CN113423814A - 具有增强多巴胺分泌功能的新的罗伊氏乳杆菌atg-f4菌株以及包含所述菌株的用于预防或治疗精神病的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及罗伊氏乳杆菌ATG‑F4(Lactobacillus reuteri ATG‑F4)菌株(登记号：KCTC13717BP)。所述菌株具有增强多巴胺分泌的功能，可用于预防或减轻精神病例如记忆受损、抑郁障碍、广泛性焦虑症、双相障碍等以及帕金森病的药物组合物或健康功能性食品中，或者可用于非常有效地改善记忆或认知功能的组合物中。此外，所述菌株表现出上调白介素‑10(IL‑10)的表达以及抑制一氧化氮(NO)的产生的抗炎效力，且针对抗菌剂没有抗性，并且因此可容易地应用于具有健康改善效果的多种食品。

Description

具有增强多巴胺分泌功能的新的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株以 及包含所述菌株的用于预防或治疗精神病的药物组合物

技术领域

本公开内容涉及具有增强多巴胺分泌功能的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株(Lactobacillus reuteri ATG-F4，登记号：KCTC13717BP)以及包含所述菌株的用于预防或治疗精神疾病的组合物。

背景技术

肠-脑轴(gut-brain axis)是关于微生物与动物之间的共生的理论，其基于近年来关于肠微生物区系(gut microbiota)与精神健康之间相关性的研究(Cryan and Dinan,2012；Fung et al,2017)。这可影响由取决于肠中现有或新引入的微生物的组成、致病性、生态学特征、免疫学特征等的神经损伤引起的抑郁、孤独症、精神分裂症，以及甚至帕金森病和阿尔茨海默病。作用于上述肠脑轴中的认知区域和神经元的发病机制包括：基于肠微生物区系失调(dysbiosis)，1)由于肠的渗透性提高和炎症，血液LPS提高(Pistollato etal,2016)；2)由于血液炎症指标升高和肠免疫细胞异常分化，对神经的不良作用(Fung etal,2017)；3)由于某些细菌的优势，由血液中恶性蛋白质的积累引起的神经元凋亡(Dinanand Cryan,2015)等。

在这种背景下，对精神健康产生积极影响的益生菌微生物被称为精神益生菌(psychotropic probiotic)，引出了精神益生菌(psychobiotic)的概念，并且正在进行目标是实际应用精神益生菌以改善精神健康的多项研究(Dinan et al.,2013)。为了减轻与肠脑轴相关的精神疾病，可需要例如以下的作用：1)炎症抑制，2)维持和增强神经递质，以及3)有益于宿主健康的肠微生物区系的改变。

因此，本公开内容的发明人已确定：在有用的微生物中，一种新的微生物，即罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株，具有增强多巴胺的分泌以及恢复血清素的产生的功能，使得可使用上述菌株治疗精神疾病或改善精神健康，因此最终获得本公开内容。

[引用列表]

[专利文献]

(专利文件1)韩国专利No.10-0942290(标题：具有由泡菜乳酸菌发酵的大豆酸奶的抗疑病症组合物(Anti-hypochondria composition with soy yogurt fermented bykimchi lactic-acid bacteria)，申请人：DUDUWON CO.Ltd，登记日期：2010年2月5日)

(专利文件2)韩国专利申请公开No.10-2018-0060928(标题：使用新乳酸菌用于预防和治疗退行性脑病的组合物(Composition for preventing and treatingdegenerative brain disease using novel lactic-acid bacteria)，申请人：WedeaCom.，公开日期：2018年6月7日)

[非专利文献]

(非专利文件1)Cryan,J.F.,&Dinan,T.G.(2012).Mind-alteringmicroorganisms:the impact of gut microbiota on brain and behaviour.NatureReviews Neuroscience,13(10),701。

(非专利文件2)Dinan,T.G.,Stanton,C.,&Cryan,J.F.(2013).Psychobiotics:anovel class of psychotropic.Biological Psychiatry,74(10),720-726。

(非专利文件3)Dinan,T.G.,&Cryan,J.F.(2015).The impact of gutmicrobiota on brain and behaviour:implications for psychiatry.CurrentOpinions in Clinical Nutrition&Metabolic Care,18(6),552-558。

(非专利文件4)Fung,T.C.,Olson,C.A.,&Hsiao,E.Y.(2017).Interactionsbetween the microbiota,immune and nervous systems in health anddisease.Nature Neuroscience,20(2),145。

