CN113444753B

CN113444753B - 一种含d-阿洛酮糖的果葡糖浆及其制备方法

Info

Publication number: CN113444753B
Application number: CN202110560270.8A
Authority: CN
Inventors: 高润香; 姚宏伟; 蔡侠; 东刚; 贾伟; 王水淋
Original assignee: Beijing Chengzhi High Tech Biotechnology Co ltd; Jiangxi Chengzhi Biological Engineering Co ltd; Chengzhi Life Sci & Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Chengzhi High Tech Biotechnology Co ltd; Jiangxi Chengzhi Biological Engineering Co ltd; Chengzhi Life Sci & Tech Co ltd
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113444753A

Abstract

本申请公开了一种含D‑阿洛酮糖的果葡糖浆制备方法，包括如下步骤：将果葡糖浆浓缩液通过装有D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶(DPE固定化酶)的反应器中进行连续转化，得到含有D‑阿洛酮糖的果葡糖浆。本申请提供了含D‑阿洛酮糖的果葡糖浆及其制备方法，该制备方法以非粮作物来源的菊粉、菊苣为原料，通过菊粉外切酶以及DPE固定化酶连续转化制备含D‑阿洛酮糖的果葡糖浆，具有反应稳定易控制、转化产物稳定高效的特点，而且DPE固定化酶易从反应体系中分离出来，同时产生的转化液中无杂质及酶蛋白的干扰，适用于工业化放大生产。

Description

一种含D-阿洛酮糖的果葡糖浆及其制备方法

技术领域

本申请涉及生化工程技术领域，具体涉及一种含D-阿洛酮糖的果葡糖浆及其制备方法。

背景技术

目前，全球淀粉糖及糖醇等产品消耗量已超过3000万吨，其中占比较大的是果葡糖。然而，糖的过量摄入，特别是果糖的过量摄入，导致肥胖、甘油三酯升高等一系列慢性代谢疾病，严重影响人类健康，亟待开发低热量的功能性健康糖。

D-阿洛酮糖(D-allulose)又名D-核糖-2-己酮糖，是D-果糖的C-3位的差向异构体。D-阿洛酮糖是一种天然存在但有含量极少的低热量功能性甜味剂，其甜度为蔗糖的70％，但能量仅为蔗糖的0.3％。相关研究表明，D-阿洛酮糖具有降低血糖、促进血液健康、改善脂肪代谢等功能，在美国、日本等国已应用于食品领域，2019年4月，FDA宣布将低热量甜味剂D-阿洛酮糖排除在“添加糖”、“总糖”标签之外，因此，D-阿洛酮糖已获得越来越多的关注，成为最具市场竞争潜力的一种新型功能性零热量甜味剂，有望发展成为完全或部分替代果糖、果葡糖、蔗糖的下一代功能糖。

目前用量占比较大的果葡糖，主要包括含果糖42％、55％、90％的3种液体糖，通常采用粮食来源的葡萄糖原料，经异构酶转化、分离、混合等方法制备。

D-阿洛酮糖的制备过程可以分为化学制备和生物制备。化学制备法由于工艺步骤繁杂，化学污染严重以及副产物杂质多等一系列原因，未得到有效应用。1990年，日本香川大学(Kagawa University)泉森(Izumori)团队首次报道了1株产碱杆菌属细菌(Azcaligenessp.701B)静息细胞能以阿洛糖醇、D-塔格糖或半乳糖醇为底物生产D-阿洛酮糖，开辟了D-阿洛酮糖酶转化生产的先河。酶转化技术因具有反应单一，纯化步骤简单等优点而逐渐成为D-阿洛酮糖制备研究的主要方向，迄今已有10余年的历程。现有酶转化技术多采用改良的重组菌株制备D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose3-epimerase，缩写为DPE)，并通过整体细胞或粗酶的批次转化工艺，将果糖转化为D-阿洛酮糖，酶只能利用一次，酶的利用率极低。采用固定化酶转化工艺，可以实现连续转化，有效提高了酶的利用率。然而目前采用DPE生产制备D-阿洛酮糖存在以下问题：现有固定化酶的技术多以海藻酸钠作为固定化的载体，海藻酸钠在高浓度的电解质，溶液中性质不够稳定，容易变软。使用海藻酸钠作为载体时，同时会加入戊二醛作为交联剂，戊二醛有微毒性，且对金属有腐蚀作用，实验操作要求高。

