CN113412786A - 一种促进葫芦子叶再生的培养基及其应用 - Google Patents

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宋慧
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Abstract

本发明公开了一种促进葫芦子叶再生的培养基，包括下述成分：MS培养基、终浓度为1.0mg/ml的6‑BA、终质量分数为3％的蔗糖和终质量分数为0.68％的琼脂；其中，6‑BA为PhytoTech Lab品牌的6‑BA；以该培养基进行子叶再生，方法包括：无菌苗培养、切割和组织培养。该培养基提高了子叶再生芽的数量。

Description

一种促进葫芦子叶再生的培养基及其应用
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体地说是涉及一种促进葫芦子叶再生的培养基及其应用。
背景技术
葫芦，又名瓠瓜、瓠子、扁蒲，是葫芦科葫芦属一年生草本植物。葫芦根系发达，下胚轴粗壮，不空心，适用于西瓜、甜瓜和黄瓜等瓜类作物的砧木，以克服生产中的连作障碍。葫芦砧木与其他瓜类作物共生亲和性强，成活率高，是研究瓜类嫁接亲和特性的模式作物。同时，葫芦也是研究植物开花与性别分化的模式植物。欲利用遗传转化手段，研究葫芦重要性状，首先需要建立高频的再生系统。
子叶是众多植物高频再生的主要外植体，但是葫芦子叶再生困难，属于组织培养顽拗型作物。多有学者利用葫芦叶芽进行培养。叶芽已经是分化成熟的器官，容易再生，但是不利于转化。培养基成分是植物再生系统的重要组成部分，目前，大多数学者仅将侧重点放在培养基的组分上，但是，其实子叶的切割方式在很大程度上决定着子叶伤口的分布形态，进而影响子叶再生；而目前，还没有相关人员对子叶的切割方式进行研究以促进葫芦子叶的再生。
因此，如何提供一种促进葫芦子叶再生的子叶切割方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种促进葫芦子叶再生的培养基，并将该培养基应用于促进葫芦子叶再生中，提高了子叶再生芽的数量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种促进葫芦子叶再生的培养基，包括下述成分：1×MS培养基、终浓度为1.0mg/ml的6-BA、终质量分数为3％的蔗糖和终质量分数为0.68％的琼脂；其中，6-BA为PhytoTechLab品牌的6-BA。
所述的促进葫芦子叶再生的培养基在促进葫芦子叶再生中的应用。
一种促进葫芦子叶再生的方法，包括下述步骤：
1)无菌苗培养：选择饱满的葫芦种子，剥除种皮，对种仁杀菌，并接入琼脂培养基中，暗培养3-5天，获得无菌苗；
2)切割：将步骤1)所得无菌苗进行切割，获得外植体；
3)组织培养：将步骤2)所得外植体接入再生培养基中培养，每隔7天进行一次换代培养，培养40天，得葫芦子叶再生芽。
作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述对种仁杀菌为先以浓度为2％的次氯酸钠灭菌10-15min，再以无菌水清洗3次，每次清洗5min。
作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述琼脂培养基包括：琼脂粉0.5-0.8g和水100ml。
作为本发明优选的技术方案，步骤2)中所述切割包括下述过程：
21)固定葫芦无菌苗胚根，并切去子叶顶部叶缘，切去部分约占子叶长度的1/6；
22)在步骤1)的基础上，切去子叶两侧叶缘，切去部分约占子叶宽度的1/6；
23)在步骤2)的基础上，切去子叶基部和叶芽部分，切去部分约占子叶长度的1/6，剩下的部分即为子叶外植体；
24)沿着平行和垂直子叶主叶脉的方向，将子叶外植体平均分为4块子叶外植体，完成子叶的切割。
作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述外植体接入再生培养基时的初始密度为25个外植体/培养基；待培养两周后，将接种密度调整为15个外植体/培养基。
作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述培养的条件为温度25±1℃、光照强度3000lux、光照/黑暗周期16h/8h。
与现有技术相比，本发明公开提供了一种葫芦子叶的培养基和培养方法，本发明限定了6-BA的种类具体为PhytoTech Lab品牌的6-BA，由于葫芦属于子叶再生顽拗型作物，其他品牌的6-BA都不可促进子叶再生，只有PhytoTech Lab品牌的6-BA可以有效促进子叶的再生，因此，本发明将特定的子叶切割方式和6-BA联合应用于葫芦子叶再生的培养中，显著提高了子叶再生率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为子叶切割示意图；