(非专利文件5)Pistollato,F.,Sumalla Cano,S.,Elio,I.,Masias Vergara,M.,Giampieri,F.,&Battino,M.(2016).Role of gut microbiota and nutrients inamyloid formation and pathogenesis of Alzheimer’s disease.Nutrition Reviews,74(10),624-634。

(非专利文件6)Barrett,E.,Kerr,C.,Murphy,K.,O’Sullivan,O.,Ryan,C.A.,Dempsey,E.M.,&Ross,R.P.(2013).The individual-specific and diverse nature ofthe preterm infant microbiota.Archives of Disease in Childhood-Fetal andNeonatal Edition,fetalneonatal-2012。

(非专利文件7)Baskerville,T.A.,&Douglas,A.J.(2010).Dopamine andoxytocin interactions underlying behaviors:potential contributions tobehavioral disorders.CNS neuroscience&therapeutics,16(3),e92-e123。

(非专利文件8)Desbonnet,L.,Clarke,G.,Shanahan,F.,Dinan,T.G.,&Cryan,J.F.(2014).Microbiota is essential for social development in themouse.Molecular psychiatry,19(2),146。

(非专利文件9)Dinan,T.G.,&Cryan,J.F.(2015).The impact of gutmicrobiota on brain and behaviour:implications for psychiatry.Current Opinionin Clinical Nutrition&Metabolic Care,18(6),552-558。

(非专利文件10)Fung,T.C.,Olson,C.A.,&Hsiao,E.Y.(2017).Interactionsbetween the microbiota,immune and nervous systems in health anddisease.Nature Neuroscience,20(2),145。

(非专利文件11)Johnson,K.V.A.,&Foster,K.R.(2018).Why does themicrobiome affect behaviour？Nature Reviews Microbiology,1。

(非专利文件12)EFSA Panel on Additives and Products or Substances usedin Animal Feed(FEEDAP).2012.Guidance on the assessment of bacterialsusceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance.EFSAJournal 10(6):2740。

(非专利文件13)Nievergelt C.M.,Kripke D.F.,Barrett T.B.,Burg E.,RemickR.A.,Sadovnick A.D.,McElroy S.L.,Keck Jr.P.E.,Schork N.J.,Kelsoe J.R.:Suggestive evidence for association of the circadian genes PERIOD3 and ARNTLwith bipolar disorder.American Journal of Medical Genetics Part B:Neuropsychiatric Genetics 2006,141:234-241。

(非专利文件14)Partonen T.,Treutlein J.,Alpman A.,Frank J.,JohanssonC.,Depner M.,Aron L.,Rietschel M.,Wellek S.,Soronen P.:Three circadian clockgenes Per2,Arntl,and Npas2 contribute to winter depression.Annals of Medicine2007,39:229-238。

(非专利文件15)Lauretti E.,Di Meco A.,Merali S.,Pratico D.:Circadianrhythm dysfunction:a novel environmental risk factor for Parkinson’sdisease.Molecular Psychiatry 2017,22:280。

(非专利文件16)Radwan B.,Liu H.,Chaudhury D.:The role of dopamine inmood disorders and the associated changes in circadian rhythms and sleep-wakecycle.Brain Research 2018。

(非专利文件17)Ayano G.Dopamine:Receptors,Functions,Synthesis,Pathways,Locations and Mental Disorders:Review of Literatures.Ayano,J.Ment.Disord.Treat.2016,2(2),1～4。

发明内容

技术问题

本公开内容的一个目的是提供具有增强多巴胺分泌功能的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株(登记号：KCTC13717BP)以及包含所述菌株的用于预防或治疗精神疾病的组合物。

技术方案

本公开内容的一个方面提供了具有增强多巴胺分泌功能的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株(登记号：KCTC13717BP)。

此外，罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株具有抗炎效力。

本公开内容的另一方面提供了用于预防或治疗精神疾病的药物组合物或者用于预防或改善精神疾病的功能性健康食品，其包含罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株或其培养物，其中所述精神疾病可选自：注意缺陷多动障碍、记忆障碍、抑郁障碍、广泛性焦虑症和双相障碍。