发明内容

针对上述现有技术的缺点及不足之处，本申请提供一种含D-阿洛酮糖的果葡糖浆及其制备方法，该制备方法以菊芋、菊苣等非粮作物制备的菊粉为原料，通过菊粉外切酶水解得到果葡糖浆浓缩液，果葡糖浆浓缩液以一定流速通入装有DPE固定化酶的反应器中连续转化制备D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合糖浆，具有反应稳定易控制、转化产物稳定高效的特点，而且DPE固定化酶易从反应体系中分离出来。

本申请提供如下技术方案。

1、一种含D-阿洛酮糖的果葡糖浆制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将果葡糖浆浓缩液通过装有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶(DPE固定化酶)的反应器中进行连续转化，得到含有D-阿洛酮糖的果葡糖浆。

2、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述DPE固定化酶包括酶载体和DPE；

所述酶载体与DPE通过共价键结合在一起。

3、根据项2所述的制备方法，其特征在于，所述酶载体为中性或弱碱性大孔树脂，优选为中性大孔树脂。

4、根据项2所述的制备方法，其特征在于，所述酶载体为聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为聚丙烯酸类大孔树脂。

5、根据项2所述的制备方法，其特征在于，所述酶载体为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为带有疏水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂。

6、根据项2所述的制备方法，其特征在于，所述酶载体选自带有环氧基团或胺基基团的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂；优选为带有环氧基团的聚丙烯酸类大孔树脂。

7、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述DPE固定化酶酶活为20U/g～60U/g，优选为35U/g～60U/g。

8、根据项2所述的制备方法，其特征在于，所述DPE与酶载体的酶活质量比(U/g)为(70～400):1，优选为(100～250):1。

9、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述果葡糖浆浓缩液的制备方法7_包括如下步骤：

以菊芋、菊苣等果糖基生物质来源的菊粉，通过菊粉外切酶水解得到果糖与葡萄糖的混合液；

纯化浓缩所述果糖与葡萄糖的混合液，得到果葡糖浆浓缩液。

10、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉的制备方法包括如下步骤：选取新鲜菊芋、菊苣块茎，洗净、切片，100℃加热10min、热水浸提、去除不溶性固体、80℃烘干，粉碎过筛制得80目菊粉。

11、根据项10所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉通过菊粉外切酶水解得到果糖与葡萄糖的混合液；

所述菊粉外切酶与所述菊粉的酶活质量比为50～300U/g，优选为100～200U/g；

所述菊粉外切酶的酶活为5000～25000U/g。

12、根据项11所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉的水解温度为35～60℃，优选为40～55℃；水解时间为1～6h，优选为3～5h。

13、根据项9所述的制备方法，其特征在于，利用活性炭对所述果糖与葡萄糖的混合液进行纯化除杂、减压浓缩，得到所述果葡糖浆浓缩液。

14、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述果葡糖浆浓缩液的总糖浓度为200～750g/L，优选为650～750g/L；

在所述果葡糖浆浓缩液中所述葡萄糖与果糖比例为1：(6.0～9.0)，优选为1：(8.0～8.5)。

15、根据项1所述的制备方法，其特征在于，当所述DPE固定化酶加入到带夹套的反应器中，控制夹套温度为40～60℃，优选为50～55℃进行连续转化。

16、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述果葡糖浆浓缩液通过装有DPE固定化酶的反应器中连续转化时，每小时所述果葡糖浆浓缩液流量与DPE固定化酶装量比(ml/ml)为(0.3～1)：1，优选为(0.4～0.6)：1。

17、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中含有D-阿洛酮糖、果糖以及葡萄糖，所述D-阿洛酮糖的含量为50～200g/L，优选为160～200g/L；所述果糖的含量为120～480g/L，优选为400～480g/L；所述葡萄糖的含量为20～110g/L，优选为60～85g/L。

