CN113398118A

CN113398118A - 海恩酮在制备治疗弓形虫感染疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN113398118A
Application number: CN202110711355.1A
Authority: CN
Inventors: 张继瑜; 邱燕华; 翟斌涛; 王玮玮; 周绪正; 李冰; 杨枭荣; 魏小娟; 程富胜; 尚小飞
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2021-09-17

Abstract

本发明涉及寄生虫病防治技术领域，提供了海恩酮在制备治疗弓形虫感染疾病药物中的应用。本发明发现硫氧杂蒽类化合物海恩酮对不同基因型的强毒或弱毒弓形虫均具有显著的抑制活性，能够抑制弓形虫的增殖，试验发现海恩酮作用细胞内的弓形虫24h后，弓形虫的存活率仅为14.57％，优于现有的治疗弓形虫的药物乙胺嘧啶。本发明开拓了海恩酮的用药谱，为弓形虫急性和慢性感染的治疗提供了一种有效且副作用低的药物，应用前景良好。

Description

海恩酮在制备治疗弓形虫感染疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及寄生虫病防治技术领域，特别是弓形虫防治领域，具体提供了海恩酮在制备治疗弓形虫感染疾病药物中的应用。

背景技术

弓形虫病是一种由刚地弓形虫引起的专性胞内寄生原虫病。刚地弓形虫能感染包括人在内的所有温血动物，甚至是一些冷血动物，并且能寄生于动物机体的所有有核细胞内。而且弓形虫病的传播途径广泛，宿主主要可通过饮食、垂直传播、器官移植和输血等方式感染。在免疫力强的个体中，弓形虫病通常不表现出症状，或者是轻度的自限性感染。然而，在免疫系统不发达的胎儿和新生儿或在HIV和其它具有细胞免疫力下降的疾病使免疫系统受损的情况下，弓形虫病可能会危及生命。弓形虫病能严重影响人类、家畜和野生动物的健康，被视为一种严重威胁。

近年来，虽然在诊断、流行病学和病原学等方面取得了巨大进展，但在治疗方面几乎没有取得新的进展。由于弓形虫生命周期的复杂性、发病机制的多样性和生物学特性的差异性，现在尚无预防和特异性的药物治疗。尽管乙胺嘧啶和磺胺嘧啶的联合用药是目前治疗弓形虫病的黄金标准，但治疗往往伴随着严重的副作用，并且治疗不彻底，易复发。

海恩酮(Hycanthone)是噻吨酮类的DNA嵌入剂(DNA intercalator)，可抑制RNA合成以及DNA拓扑异构酶I和II。海蒽酮是一种已退役的药物，以前用于治疗由曼氏血吸虫和血吸虫感染引起的血吸虫病，但因其耐药性和不良特性目前已停止使用。虽然海蒽酮是一种退役药物，但不影响其作为无禁忌症衍生化合物设计的来源，即作为先导化合物。目前，正在研究海恩酮重新用于铂类癌症化疗药物的协同联合治疗。血吸虫又称裂体吸虫；扁形动物门，吸虫纲，复殖目，裂体科。寄生于人体的有日本血吸虫(日本裂体吸虫)、埃及血吸虫和曼氏血吸虫3种；血吸虫寄生于人畜体内的门静脉系统，可引起血吸虫病。

弓形虫隶属于顶端复合物亚门，孢子虫纲，球虫亚纲，真球虫目，艾美耳亚目，弓形虫科，弓形虫属(Toxoplasma)。弓形虫属下只有一个种，为刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)，常称为弓形虫。但根据不同地域,不同宿主、不同毒力、生活史及其发育时间不同等，可将其分为三种不同的基因型，Ⅰ型(RH和GT-1株)、Ⅱ型(ME49和Pru株)与Ⅲ型(CEP和VEG株)，弓形虫为细胞内寄生性原虫。弓形虫和血吸虫虽同为可以寄生人体的寄生虫，但在生活史、发病机制、生物特性、传播途径等各方面都大相径庭，血吸虫为胞外寄生虫，胞内寄生虫比胞外寄生虫更难清除，危害更严重，因为胞内寄生虫寄生于细胞内，破坏宿主细胞。胞内寄生虫普遍存在的技术难题就是需要尽可能保证宿主细胞完整、不伤害宿主细胞的同时将细胞内的寄生虫清除。