由于本公开内容的菌株或其培养物能够提高多巴胺的产生，因此其可以作为用于预防或治疗帕金森病的药物组合物或者用于预防或改善帕金森病的功能性健康食品提供。

另外，本公开内容的菌株或其培养物由于提高多巴胺分泌的活性，还易于用作用于改善记忆或认知功能的功能性健康食品。

功能性健康食品优选选自：饮品、肉、香肠、面包、糖果、零食

面条、冰淇淋、乳制品、汤、电解质饮料

饮用水、酒精饮料、口香糖、茶和维生素复合物。

在下文中，将给出本公开内容的详细描述。

根据本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株除了具有增强多巴胺分泌的功能之外，还具有抗炎效力，并且更优选地以上调IL-10(白介素-10)的表达和抑制NO(一氧化氮)的产生为特征，从而激活抗炎功能。

本公开内容的菌株针对选自以下的任何抗生素均不具有抗性：氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、克林霉素、红霉素、四环素和氯霉素。

另外，本公开内容可提供包含罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株或其培养物的药物组合物。该药物组合物有效预防、改善或治疗多种精神疾病，例如注意缺陷多动障碍、记忆障碍、抑郁障碍、广泛性焦虑症、双相障碍等，以及帕金森病。

可将罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株或其培养物以0.001至100wt％的量添加至本公开内容的药物组合物。

药物组合物可根据各典型方法被配制成经口剂型，例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂制剂，以及外用制剂、栓剂和无菌注射溶液剂。可包含在药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸类、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂通常可使用稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等)来制备。用于经口施用的固体制剂可包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这样的固体制剂可通过将本公开内容的菌株或其培养物与至少一种赋形剂(例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)混合来制备。除简单的赋形剂之外，可使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。经口液体制剂可包括混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂等，并且还可不仅包含简单的稀释剂，例如水或液体石蜡，而且还可包含多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂可包括无菌水性溶液剂、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水性溶剂或混悬剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质，可使用witepsol

聚乙二醇

吐温61、可可脂、月桂精酯、甘油明胶等。

当施用时，根据本公开内容的药物组合物的量可根据待治疗的对象的年龄、性别和体重，治疗的具体疾病或病理状况，疾病或病理状况的严重程度，施用途径以及开处方者的判断而有所不同。基于这些因素的剂量确定将由本领域技术人员容易地进行，并且剂量通常为0.01mg/kg/天至约2000mg/kg/天。优选地，剂量设定为1mg/kg/天至500mg/kg/天。施用可每天一次或每天数次地进行。剂量不以任何方式限制本公开内容的范围。

本公开内容的药物组合物可通过多种途径施用于哺乳动物，例如小鼠、家畜、人等。可考虑所有施用方式，并且本公开内容的药物组合物可例如通过经口、经直肠、静脉内、肌内、皮下、子宫内硬膜注射或脑血管内注射来施用。由于本公开内容的菌株毒性小且副作用最小，因此即使为了预防目的长时间服用也可以安全地使用。由于本公开内容的菌株具有小的毒性和最小的副作用，因此其是即使为了预防目的而长时间服用时也可安全使用的药物。

另外，本公开内容提供了功能性健康食品，其包含罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株或其培养物和食品可接受的食品添加剂。

功能性健康食品有效预防或改善多种精神疾病，例如记忆障碍、抑郁障碍、广泛性焦虑症、双相障碍等，以及帕金森病，并且还有效改善记忆和认知功能。

可将罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株或其培养物溶液以0.001至100wt％的量添加至本公开内容的功能性健康食品。本公开内容的功能性健康食品以片剂、胶囊剂、丸剂或液体剂的形式提供，并且可向其中添加本公开内容的菌株的食品的一些实例可包括饮品、肉、香肠、面包、糖果、零食、面条、冰淇淋、乳制品、汤、电解质饮料、饮用水、酒精饮料、口香糖、茶和维生素复合物。

由包含本公开内容的菌株或其培养物溶液的组合物诱导的治疗的概念具有广泛的概念，其中疾病由于摄入本公开内容的菌株或其培养物溶液而得以预防、减轻、改善或治疗。

有益效果

根据本公开内容，罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株(登记号：KCTC13717BP)具有增强多巴胺分泌的功能，并且因此可用作能够预防或改善精神疾病，例如注意缺陷多动障碍、记忆障碍、抑郁障碍、广泛性焦虑症、双相障碍等以及帕金森病的功能性健康食品，并且可用作用于改善记忆或认知功能的非常有效的组合物。此外，上述菌株具有上调IL-10(白介素-10)的表达和抑制NO(一氧化氮)的产生的抗炎效力，并且针对抗生素不具有抗性，并且因此可容易地应用于具有健康改善作用的多种食品。

附图说明

图1示出了：显示当使用罗伊氏乳杆菌ATG-F4在RAW 264.7细胞中用LPS诱导炎症时IL-10的产生提高的结果(图1A)，以及确定了由于由LPS诱导的炎性应答而抑制NO产生的作用的结果(图1B)；