18、一种根据项1-17任一项所述的制备方法制备的含D-阿洛酮糖的果葡糖浆。

本申请提供的含D-阿洛酮糖的高果糖浆及其制备方法，该制备方法以菊芋、菊苣等果糖基生物质来源的菊粉为原料，通过菊粉外切酶将菊粉水解形成葡萄糖与果糖的混合液，通过活性炭脱色、除杂、减压浓缩得到果葡糖浆浓缩液，所述果葡糖浆浓缩液中，果糖含量超过80％，然后通过将果葡糖浆浓缩液以一定的流速通入装有DPE固定化酶的反应器中，进行连续转化，高浓度的果糖在DPE固定化酶的作用下转化为D-阿洛酮糖，所述果糖的转化率可达29.35％，从而得到富含D-阿洛酮糖、葡萄糖、果糖的混合糖浆。该制备方法具有反应稳定易控制、转化产物稳定高效的特点，而且DPE固定化酶易从反应体系中分离出来。

附图说明

附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：

图1为不同果糖底物浓度条件下，酶载体RC01制备的DPE固定化酶连续转化时果糖平均转化率变化示意图。

图2为750g/L果糖底物浓度条件下，酶载体RC01制备的DPE固定化酶连续转化时果糖转化率变化示意图。

图3为750g/L果糖底物浓度条件下，酶载体RC04制备的DPE固定化酶连续转化时果糖转化率变化示意图情况。

图4为DPE固定化酶连续转化反应前，果葡糖浆浓缩液中各组分含量示意图。

图5为DPE固定化酶连续转化反应后，果葡糖浆浓缩液中各组分含量。

具体实施方式

以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

本申请提供一种含D-阿洛酮糖的果葡糖浆的制备方法，包括如下步骤：

所述果葡糖浆浓缩液可以通过购买得到，也可以制备得到。

当所述果葡糖浆浓缩液是制备得到时，包括如下具体步骤：

步骤一：选取菊芋、菊苣等果糖基生物质的块茎，洗净、切片，100℃加热10min、热水浸提、去除不溶性固体、80℃烘干，粉碎过筛制得80目菊粉。

菊芋、菊苣块茎中菊糖约占干重的80％，其中含75％～85％果糖和15％～25％葡萄糖，因此是良好的果糖基原料。

步骤二、将菊粉通过菊粉外切酶水解得到葡萄糖与果糖的混合液，水解过程中定时取样，用高效液相色谱检测并计算水解产物中葡萄糖、果糖浓度，当果糖浓度达到平衡不再升高时，水解反应完成。

步骤三：纯化浓缩所述葡萄糖与果糖的混合液，利用活性炭对葡萄糖与果糖的混合液进行脱色、除杂、减压浓缩，得到果葡糖浆浓缩液，取样测折光度即得到浓缩液总糖浓度，用高效液相色谱检测果糖与葡萄糖浓度。

步骤四：将所述果葡糖浆浓缩液加入到装有DPE固定化酶的带夹套的反应器中，控制反应器夹套温度40～60℃，优选为50～55℃，控制每小时果葡糖浆浓缩液流量与DPE固定化酶装量比(ml/ml)为(0.3～1)：1，优选为(0.4～0.6)：1，以上进下出方式进行连续转化，转化达到平衡后，转化液中D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖含量亦达到平衡，即可连续获得含D-阿洛酮糖的果葡糖浆，定时取样用高效液相色谱检测转化液中D-阿洛酮糖浓度和转化率，当D-阿洛酮糖含量大幅下降时，终止转化反应。

具体地，每小时果葡糖浆浓缩液流量与DPE固定化酶装量比(ml/ml)可以为(0.3：1)、(0.4：1)、(0.5：1)、(0.6：1)、(0.7：1)、(0.8：1)、(0.9：1)以及(1：1)。

通常经酶法生产的含果糖42％的果葡糖浆，也称为高果糖浆。经过进一步分离出葡萄糖，得果糖质量分数90％的果糖浆。质量分数90％的果糖浆再和适量质量分数42％果糖产品混合，可得到果糖质量分数55％的糖浆。工业称上述3种高果糖浆分别为F-42(HFC-S42)，F-90(HFC-S90)、F-55(HFC-S55)。

这三种产品都是液体，其中HFC-S42含果糖42％，葡萄糖52-55％，低聚糖6-8％。HFC-S55含果糖55％，葡萄糖40％，低聚糖4％。HFC-S90含果糖90％，葡萄糖8％，低聚糖1％。固形物含量通常在71～80％范围内。