发明内容

本发明的目的是提供海恩酮的新用途。本发明在研究过程中发现，抗血吸虫的药物海恩酮对于胞内寄生原虫弓形虫也有显著的抑制活性。

第一方面，本发明提供了含有海恩酮的组合物在制备治疗弓形虫感染疾病药物中的应用。

本发明提供了含有海恩酮的组合物在制备抑制弓形虫增殖、或抑制弓形虫裂解细胞能力的药物中的应用。

本发明提供了含有海恩酮的组合物在制备预防弓形虫感染的药物中的应用。

第二方面，本发明提供了海恩酮在制备治疗弓形虫感染疾病药物中的应用。

本发明提供了海恩酮在制备抑制弓形虫增殖、或抑制弓形虫裂解细胞能力的药物中的应用。

本发明提供了海恩酮在制备预防弓形虫感染的药物中的应用。

本发明提供了海恩酮在提高对弓形虫杀虫效率中的应用。该应用为非疾病治疗目的，或疾病治疗目的。

上述应用中，海恩酮的用量为2-6μg/mL，优选4μg/mL。

上述应用中，本发明发现在弓形虫的速殖子期施用海恩酮或含海恩酮的组合物对弓形虫的抑制生长效果最好。

所述弓形虫为I型基因型、II型基因型、和/或III型基因型弓形虫。优选地，为Ⅰ型(RH和GT-1株)、Ⅱ型(ME49和Pru株)与Ⅲ型(CEP和VEG株)。

本发明首次发现硫氧杂蒽类化合物海恩酮对弓形虫具有显著抑制活性，可以用于治疗弓形虫病，海恩酮的抗弓形虫增殖作用和对弓形虫裂解周期的影响甚至优于现在临床所用的药物乙胺嘧啶。海恩酮作用细胞内的弓形虫24后，弓形虫的存活率仅为14.57％，优于10μg/mL的乙胺嘧啶，并且海恩酮对弓形虫的作用呈剂量依赖性，说明浓度越高抗虫效果越佳。海恩酮不仅对Ⅰ型强毒株RH-2F有显著的抑制作用，还对Ⅱ型弱毒株Pru有显著的抑制作用，提示海恩酮不仅对急性弓形虫病有效，还可能对于弓形虫的慢性感染也有效。

附图说明

图1为不同浓度海恩酮对细胞外RH-2F速殖子的抑制作用效果图。

图2为不同浓度海恩酮对Vero细胞的细胞毒性试验效果图。

图3为海恩酮对细胞内RH-2F的抗增殖作用。

图4为海恩酮对细胞内的弓形虫Pru的抗增殖作用。

图5为海恩酮的噬斑试验图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

细胞及虫株来源：非洲绿猴肾细胞(Vero)购自中国科学院细胞库；弓形虫RH-2F购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)；弓形虫Ⅰ型虫株RH和Ⅱ型虫株Pru速殖子本领域常规公知材料，其中RH-2F是表达了β-半乳糖苷酶的弓形虫RH株，Ⅰ型虫株RH是强毒株，致死率较高，一般发生急性感染；而Ⅱ型Pru是弱毒株，毒力相对较弱，一般经过急性感染期后在组织内形成包囊而转为慢性感染。

细胞的培养以及三种弓形虫虫株的传代方法：Vero细胞培养于含10％FBS、1％NEAA、1％Glutamax、1％Sodium pyruvate和1％双抗的DMEM培养基中。3种虫株用含3％FBS的DMEM培养基于Vero细胞中培养和传代。弓形虫多数溢出细胞时用细胞刮把细胞刮下，27G针头反复抽吸两次，200×g离心5min后用5μm孔径的滤膜过滤上清，1500×g离心10min后获得纯化后的速殖子，速殖子用培养基重悬，台盼蓝染色，血细胞计数板计数后用于后续试验与传代。

实施例1生物化学发光法测定海恩酮对细胞外RH-2F速殖子的抑制作用

步骤：选择表达了β-半乳糖苷酶的弓形虫Ⅰ型强毒株RH-2F用于生长抑制测定。从Vero细胞中收获新鲜活力强的RH-2F速殖子，血细胞计数板计数，调整RH-2F的浓度为1×10⁵个/mL。以此配制各浓度的海恩酮，加入白色96孔板中，以0.25％DMSO为对照组，10μg/mL的乙胺嘧啶为阳性对照，只含培养基的为空白组。培养12h后加入Beta-

检测试剂，作用30min后于光度计中检测发光值计算RH-2F的存活率。

结果：结果如图1，海恩酮对弓形虫的IC₅₀为18.74μg/mL，对弓形虫的抑制作用呈剂量依赖，浓度越高抑制作用越强。海恩酮5μg/mL(79.16％)开始时对弓形虫的抑制作用就强于10μg/mL的乙胺嘧啶(85.53％)。

