抗BMP6抗体(参见例如WO2011/004192、WO2011/158009和WO2013/061098)。对于所述计划，生成含有人类免疫球蛋白基因的KymouseTM HK品系，其产生具有人类可变结构域的κ(HK)抗体，其中已敲除鼠类bmp6基因。使用初次/加强方案(表1)，用重组人类BMP6(Peprotech 120-06；SEQ ID NO：2)将所述KymouseTMHK bmp6-/-小鼠免疫化。在每个方案结束时，施用最终加强，且在约6-7天后取出脾脏和淋巴结。在一些情况下仅使用脾细胞，在其它情况下也使用从引流淋巴结获得的细胞(表2)。将组织解聚成单细胞悬浮液以使用B细胞FACS选择技术进行抗原驱动的B细胞选择。在免疫过程中测定血清滴度时，如下文概述使用DELFIA检定。图4中对于5只动物(KM089)显示3次加强后抗BMP6 IgG的示例性血清滴度。从表1显而易见，KM152为来自KM089的直接重复单元且产生相似滴度(数据未示出)。
表1：使用KymouseTMHK bmp6-/-小鼠的免疫化方案概述
免疫化 Kymouse<sup>TM</sup>品系 初次/加强方案
KM089 HK bmp6-/- 初次，接着3-4次加强；
KM152 HK bmp6-/- 初次，接着2-3次加强；
通过
Figure BDA0002991179750001121
测定血清滴度：
通过反向
Figure BDA0002991179750001122
检定(珀金埃尔默)测定抗BMP6抗体的血清滴度，其中经由Fc结构域(山羊抗小鼠IgG；Southern Biotech 1030-01)捕获抗体，用封闭缓冲液(含有1％w/v BSA的PBS)封闭，随后将生物素化的BMP6(Peprotech 120-06，SEQ ID NO：2)添加到孔中。使用1∶1000稀释的DELFIA Eu-N1抗生蛋白链菌素(珀金埃尔默)检测结合的BMP6。添加增强溶液5分钟且在室温下在黑暗中静置，随后在615nm下读数(Perkin Elmer Envision)。在每个温育步骤之间用洗涤缓冲液(PBS 0.1％v/v Tween)洗涤培养板3次。抗人类BMP6抗体(R&D Systems MAB507)用作阳性对照。
鼠类组织分离和制备：
基于抗BMP6滴度对所选动物给与最终加强，且在6-8天后切除脾脏，在1xPBS中洗涤且保持于冰上直到进一步加工。在含有1×PBS(英杰(Invitrogen))和3％热灭活FBS(英杰)的缓冲液中制备组织。通过将组织通过40μm滤器(BD Falcon)压碎且用30ml 3％FBS/PBS缓冲液冲洗，随后在4℃下以500g离心10分钟来分散脾细胞。为了去除红细胞，将沉淀的脾细胞重新悬浮于1ml ACK裂解缓冲液(英杰)中。在室温下温育2分钟后，通过添加9ml 3％FBS/1×PBS缓冲液终止裂解反应。用40μm滤器过滤出细胞团块。将剩余脾细胞沉淀用于进一步程序。
BCT分选和处理以用于表达
对于KM089，使用4只动物进行一次B细胞分选，而对于KM152，使用总共6只动物进行两次B细胞分选(表2)。从所选动物制备脾细胞以及在一些情况下也制备淋巴结，且进行抗原特异性B细胞选择和分选。为此，从重组产生的人类BMP6(Peprotech 120-06SEQ IDNO：2)生成生物素化的BMP6材料，且测试所述材料与抗BMP6 MAB507(R&D Systems；数据未示出)的结合活性。通过测量经标记的BMP6材料与从用不相关免疫原免疫化的动物分离的B细胞的结合来评估标记材料的背景结合。将抗原阳性和B细胞标记阳性单个B细胞分选到96孔培养板中且立即冷冻用于分子生物学处理。B细胞技术(一般描述参见WO2015040401)用于扩增来自那些抗原选择的B细胞的V区。从所述初级PCR产物，通过进一步PCR和本领域中的标准分子生物学方法回收V区，且在96孔培养板中在HEK细胞中克隆到哺乳动物表达载体中，其中回收的重链和轻链配对作为重组嵌合IgG或作为嵌合Fab片段。培养6-8天后，测试上清液的结合或中和活性，如下文所概述。在一些情况下，衍生自抗原选择的单个B细胞的初级PCR产物也经受NGS测序且从合成DNA产生V区，克隆到哺乳动物表达载体中且制备质粒DNA用于转染哺乳动物细胞以进行表达。
实施例3
初步筛选
通过均相时间分辨式FRET(HTRF)进行初步筛选以确定回收的抗体与人类BMP6(Peprotech 120-06SEQ ID NO：2)的结合，且在一些情况下也通过表面等离子体共振(SPR)使用与固定的人类BMP6结合的人类Fab片段。在一些情况下，在初步筛选设置中使用在实施例1中描述的使用人类BMP6(Peprotech 120-06SEQ ID NO：2)的基于HepG2的hamp荧光素酶报道基因检定来直接选择中和抗体(表2)。在使用解离速率评级作为选择标准的情况下，使用在37℃下至少10-4[1/s]的解离速率(kd)阈值。
表2：对于哺乳动物细胞中回收且表达的培养上清液或纯化IgG或Fab片段进行的 初步筛选和结果的概述
Figure BDA0002991179750001141
与人类BMP6结合的HTRF检定
用抗生蛋白链菌素D2(Cisbio，目录号610SADLB))检测生物素化的BMP6(Peprotech120-06SEQ ID NO：2)，且使用用穴状化合物标记的抗小鼠IgG(SouthemBiotech#1030-01)检测与BMP6结合的抗体。MAB507(R&D Systems)用作阳性对照且小鼠IgG同种型用作阴性对照。利用Envision培养板读取器(珀金埃尔默)读取培养板且使用IDBS软件分析数据。阳性通常定义为＞阳性对照的10％信号。
筛选HepG2细胞中在hamp调节区域控制下人类BMP6诱导的荧光素酶表达的功能抑 制
在一些情况下，使用实施例1中描述的HepG2 hamp荧光素酶报道基因检定对回收的IgG进行初步评估，以评估BMP6的中和能力。将15ul已知BMP6信号传导抑制剂用作阳性对照(R&D Systems MAB507；(Andriopoulos等，2009))且人类或小鼠IgG用作阴性对照。在HMM25％E培养基中制备纯化抗体(从150nM起，1∶3稀释曲线，11个点)或将含IgG的上清液样品以10nM于MEM1％FBS中的最终浓度添加到15ul人类BMP6(Peprotech120-06SEQ ID NO：2)且在室温下温育30分钟，随后以10 000个细胞/孔添加30ul HepG2报道细胞且在37℃下温育过夜。第二天，将30ul荧光素酶底物缓冲液(Pierce Firefly Luc One-Step Glow检定试剂盒，目录号：16197，Perbio)添加到整个培养板中且使用Envision培养板读取器(珀金埃尔默)读取。
SPR解离速率评级分析
在ProteOnTM XPR36系统(伯乐(BioRad))上进行解离速率筛选。在NLC传感器芯片表面上捕获生物素化的BMP-6(Peprotech 120-06SEQ ID NO：2)且将50μl纯化的Fab材料用作于200μl HBS-EP缓冲液中稀释的分析物。使用ProteOn固有的软件进行解离速率分析且所有检定操作均在37℃进行。本发明人设定判定准则，即显示＜1×10-4[1/s]或更佳解离速率的抗体鉴定为阳性。
实施例4
二次筛选和前导小组的选择
表3总结了本发明人设计的二次筛选和进一步选择准则且应用于导致选择前导小组用于体内分析。所述重新测试涉及使用利用BMP6刺激和/或SPR解离速率评级的HepG2hamp荧光素酶报道基因检定，其中在初步筛选中未应用。此外，通过测试所有选择的命中物在HepG2报道基因检定中中和相关BMP分子的能力，测试其对BMP6的特异性。在第一种情况下，测试BMP5(SEQ ID NO：495)和BMP7(SEQ ID NO：496)，因为其与BMP6具有较高的氨基酸同源性(在成熟蛋白中，人类BMP5与人类BMP6共有81％氨基酸同源性且人类BMP7与人类BMP6共有72％氨基酸同源性)。如实施例1中所概述，所有所述BMP均能够在hamp调节元件区域的控制下有效地触发HepG2细胞中的荧光素酶报道基因表达。在所述检定中使用MAB507作为对照，因为所述mAb先前已特定显示出与BMP5和BMP7的交叉反应性(Andriopoulos等，2009)。本发明人设定判定准则，即排除显示BMP5(SEQ ID NO：495)和BMP7(SEQ ID NO：496)或两者的一致中和的抗体。在KM089-B1二次筛选的情况下，也使用鼠类BMP6(R&D Systems；SEQ ID NO：5)进行HepG2报道基因检定以测试鼠类交叉反应性，然而，对于后续活动，大概由于人类与小鼠BMP6之间的高度同源性，通常在所有命中物均观察到鼠类交叉反应性，因此从二次筛选中删去所述筛选。