在本申请中，所述的果葡糖浆浓缩液是包括葡萄糖和果糖的混合液，果葡糖浆浓缩液可以根据实际需要进行浓缩和稀释。

在本申请中，所述DPE固定化酶，包括酶载体和DPE。

所述DPE固定化酶为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的简称。

所述DPE为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的简称。

在本申请中，所述DPE与酶载体的酶活质量比(U/g)为(70～400)：1，优选为100～250U/g；

所述DPE与酶载体的酶活质量比(U/g)可以为70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、120:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1、200:1、210:1、220:1、230:1、240:1、250:1、260:1、270:1、280:1、290:1、300:1、310:1、320:1、330:1、340:1、350:1、360:1、370:1、380:1、390:1、400:1中的一种。

在本申请中，所述聚丙烯酸类树脂为大孔网状结构；所述聚丙烯酸类树脂与DPE通过共价键结合在一起。DPE的分子表面上的非必需基团与载体材料表面上的活性功能团在温和条件下形成共价键，降低了DPE分子从载体上脱落的概率，且对DPE分子活性中心影响较小。该方法能牢固地连接载体和DPE，具有良好的稳定性和可重复使用性。

在本申请中，所述酶载体为中性或弱碱性大孔树脂，优选为中性大孔树脂。

在本申请中，所述酶载体为聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为聚丙烯酸类大孔树脂。

在本申请中，所述酶载体可以为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂；所述酶载体还可以为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚苯乙烯类大孔树脂，优选为带有疏水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂。

所述酶载体可以具有以下基团中的一种或多种：羧酸基、羟基、磺酸基、磷酸基、氨基、铵基、烃基、酯基、聚氧丙烯基、长链全氟烷基、聚硅氧烷基。

在本申请中，所述酶载体可以为带有环氧基团或胺基基团的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，例如西安蓝晓的LXTE-606、LXTE-900、LX-1000EA、天津南开合成的ES-1、ESR-2、杭州创科的MC-300EP、ECR-1604等，优选为带有环氧基团的聚丙烯酸类大孔树脂。

环氧基大孔树脂表面的活性功能基团，可以在温和条件下与酶分子上的氨基、巯基和酚羟基等非必须基团发生多点共价键结合反应，将酶固定在树脂载体上，形成具有良好稳定性和酶催化活性的固定化酶。

所述胺基大孔树脂在使用前用戊二醛活化可以在其表面形成醛基，与酶分子表面的胺基发生反应形成Schiff碱，生成牢固的多点共价键合位点，从而形成稳定性良好的固定化酶。

在本申请中，所述DPE固定化酶的酶活为20U/g～60U/g，优选为35U/g～60U/g。

所述DPE固定化酶的酶活可以为20U/g、21U/g、22U/g、23U/g、24U/g、25U/g、26U/g、27U/g、28U/g、29U/g、30U/g、31U/g、32U/g、33U/g、34U/g、35U/g、36U/g、37U/g、38U/g、39U/g、40U/g、41U/g、42U/g、43U/g、44U/g、45U/g、46U/g、47U/g、48U/g、49U/g、50U/g、51U/g、52U/g、53U/g、54U/g、55U/g、56U/g、57U/g、58U/g、59U/g、60U/g中的一种。

本申请还提供一种DPE固定化酶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：DPE酶液的制备：发酵培养含DPE酶的菌株，离心收集菌体细胞，用pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体细胞，并用高压均质机破碎细胞，然后离心得到的上清液，即为DPE酶液。

上述菌株的来源，可以通过基因工程方法构建获得，也可以通过筛选获得，也可以通过购买获得，所述菌株，可以是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酿酒酵母等种属的任何含有DPE酶的菌株。

步骤二：将DPE酶液与酶载体混合，摇床振荡使得DPE被固定到酶载体上，摇床振荡后形成混合液，静置分层，弃去所述混合液的上层液体，取1.5～2.0倍酶载体体积的去离子水缓慢搅拌漂洗位于所述混合液下层的固体,将所述固体反复漂洗多次，直至上层液体澄清为止，去掉上清液，下层的固体即为DPE固定化酶。