图2示出了在施用罗伊氏乳杆菌ATG-F4或氨苄青霉素(Amp)4周的小鼠中，血清中多巴胺浓度(图2A)的提高和血清中血清素的维持(图1B)；

图3示出了小鼠模型微生物区系依赖于罗伊氏乳杆菌ATG-F4乳酸菌摄入之变化的分析结果(ABX：用抗生素处理的实验组，对照：未经处理的实验组，F4：用F4乳酸菌饲喂的实验组)；以及

图4示出了确定Per1(NM_001159367.2)、Per2(NM_011066.3)和Per3(NM_001289877.1)依赖于罗伊氏乳杆菌ATG-F4乳酸菌摄入之变化的结果，所述Per1、Per2和Per3是涉及小鼠昼夜节律的基因。

具体实施方式

通过以下实施例将获得对本发明的更好的理解。然而，本发明不限于这些实施例，并且可以以其他形式实施。提供这些实施例以彻底解释本发明并将本发明的精神充分地传达给本领域技术人员。

<实施例1.F4乳酸菌的分离和鉴定>

新生儿粪便(捐赠者：Baek*Hyun，出生于2018年5月23日，韩国Daejeon)是于2018年5月31日(出生之后第8天)捐赠的，并且将通过使用10倍系列稀释方法在0.9％盐水中稀释新生儿粪便而获得的所得产物铺在de Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培养基上，并在37℃下培养约48小时。

使用显微镜观察在培养的MRS培养基中形成的乳酸菌的菌落，并且选择未表现出过氧化氢酶反应的芽孢杆菌型乳酸菌，对其进行全基因组测序，并将其命名为F4。

F4菌株的16S rRNA测序由Solgent(Daejeon)进行。使用

作为测序用引物，总共进行四次核苷酸序列读取，并使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST在线工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)来分析通过每次读取的核苷酸序列比对获得的重叠群。

基于通过用NCBI的BLAST数据库进行的16S rRNA测序而获得的SEQ ID NO:1的核苷酸序列的比较结果，其16S rRNA序列与罗伊氏乳杆菌菌株IRT具有99.9％的同一性，表明其分类位置属于罗伊氏乳杆菌。

因此，将本公开内容的菌株命名为罗伊氏乳杆菌ATG-F4，并于2018年11月15日保藏在韩国典型培养物保藏中心(登记号：KCTC13717BP)。

SEQ ID NO:1：罗伊氏乳杆菌ATG-F4的16S rRNA序列

另外，进行API50 CH测试(BioMerieux，法国)，以通过糖发酵模式来研究鉴定和特征。简言之，将在10ml的API 50CHL培养基(BioMerieux，法国)中培养至纯的乳酸菌混悬，直到获得约0.5的吸光度OD₆₀₀，在此之后将培养物混悬液接种到API 50CH测试条(teststrip)的每个杯形托(cupule)中，并在37℃下培养。在接种之后24、48和72小时确认糖发酵的结果，并且其示于下表1中。

[表1]

基于对F4乳酸菌的糖降解能力的研究结果，观察到对D-阿拉伯糖、D-木糖、侧金盏糖醇、鼠李糖、肌醇、山梨糖醇、甲基-αD-吡喃葡萄糖苷、熊果苷、水杨苷、纤维二糖、龙胆二糖、L-阿拉伯醇和D-阿拉伯醇的弱阳性应答，并且观察到对L-阿拉伯糖、核糖、半乳糖、葡萄糖、七叶苷、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、L-岩藻糖和葡糖酸盐的阳性应答(在48小时内蓝色变为黄色)。展示了其降解总共25种糖的能力。

<实施例2.F4乳酸菌的抗生素安全性>

使用包括氨苄青霉素、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、克林霉素、红霉素、四环素和氯霉素在内的9种类型抗生素的E-测试条(E-test strip)(BioMerieux，法国)进行抗生素测试，以确定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。简言之，将待测试的乳酸菌各自混悬至约0.8的吸光度OD₆₀₀，并随后使用无菌棉签将其散布在MRS固体培养基上。将其上散布有乳酸菌的固体培养基干燥约3分钟，并将E-测试条置于其上，随后在37℃下培养约24至48小时。在此，由于乳酸菌的性质，可出现对氨基糖苷类的庆大霉素、卡那霉素和链霉素的固有抗性，并且因此，作为相应抗生素的测试培养基，使用了平板计数琼脂(plate-count agar，PCA)(Difco实验室，美国)或Mueller-Hinton琼脂(Mueller-Hinton agar，MHA)(Difco实验室，美国)。对于抗生素的类型和可被认为是安全的最低抑菌浓度的标准，参考了欧洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)发布的指南(动物饲料中使用的添加剂和产品或物质的EFSA小组，2012年)(EFSA Panel onAdditives and Products or Substances used in Animal Feed,2012)。