___________________________
表3：对于哺乳动物细胞中回收且表达的培养物上清液或纯化IgG或Fab片段进行 的初步命中物的二次和进一步评估的概述
Figure BDA0002991179750001161
选择前导小组用于体内测试
从KM089二次筛选中鉴定出23个组合命中物(表3)。利用来自单个B细胞PCR的初步命中物的二次筛选与所有分选的抗原特异性B细胞的NGS分析的组合，还从KM152-B1鉴定4个克隆(表3)。对所述27种抗体进行详细的序列分析，以鉴定独特克隆序列和本发明人判断中不具有明显可开发性倾向的序列。遵循所述门控准则，本发明人选择12种抗体，重新表达且纯化为完全人类IgG4(SEQ ID NO：454)。12种抗体中的两种显示出表达或纯化后质量问题的迹象，因此不再进一步研究。随后使用HepG2 hamp荧光素酶报道基因检定测试剩余10种抗体对人类BMP6的特异性和人类BMP6的中和性能(表4)。
表4：源自KM089和KM152的10种抗体之前导选择，且在二次筛选中评估对于人类 BMP6的选择性(选择用于体内分析的抗体以粗体显示)
Figure BDA0002991179750001171
此后，未观测到与BMP5(R&D Systems 615-BMC；SEQ ID NO：495)或BMP7(R&DSystems 354-BP；SEQ ID NO：496)的交叉反应性的7种克隆(表4中粗体显示)进行体内大鼠研究(实施例11)且因此在放大规模的CHO悬浮细胞中重新表达且纯化用于体内使用。
对于KM152-B2，在初步中和筛选后选择的12个组合命中物(表2)再次表达。通过比较HepG2 hamp luc报道基因检定中11个稀释点曲线中的人类BMP6(Peprotech 120-06；SEQID NO：2)与来自KM089的最佳前导的中和性能以及考虑对于BMP5(R&D Systems 615-BMC；SEW ID NO：495)和BMP7(R&D Systems 354-BP；SEQ ID NO：496)的中和，进一步测试所述纯化的前导小组。由此排除5种对来自KM089的先前前导未显示优异性能的抗体，留下7个克隆用于体内测试(数据未显示；表5)。
表5：选自在对于人类BMP6的选择性的二次筛选中评估的KM152-B2的12种抗体(选 择用于体内分析的抗体以粗体显示)
抗体ID 来源 hBMP5中和 hBMP7中和 选择用于体内评估
CL-75714 KM152-B2 否 否 是
CL-75605 KM152-B2 否 否 否；表达问题；无优异中和
CL-75565 KM152-B2 否 否 是
CL-75539 KM152-B2 否 否 是
CL-75520 KM152-B2 否 否 是
CL-75519 KM152-B2 否 否 否；表达问题；无优异中和
CL-75511 KM152-B2 否 否 否；表达问题；无优异中和
CL-75506 KM152-B2 否 否 是
CL-75500 KM152-B2 否 否 是
CL-75496 KM152-B2 否 否 否；无优异中和
CL-75194 KM152-B2 否 否 否；无优异中和
CL-75183 KM152-B2 否 否 是
在分析第一组体内7种抗体(表4)且观测CL-58838的优异活性(参见实施例11)后，决定使用通过下一代测序(NGS)获得的数据，通过鉴定基于所述抗体的Vh(SEQ ID NO：114)和Vk(SEQ ID NO：123)类序列的抗体，潜在扩展前导克隆小组。对于在B细胞分选后从扩增V区上的NGS获得的成对Vh和Vk链分析与CL-58838具有高度同源性的序列，目的为获得与CL-58838稍微突变但高度相关的抗体序列。通过相同使用人类V、D和J区(IGHV3-11*01、IGHD6-19*01、IGHJ4*02/IGKV3-20*01、IGKJ1*01)和相同CDRH3序列来驱动搜索。通过所述方法鉴定总共21种抗体，表达，纯化且评估功能、对BMP6的特异性和性能(表3)。21种抗体来源于来自免疫活动KM089和KM152的5种不同免疫化小鼠。最初证实10种抗体作为BMP6的中和剂，但在评估BMP6相比于BMP5和BMP7的特异性且比较HepG2 luc检定中中和人类BMP6与CL-58838的性能后，选择7种抗体，如表6所示。与在所有先前筛选活动中测试的抗体的交叉序列比较排除评估的另外3种抗体，然后留下四种表达和纯化的新的独特抗体用于体内分析。在所述四种中，CL-58713在所述规模下未以足够量表达，因此也排除在外。剩下的三种新抗体在大鼠中进行体内研究(表6以粗体显示且示于实施例17中)且来自免疫化KM089的两种不同免疫化bmp6-/-小鼠。
表6：通过NGS鉴定具有与CL-58838相同的V基因使用和CDRH3长度且通过功能筛选 进行选择的抗体
Figure BDA0002991179750001191
实施例5
前导克隆的序列分析
分析选择用于体内使用的抗体的V区基因使用和在KymouseTM免疫期间自然发生的体内成熟过程中引入的突变程度。表7-9概述表4-6中选择的抗体的所述信息。这里显示的所有CDR定义均为IMGT定义。
表7：用于体内研究的选自KM089和KM152-B1的7种抗体
Figure BDA0002991179750001192
表8：用于体内研究的选自KM152-B2的KM152-B27种抗体
Figure BDA0002991179750001201
表9：通过NGS和序列挖掘鉴定的CL-58838样抗体
Figure BDA0002991179750001202
实施例6
通过SPR测量的抗体CL-58838的结合动力学
CL-58838IgG4(SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：125)与人类BMP6结合的动力学通过表面等离子体共振(SPR)在37℃下在pH 7.6下测定。与实施例中使用的其它抗体一样，CL-58838IgG4抗体包含SEQ ID NO：454的IgH恒定区(我们称之为“IgG4-PE”)，其为效应功能失活且铰链稳定的。简单来说，对于所述测量，将生物素化的重组人类BMP6(Peprotech 120-06)(SEQ ID NO：2)固定于抗生蛋白链菌素包覆的生物传感器芯片上，且使用在5种不同IgG浓度下操作的单循环动力学方法研究结合。在所述装置中，二价IgG4抗体与二聚体BMP6抗原相互作用，这意味着由于每个分子发生潜在的多重相互作用，亲合力将在测量的总结合动力学中起作用。用于数据分析的二价模型旨在对所述效应进行去卷积，但不如测量真正的1∶1相互作用那样可靠。因此，在所述设置中，KD值应被称为“相对”亲和力值。通过所述方法对CL-58838测定的相对KD值为0.07nM(表10)。
表10：在37℃和pH 7.6下测量CL-58838IgG4与人类BMP6的结合动力学
样品 ka[1/Mx1/s] kd[1/s] 相对KD[nM]
CL-58838 IgG4 5.22<sup>06</sup> 3.69<sup>-04</sup> 0.07
在第二种实验设置中，通过在CHO细胞中的表达生成CL-58838的Fab片段且测量相互作用，其中所述Fab片段为中性抗生物素蛋白生物传感器芯片NLC(Biorad)上与固定的生物素化人类BMP6(Peprotech 120-06)(SEQ ID NO：2)结合的流动池中的分析物。由于所述实验设置涉及避免二价相互作用的单体Fab片段，这代表相互作用为亲合力极为有限或对结合动力学无贡献，因此可以确定真正KD值(表11)。CL-58838显示Fab片段与人类BMP6在37℃和pH 7.6下的相互作用的真正KD为约140pM。
表11：来自两个实验的代表性结果，所述实验测量基于CL-58838的Fab片段与固定 化人类BMP6在37℃和pH 7.6下的结合动力学
样品 Ka[1/Mx1/s] Kd[1/s] KD[nM]
CL-58838 Fab 3.64<sup>06</sup> 4.99<sup>-04</sup> 0.14
方法：
IgG的SPR分析
重组人类BMP6(Peprotech120-06)(SEQ ID NO：2)经生物素化且固定于SA生物传感器芯片(GE医疗(GE Healthcare))上，且采用单循环动力学方法，以5种不同浓度的CL-58838(0.1、0.5、2.5、12.5和62.5nM)作为分析物操作IgG。使用相同的一组含缓冲液的注射液替代抗体，双重参考结合传感图。将数据与Biacore 8K(GE医疗)分析软件固有的二价模型拟合。使用HBS-EP作为pH 7.6的电泳缓冲液在37℃下进行检定。