所述DPE酶液的酶活为20～120U/ml，优选为25～100U/ml。即1ml DPE酶液中酶活为20～120U，优选为25～100U。

所述DPE酶液的酶活可以为20U/ml、21U/ml、22U/ml、23U/ml、24U/ml、25U/ml、26U/ml、27U/ml、28U/ml、29U/ml、30U/ml、31U/ml、32U/ml、33U/ml、34U/ml、35U/ml、36U/ml、37U/ml、38U/ml、39U/ml、40U/ml、41U/ml、42U/ml、43U/ml、44U/ml、45U/ml、46U/ml、47U/ml、48U/ml、49U/ml、50U/ml、51U/ml、52U/ml、53U/ml、54U/ml、55U/ml、56U/ml、57U/ml、58U/ml、59U/ml、60U/ml、61U/ml、62U/ml、63U/ml、64U/ml、65U/ml、66U/ml、67U/ml、68U/ml、69U/ml、70U/ml、71U/ml、72U/ml、73U/ml、74U/ml、75U/ml、76U/ml、77U/ml、78U/ml、79U/ml、80U/ml、81U/ml、82U/ml、83U/ml、84U/ml、85U/ml、86U/ml、87U/ml、88U/ml、89U/ml、90U/ml、91U/ml、92U/ml、93U/ml、94U/ml、95U/ml、96U/ml、97U/ml、98U/ml、99U/ml、100U/ml、105U/ml、110U/ml、115U/ml、120U/ml中的一种。

在本申请中，所述摇床振荡的时间为10～36h，优选为12～20h。

所述摇床振荡的时间可以为10h、12h、15h、20h、25h、30h、35h以及36h中的一种。

在本申请中，所述DPE酶液与酶载的混合后，摇床振荡反应的温度为15～35℃，优选为20～25℃。

所述摇床振荡反应的温度可以为15℃、20℃、25℃、30℃以及35℃中的一种。

在本申请中，洗涤所述混合液的下层固体的次数为2～8次，优选为3～5次。

洗涤所述混合液的下层固体的次数可以为2次、3次、4次、5次、6次、7次以及8次中的一种。

DPE酶液的酶活的测定：取1ml浓度为10g/L的果糖溶液，加入10μl稀释10倍的DPE酶液，恒温水浴55度反应20分钟，于沸水中煮沸5分钟灭酶，离心取上清液稀释5倍用高效液相色谱检测(HPLC检测)。

DPE固定化酶的酶活的测定：取10ml浓度为10g/L的果糖溶液，加入0.1～0.5g滤纸过滤后的DPE固定化酶，水浴摇床55℃恒温120rpm反应20min，吸取1ml上清溶液，沸水中煮沸5分钟灭酶，离心取上清液用HPLC检测并计算酶活。

DPE固定化酶酶活力单位U定义为：单位时间内产生1μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量。

HPLC检测条件如下：Agilent 1260高效液相色谱系统，Waters公司；Aminex HPX-87N色谱柱，Waters公司；Agilent示差折光检测器；柱温：80℃，流速：1mL/min；以经0.22μm孔径的醋酸纤维膜过滤后并超声脱气的纯水作为流动相。

所述菊粉也可以购买获得。

在本申请中，所述菊粉外切酶与所述菊粉的酶活质量比为50～300U/g，优选为100～200U/g；

所述菊粉外切酶的酶活为5000～25000U/g。

在本申请中，所述菊粉的水解温度为35～60℃，优选为40～55℃；水浴反应为1～6h，优选为3～5h。

菊粉外切酶的酶活测定：取900μl浓度为50g/L的果糖溶液，加入100μl浓度为10g/L的酶液，恒温水浴50度反应5分钟，于沸水中煮沸5分钟灭酶，离心取上清液稀释5倍用高效液相色谱检测(HPLC检测)。

菊粉外切酶酶活力单位U定义为：单位时间内产生1μmol的果糖所需要的酶量。

在本申请中，利用活性炭对菊粉外切酶的葡萄糖和果糖混合液进行脱色、除杂，控制真空度-0.09～-0.1MPa、温度50-55℃、进行减压浓缩，得到果葡糖浆浓缩液，取样测折光度即得到浓缩液总糖含量，用高效液相色谱检测糖浆中的果糖与葡萄糖含量。

在本申请中，所述果葡糖浆浓缩液的总糖浓度为200～750g/L，优选为650～750g/L。在所述果葡糖浆浓缩液中，所述葡萄糖与果糖比例为1：(6.0～9.0)，优选为1：(8.0～8.5)。此处葡萄糖与果糖的比例为质量比。

