CN113398106A - 用于自噬增强的非mtor依赖性tfeb激活剂和其用途 - Google Patents

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CN113398106A CN202110429206.6A CN202110429206A CN113398106A CN 113398106 A CN113398106 A CN 113398106A CN 202110429206 A CN202110429206 A CN 202110429206A CN 113398106 A CN113398106 A CN 113398106A
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宋聚先
曾玉
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Abstract

本发明公开了一种组合物，所述组合物包含自噬增强化合物。公开了能够通过激活基因TFEB来增强自噬和溶酶体生物合成的小分子，所述小分子可以阻止毒性蛋白质聚集体的积聚以治疗神经退行性疾病。

Description

用于自噬增强的非MTOR依赖性TFEB激活剂和其用途
本申请是基于申请日为2015年3月6日、申请号为201580012376.7(国际申请号为PCT/CN2015/073764)、发明名称为“用于自噬增强的非MTOR依赖性TFEB激活剂和其用途”的发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2014年3月06日提交的美国临时专利申请序列号61/949,233和2015年1月30日提交的美国非临时专利申请序列号14/609,438的权益，这些专利申请的公开内容在此以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及一种组合物，所述组合物包含自噬增强化合物。具体来说，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含能够通过激活基因TFEB来增强自噬和溶酶体生物合成的小分子，所述小分子可以阻止毒性蛋白质聚集体的积聚以治疗神经退行性疾病，如帕金森病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)以及亨廷顿病(Huntington's disease)。
背景技术
巨自噬在本文被称为自噬，是用于细胞降解和胞质内容物再循环以维持细胞稳态的一个高度保守的过程。自噬底物一般是细胞器、长寿命的蛋白质以及易形成聚集体的蛋白质。由于它的功能在于清除胞质内容物，因此这一高度保守的过程已经被证实为可用于治疗以细胞内聚集体形成为特征的疾病(如脑衰老和神经退行性疾病)的一种有前途的方法。
自噬-溶酶体途径(ALP)功能障碍已经被证实直接与神经退行性疾病有关。最近，转录因子EB(TFEB)已经在以下文献中被鉴定为ALP的主要调节因子：Settembre,C.等,TFEBlinks autophagy to lysosomal biogenesis(TFEB关联自噬与溶酶体生物合成).Science,2011.332(6036):1429-33；以及Sardiello,M.等,A gene network regulatinglysosomal biogenesis and function(调节溶酶体生物合成与功能的基因网络).Science,2009.325(5939):473-7。通过TFEB转基因提高其表达量、或者能够刺激内源性TFEB的细胞核转运的小分子可促进毒性蛋白质聚集体的清除，从而为神经退行性病症，如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)以及亨廷顿病(HD)提供疾病缓解干预。
当前的MTOR抑制剂，如雷帕霉素(rapamycin)和torin1通过促进TFEB的细胞核转运来激活TFEB。然而，它们的药物代谢动力学特征和副作用使得它们不太可能在患有神经退行性疾病的患者中长期使用。诸如海藻糖和蔗糖之类的二糖以非MTOR依赖性方式激活TFEB并且可以有益于神经退行性疾病。然而，海藻糖和蔗糖的血脑屏障(BBB)穿透性不佳。直接靶向调控TFEB的小分子的发现对于开发有效神经保护治疗具有很大的希望。
本发明的目的在于提供具有良好的BBB穿透性和强效的TFEB激活作用以用于治疗神经退行性疾病的小分子化合物。本发明提供了一种可以容易大规模合成的具有简单化学结构的化合物。本发明提供了一种直接结合和激活TFEB而不抑制MTOR途径，从而消除可能的MTOR相关并发症的化合物。本发明的另一个目的在于提供一种用于治疗可以受益于自噬的溶酶体贮积病症和疾病的方法，所述病症和疾病包括但不限于神经退行性疾病、免疫疾病、心脏疾病以及癌症。