Fab片段的SPR分析
人类BMP6(Peprotech 120-06)(SEQ ID NO：2)经生物素化且固定于中性抗生物素蛋白生物传感器芯片NLC(Biorad 1765021)上。通过在HEK细胞中表达生成CL-58838的Fab片段且用蛋白G和尺寸排阻色谱法纯化。使用64、16、4、1和0.25nM的Fab作为分析物。使用注射缓冲液双重参照结合传感图。将数据与ProteOn XPR36分析软件固有的1∶1模型拟合。使用HBS-EP作为pH 7.6的电泳缓冲液在37℃下进行检定。
实施例7
测试CL-58838与其它BMP的交叉反应性
抗体CL-58838IgG4(SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：125)在其与其它BMP家族成员缺乏交叉反应性方面进行更详细评估。筛选策略已经有效地排除对BMP5和BMP7的任何影响，BMP5和BMP7为两种最相关的BMP氨基酸序列(分别为81％和72％)。如实施例4中所概述，使用实施例1中开发的HepG2报道基因检定评估交叉反应性，其中扩展小组还包括BMP家族的较小同源性成员，如BMP2(56％)、BMP4(58％)和BMP9(54％)。在所有BMP为10nM的固定最终浓度下进行检定，其提供对hamp驱动的报道基因表达的充分刺激和从最终浓度600nM起始的CL-58838抗体的11点稀释范围。对于BMP2(R&D Systems355-BM；SEQ ID NO：493)、BMP4(R&D Systems314-BP；SEQ ID NO：494)和BMP9(Peprotech120-7；SEQ ID NO：497)进行交叉反应性测试一次，而对于BMP5(R&D Systems 615-BMC SEQ ID NO：495)和BMP7(R&DSystems 354-BP；SEQ ID NO：496)，n＝2。图7中在每种情况下显示一个实验。结果显示CL-58838对这里测试的任何BMP均无可检测的中和作用。对每种检定中测试的相关BMP具有特异性的商业对照抗体如预期中和报道基因表达(抗BMP2/4R&D Systems MAB3552；抗BMP5R&D Systems MAB7151、抗BMP7 R&D Systems MAB3541、抗BMP9R&D Systems 3209)。
方法
在MEM 1％FBS中以40nM(10nM最终检定浓度)制备人类BMP。使用抗BMP2/4(R&DSystems)、抗BMP5(MAB7151，R&D Systems)、抗BMP7(MAB3541，R&D Systems)和人类IgG4同种型对照(内部产生)制备对照曲线。使用三倍稀释系列从2.4μM PBS溶液滴定参考抗体(600nM最终检定浓度)，以生成11点曲线。使用三倍稀释系列从800nM PBS溶液制备BMP标准曲线(200nM最终检定浓度)，以生成11点曲线。通过于PBS中三倍稀释(11点曲线)产生测试的各分子的滴定。随后将15μL从稀释液转移到检定培养板(LUC)。将15μL PBS添加到总结合和非特异性结合孔中，将15μL40nM的人类BMP添加到测试孔中且添加到总结合对照孔中，且将15μL的MEM 1％FBS转移到非特异性结合对照孔中。在制备HepG2报道细胞的同时将培养板置于室温下。将细胞从烧瓶中分离，沉淀且重新悬浮于补充有1％FBS的MEM中，浓度为3.3×105个细胞/毫升。将30μl细胞以10,000个细胞/孔添加到整个测试培养板中。
将培养板在37℃、5％CO2下温育过夜，第二天，将30μl荧光素酶底物(包含于Pierce Firefly Luc一步发光检定试剂盒中)添加到检定培养板中。将培养板在室温下在黑暗中温育10分钟且使用Envision(珀金埃尔默)读取。
实施例8
测试抗RMP6抗体对受体二聚化的干扰
在文献中已提出ALK2和ALK3为在小鼠和人类的肝脏中表达的主要I型BMP受体(Mayeur等，2014；Xia等，2008)，其能够在肝细胞中实现BMP诱导的信号传导。因此，我们关注用抗BMP6抗体阻断BMP6的生物学活性会如何影响BMPR1和BMPR2的二聚化，其已描述为需要触发BMPR1磷酸化和随后经由SMAD路径的信号传导。我们研究对BMPR1A(ALK3、CD292)与BMPR2(T-ALK)和BMPR1B(ALK6)和与BMPR2(T-ALK)二聚化的影响。使用
Figure BDA0002991179750001231
eXpress二聚化检定(DiscoverX)测量二聚化。在所述系统中，U2OS细胞用修饰的人类ALK3/ALK6和分别用无活性酶亚基、ProLinkTM(PK)或酶受体(EA)细胞内标记的BMPR2稳定转染。在配体诱导的活化后，两种受体二聚化，迫使两种酶组分互补，产生活性酶，随后水解底物以生成化学发光信号。在所述两种情况下，这里我们使用BMP6触发二聚化事件。
最初，使用以5μg/ml最终浓度起始且进一步加倍稀释的一系列BMP6浓度建立BMP6响应曲线。最后，选择固定浓度的200ng/ml BMP6用于分析抗BMP6抗体对BMP6诱导的受体二聚化的影响。在一系列抗体浓度下研究抗BMP6单克隆小鼠抗体MAB507(R&D Systems)和各种其它抗BMP6抗体对二聚化的影响。抗体A为抗BMP6抗体，其包含VH结构域，其中各结构域包含SEQ ID NO：402；和VL结构域，其中各结构域包含SEQ ID NO：410。抗体B为抗BMP6抗体，其包含VH结构域，其中各结构域包含SEQ ID NO：418；和VL结构域，其中各结构域包含SEQID NO：426。
图6A显示对BMPR1A(ALK3)/BMPR2的二聚化进行的两个实验的代表性结果。所有人类抗BMP6抗体均以浓度依赖性方式测试减少的ALK3/BMPR2受体二聚化，导致在浓度大于10nM时完全抑制二聚化。对于所测试的人类抗BMP6抗体，所述实验中的IC50值为2nM。鼠类单克隆MAB507(R&D Systems)的IC50略低于3nM。虽然不希望受任何特定理论束缚，但所述观测结果的最有可能的解释为，抗BMP6抗体与BMP6的结合阻止BMP6与一种或两种BMP受体相互作用，因此阻止BMP6驱动的I型和II型受体的二聚化。然而，也可以想象一些抗BMP6抗体可以仍然允许BMP6-抗体复合物与那些受体分子之一相互作用的方式与BMP6结合，并且其中所述抗体在复合物与受体之一相互作用时仍然与BMP6结合。所述结合的受体-抗体复合物然后可在空间上阻止或干扰所述受体-抗体复合物与其它配对受体之后续相互作用，因而避免在所述检定中有效的二聚化和信号产生。
图6B显示对BMPR1B(ALK6)/BMPR2的二聚化进行的两个实验的代表性结果。测试人类抗BMP6抗体1-8以浓度依赖性方式影响ALK6/BMPR2受体二聚化的能力。所有测试的抗体均导致完全抑制二聚化。这里使用的一些抗BMP6抗体仅在100nM或更高浓度时显示出完全中和。在所述检定中，鼠类单克隆MAB507(R&D Systems)具有约0.2nM的IC50。
如人类蛋白质图谱(https：//www.proteinatlas.org/ENSG00000168509-HFE2/ cell#rna)所示，U2O2细胞不表达HJV(也称为血幼素(haemojuvelin/hemojuvelin)、HFE2A、HJV、JH和RGMC)。此外，我们设计细胞系来表达外源性人类BMP受体，但未进行任何工程改造来表达外源性HJV。因此，结果令人惊讶地表明可使用抗BMP6拮抗剂通过BMP6抑制BMP受体的HJV非依赖性二聚化。
方法
创建表达人类ALK3+人类BMPR2的细胞系，且创建表达人类ALK6+人类BMPR2的细胞系，ALK用无活性酶亚基ProLinkTM(PK)进行工程改造，而BMPR2用酶受体(EA)进行工程改造。将
Figure BDA0002991179750001241
eXpress BMPR1A+BMPR2和BMPR1B+BMPR2转染的U2OS细胞(DiscoverX#93-1053C3或#93-1063E3)重新悬浮于所提供的细胞接种试剂中，且将100μl细胞悬浮液添加到白壁透明底96孔组织培养板(DiscoverX#15-073)的每个孔(1×104个细胞/孔)且在37℃温育24小时。为建立适当的检定窗口，制备以5μg/ml最终浓度起始且于细胞接种试剂中以1∶3(×11)稀释的人类BMP6(Peprotech 120-06)(SEQ ID NO：2)滴定。从所述稀释系列的结果，为两个实验选择固定的最终浓度200ng/ml BMP6。然后通过添加200ng/ml hBMP6最终浓度到微量滴定板的孔中的抗BMP6抗体连续稀释液且在室温下温育1小时来测试抗体。此后，然后将10μl所述预温育的混合物添加到U2OS细胞培养板每孔中且在37℃下再温育16小时。通过将1体积闪烁细胞检定缓冲液(DiscoverX#30-390)添加到4体积闪烁底物试剂(DiscoverX#10-219)中来制备检测试剂。将110μl所述制备的检测混合物添加到各孔中且在室温下在黑暗中温育1小时。使用Envision(PerkinElmer)培养板读取器读取培养板且分析。