具体地，所述萄糖与果糖比例可以为1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9。

在本申请中，所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中含有D-阿洛酮糖、果糖以及葡萄糖，所述D-阿洛酮糖的含量为50～200g/L，优选为160～200g/L；所述果糖的含量为120～480g/L，优选为400～480g/L；所述葡萄糖的含量为20～110g/L，优选为60～85g/L。

在所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中，所述D-阿洛酮糖的含量可以为50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L、115g/L、120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L或200g/L。

在所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中，所述果糖的含量可以为120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、210g/L、220g/L、230g/L、240g/L、250g/L、260g/L、270g/L、280g/L、290g/L、300g/L、310g/L、320g/L、330g/L、340g/L、350g/L、360g/L、370g/L、380g/L、390g/L、400g/L、410g/L、420g/L、430g/L、440g/L、450g/L、460g/L、470g/L或480g/L。

在所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中，所述葡萄糖的含量可以为20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L。

本申请还提供一种通过上述方法制备的含D-阿洛酮糖的高果糖浆。

实施例

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1DPE酶液的制备

挑取含有DPE基因序列的重组大肠杆菌至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养；然后以1％的接种量接入装有3.5LLB培养基的5L发酵罐中，控制培养温度37℃、搅拌转速300rpm、通风比为1：0.5的条件下，培养至OD值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，调整转速至100rpm诱导培养15-16h。然以8000rpm离心收集菌体细胞、再用pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体、用高压均质机破碎细胞，然后在4℃、10000rpm离心得到的上清液，即为DPE酶液，取样测定DPE酶活。

实施例2.DPE固定化酶制备

选择DPE与酶载体的酶活质量比(U/g)250：1条件，分别称取9种酶载体各10g置于三角瓶中，根据DPE酶液的酶活检测结果，加入2500U的DPE酶液，混合均匀后，密封瓶口，于25℃摇床缓慢振荡20h，弃去上层液体，采用去离子水约20ml充分洗涤下层固体，弃去洗涤液，反复洗涤5次，即得到DPE固定化酶，取样检测DPE固定化酶酶活。结果如表1所示，以DPE固定化酶酶活比较，中性疏水型环氧基聚丙烯酸类大孔树脂，优于弱碱性疏水型胺基聚苯乙烯类大孔树脂，优于中性亲水型环氧基聚丙烯酸类大孔树脂，优于弱碱型亲水性胺基聚苯乙烯类大孔树脂。对于弱碱性胺基聚苯乙烯类大孔树脂，戊二醛活化后使用，DPE固定化酶明显提高。

表1.不同酶载体的DPE固定化酶酶活比较

注：RC07与RC04采用相同的酶载体，但是RC07的酶载体在放入三角瓶之前需要通过戊二醛活化；RC08与RC05采用相同的酶载体，但是RC08的酶载体在放入三角瓶之前需要通过戊二醛活化；RC09与RC06采用相同的酶载体，但是RC09的酶载体在放入三角瓶之前需要通过戊二醛活化。

实施例3.DPE酶与酶载体的酶活质量比优选

根据实施例2结果，分别称量载体RC01、RC02各10g置于三角瓶中，根据DPE酶液的酶活检测结果，分别按照酶活载体质量比(U/g)60：1、70：1、100：1、200：1、250：1、400：1，计算并加入相应酶活单位的DPE酶液，混合均匀后，密封瓶口，进行DPE固定化酶制备，固定化条件、洗涤方法和洗涤次数与实施例1相同，取样检测DPE固定化酶酶活。结果如表2，从表2可知，DPE与酶载体的酶活质量比在(60～250):1范围内时，两者的比例越高，DPE固定化酶的酶活越高，但当两者的比例由250：1提高到400：1时，DPE固定化酶的酶活不再显著提高，说明DPE与酶载体的酶活质量比大于250U/g时，载体上的活性功能基团与酶分子的结合趋于饱和，固定化酶的酶活不再显著增加，当DPE与酶载体的酶活质量比小于70U/g时，载体上的活性功能基团与DPE酶分子的结合效率低，载体利用不充分，DPE固定化酶的酶活较低，优选的DPE酶与酶载体的酶活质量比(U/g)为(100～250):1。