下表2示出了测量罗伊氏乳杆菌ATG-F4乳酸菌对主要抗生素的最低抑菌浓度(MIC)的实验结果，其中一起记录了各EFSA建议的极限值。根据结果，观察到抗生素敏感性显著低于EFSA指南中的极限，并且不存在交换具有抗生素抗性的基因的风险。

此外，如稍后将描述的，即使当通过PathoFinder使用全基因组信息预测F4乳酸菌的致病性时，基于与数据库比较的结果确定了F4乳酸菌是非人病原体，并且因此对人体无害(实施例6)。

[表2]

<实施例3.F4乳酸菌的抗炎作用的确定>

为了测量F4乳酸菌的抗炎作用，进行了使用细胞的细胞因子定量实验。将作为处理材料的F4乳酸菌在MRS肉汤中进行液体培养，并随后离心，在此之后回收菌株的细胞并将其浓缩10倍。将由此获得的浓缩溶液用溶菌酶处理1小时，通过声处理裂解，并随后通过固体含量分析进行定量。所使用的细胞是小鼠巨噬细胞系RAW264.7，并且每个细胞实验所使用的培养基是补充有10％胎牛血清(Gibco，美国)和1％青霉素/链霉素混合物(Sigma-Aldrich，德国)的

杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco Modified Eagle Medium)(DMEM，Gibco，美国)。回收在材料处理之前以约80％至90％汇合度培养的RAW264.7细胞，并以24孔板的每孔1×10⁶个细胞的量接种。接种之后，在37℃和5％CO₂的环境中进行培养，持续24小时，以实现对24孔板的黏附及其稳定化。所使用的实验组是：用浓度为100μg/ml的单独的F4乳酸菌裂解物处理的实验组、用1μg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide)(LPS，Sigma-Aldrich，德国)以及用F4乳酸菌裂解物二者处理的炎症诱导实验组、作为阳性对照的用1μg/ml LPS处理的实验组以及作为阴性对照的未用任何材料处理的实验组。在材料处理之后，将细胞在37℃和5％CO₂下培养24小时，并且回收细胞培养物溶液，然后使用小鼠IL-10Quantikine ELISA试剂盒(R&D systems，美国)进行抗炎细胞因子IL-10的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。为了确定在LPS诱导的组中是否抑制了作为另外的炎症指标的一氧化氮(nitric oxide，NO)的产生，将预定量的在用于测量细胞因子的细胞实验中获得的细胞培养物上清液转移到96孔中，并且向其注射100μl的Griess试剂(改良的，SIGMA，美国)，在此之后在室温下进行反应，持续10分钟，并使用ELISA读取器测量540nm处的吸光度。通过将存在于细胞培养物溶液中的NO的比例与作为对照的LPS处理的组进行比较，来计算所产生的NO的量。

根据结果，如图1中所示，与28.24pg/ml(其为没有任何处理的对照的IL-10产生)相比，当用单独的F4乳酸菌裂解物处理RAW 264.7时，IL-10以90.38pg/ml的量产生，并且因此认为被显著地诱导(图1A)。当诱导LPS炎性应答时，IL-10以166.60pg/ml的量产生，并且当同时添加F4乳酸菌裂解物时，IL-10以916.39pg/ml的量产生，其为约5.5倍高。可以看出，作为抗炎细胞因子IL-10抑制炎症的显著作用，NO的产生也显著降低LPS诱导的炎症至35.89％的水平(图1B)。

<实施例4.F4乳酸菌对在血液中诱导神经递质的作用>

在所有动物实验之前，由AtoGEN的机构动物护理和使用委员会(IACUC)通过适当的程序批准了动物实验并授予了批准号ATG-IACUC-REV-180810，并且遵循了伦理动物实验的指南。通过中央实验室动物(Seoul，韩国)购买了4周龄C57BL/6J小鼠，并且所使用的实验组为：饲喂普通饲料和饮用水的对照(Ctrl)、饲喂普通饲料和含有1g/l氨苄青霉素的饮用水的肠微生物区系失调实验组(Amp)以及饲喂普通饲料和含有约10⁷CFU/ml乳酸菌F4的饮用水的实验组(F4)。每个实验组使用五只小鼠。在使4周龄小鼠稳定1周之后，使用上述实验组进行实验，持续4周。整个实验独立重复两次。