实施例9
使用重叠肽阵列的线性抗原决定基定位
使用涵盖成熟人类BMP6的整个序列的线性肽进行线性抗原决定基定位。BMP6肽在C端和N端用中性甘氨酸-丝氨酸(GSGSGSG)连接子延长，以避免产生在C端和N端截短的肽。随后将延长的BMP6序列转化为重叠的15个氨基酸的肽，其中重叠为14个氨基酸。印刷微阵列芯片，其含有小鼠BMP6序列与人类BMP6(PEPerPRINT GmbH)不同的所有位置的所有重叠肽以及肽变异。所得BMP6肽微阵列含有232个不同肽，双重复地印刷(464个肽点)。CL-58838、抗体A、抗体B、mab155963(艾博抗(Abcam))用线性合成BMP6肽培养，且Morph 6.1(Acris BM4103)用BMP6合成肽(SEQ ID NO：17；Schluessener等，1995)培养。
方法
抗体以于培养缓冲液中1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的浓度使用；在4℃下温育16小时且以140rpm振荡。使用物种特异性二次抗体：用对照抗体小鼠单克隆抗HA(12CA5)DyLight800(1∶2000)染色，同时用二次抗体山羊抗人类IgG(H+L)DyLight680(1：5000)和绵羊抗兔IgG(H+L)DyLight680(1∶5000)染色。然而，为了避免二次抗体与对照抗体之间的任何干扰，在用二次抗体山羊抗小鼠IgG(H+L)DyLight680染色后用小鼠对照抗体进行染色。经由LI-COR Odyssey成像系统读出；扫描偏移0.65mm，分辨率21μm，扫描强度为7/7(红色＝700nm/绿色＝800nm)。
观察到抗体A针对由具有共同基元TLVHLMNPEYV(SEQ ID NO：8)的相邻肽形成的单个抗原决定基样斑点模式的明显反应。同样，观察到抗体B针对由具有共同基元HLMNPEY(SEQ ID NO：9)的相邻肽形成的单个抗原决定基样斑点模式的明显反应。观察到mab155963针对由人类或小鼠的相邻肽形成的四种抗原决定基样斑点模式的较弱但仍然明显的反应，从而鉴定共同基元SASDYNSSELKTA(人类；SEQ ID NO：10)、ELKTACRKHELYV(人类；SEQ IDNO：11)、GSSDYNGSELKTA(小鼠；SEQ ID NO：12)和ELKTACKKHELYV(小鼠/大鼠；SEQ ID NO：13)。所有那些基元均显示出共同核心基元ELKTA(SEQ ID NO：14)可能对应于由所述兔抗BMP6单克隆抗体识别的核心抗原决定基，并且可能为用于产生所述单克隆抗体的肽的一部分。观察到Morph6.1针对由相邻肽形成的两种模式的非常强烈的反应，其中共同基元QSQDVAR(人类；SEQ ID NO：15)和QSQDVSR(小鼠/大鼠；SEQ ID NO：16)差异仅在于人类与大鼠/小鼠组的BMP6肽之间可见的氨基酸S和A的一个交换。所述基元完全包含于用作生成所述单克隆抗体的免疫原的BMP6肽序列(QSRNRSTQSQDVARVSSASDYNSSELKTAC SEQ ID NO：17；Schluessener等，1995)中。与所述结果相反，即使在显著提高的亮度和对比度下，用CL-58838IgG4(SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：125)也未观察到高于检定噪音水平的染色。然而，在检定中使用的所有阳性对照线性抗原决定基如预期进行。所述结果最可能由以下事实解释：与上文定位的所有抗体相比，CL-58838结合于构象敏感或不连续的抗原决定基，其不可由微阵列中的线性抗原衍生肽模拟或表示。
实施例10
与人类BMP6结合的蛋白质印迹法分析
由于实施例9中的肽定位实验表明CL-58838不能结合由BMP6一级序列产生的重叠线性肽，因此对抗体进行蛋白质印迹法，其中将人类BMP6应用于还原和非还原条件下的SDS-PAGE。由于BMP6为二硫键连接的二聚体，因此还原条件应该在凝胶上产生单体而非在非还原凝胶上产生二聚体。在两种情况下，SDS的存在将导致蛋白质结构的一般性展开，公开潜在的线性抗原决定基，但也消除或至少减少二级结构。根据实施例9的结果，预计CL-58838可能不识别在SDS-PAGE上呈现的展开BMP6，而抗体A和B可清楚地识别BMP6序列的线性部分。图5显示所述分析的结果。考马斯染色凝胶清楚地显示在还原泳道中18kDa的BMP6单体和非还原泳道中约32kDa的二聚体，证实在应用还原条件时形成单体。CL-58838在非还原的二硫键连接的二聚体上产生信号，但在还原单体上未产生信号。相反，抗体A在二聚体上产生信号且在BMP6单体上产生非常明确的信号，表明足以结合抗体A的抗原决定基不需要BMP6的特定折叠或二聚化。抗体B与抗体A的结果非常相似，再次强调所述两种抗体的抗原决定基的相似性。所述结果也表明CL-58838仍然能够在SDS存在下识别BMP6，但需要结合二硫键连接的BMP6二聚体的构象界面。这符合实施例9中可见的结果，并且可以表明CL-58838的抗原决定基涵盖仅在BMP6二聚体中聚集在一起的残基和/或介导结合活性的关键残基位于BMP6单体之间的分子间二硫键附近。
实施例11
在正常大鼠中单次静脉内注射(iv)后评估抗BMP6抗体
向雄性Wistar大鼠(250-325g，n＝6/组)给予单次1mg/kg静脉内注射完全人类IgG4抗BMP6抗体。每个研究中包括两个或三个对照组，其接受单次1mg/kg iv剂量、hIgG4同种型对照抗体(标记为“同种型”)和一种或两种另外的人类IgG抗BMP6抗体(抗体A和B)。
在给药前一小时(-1)对动物进行给药前抽血以得到基线测量，随后在5分钟、6小时和24小时以及第3、7、9、14、22、29和36天测量。每个时间点确定血浆转铁蛋白饱和度(TSAT)。
设计所述实验以测量单次静脉内注射本发明产生的完全人类IgG4抗BMP6抗体后的TSAT变化。根据上文概述的实验程序，在三项独立研究中评估总共17种抗体(表4-6和7-9)。表12-14显示所述3个实验的TSAT结果。
表12：在表7中选择的抗体的单次静脉内注射后，从血浆中测量的铁参数计算 TSAT。如上所述，所有抗体和对照以1mg/kg给药
Figure BDA0002991179750001271
表13：在表8中选择的抗体的单次静脉内注射后，从血浆中测量的铁参数计算 TSAT。如上所述，所有抗体和对照以1mg/kg给药
Figure BDA0002991179750001272
表14：在表9中选择的抗体的单次静脉内注射后，从血浆中测量的铁参数计算 TSAT。如上所述，所有抗体和对照以1mg/kg给药
Figure BDA0002991179750001273
绘制结果显示于图8A-D(表12)、图8E-G(表13)以及图8H和I(表14)中。总之，根据所有三个实验，在TSAT峰值增加和作用持续时间方面对TSAT量显示最高作用的两种抗体为CL-58838(图8A)和CL-58835(图8H)。
实施例12
在正常大鼠中单次静脉内注射后CL-55838的剂量反应评估
抗体CL-58838为在实施例11中显示优选概况的抗体之一，因此关注于确定在一定剂量范围内IV注射CL-58838后对转铁蛋白饱和度和作用持续时间的影响。向雄性Wistar大鼠(250-325g，n＝6/组)给予单次静脉内注射0.3、1或3mg/kg的CL-58838完全人类IgG4(SEQID NO：116和SEQ ID NO：125)。还包括hIgG4同种型对照(标记为“同种型”)和抗体A，其接受单次1mg/kg iv剂量。
在给药前一小时(-1)对动物进行给药前抽血以得到基线测量，随后在5分钟、6小时和24小时，以及第3、7、9、14、22、29和36天测量。每个时间点确定血浆TSAT(表15)。
表15：在以不同剂量单次静脉内注射抗体CL-58838后，从血浆中测量的铁参数计 算TSAT。同种型对照和抗体A以仅1mg/kg给药
Figure BDA0002991179750001281