表2.DPE与酶载体的酶活质量比优选

实施例4.DPE固定化酶连续转化果糖底物浓度的选择

取树脂载体RC01制备的DPE固定化酶100ml装入带套管的玻璃制柱中，控制套管温度55℃，分别以200g/L、400g/L、650g/L、750g/L的果糖溶液为底物，控制进料流速40ml/h，进行DPE固定化酶连续转化，当反应平衡后，定时取样检测D-阿洛酮糖浓度及转化率，结果如图1所示，D-阿洛酮糖平均转化率均能达到29％以上。综合考虑，可以选取750g/L果糖底物浓度，进行固定化酶连续转化。

实施例5.果糖底物DPE固定化酶连续转化

取酶载体RC01、RC04制备的DPE固定化酶各100ml，分别装入2个带套管的玻璃反应器中，控制套管温度55℃，选取750g/L的果糖浓度，以40ml/h的流速，进行DPE固定化酶连续转化，当反应平衡后，定时取样检测D-阿洛酮糖浓度及转化率，直至转化率明显下降为止，计算连续转化反应时间。

结果如图2和图3所示，酶载体RC01制备的DPE固定化酶，连续转化14天，果糖平均转化率达到29.35％、转化液中D-阿洛酮糖的浓度达到220g/L以上(见图2所示)，第15天转化率大幅下降；酶载体RC04制备的DPE固定化酶，连续转化8天，果糖平均转化率达到28.02％、转化液中D-阿洛酮糖的浓度达到210g/L以上(见图3所示)，第9天转化率大幅下降。

实施例6含D-阿洛酮糖的果葡糖浆的制备

1、菊粉的制备

选取菊芋或菊苣块茎100g，洗净、切片，100℃加热10min、热水浸提、去除不溶性固体、80℃烘干，粉碎过筛制得80目菊粉。

2、葡萄糖与果糖混合液的制备

取2g菊粉溶于水中配成100ml的菊粉溶液置于三角瓶中，根据菊粉外切酶的酶活检测结果，分别按照菊粉外切酶与菊粉的酶活质量比(U/g)40：1、50：1、100：1、150：1、200:1、300：1，计算并加入相应酶活单位的菊粉外切酶(购于上海源叶生物科技有限公司)，混合均匀后，密封瓶口，控制恒温反应器的温度50℃、转速为120rpm、反应5h，得到葡萄糖与果糖的混合液，用HPLC检测并计算所述葡萄糖与果糖的混合液中各组分含量，结果如表3。

从表3可知，菊粉外切酶与菊粉的酶活质量比(U/g)在(40～250):1范围内时，两者的比例越高，葡萄糖与果糖混合液中果糖含量越高，当两者的比例低于50:1时，葡萄糖与果糖混合液中果糖尚未达到平衡浓度，当两者的比例由200：1提高到300：1时，葡萄糖与果糖混合液中果糖含量提高不显著，说明菊粉外切酶与菊粉的酶活质量比大于200U/g时，菊粉外切酶作用于菊粉的酶催化反应效率趋于饱和。

表3.葡萄糖与果糖混合溶液的制备

4、果葡糖浆浓缩液的制备

在菊粉外切酶与菊粉的酶活质量比(U/g)200：1条件下，按上述方法制备的葡萄糖与果糖混合液，在沸水中煮沸5分钟灭酶、降温至55℃，按0.2％～0.5％比例加入活性炭，混合均匀，恒温搅拌为15-20min，过滤除杂得到滤清液，控制真空度为-0.09～-0.1MPa、45～55℃条件下，减压浓缩，得到总糖含量为200g/L、650g/L、750g/L的果葡糖浆浓缩液。

5、含D-阿洛酮糖果葡糖浆的制备

将实施例2制备的载体编号为RC01的DPE固定化酶100ml置于带夹套的反应器中，分别将总糖含量为200g/L、650g/L、750g/L的果葡糖浆浓缩液采用上进下出的方式，控制进料流速40ml/h、料液温度55℃，使果葡糖浆浓缩液与DPE固定化酶进行连续转化反应，得到含D-阿洛酮糖、葡萄糖、果糖的混合糖浆，通过HPLC检测，与DPE固定化酶连续转化反应前后，果葡糖浆浓缩液中各组分含量变化如图4、图5、表4所示，糖浆浓缩液经过DPE固定化酶连续转化反应，糖浆浓缩液中果糖转化为D-阿洛酮糖的平均转换率可以达到29％以上。