在4周的饲喂实验之后，使用乙醚麻醉小鼠，并从其心脏获得血液。使由此获得的血液在室温下硬化1小时，并随后以2,500rpm离心20分钟以获得血清。使用多巴胺ELISA试剂盒(Abnova，中国台湾)和血清素ELISA试剂盒(Abcam，美国)来测量由此获得的血清，以确定血液中多巴胺和血清素的量。

作为分析在实验结束时回收的各实验小鼠的血清的结果，如图2中所示，确定了多巴胺在对照(Ctrl)中以2.95ng/ml，在肠微生物区系失调组(Amp)中以2.09ng/ml，以及在饲喂F4乳酸菌的组(F4)中以5.43ng/ml的量产生，基于此，在Ctrl和Amp之间没有显著差异，但是与Ctrl和Amp相比，在F4中，多巴胺的产生显著提高至约3倍(图2A)。此外，测量的血清素的量在Ctrl中为3537.2ng/ml，在Amp中为2365.0ng/ml，并且在F4中为3413.3ng/ml，基于此，在与饲喂抗生素的组相比认为是显著更高的Ctrl和F4之间没有显著差异(图2B)。可以确定，与Ctrl和F4相比，在Amp中由于肠微生物区系失调，血清素的量显著降低。

<实施例5.由F4乳酸菌诱导的肠微生物区系的变化>

在实施例4中进行的动物实验中，通过将各实验组的小鼠放置在单独的笼中30分钟，新鲜地收集各实验组中每个个体的粪便，并将其立即在-80℃下冷冻。使用MacrogenInc.的Miseq平台，从提取自冷冻样品的宏基因组DNA获得16S rRNA的V3至V4区的扩增子序列，并由此分析了由于F4乳酸菌而引起的肠微生物区系的变化。

根据结果，如图3中所示，为了比较由于F4乳酸菌而引起的肠微生物区系的变化，当比较分为抗生素处理的组(ABX，饮用水含有1g/l氨苄青霉素)、未经处理的组(对照)以及用F4乳酸菌处理的组(F4)的组(每组5只小鼠)时，确定了用F4菌株处理的组显著提高了拟杆菌(Bacteroidetes)(浅蓝色)的量并抑制了变形菌(Proteobacteria)(紫色)的量，从而表现出改变肠微生物区系的益生菌作用。另外，当与对照相比时，在饲喂F4的所有小鼠中观察到厚壁菌(Firmicutes)(橙色)的明显变化。

<实施例6.F4乳酸菌的全基因组分析>

对于F4乳酸菌的全基因组分析，提取了基因组DNA，并使用Pacific Bioscience的单分子实时(Single-Molecule Real-Time，SMRT)测序技术分析了其核苷酸序列。使用SMRT分析软件v2.3.0的分级基因组装配过程(Hierarchical Genome Assembly Process，HAGP)2协议来装配由此获得的核苷酸序列数据，并且利用使用子系统技术的快速注释(RapidAnnotation using a Subsystem Technology，RAST)服务器(http://rast.nmpdr.org/)进行注释。另外，进行平均核苷酸同一性(Average Nucleotide Identity，ANI)分析以确定与先前已知的罗伊氏乳杆菌菌株的相似性，并使用PathoFinder 1.1(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PathogenFinder/)从遗传信息中再次验证了安全性。

基于对以该方式鉴定的F4乳酸菌的基因组信息与2018年11月作为完整基因组序列注册的罗伊氏乳杆菌属的12种菌株进行比较的结果，所有基因组大小均不同，并且ANI分析的结果显示出0.01至4.66％的差异，表明本公开内容的菌株是独立于现有菌株的菌株(表3)。

[表3]

另外，当基于注释信息对编码序列进行分类时，确定了本公开内容的菌株具有与碳水化合物转运和代谢相关的112个基因以及与细胞壁、膜和包膜(envelope)生物发生相关的81个基因，并且因此表现出益生菌效力(表4)。

[表4]