发明内容
本发明涉及一种组合物，所述组合物包含自噬增强化合物。具体来说，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含能够通过激活基因TFEB来增强自噬和溶酶体生物合成的小分子，所述小分子可以阻止毒性蛋白质聚集体的积聚以治疗神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病以及亨廷顿病。
本发明公开了一种强效的TFEB激活剂，所述激活剂增强神经细胞和非神经细胞中的自噬和溶酶体生物合成。与目前已知的TFEB激活剂相比，本发明的优势是：1)本发明的化合物是具有良好的BBB穿透性和强效的TFEB激活特性的小脂质分子；2)本发明的化合物的化学结构简单，并且可以容易地大规模合成以用于临床前研究和临床研究；3)本发明的化合物激活TFEB而不抑制MTOR途径，从而消除临床试验中可能的MTOR相关并发症。因此，本发明在治疗溶酶体贮积病症和常见的神经退行性疾病中具有广泛的应用领域。
在本发明的第一个方面，提供了三种强效的自噬增强剂。这三种化合物(即A2、B3以及C1)诱导神经元样N2a细胞中的自噬。这三种化合物是姜黄素的合成单羰基类似物并且它们的化学名称是：
A2：1,5-双(3-(三氟甲基)苯基)戊-1,4-二烯-3-酮
B3：1,5-双(4-羟基苯基)戊-1,4-二烯-3-酮
C1：1,5-双(2-甲氧基苯基)戊-1,4-二烯-3-酮
在本发明的另一个实施方案中，提供了这三种化合物A2、B3以及C1促进细胞培养物中野生型和A53T突变型α-突触核蛋白(SNCA)的降解。
在本发明的另一个实施方案中，提供了化合物A2和B3经由抑制AKT/MTOR途径来诱导自噬。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了化合物C1激活转录因子EB(TFEB)，所述转录因子EB是自噬和溶酶体生物合成的必要的调节因子。C1显著地提高内源性TFEB表达并且促进TFEB的核转运。
已知MTOR途径是细胞生长和增殖的一种关键的调节因子。在本发明的另一个实施方案中，提供了化合物C1激活TFEB介导的自噬而不抑制MTOR途径。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了C1与TFEB直接结合并且抑制MTOR-TFEB-YWHA相互作用，这使得TFEB从MTOR复合体中释放并且促进TFEB核转运。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了化合物C1增强非神经细胞和神经细胞中TFEB介导的自噬和溶酶体生物合成。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了在大鼠中，在单次剂量的静脉内(IV)尾静脉注射的情况下，C1的半数致死剂量(LD50)值是175mg/kg。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了在向大鼠短期和长期经口施用C1(10mg/kg)6小时后，C1在脑组织中的平均浓度分别是0.26±0.063μg/g和0.849±0.302μg/g。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了姜黄素类似物C1的短期经口施用激活大鼠脑中的TFEB和自噬，并且C1的长期施用促进大鼠脑中内源性SNCA的降解。
本发明的第二个方面提供了一种用于治疗神经退行性疾病而没有明显的由mTOR抑制所引起的副作用的方法，所述方法包括施用包含化合物C1的组合物。这样的神经退行性疾病包括但不限于以下：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)。
在本发明的第二个方面的一个实施方案中，以每千克需要其的受试者的体重1.62mg至28.38mg施用C1。
在本发明的第二个方面的另一个实施方案中，经由口服施用和/或静脉内注射施用所述组合物。
本发明的第三个方面提供了一种用于增强细胞中的自噬的方法，所述方法包括提供具有下式的姜黄素的单羰基类似物：
Figure BDA0003030770380000041
其中R独立地选自CF3、OH或OCH3。
在本发明的第三个方面的第一个实施方案中，所述姜黄素的单羰基类似物具有A2的化学式：
Figure BDA0003030770380000051
1,5-双(3-(三氟甲基)苯基)戊-1,4-二烯-3-酮。
在本发明的第三个方面的第二个实施方案中，所述姜黄素的单羰基类似物具有B3的化学式：