图9显示所述实验的结果。在用CL-58838处理后，存在TSAT的快速且强烈的增加以及剂量依赖性峰值含量和剂量依赖性TSAT调节持续时间。3mg/kg具有最高和最长的作用持续时间，TSAT相比于同种型对照升高至少864小时(图9A)。当在1mg/kg的相同剂量下比较时，CL-58838显示出与抗体A类似的TSAT增加和作用持续时间，但抗体A的峰值含量似乎略高但恢复到同种型含量达696小时，而CL-58838在所述时间点仍然高于同种型(图9B)。
图11显示所述实验中CL-58838的药物动力学(PK)曲线(图11A)，随着剂量每次递增，峰值浓度和暴露持续时间增加。当在1mg/kg剂量下将所述PK曲线与抗体A的PK曲线进行比较时，CL-58838显示出类似的峰值浓度但暴露持续时间增加(图11B)。
实施例13
在正常大鼠中单次皮下(sc)注射后CL-55838的剂量反应评估
向雄性Wistar大鼠(250-325g，n＝6/组)给予单次皮下(sc)注射0.3、1或3mg/kg的CL-58838，呈完全人类IgG4抗BMP6抗体(SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：125)形式。还包括hIgG4同种型对照抗体(标记为“同种型”)和抗BMP6抗体A和B，各自接受单次1mg/kg sc剂量。
在给药前一小时(-1)对动物进行给药前抽血以得到基线测量，然后在5分钟、6小时和24小时，以及第3、7、9、14、22、29和36天测量。每个时间点确定血浆TSAT(表16)。
表16：在单次皮下注射抗体CL-58838后，从血浆中测量的铁参数计算TSAT。同种型 对照以及抗体A和B以仅1mg/kg给药
Figure BDA0002991179750001291
图10显示结果。在用CL-58838处理后，在所有剂量下存在TSAT的快速且强烈增加，剂量依赖性峰值含量在24到72小时和剂量依赖性TSAT调节持续时间。3mg/kg具有最长的持续时间，TSAT相比于同种型对照升高至少864小时(图10A)。在1mg/kg下，CL-58838显示与抗体A和B非常类似的TSAT增加(图10B)。在所述实验中，作用持续时间与抗体B更相似，在528小时时均高于同种型对照。
图11显示单次皮下给药后CL-58838的药物动力学(PK)曲线，随着剂量每次递增，峰值浓度和暴露持续时间增加(图11C)。当在1mg/kg剂量下比较CL-58838的PK曲线与抗BMP-6抗体A和B时，CL-58838显示类似的峰值暴露与暴露持续时间增加(图11D)。
实施例14
在慢性炎症贫血的PG-PS大鼠模型中评估CL-58838
PG-PS大鼠疾病模型为施用A组链球菌肽聚糖-多糖(PG-PS)后持久且长期持续的关节炎症的疾病模型。所述大鼠中的大多数也在两到三周时期内发展为重度贫血，因此所述模型也代表在许多慢性发炎性疾病中观察到的炎症驱动的功能性缺铁贫血的模型，即代表慢性疾病贫血(ACD；(Theurl等，2011))的模型。
在第-14天向6-8周龄雌性Lewis大鼠给予15mg/kg PG-PS的单次腹膜内(ip)注射。在第-1天(第0周)，将动物从尾静脉放血，收集血浆且采集全血并用于全血细胞计数(CBC)分析。患上贫血(血红蛋白含量小于15g/dl)以及白细胞计数增加的动物进入研究。治疗天然组纳入研究中用于基线读数(n＝5)。在第0天，将动物随机分组，以在所有治疗组(n＝6-9)中给出相似的平均血红蛋白含量和白细胞计数。随后用单次皮下注射IgG4同种型对照(n＝8)、CL-588383mg/kg(n＝9)、达贝泊汀α(EPO)10μg/kg(n＝8)或CL-588383mg/kg与EPO 10μg/kg的组合(n＝7)处理大鼠。在接受EPO的组中每周重复EPO施用。
在第-1天(第0周)、第7天(第1周)、第14天(第2周)、第21天(第3周)从尾静脉取血以及在第28天(第4周)挑选以允许进一步分析铁状态和贫血。
所述实验经设计用于研究与未处理的对照相比，CL-58838是否能够对大鼠中的贫血产生积极影响。为了确定其对血红蛋白的影响，在单个剂量的单独或与红细胞生成素(EPO)组合的CL-58838后，测量TSAT、全血细胞计数和铁调素含量，代表慢性疾病贫血的常见治疗选择。
表17：在治疗开始后第0、1、2、3和4周测量的血红蛋白(g/dl)、血细胞比容(％)、平 均细胞体积(MCV，fL)、平均细胞血红蛋白(MCH，pg)和白细胞(WBC x103/μL)。CL-58838和同 种型对照以3mg/kg给药，EPO(达贝泊汀α)以10μg/kg给药。
Figure BDA0002991179750001301
Figure BDA0002991179750001311
表17和图12显示与用同种型对照处理的动物相比，用CL-58838自身处理在所有四个时间点增加TSAT(图12A)。将CL-58838与EPO组合施用使TSAT在实验持续时间内进一步保持升高超过50％，类似于在天然动物中观察到的TSAT。CL-58838也防止在第3周与第4周之间对于同种型处理动物所见的血红蛋白下降(图12B)。将CL-58838与EPO组合施用导致血红蛋白的大量协同增加超过在天然动物中观察到的程度(图12B)。对MCH进行类似观测，其中共同处理恢复了对于天然动物观测到的MCH含量(图12C)。图12D-F显示在第0周(图12D)、第1周(图12E)和第2周(图12F)循环铁调素含量的结果。在治疗开始时(12D)，相比于天然动物，所有群组已由于炎症快速发作而驱动铁调素含量大大提高。在开始治疗后第1周和第2周，同种型对照动物进一步增加铁调素含量，这可能是由于持续的炎症和铁调素过量产生(图12E和12F)。单独用EPO处理不能减少铁调素含量的增加且仍然随时间增加，保持在同种型对照的20-30％内。单独用CL-58838处理对铁调素含量具有显著影响，与同种型对照处理的动物相比最初显著降低，随后保持在同种型对照处理动物的铁调素含量的约50％。用CL-58838和EPO投药进行处理最初使铁调素含量降到与单独CL-58838相似的程度，但与同种型、CL-58838或EPO处理的动物相比，保持或甚至进一步降低铁调素含量。EPO和CL-58838一起添加似乎对铁调素含量具有协同作用，其可能经由在可用铁含量增加的情况下有效刺激红细胞生成，且导致铁调素产生的可能下调(Nai等，2015)。
实施例15
在食蟹猴中单次剂量静脉内注射后CL-58838的剂量反应评估
向体重为2.5-4.0kg的15只雄性健康食蟹猴单次静脉内注射1、3和10mg/kg的CL-58838人类IgG4(SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：125)。也以单次静脉内注射3mg/kg包括抗BMP6抗体A和B。
在给药前第-6天、第-1天和即将给药前(0)将动物抽血，得到基线测量，随后在6/24小时，以及第3天、第7天、第9天、第14天、第22天、第29天、第35天和第43天测量。在每个时间点测量血浆TSAT和铁调素含量，以评估CL-58838在调节铁代谢中的功效。所有时间点以及所有组中的TSAT值如表18所示。
表18：在单次静脉内注射抗体后，从食蟹猴血浆中测量的铁参数计算TSAT。同种型 对照以及抗体A和B仅以3mg/kg给药
Figure BDA0002991179750001321
图13显示单次iv剂量的3mg/kg CL-58838后TSAT和作用持续时间的增加，其与相同剂量的抗体A和B类似(A)。在用不同剂量的CL-58838处理后，TSAT总效应、TSAT峰值含量和TSAT调节持续时间存在剂量依赖性增加(图13B)。CL-58838以及抗体A和B在3mg/kg下均显示血浆铁调素含量的相似降低以及类似的作用持续时间(图13C)。用CL-58838处理后铁调素降低在3mg/kg下程度最大，且用10mg/kg处理显示铁调素含量无进一步降低(图13D)。
图14显示所述实验中CL-58838的PK曲线(图14A)，其中随着剂量每次递增，暴露和峰值浓度以及暴露持续时间增加。当在3mg/kg下比较CL-58838与抗体A或B的暴露曲线时，所有抗体均显示类似曲线，但CL-58838显示暴露持续时间可能增加的趋势(图14B)。
实施例16
CL-58838和CL-58838样抗体的序列分析