预测的功能	基因数
		翻译、核糖体结构和生物发生	138
RNA加工和修饰	0
		转录	109
复制、重组和修复	214
		染色质的结构与动力学	0
细胞周期控制、细胞分裂、染色体分区	19
		核结构	0
防御机制	34
		信号转导机制	48
细胞壁/膜/包膜生物发生	81
		细胞运动性	4
细胞骨架	0
		胞外结构	0
胞内移行、分泌和膜泡运输	20
		翻译后修饰、蛋白质更新、分子伴侣	49
能量产生和转换	72
		碳水化合物转运和代谢	112
氨基酸转运和代谢	136
		核苷酸转运和代谢	82
辅酶转运和代谢	78
		脂质转运和代谢	43
无机离子转运和代谢	71
		次生代谢物的生物合成、转运和分解代谢	17
仅一般功能预测	197
		未知的功能	469

<实施例7.涉及昼夜节律的基因的变化的确定>

在实施例4中进行的实验中，获得各实验组的小鼠的小肠，并使用RNA-seq技术从其中提取mRNA，在此之后使用Macrogen Co.Ltd的Novaseq平台测量涉及昼夜节律的基因的表达变化。

如图4中所示，与对照(Ctrl)和经氨苄青霉素处理的组(Amp)相比，在F4乳酸菌中，涉及昼夜节律的基因Per1(NM_001159367.2)、Per2(NM_011066.3)和Per3(NM_001289877.1)显著上调。

对于这些基因，已经报道了昼夜节律对与人中的Per1(NM_002616.3)、Per2(NM_022817.3)和Per3(NM_001289861.1)相关的抑郁、孤独症和帕金森病具有多种心理影响(Nievergelt et al.,2006；Partonen et al.,2007；Lauretti et al.,2017)，并且此外，还报道了昼夜节律与与多巴胺产生相关的情感障碍(涵盖多种精神障碍)相关(Radwan etal.,2018)。

总之，可以推断F4乳酸菌增强了昼夜节律，并且与之相关的多巴胺的产生提高，表明F4乳酸菌可最终应用于认知和神经疾病。

通过如上所述的实施例1至7的实验，根据本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4乳酸菌作为精神益生菌的特征在于：具有1)抗炎作用，2)提高血液中多巴胺的量的作用，以及3)健康的肠微生物区系提高。抗炎作用全身性地表现，并且特别是在预防消化器官的黏附提高和体内毒性物质的吸收方面以及还在表现出全身性作用方面发挥作用，因此使得能够抑制与神经元相关的免疫细胞的过度活动(Fung et al.,2017)。多巴胺是情绪发展的重要神经递质，影响与幸福和生活质量相关的其他神经递质，例如血清素、缩宫素等，并且与压力抗性相关(Baskerville and Douglas,2010)，以及还与注意缺陷多动障碍(ADHD)相关(Ayano,2016)。

在该方面，来自学术界的观点是神经递质(例如多巴胺和血清素)与肠微生物之间的关系的直接和间接积极作用已演变为共生状态(Johnson and Foster,2018)。在肠微生物区系的变化中，拟杆菌的量显著提高，这被认为是肠微生物区系的健康变化。对于患有精神疾病的个体中拟杆菌的量的降低以及降低的拟杆菌/厚壁菌的比，已经报道了肠微生物区系的变化与精神障碍(例如孤独症、抑郁等)的发生密切相关(Barrett et al.,2013；Desbonnet et al.,2014；Dinan and Cryan,2015；Fung et al.,2017)。

因此，认为本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4乳酸菌通过上述三个作用表现出精神益生菌的特性。特别地，认为通过饲喂罗伊氏乳杆菌ATG-F4乳酸菌在体内提高多巴胺的分泌是一项卓越的发现。

<制剂实施例1.食品的制备>

制剂实施例1-1.烹饪调味料的制备

通过将1wt％的本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株添加至烹饪调味料来制备用于健康改善的烹饪调味料。

制剂实施例1-2.小麦面粉食品的制备

通过将0.1wt％的本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株添加至小麦面粉以提供混合物，随后将混合物制成面包、蛋糕、曲奇饼

饼干

和面条来制造用于健康改善的食品。

制剂实施例1-3.乳制品的制备

使用含有0.1wt％的本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株的乳制备多种乳制品，例如黄油和冰淇淋。

制剂实施例1-4.蔬菜汁的制备

通过将0.5g本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株添加至1,000ml的番茄汁或胡萝卜汁来制备用于健康改善的蔬菜汁。

制剂实施例1-5.果汁的制备

通过将0.1g本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株添加至1,000ml的苹果汁或葡萄汁来制备用于健康改善的果汁。