表4.与DPE固定化酶连续转化反应前后，果葡糖浆浓缩液中各组分含量变化

实施例7

购买中粮集团的F55果葡糖浆(71％w/w)，量取1L的F55果葡糖浆，加水稀释为总糖浓度为750g/L的果葡糖浆。将实施例2制备的载体编号为RC01的DPE固定化酶100ml置于反应器中，采用上进下出的方式，控制进料流速40ml/h、料液温度55℃，使稀释后的F55果葡糖浆与DPE固定化酶进行反应，得到含D-阿洛酮糖、葡萄糖、果糖的混合糖浆，通过HPLC检测，D-阿洛酮糖含量为121.13g/L，葡萄糖含量为300.13g/L，果糖含量为291.53g/L。

小结：通过DPE固定化酶连续转化法制备的含D-阿洛酮糖的果葡糖浆，糖浆浓缩液中29％以上的果糖转化为D-阿洛酮糖，为制备降低果糖含量，增加功能性零热量健康糖的果葡糖浆，提供了一种解决方案。

尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

Claims

1.一种含D-阿洛酮糖的果葡糖浆制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将果葡糖浆浓缩液通过装有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶(DPE固定化酶)的反应器中进行连续转化，得到含有D-阿洛酮糖的果葡糖浆;

所述DPE固定化酶加入到带夹套的反应器中，控制夹套温度为40～60℃进行连续转化；

所述DPE固定化酶包括酶载体和DPE；

所述酶载体与DPE通过共价键结合在一起;

所述酶载体为中性带有疏水性骨架的带有环氧基的聚丙烯酸类大孔树脂；

所述果葡糖浆浓缩液的总糖浓度为200～750g/L；

在所述果葡糖浆浓缩液中，葡萄糖与果糖比例为1：（6.0～9.0）；

所述DPE与酶载体的酶活质量比（U/g）为(70～400):1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DPE固定化酶酶活为20U/g～60U/g。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DPE固定化酶酶活为35U/g～60U/g。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DPE与酶载体的酶活质量比（U/g）为(100～250):1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述果葡糖浆浓缩液的制备方法包括如下步骤：

以菊芋或菊苣来源的菊粉，通过菊粉外切酶水解得到果糖与葡萄糖的混合液；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉的制备方法包括如下步骤：选取新鲜菊芋、菊苣块茎，洗净、切片，100℃加热10min、热水浸提、去除不溶性固体、80℃烘干，粉碎过筛制得80目菊粉。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉通过菊粉外切酶水解得到果糖与葡萄糖的混合液；

所述菊粉外切酶与所述菊粉的酶活质量比为50～300U/g；

所述菊粉外切酶的酶活为5000～25000U/g。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉外切酶与所述菊粉的酶活质量比为100～200U/g。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉的水解温度为35～60℃；水解时间为1～6h。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉的水解温度为40～55℃。

11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉的水解时间为3～5h。

12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，利用活性炭对所述果糖与葡萄糖的混合液进行纯化除杂、减压浓缩，得到所述果葡糖浆浓缩液。

13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述果葡糖浆浓缩液的总糖浓度为650～750g/L。

14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述果葡糖浆浓缩液中，所述葡萄糖与果糖比例为1：（8.0～8.5）。

15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述DPE固定化酶加入到带夹套的反应器中，控制夹套温度为50～55℃进行连续转化。

16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述果葡糖浆浓缩液通过装有DPE固定化酶的反应器中连续转化时，每小时所述果葡糖浆浓缩液流量与DPE固定化酶装量比（ml/ml）为（0.3～1）：1。

17.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述果葡糖浆浓缩液通过装有DPE固定化酶的反应器中连续转化时，每小时所述果葡糖浆浓缩液流量与DPE固定化酶装量比（ml/ml）为（0.4～0.6）：1。

18.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中含有D-阿洛酮糖、果糖以及葡萄糖，所述D-阿洛酮糖的含量为50～200g/L；所述果糖的含量为120～480g/L；所述葡萄糖的含量为20～110g/L。

19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，在所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中，所述D-阿洛酮糖的含量为160～200g/L。

20.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，在所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中，所述果糖的含量为400～480g/L。

21.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，在所述含D-阿洛酮糖的果葡糖浆中，所述葡萄糖的含量为60～85g/L。