根据所选抗体的体内分析结果(实施例11)，再次分析抗体序列的功能活性，且根据仅CL-58838显示非常有效的延长铁含量和TSAT升高的活性的事实进行比较。由于从KymouseTM回收的所有抗体的序列均可用，因此开发了具有相同VDJ区域(IGHV3-11*01、IGHD6-19*01、IGHJ4*02/IGKV3-20*01、IGKJ1*01)和相同CDRH3序列的抗体的序列池。如实施例5(表6)中所解释，在两种免疫化方案中从NGS序列池中鉴定出若干抗体。最后选择三种新的抗体用于体内分析(在表6和表9中以粗体显示)。然而，在体内测试(实施例11、表14)后，通过所述方法鉴定的CL-58722或CL-58756均未显示出与CL-58838类似的活性，并且仅CL-58835类似。鉴于所述抗体组中氨基酸序列之间的高度同源性，这是令人惊讶的。图15显示来自表6的所有独特抗体与CL-58838的Vh(IGHV3-11)和Vk(IGKV3-20)区域的比对。首先应注意CL-58838和CL-58835具有相同轻链，这对于所述两种抗体为独特的且仅在CDRH2中相差一个氨基酸。在体内测试但未显示与体内CL-58838或CL-58835的类似性能的抗体未显示对于CL-58838或CL-58835观察到的M75和D76的在残基75和76(Kabat)处的生殖系Vh变化。无其它Vh测试所述突变或其它显著差异可解释这种差异。因此，所述两个突变可能为介导对所述两种抗体观测到的特殊性能的主要序列基元。不能排除的是，独特的Vk区域也有助于CL-58838和CL-58835的特征，尽管本领域中已知Vh区域和特别是CDRH3通常为抗体特异性和性能的主要贡献者(Xu和Davis，2000)。
当考虑与BMP7的交叉反应性时进行另一观测。在所述组中显示与BMP7具有一定程度的交叉反应性的抗体为CL-58680、CL-58679和CL-58680。Vh结构域中的序列差异不能归因于所述效应，因为它们也出现于其它克隆中。然而，对于与BMP7交叉反应的克隆，在Vk结构域中，位置52和53(Kabat)相比于生殖系IGKV3-20未改变，而所有不与BMP7交叉反应的克隆均具有一个或两个所述残基改变。
当在均相时间分辨式FRET(HTRF)检定中以头对头竞争实验测试时，那些抗体的体外性能类似，其中用抗生蛋白链菌素-穴状化合物检测的生物素化的CL-58838与用647标记的BMP6结合(图16)。随后通过在所述实验中测试的未经标记的抗体竞争经标记的CL-58838与经标记的人类BMP6的所述相互作用。如所预期，CL-58838与经标记的CL-58838完全竞争。CL-58722和CL-58756显示出与经标记的CL-58838竞争的能力稍低，这可能也反映序列变化对BMP6亲和力的一些影响。所述分析令人惊讶地表明，尽管从所述系列中选择用于体内分析的抗体(具有相同的VDJ使用和相同的CDRH3)显示出非常相似的结合且中和人类BMP6的能力，并且所有抗体皆与CL-58838竞争结合BMP6但仍然在其体内性能方面显著不同。
实施例17
评估CL-58838于慢性炎症贫血的PG-PS大鼠模型中的ESA节减能力
如实施例14中所详述，PG-PS大鼠疾病模型为用于研究慢性炎症贫血的公认模型。
所述研究的目的为测试与达贝泊汀α(EPO)组合的抗BMP-6IgG4抗体CL-58838(SEQID NO：116和SEQ ID NO：125)是否可以与EPO单一疗法相比减少使用所述模型有效地恢复血液学参数所需的EPO剂量。
方法
6-8周龄的雌性Lewis大鼠在时间点“第-2周”给予单次腹膜内(ip)注射15mg/kgPG-PS，且在两周后(即时间点“第0周”)将动物从尾静脉取血以进行全血细胞计数分析。仅当大鼠在时间点第0周具有增加的粒细胞计数时，将其纳入所述实验中(参见图17A)。未处理的天然组纳入研究中用于基线读数(第I组，参见表19)。另外，研究所纳入大鼠的血红蛋白(Hgb)值。如果Hgb值＜13.5g/dL，则将大鼠分配到特定治疗组(II-IV，参见表19)。如果Hgb值＞13.5g/dL，则未将大鼠分配到特定治疗组且于下周再次分析(参见图17B)。在所有时间点收集血浆用于进一步分析。在将动物分配到一个相应治疗组后，第II组中的大鼠用IgG4对照抗体的单次s.c.注射处理，第III组中的大鼠用10μg/kg达贝泊汀α处理，且第IV组中的大鼠接受3mg/kg CL-58838与10μg/kg达贝泊汀α的组合(参见表19)。
表19：评估CL-58838用于治疗ACD的ESA节减能力的治疗组
第I组 天然对照大鼠
第II组 接受IgG4对照抗体[3mg/kg]s.c.的ACD大鼠
第III组 接受达贝泊汀α[10μg/kg]s.c.的ACD大鼠
第IV组 接受CL-58838[3mg/kg]和达贝泊汀α[10μg/kg]的ACD大鼠
在初始治疗后，每三周重复施用CL-58838(第IV组)或IgG4对照(第II组)。相反，任何进一步的EPO施用均依赖于Hgb值，其在整个研究中每周在各个别大鼠中评估。如图17B所示，如果治疗组III和IV中的Hgb值低于天然对照大鼠(第1组)的平均Hgb值，则仅施用EPO。我们选择所述实验设置来模拟人类中的真实临床环境，因为CKD患者仅接受依赖于某个预定Hgb含量的EPO。
从尾静脉每周采集血液(即时间点“第0周-第6周”)且在“第7周”进行挑选以允许进一步分析铁状态和贫血。
从“第0周”开始，根据上述准则将大鼠分配到所述治疗组之一。第3周后，所有大鼠均分配到所述治疗组之一且可开始治疗。重要的是，Hgb值在第1次治疗当天均匀分布于各组之间(图17C)。关于大鼠数量和治疗开始时间点的细节示于表20中。
表20：根据纳入实验中的时间点列出的大鼠
组 治疗 数量(在第0/1/2/3周纳入)
第I组 天然对照 5(5/0/0/0)
第II组 ACD/IgG4对照抗体[3mg/kg] 7(2/2/2/1)
第III组 ACD/达贝泊汀α[10μg/kg] 10(1/5/2/1)
第IV组 ACD/CL-58838[3mg/kg]和达贝泊汀α[10μg/kg] 11(1/5/3/2)
结果
如上文所概述，如果大鼠的Hgb值＜13.5g/dL，则将大鼠分配到治疗组中。用同种型对照抗体处理的ACD大鼠在整个实验中保持贫血。单独用EPO治疗可使Hgb含量恢复到接近正常值。然而，CL-58838与EPO的组合显示对Hgb值的协同作用。在治疗开始后一周，Hgb值经归一化且随时间进一步增加(图17C)。此外，作为铁可用性的敏感指标的平均红细胞体积(MCV)和平均红细胞血红蛋白(MCH)在用CL-58838与EPO组合治疗的ACD大鼠中经归一化，而ACD对照大鼠和用EPO治疗的大鼠在整个实验期间仅保持小红细胞性和低色度(图17D和E)。
另外，为评估组合疗法是否具有EPO节减作用，监测在治疗组III和IV的大鼠中施用的EPO量。以下计算基于额外EPO剂量，因此排除第一次治疗所施用的EPO剂量：
总共最多40次(ACD/达贝泊汀α)和44次(ACD/达贝泊汀α+CL-58838)EPO施用在理论上可在治疗4周后将所有大鼠降到低于天然对照大鼠的平均Hgb值的限定阈值。坚持上面解释且于图17B中概述的准则，40个可能剂量中的21个必须施用到第III组的大鼠。相反，在44种可能的EPO投药中，仅有8种额外EPO剂量必须应用于第IV组的大鼠。换句话说，虽然EPO治疗的大鼠在所有可能的EPO剂量中“消耗”53％，但组合组仅需要18％来维持Hb值高于截止值(图17F)。这清楚地表明，组合疗法可以比EPO单一疗法更有效地校正Hgb值。因此，添加CL-58838能够产生EPO节减作用。
实施例18
在慢性肾病小鼠模型中评估CL-58838
除了实施例14和17中描述的大鼠模型之外，也在鼠类慢性肾病模型(CKD)中测试人类IgG4抗BMP-6抗体CL-58838(SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：125)。经由含有0.2％腺嘌呤的特殊饮食诱发肾损伤(Akchurin等，2016)。所述研究的目的为测试CL-58838作为单一疗法或与达贝泊汀α(EPO)组合在所述疾病模型中的作用。
方法
向3周龄雄性C57BL/6N小鼠喂食含有0.2％腺嘌呤、0.9％磷酸盐和30mg铁的特殊饮食(称为腺嘌呤饮食)。向未经处理的对照小鼠(n＝7)喂食含有30mg Fe而不含腺嘌呤的饮食。
在时间点“第0周”，将CKD动物随机分配到不同治疗组(关于细节参见表21)。因此，第II组用IgG4对照[3mg/kg]的单次s.c.注射处理(n＝5)，第III组接受CL-58838[3mg/kg](n＝6)，第IV组用达贝泊汀α[10μg/kg]处理(n＝6)，且第V组接受CL-58838[3mg/kg]与达贝泊汀α[10μg/kg]的组合(n＝6)。未经处理的天然组纳入研究中用于基线读数(n＝7)。每周重复EPO处理，即用EPO处理小鼠4次。每隔一周进行CL-58838施用，即小鼠接受两次药物注射。处理4周后终止实验。
实验设置如图18A所示。
表21：在慢性肾病小鼠模型中评估CL-58838的治疗组
第I组 健康对照
第II组 CKD小鼠接受IgG4对照抗体[3mg/kg]i.p.