实施例2海恩酮对Vero细胞的细胞毒性

步骤：采用CCK-8法测定海恩酮对Vero细胞的毒性。Vero细胞1×10⁵个/mL，接种于96孔板，培养12h后，加入各浓度的化合物。以未加化合物的孔为对照组，只含培养基的孔为空白组。培养24h后加入CCK-8试剂，作用1～2h后于酶标仪内测定各孔OD值，按以下公式计算细胞存活率，独立的试验重复3次。

细胞存活率(％)＝(OD_实验组-OD_空白组)/(OD_对照组-OD_空白组)×100％

结果：海恩酮对非洲绿猴肾细胞的IC₅₀为27.66μg/mL，且呈剂量依赖性，浓度为100μg/mL时细胞存活率为24.53％，50μg/mL时为33.87％。4μg/mL时基本对Vero细胞无毒性，此时的细胞存活率为99.81％，选择4μg/mL的海恩酮为安全浓度，见图2。

实施例3生物化学发光法测定海恩酮对细胞内RH-2F的抗增殖作用

步骤：将1×10⁵个/mL RH-2F速殖子接种于单层Vero细胞的96孔板中，入侵2h后用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)将未入侵的速殖子清除，加入浓度为4μg/mL的海恩酮，同时设置阴性对照组(0.25％DMSO)和阳性对照组(10μg/mL乙胺嘧啶)。24h后加入Glo Lysis Buffer裂解细胞，再加入Beta-

检测试剂测定发光值计算RH-2F的存活率。

结果：将阴性对照组RH-2F速殖子的存活率记为100％，计算海恩酮和乙胺嘧啶的RH-2F存活率，阳性对照乙胺嘧啶的存活率为15.54％，海恩酮的存活率为14.57％。结果表明海恩酮对细胞内RH-2F的抗增殖作用效果显著，优于阳性对照乙胺嘧啶(图3)。

实施例4间接免疫荧光法测定海恩酮对细胞内Pru的抗增殖作用

步骤：将1×10⁵个/mL的Pru速殖子接种于12孔板中的单层Vero细胞的爬片中，入侵6h后加入浓度为4μg/mL的海恩酮作用24h，同时设置0.25％DMSO的阴性对照和10μg/mL乙胺嘧啶的阳性对照。固定、封闭，通透和染色。小鼠抗弓形虫单克隆抗体为一抗，二抗为山羊抗小鼠lgG H&L(Alexa

647)，DAPI染核。封片后于共聚焦显微镜下观察拍照。

结果：结果如图4，阴性对照组中可见很多体积大的纳虫泡，阳性对照中也可见纳虫泡，但体积小的多，还可见Pru速殖子。海恩酮中未见纳虫泡，只可见数量很少的Pru速殖子。结果说明海恩酮对细胞内的Pru具有显著的抗增殖作用，可以抑制Pru纳虫泡的形成，抗增殖效果优于阳性对照。

实施例5噬斑试验测定海恩酮对RH裂解周期的影响

步骤：5×10³个/mL的RH速殖子入侵6孔板中的单层Vero细胞2h后加入浓度为3μg/mL的海恩酮孵育5d后，固定、0.1％结晶紫染色于体视显微镜下7倍放大拍照观察噬斑大小和数量。同时设置0.25％DMSO的阴性对照和10μg/mL乙胺嘧啶的阳性对照。

结果：结果如图5，阴性对照组中噬斑数量众多，面积大。阳性对照组和海恩酮中可见少量面积小的噬斑。海恩酮可以明显抑制弓形虫裂解细胞能力，能明显影响弓形虫的裂解周期。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.含有海恩酮的组合物在制备治疗弓形虫感染疾病药物中的应用。

2.含有海恩酮的组合物在制备抑制弓形虫增殖、或抑制弓形虫裂解细胞能力的药物中的应用。

3.含有海恩酮的组合物在制备预防弓形虫感染的药物中的应用。

4.海恩酮在制备治疗弓形虫感染疾病药物中的应用。

5.海恩酮在制备抑制弓形虫增殖、或抑制弓形虫裂解细胞能力的药物中的应用。

6.海恩酮在制备预防弓形虫感染的药物中的应用。

7.海恩酮在提高对弓形虫杀虫效率中的应用。

8.根据权利要求1-7任一所述的应用，其特征在于，海恩酮的用量为2-6μg/mL，优选4μg/mL。

9.根据权利要求1-7任一所述的应用，其特征在于，在弓形虫的速殖子期施用海恩酮或含海恩酮的组合物。

10.根据权利要求1-9任一所述的应用，其特征在于，所述弓形虫为I型基因型、II型基因型和/或III型基因型弓形虫。