图2附图为葫芦子叶再生芽示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种促进葫芦子叶再生的方法，包括下述步骤：
1)无菌苗培养：选择颗粒饱满、大小一致的葫芦种子30粒，手工剥除外种皮，留下种仁，种仁经2％次氯酸钠灭菌10min，无菌水清洗3次(5分钟/次)，接入0.6％琼脂培养基，接种密度为10个种仁/培养皿，黑暗条件下培养3天，获得葫芦无菌苗。此时的葫芦子叶为鹅黄色，尚未展开；
2)按照图1所示，切割葫芦的两片子叶，得到8个子叶外植体/无菌苗，合计240个子叶外植体；切割方式具体为：
21)固定葫芦无菌苗胚根，并切去子叶顶部叶缘；
22)在步骤1)的基础上，切去子叶两侧叶缘；
23)在步骤2)的基础上，切去子叶基部和叶芽部分，剩下的部分即为子叶外植体；
24)沿着平行和垂直子叶主叶脉的方向，将子叶外植体平均分为4块子叶外植体，完成子叶的切割；
3)以25个子叶外植体/培养皿接种于葫芦高频再生培养基中，包括MS培养基、终浓度为1.0mg/ml的6-BA、终质量分数为3％的蔗糖和终质量分数为0.6％的琼脂；其中，6-BA为PhytoTech Lab品牌的6-BA；培养条件为：温度(25±1)℃，光照强度3000lux，16h/8h(光照/黑暗)光周期；每隔7天换代培养；培养两周后，子叶外植体体积增大，接种密度逐步调整为15个子叶外植体/培养皿；培养40天后，葫芦子叶再生芽出现(见图2)。统计外植体再生率、再生芽/子叶块的最大值和平均值，结果如表1；
表1葫芦子叶再生芽统计
Figure BDA0003120085470000041
不使用本发明的切割方式和PhytoTech Lab品牌的6-BA，即不切去叶缘，使用国药集团化学试剂6-BA，按照实施例1，外植体的再生率、再生芽/子叶块的最大值和平均值见表2；
表2南瓜子叶再生芽统计
Figure BDA0003120085470000042
由表1和表2可知，本发明的切割方式和PhytoTech Lab品牌的6-BA可以显著促进葫芦子叶的再生。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种促进葫芦子叶再生的培养基，其特征在于，包括下述成分：MS培养基、终浓度为1.0mg/ml的6-BA、终质量分数为3％的蔗糖和终质量分数为0.68％的琼脂；其中，6-BA为PhytoTechLab品牌的6-BA。
2.权利要求1所述的促进葫芦子叶再生的培养基在促进葫芦子叶再生中的应用。
3.一种促进葫芦子叶再生的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)无菌苗培养：选择饱满的葫芦种子，剥除种皮，对种仁杀菌，并接入琼脂培养基中，暗培养3-5天，获得无菌苗；
2)切割：将步骤1)所得无菌苗进行切割，获得外植体；
3)组织培养：将步骤2)所得外植体接入再生培养基中培养，每隔7天进行一次换代培养，培养40天，得葫芦子叶再生芽。
4.根据权利要求3所述的一种促进葫芦子叶再生的方法，其特征在于，步骤1)中，所述对种仁杀菌为先以浓度为2％的次氯酸钠灭菌10-15min，再以无菌水清洗3次，每次清洗5min。
5.根据权利要求3所述的一种促进葫芦子叶再生的方法，其特征在于，步骤1)中，所述琼脂培养基包括：琼脂粉0.5-0.8g和水100ml。
6.根据权利要求3所述的一种促进葫芦子叶再生的方法，其特征在于，步骤2)中所述切割包括下述过程：
21)固定葫芦无菌苗胚根，并切去子叶顶部叶缘，切去部分约占子叶长度的1/6；
22)在步骤1)的基础上，切去子叶两侧叶缘，切去部分约占子叶宽度的1/6；
23)在步骤2)的基础上，切去子叶基部和叶芽部分，切去部分约占子叶长度的1/6，剩下的部分即为子叶外植体；
24)沿着平行和垂直子叶主叶脉的方向，将子叶外植体平均分为4块子叶外植体，完成子叶的切割。
7.根据权利要求3所述的一种促进葫芦子叶再生的方法，其特征在于，步骤3)中，所述外植体接入再生培养基时的初始密度为25个外植体/培养基；待培养两周后，将接种密度调整为15个外植体/培养基。
8.根据权利要求3所述的一种促进葫芦子叶再生的方法，其特征在于，步骤3)中，所述培养的条件为温度25±1℃、光照强度3000lux、光照/黑暗周期16h/8h。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003057889A1 (en) * 2002-01-09 2003-07-17 Nexgen Biotechnologies, Inc. Method for preparing transformed cucumis sativus
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CN109566420A (zh) * 2019-01-31 2019-04-05 江苏省农业科学院 一种葫芦的组培快繁方法

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