第III组 CKD小鼠接受CL-58838[3mg/kg]i.p.
第IV组 CKD小鼠接受达贝泊汀α[10μg/kg]i.p.
第V组 CKD小鼠接受CL-58838[3mg/kg]和达贝泊汀α[10μg/kg]i.p.
结果
第1次处理后4周，分析小鼠。使用CL-58838或EPO的单一疗法可以略微改善Hgb值，然而，组合疗法将Hgb值相对于基线值归一化(图18B)。此外，经CL-58838处理的动物具有显著高于未处理或仅EPO处理的小鼠的平均红细胞体积(MCV)和平均红细胞血红蛋白(MCH)值。重要的是，MCV和MCH在双重处理动物中完全归一化，表明所述处理动物的红细胞祖细胞的铁供应得以改善(图18C和18D)。由于CL-58838经由靶向BMP6调节铁调素表达，我们详细研究了所述动物中与铁代谢相关的基因、蛋白质和参数。如图18E所示，在接受CL-58838单一疗法或CL-58838与达贝泊汀α组合的动物中，肝Hamp表达量显著减少。CKD对照动物中血浆铁含量和因此转铁蛋白饱和度(TSAT)值均降低。EPO以及CL-58838单一疗法导致铁含量和TSAT略有增加。此外，组合疗法引起血浆铁含量的最强增加(图18F)。据此，与单独用EPO处理的动物相比，接受双重处理的动物的TSAT值也显著增加(图18G)。总之，所述数据清楚地表明铁被有效地动员，与Tf结合，并入骨髓中红细胞的血红蛋白中。
实施例19
在慢性肾病小鼠模型中评估CL-58838的ESA节减能力
如实施例18中所详述，经由含有腺嘌呤的饮食在雄性小鼠中诱发CKD，造成肾损伤且在8周后导致贫血。所述研究的目的在于测试
1)CL-58838与EPO(达贝泊汀α)的组合疗法是否可导致更好的总体反应和EPO剂量的潜在减少。
2)如果与CL-58838组合，是否可以有效使EPO剂量本身对改善Hgb结果无影响。
方法
向3周龄雄性C57BL/6N小鼠喂食含有0.2％腺嘌呤、0.9％磷酸盐和30mg铁的特殊饮食(称为腺嘌呤饮食)。在“第0周”将CKD动物随机分配到不同治疗组(关于细节参见表22和图18A)且开始治疗。第1次处理后4周，分析小鼠。
表22：待评估的治疗组
Figure BDA0002991179750001371
结果
在本研究中用最大EPO剂量(1μg/kg)治疗罹患CKD的小鼠不能改善贫血。然而，如果1μg/kg EPO与CL-58838组合，则无论CL-58838剂量[0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg]如何，贫血可以显著改善(图19A)。两种较高剂量的CL-58838对效果更明显。所述结果清楚地表明，如果与CL-58838组合，则可以有效地使EPO剂量本身对Hgb含量无影响。
反之亦然，我们实验设置允许评估组合疗法是否可导致在组合治疗中使用较低剂量的EPO(即ESA节减)。在这方面，如果与0.1μg/kg EPO组合，则10mg/kg剂量的CL-58838能够显著增加Hb含量，其比单独使用的EPO剂量低10倍，甚至比实施例18中使用的剂量低100倍(图19B)。
此外，作为红细胞铁可用性的替代物的平均红细胞体积(MCV)呈剂量依赖性增加(图19C)。换句话说，施用CL-58838的剂量愈高，红细胞的铁供应愈佳，其反映为更高的MCV值。众所周知，饱和转铁蛋白(TSAT)形式的铁代表发育红细胞的主要铁传递路径，我们也评估所述参数。如图19D所示，与仅接受EPO的小鼠相比，在接受1μg/kg EPO与1mg/kg和10mg/kg CL-58838组合的小鼠中，TSAT显著增加。
此外，即使与1mg/kg CL-58838组合的最低EPO剂量(0.01μg/kg)未导致Hb显著增加(未显示)，但确实导致更高的MCV值，表明更好的红细胞质量(图19E)。
抗BMP6经由CL-58838处理靶向降低铁调素含量。因此，分析铁调素含量(通过测量肝脏中的Hamp mRNA表达量，其已知与血浆铁调素含量良好相关)。通常，在所有双重处理的动物中存在Hamp表达量明显降低的趋势，而接受本文测试的最低CL-58838剂量[0.1mg/kg]的第III组中的小鼠除外(图19F)。有趣的是，接受相同CL-58838剂量但不同剂量的EPO(即治疗组IV-VI和VII-IX)的动物显示出随着EPO剂量愈高而Hamp表达量愈高的趋势。由于Hb含量也呈剂量依赖性增加，因此必须考虑到铁稳态与红细胞生成之间的串扰来解释更高的Hamp表达量。举例来说，在Hb含量足够的情况下，Hamp表达不再受发育红细胞产生的信号的强烈抑制，如Erfe(Kautz等，2014)。
参考文献
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序列：
Figure BDA0002991179750001401
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Figure BDA0002991179750002161
Figure BDA0002991179750002171

Claims (38)

1.一种抗体或片段，其包含特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)的结合位点，其中所述结合位点包含VH结构域，其中所述VH结构域包括包含SEQ ID NO：114的VH结构域的CDRH3序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述CDRH3包含SEQ ID NO：110或113。
3.根据任一前述权利要求所述的抗体，其中所述VH结构域由源自人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组的核苷酸序列编码，其中
(a)所述VH基因区段选自IGHV3-11和IGHV1-3；
(b)所述DH基因区段为选自IGHD3-10、IGHD6-19、IGHD7-27、IGHD4-23、IGHD5-18、IGHD3-22和IGHD3-16的人类基因区段；和/或
(c)所述JH基因区段为选自IGHJ3、IGHJ4和IGHJ5的人类基因区段。
4.根据任一前述权利要求所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括(i)包含SEQ IDNO：110的VH结构域，其与包含SEQ ID NO：119的VL结构域配对；或(ii)包含SEQ ID NO：113的VH结构域，其与包含SEQ ID NO：122的VL结构域配对。
5.根据任一前述权利要求所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括包含SEQ ID NO：114的VH结构域，其与包含SEQ ID NO：123的VL结构域配对。
6.根据任一前述权利要求所述的抗体或片段，其中所述VH结构域包含
(a)包含SEQ ID NO：110的CDRH3；和包含SEQ ID NO：108的CDRH1和/或包含SEQ ID NO：109的CDRH2；或
(b)包含SEQ ID NO：113的CDRH3；和包含SEQ ID NO：111的CDRH1和/或包含SEQ ID NO：112的CDRH2。
7.一种抗体或片段(任选地根据任一前述权利要求所述)，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包括包含SEQ ID NO：114或与其具有至少70％一致性的氨基酸的VH结构域。
8.根据任一前述权利要求所述的抗体或片段，其包含所述VH结构域的第一拷贝和第二拷贝。
9.一种抗体或片段(任选地根据任一前述权利要求所述)，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包含VL结构域，其中所述VL结构域包括包含SEQ ID NO：123的VL结构域的CDRL3序列。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述CDRL3包含SEQ ID NO：119或122。
11.根据权利要求9或10所述的抗体，其中所述VL结构域由源自人类VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码，其中
(a)所述VL基因区段选自IGKV3-20、IGKV1-5和IGKV3-15；和/或
(b)所述JL基因区段选自IGKJ1和IGKJ3。
12.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的抗体或片段，其中所述VL结构域包含
(a)包含SEQ ID NO：119的CDRL3；和包含SEQ ID NO：117的CDRL1和/或包含SEQ ID NO：118的CDRL2；或
(b)包含SEQ ID NO：122的CDRL3；和包含SEQ ID NO：120的CDRL1和/或包含SEQ ID NO：121的CDRL2。
13.一种抗体或片段(任选地根据任一前述权利要求所述)，其包含特异性结合BMP6的结合位点，其中所述结合位点包括包含SEQ ID NO：123或与其具有至少70％一致性的氨基酸的VL结构域。
14.根据权利要求9到13中任一权利要求所述的抗体或片段，其包含所述VL结构域的第一拷贝和第二拷贝。