<制剂实施例2.药物组合物的制备>

通过将0.1g本公开内容的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株的冻干粉末与0.5g的乳糖混合以提供混合物，随后将混合物放置在胶原胶囊中来制备胶囊制剂。

[保藏机构]

保藏机构的名称：韩国典型培养物保藏中心

登记号：KCTC13717BP

登记日期：20181115

序列表

<110> AtoGen Co., Ltd

<120> 刺激多巴胺分泌的新的罗伊氏乳杆菌ATG-F4，包

含所述菌株的用于预防或治疗精神疾病的组合物

<160> 1

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1523

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）

<400> 1

tcaggatgaa cgccggcggt gtgcctaata catgcaagtc gtacgcactg gcccaactga 60

ttgatggtgc ttgcacctga ttgacgatgg atcaccagtg agtggcggac gggtgagtaa 120

cacgtaggta acctgccccg gagcggggga taacatttgg aaacagatgc taataccgca 180

taacaacaaa agccgcatgg cttttgtttg aaagatggct ttggctatca ctctgggatg 240

gacctgcggt gcattagcta gttggtaagg taacggctta ccaaggcgat gatgcatagc 300

cgagttgaga gactgatcgg ccacaatgga actgagacac ggtccatact cctacgggag 360

gcagcagtag ggaatcttcc acaatgggcg caagcctgat ggagcaacac cgcgtgagtg 420

aagaagggtt tcggctcgta aagctctgtt gttggagaag aacgtgcgtg agagtaactg 480

ttcacgcagt gacggtatcc aaccagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 540

taatacgtag gtggcaagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt 600

gcttaggtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccgaagaa gtgcatcgga aaccgggcga 660

cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg 720

gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct ggtctgcaac tgacgctgag gctcgaaagc 780

atgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctagg 840

tgttggaggg tttccgccct tcagtgccgg agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 900

gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 960

tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tgcgctaacc 1020

ttagagataa ggcgttccct tcggggacgc aatgacaggt ggtgcatggt cgtcgtcagc 1080

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtt actagttgcc 1140

agcattgagt tgggcactct agtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggacg 1200

acgtcagatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacggtaca 1260

acgagtcgca aactcgcgag agtaagctaa tctcttaaag ccgttctcag ttcggactgt 1320

aggctgcaac tcgcctacac gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1380

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt ttgtaacgcc 1440

caaagtcggt ggcctaacct ttatggaggg agccgcctaa ggcgggacag atgactgggg 1500

tgaagtcgta acaggaaacc ccg 1523

PCT/RO/134表

Claims (12)

1.具有增强多巴胺分泌功能的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株(Lactobacillus reuteriATG-F4，登记号：KCTC13717BP)。

2.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌ATG-F4菌株，其中所述菌株具有抗炎效力。

3.用于预防或治疗精神疾病的药物组合物，其包含权利要求1所述的菌株或其培养物。

4.权利要求3所述的药物组合物，其中所述精神疾病选自：注意缺陷多动障碍、记忆障碍、抑郁障碍、广泛性焦虑症和双相障碍。

5.用于预防或改善精神疾病的功能性健康食品，其包含权利要求1所述的菌株或其培养物。

6.权利要求5所述的功能性健康食品，其中所述精神疾病选自：注意缺陷多动障碍、记忆障碍、抑郁障碍、广泛性焦虑症和双相障碍。

7.权利要求5所述的功能性健康食品，其中所述功能性健康食品选自：饮品、肉、香肠、面包、糖果、零食、面条、冰淇淋、乳制品、汤、电解质饮料、饮用水、酒精饮料、口香糖、茶和维生素复合物。

8.用于预防或治疗帕金森病的药物组合物，其包含权利要求1所述的菌株或其培养物。

9.用于预防或改善帕金森病的功能性健康食品，其包含权利要求1所述的菌株或其培养物。

10.权利要求9所述的功能性健康食品，其中所述功能性健康食品选自：饮品、肉、香肠、面包、糖果、零食、面条、冰淇淋、乳制品、汤、电解质饮料、饮用水、酒精饮料、口香糖、茶和维生素复合物。

11.用于改善记忆或认知功能的功能性健康食品，其包含权利要求1所述的菌株或其培养物。

12.权利要求11所述的功能性健康食品，其中所述功能性健康食品选自：饮品、肉、香肠、面包、糖果、零食、面条、冰淇淋、乳制品、汤、电解质饮料、饮用水、酒精饮料、口香糖、茶和维生素复合物。

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