Figure BDA0003030770380000052
1,5-双(4-羟基苯基)戊-1,4-二烯-3-酮。
在本发明的第三个方面的第三个实施方案中，所述姜黄素的单羰基类似物具有C1的化学式：
Figure BDA0003030770380000053
1,5-双(2-甲氧基苯基)戊-1,4-二烯-3-酮。
在本发明的第四个方面，提供了一种用于增强细胞中的溶酶体生物合成的方法，所述方法包括提供具有下式的姜黄素的单羰基类似物：
Figure BDA0003030770380000054
其中R是OCH3。
在本发明的第四个方面的第一个实施方案中，所述姜黄素的单羰基类似物具有C1的化学式：
Figure BDA0003030770380000055
1,5-双(2-甲氧基苯基)戊-1,4-二烯-3-酮。
在本发明的第四个方面的第二个实施方案中，所述单羰基类似物结合并且激活细胞中的TFEB。
在本发明的第三个方面和第四个方面，所述细胞是非神经细胞或神经细胞。
在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”之类的变化形式将被理解成表示包括所述整数或整数组，但并不排除任何其它整数或整数组。还要指出的是，在本公开中，并且特别是在权利要求书和/或段落中，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等术语可以具有在美国专利法中归于它的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；并且诸如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”的术语具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未明确叙述的要素，但是排除在现有技术中存在的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。
此外，在整个本说明书和权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(include)”或诸如“包括(includes)”或“包括(including)”之类的变化形式将被理解成意味着包括所述整数或整数组，但并不排除任何其它整数或整数组。
本文所用的所选择的术语的其它定义可以见于本发明的详细说明内并且在全文均适用。除非另外定义，否则本文所用的所有其它技术术语所具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。
通过审阅随后的说明，本发明的其它方面和优势对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
根据本发明的以下说明，在与附图相结合时，本发明的上述和其它目的和特征将变得显而易见，其中：
图1示出了姜黄素的单羰基类似物的化学结构(图1A)和姜黄素的单羰基类似物的细胞毒性(图1B)。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照(0.1％DMSO)，p<0.05。
图2示出了经过姜黄素类似物处理的N2a细胞中LC3-II(一种自噬标志物)的蛋白质印迹和LC3-II相对强度。将N2a细胞用姜黄素(Cur，10μM)和它的类似物(1μM)处理12小时(图2A)。在存在或不存在氯喹(CQ，20μM)的情况下将N2a细胞用Cur(10μM)、类似物A2、B3和C1(1μM)处理12小时(图2B)。将N2a细胞用非靶siRNA(siNT)或Atg5 siRNA(siAtg5，50nM)转染72小时，然后用Cur(10μM)以及类似物A2、B3和C1(1μM)处理12小时(图2C)。通过蛋白质印迹测定LC3-II的表达。将相对强度相对于ACTB/β-肌动蛋白的强度归一化。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照(0.1％DMSO)，p<0.05；#相比于单独的CQ处理，p<0.05。N.S.＝不显著。
图3示出了姜黄素类似物对mTOR途径的作用。将N2a细胞用姜黄素(Cur，10μM)、A2、B3以及C1(1μM)处理12小时。Torin 1(1μM)处理2小时用作阳性对照。图3A是示出了磷酸化(p-)和总RPS6KB1/P70S6K、MTOR以及AKT的表达的代表性印迹。图3B是示出了磷酸化(p-)和总RPS6KB1/P70S6K、MTOR以及AKT的表达的柱状图。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照(0.1％DMSO)，p<0.05。