15.一种抗体或片段(任选地根据任一前述权利要求所述)，其特异性结合骨形态发生蛋白6(BMP6)且包含(i)包含SEQ ID NO：116或与其具有至少70％一致性的氨基酸的重链氨基酸序列；和/或(ii)包含SEQ ID NO：125或与其具有至少70％一致性的氨基酸的轻链序列。
16.一种抗体或片段(任选地根据任一前述权利要求所述)，其(i)特异性结合与根据任一前述权利要求所述的抗体所结合的抗原决定基相同的人类BMP6抗原决定基；和/或(ii)与根据任一前述权利要求所述的抗体竞争结合人类BMP6。
17.根据任一前述权利要求所述的抗体或片段，其特异性结合包含SEQ ID NO：562的人类BMP6；和/或包含SEQ ID NO：564的食蟹猴BMP6；和/或包含SEQ ID NO：563的大鼠BMP6。
18.根据任一前述权利要求所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段包含人类恒定区，任选地IgG4恒定区或IgG1恒定区。
19.根据权利要求18所述的抗体或片段，其中所述恒定区为IgG4-PE恒定区，任选地所述恒定区包含SEQ ID NO：454的氨基酸序列。
20.根据任一前述权利要求所述的抗体或片段，其进一步包含特异性结合另一靶抗原(任选地人类血幼素、转铁蛋白受体或BMP受体)；或结合BMP6和另一BMP(任选地BMP2、4、7或9)的抗原结合位点。
21.根据任一前述权利要求所述的抗BMP6抗体或片段，其用于治疗或预防个体中BMP6介导的疾病或病状(任选地贫血)。
22.根据权利要求21所述的抗BMP6抗体或片段，其中所述疾病或病状选自贫血、肺动脉高压(PAH)(任选地原发性PAH或继发性PAH)、脑海绵状血管畸形(CCM)(任选地家族性CCM或偶发性CCM)、不宁腿综合征(RLS)、癌症、癌症转移、系统性硬化症、干燥综合征、内皮细胞-间质转化(EndoMT)、心血管疾病、动脉粥样硬化、系统性硬化症相关的肺纤维化和心脏纤维化。
23.根据权利要求21或22所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段与红细胞生成素刺激剂(ESA)同时或依序施用到所述个体。
24.一定量的抗BMP6抗体或片段和一定量的ESA的组合(任选地包含多个剂量的所述抗体和/或ESA)，其中所述抗体或片段是根据任一前述权利要求所述。
25.根据任一前述权利要求所述的抗体、片段或组合，其用于以下方法中：
(a)防止个体的血液血红蛋白含量降到小于10g/dL，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和红细胞生成刺激剂(ESA)；
(b)在罹患贫血的个体中将血液血红蛋白升高到至少10g/dL的含量，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗；
(c)治疗或预防罹患发炎性疾病或病状的个体的贫血，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述贫血得以治疗或预防；
(d)消除或减少对罹患贫血的个体施用铁或输血的需要，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述需要得以消除或减少；
(e)治疗或预防罹患微生物感染的个体的贫血，所述方法包括向所述个体施用抗BMP6拮抗剂和红细胞生成刺激剂(ESA)；
(f)减少向罹患贫血的个体施用红细胞生成刺激剂(ESA)以治疗贫血，所述方法包括施用所述抗体或片段和所述ESA，其中所述个体中的贫血得以治疗；或
(g)治疗或降低罹患贫血或有贫血风险的个体中的贫血风险，所述方法包括向所述个体施用所述抗体或片段和低剂量的红细胞生成刺激剂(ESA)，其中所述个体中的贫血得以治疗或贫血风险得以降低。
26.根据权利要求24或25所述的组合，其中所述ESA为
a.依泊汀α且以小于1000、1500、2500、5000、11000、18000、34000或90000单位的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受＜1500、1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90000单位的每周依泊汀α治疗；
b.达贝泊汀α或
Figure FDA0002991179740000041
且以小于6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受6.25、10、12.5、20、25、40、60、100或200微克的每周达贝泊汀α或
Figure FDA0002991179740000042
治疗；或
c.达贝泊汀α或
Figure FDA0002991179740000043
且以小于6.25、10、20、40、60、100或200微克的每周剂量施用，任选地其中所述个体先前已分别接受1500到2499、2500到4999、5000到10999、11000到17999、18000到33999、34000到89999或≥90,000单位的每周依泊汀α治疗。
27.根据任一前述权利要求所述的抗体、片段或组合，其用于在所述个体已接受所述抗BMP6抗体或片段和ESA后至少13或14天维持或提高所述个体中的血液血红蛋白含量到至少10g/dL。
28.一种根据任一前述权利要求所述的抗体、片段或组合的用途，其用于制造供施用到个体以治疗或预防BMP6介导的疾病或病状、任选地贫血的药物。
29.一种治疗或预防个体的BMP6介导的疾病或病状(任选地贫血)的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1到27中任一权利要求所述的抗体、片段或组合，其中所述BMP6介导的疾病或病状借此得以治疗或预防。
30.根据权利要求28所述的用途或根据权利要求29所述的方法，其中所述BMP6介导的疾病或病状为贫血。
31.根据权利要求21到30中任一权利要求所述的抗体、片段、组合、用途或方法，其进一步包括向所述个体施用另一疗法，例如另一治疗剂，任选地其中所述另一治疗剂选自由以下组成的组：
(a)静脉内铁；
(b)ESA(任选地EPO)；
(c)ActRIIa抑制剂；
(d)ActRIIb抑制剂；
(e)IL-6或IL-6受体抑制剂(任选地抗IL-6或IL-6受体抗体)；
(f)TNF-α或TNF-α受体抑制剂(任选地抗TNF-α或TNF-α受体抗体)；
(g)HJV抑制剂(任选地抗HJV抗体)；
(h)BMP拮抗剂(任选地另一抗BMP抗体或片段)，任选地其中所述BMP为BMP2、4、5、6、7或9；
(i)蛋白裂解酶-2(MTP2)激动剂(任选地蛋白裂解酶-2(MTP2)激动剂抗体)；
(j)HIF-PH抑制剂；
(k)转铁蛋白受体2(TFR2)抑制剂；
(l)HFE抑制剂；
(m)NRf2抑制剂；
(n)转化生长因子-β超家族I型激活素受体样激酶(ALK)受体抑制剂；
(o)激活素受体抑制剂(任选地激活素受体Fc融合体)；
(p)GDF11抑制剂；和
(q)肌肉生长抑制素抑制剂。
32.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到27和31中任一权利要求所述的抗体、片段或组合，和医药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂，和任选地与选自根据权利要求44所述的药剂的另一治疗剂组合。
33.根据权利要求32所述的医药组合物，其用于治疗和/或预防BMP6介导的病状或疾病，任选地贫血。
34.根据权利要求32或33所述的医药组合物，其与标签或使用说明书组合以治疗和/或预防人类中的所述疾病或病状；任选地其中所述标签或说明书包括上市许可号(任选地FDA或EMA许可号)；任选地其中所述试剂盒包括包含所述抗体或片段的IV或注射装置。
35.一种核酸，其
(a)编码根据权利要求1到20中任一权利要求所述的抗体或片段的VH结构域和/或VL结构域；
(b)编码(i)包含SEQ ID NO：114或与其具有至少70％一致性的氨基酸序列的VH结构域；和/或(ii)包含SEQ ID NO：123或与其具有至少70％一致性的氨基酸序列的VL结构域；
(c)包含(i)与SEQ ID NO：115的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；和/或(ii)与SEQ ID NO：124的序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；
(d)编码根据权利要求1到20中任一权利要求所述的抗体或片段的重链和/或轻链；或
(e)编码(ii)包含与SEQ ID NO：116具有至少70％一致性的氨基酸序列的重链；和/或
(iii)包含与SEQ ID NO：125具有至少70％一致性的氨基酸序列的轻链。
36.一种载体，其包含根据权利要求35所述的核酸；任选地其中所述载体为CHO或HEK293载体。
37.一种宿主细胞，其包含根据权利要求35所述的核酸或根据权利要求36所述的载体。
38.一种如本文所述的抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、用途或方法。
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