图4示出了姜黄素以及类似物A2、B3和C1激活N2a细胞中内源性TFEB的表达的作用。将细胞用姜黄素(Cur，10μM)、A2、B3以及C1(1μM)处理12小时。图4A示出了经过固定并且用TFEB抗体和DAPI染色的细胞的荧光图像(以50μm和10μm比例尺)。图4B示出了每个细胞的TFEB强度。数据是通过ImageJ软件定量的并且被表示为每一种处理条件的三次重复实验的平均值±SD。在每一个处理组中分析至少1000个细胞。*相比于对照(0.1％DMSO)，p<0.05。图4C是示出了内源性TFEB的表达的蛋白质印迹。图4D示出了相对于ACTB/β-肌动蛋白的强度归一化的TFEB的相对强度。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照(0.1％DMSO)，p<0.05。图4E是示出了已经经过Cur(10μM)、A2、B3以及C1(1μM)处理12小时的Hela细胞中3×Flag-TFEB的表达的荧光图像。Torin 1(1μM)处理2小时用作阳性对照。将细胞固定并且用抗Flag抗体染色。图4F示出了具有TFEB的核染色的细胞的百分比；TFEB的核染色是通过在三个随机的视野中对荧光细胞进行计数来定量的。图4G是示出了胞质级分(Cyt.)和核级分(Nuc.)中被Flag标记的TFEB的表达的蛋白质印迹。ACTB和H3F3A(H3组蛋白，家族3A)分别用作细胞质级分和核级分的上样对照。图4H示出了胞质级分和核级分中TFEB的相对强度。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照(0.1％DMSO)，p<0.05。
图5示出了C1抑制MTOR-TFEB-YWHA相互作用。将稳定表达3×Flag-TFEB的Hela细胞用C1(1μM)处理12小时。使内源性MTOR和YWHA与Flag-TFEB共同免疫沉淀。免疫沉淀的MTOR(图5A)和YWHA(图5B)的蛋白质印迹以及相对于它们在全细胞裂解物(WCL)中的相应水平归一化的水平。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照，p<0.05。WB：蛋白质印迹，以及IP：免疫沉淀。
图6示出了固相C1或姜黄素与重组TFEB蛋白的结合的蛋白质印迹。
图7示出了姜黄素类似物C1促进细胞培养物中TFEB介导的自噬和溶酶体生物合成。在用C1(1μM)处理12小时后，Hela细胞(图7A)和SH-SY5Y细胞(图7B)中的各种基因表达。通过实时PCR，使用所示基因的特异性引物来评估mRNA转录物丰度。相对定量(RQ)被表示为三次独立实验的平均值±SD。图7C是示出了已经经过C1(0.5μM、1μM)或蔗糖(100mM)处理12小时的Hela细胞和SH-SY5Y细胞中自噬标志物(LC3-II)、TFEB和溶酶体标志物(LAMP1、CTSD)的蛋白质水平的蛋白质印迹。Hela细胞(图7D)和SH-SY5Y细胞(图7E)中相对于ACTB/β-肌动蛋白的强度归一化的自噬标志物(LC3-II)、TFEB以及溶酶体标志物(LAMP1、CTSD)的相对强度。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照(0.1％DMSO)，p<0.05。图7F示出了蛋白质印迹(左侧)和柱状图(右侧)，它们示出了已经经过非靶siRNA(siNT)或TFEB siRND(siTFEB，100nM)转染72小时并且经过C1(1μM)处理12小时的Hela细胞中内源性TFEB和LC3-II的表达。C1的自噬增强作用具有TFEB依赖性。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照，p<0.05。N.S.＝不显著。
图8示出了姜黄素类似物促进SNCA的降解。在经过强力霉素(doxycycline)(Dox，2μg/ml)处理24小时，然后在存在或不存在氯喹(CQ，20μM)和渥曼青霉素(wortmannin)(WM，1μM)(B、D)的情况下再经过姜黄素(10μM)、A2、B3以及C1(1μM)处理48小时(A、C)的可诱导PC12细胞中HA标记的野生型(WT)或A53T突变型SNCA的表达和强度。HA-SNCA的表达是通过蛋白质印迹来测定的并且通过三次独立实验来定量。柯诺辛碱B(corynoxine B)(Cory B，25μM)用作阳性对照。将相对强度相对于ACTB/β-肌动蛋白的强度归一化。数据被表示为来自三次独立实验的平均值±SD。*相比于对照(0.1％DMSO)，p<0.05。
图9示出了短期施用C1在大鼠脑中提高了TFEB的表达并且增强了自噬。通过灌胃向SD大鼠(每组n＝6)经口施用C1(每天10mg/kg和25mg/kg)或媒介物(1％CMC-Na)，持续24小时。在将大鼠处死前6小时内给予额外剂量的C1。图9A示出了肝脏、额叶皮层以及纹状体中如所示的各种蛋白质水平的蛋白质印迹。图9B-9D是示出了肝脏、额叶皮层以及纹状体中各种蛋白质表达的定量数据的柱状图。数据被表示为平均值±SD(n＝6)。*相比于媒介物处理，p<0.05。图9E示出了通过实时PCR分析的额叶皮层中mRNA的水平。相对定量(RQ)被表示为平均值±SD(n＝4)。*相比于媒介物处理，p<0.05。
图10示出了C1的短期施用对MTOR途径、TFEB核转运以及MTOR-TFEB相互作用的作用。通过灌胃向SD大鼠(每组n＝6)经口施用C1(每天10mg/kg和25mg/kg)或媒介物(1％CMC-Na)，持续24小时。在将大鼠处死前6小时内给予额外剂量的C1。图10A示出了在用C1处理的情况下额叶皮层中的MTOR途径上MTOR和RPS6KB1表达的蛋白质印迹(左侧)和定量数据(右侧)。数据被表示为平均值±SD(n＝6)。图10B是示出了在C1处理后TFEB的核易位的蛋白质印迹(左侧)和定量数据(右侧)(n＝4)。图10C示出了在C1处理后在额叶皮层中MTOR-TFEB相互作用的免疫沉淀数据(n＝4)。*相比于媒介物处理，p<0.05。
图11示出了C1的长期施用在大鼠脑中增强了自噬并且促进了内源性SNCA的降解。通过灌胃向SD大鼠(每组n＝6)经口施用C1(每天10mg/kg)或媒介物(1％CMC-Na)，持续21天。在将大鼠处死前6小时内给予额外剂量的C1。图11A是示出了肝脏、额叶皮层以及纹状体中如所示的蛋白质水平的蛋白质印迹。图11B-11D是肝脏、额叶皮层以及纹状体中蛋白质水平的定量数据。数据被表示为平均值±SD(n＝6)。*相比于媒介物处理，p<0.05。
具体实施方式
本发明在范围上不受本文所述的具体实施方案中的任一个的限制。仅出于举例说明的目的提供以下实施方案。
定义
除非另外说明，否则如本文所用的“a/an(一)”和“所述”包括“至少一个(种)”和“一个(种)或多个(种)”。因此，例如，在提到“一种药理学上可接受的载体”时，包括两种或更多种载体的混合物以及单一载体等。
除非另外说明，否则术语“自噬”指的是巨自噬，是涉及细胞自身组分的降解的分解代谢过程，所述组分诸如长寿命的蛋白质、蛋白质聚集体、细胞器、细胞膜、细胞器膜、以及其它细胞组分。自噬的机制可以包括：(i)在细胞的靶向区域周围形成膜，从而将内容物与细胞质的其余部分隔开；(ii)所产生的囊泡与溶酶体融合并且随后将囊泡内容物降解。术语自噬还可以指的是饥饿中的细胞将营养素从不必要的过程重新分配到更为必要的过程的机制之一。此外，例如，自噬可以抑制一些疾病的进展并且发挥了对抗细胞内病原体所致的感染的保护作用。
受益于自噬诱导的疾病是如下的疾病，所述疾病的病况能通过自噬来改善、减轻或消除并且可以通过如本文所公开的发明来治疗。所述疾病包括易形成聚集体的病症，所述病症代表了与没有被生物体中天然的自噬过程充分破坏的异常蛋白质聚集体相关或由所述异常蛋白质聚集体所引起的任何疾病、病症或病况，并且可以通过本发明来诱导自噬以使其降解来治疗。举例来说，这样的疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、眼咽型肌营养不良症、朊病毒病、致死性家族性失眠症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、齿状核红核苍白球路易氏体萎缩症、额颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、x连锁脊髓延髓肌肉萎缩症、以及神经元核内透明包涵体病。所述疾病还包括癌症，例如其中诱导自噬将抑制细胞生长和分裂、减少诱变、去除由活性氧簇损伤的线粒体和其它细胞器、或杀灭发育中的肿瘤细胞的任何癌症。它们可以是慢性疾病，所述慢性疾病指的是缓慢发展的持续性和持久的疾病、医学病况或疾病。可以由本发明治疗的疾病还包括但不限于心血管病症、自身免疫性病症、代谢紊乱、错构瘤综合征、遗传性肌肉病症、以及肌病。
本发明提供了一种小分子，所述小分子能够通过激活TFEB来增强自噬和溶酶体生物发生。所述分子是姜黄素的单羰基类似物。所述分子直接与TFEB结合，促进它的表达和核转运。所述分子可以阻止毒性蛋白质聚集体的积聚以治疗神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病以及亨廷顿病。所述分子激活TFEB而不抑制MTOR途径，所述MTOR途径是细胞生长和增殖的一种关键的调节因子。
TFEB已经被鉴定为调节溶酶体生物合成和自噬的主基因。药理学激活TFEB可促进细胞内积聚的毒性分子的清除。本发明公开了一种强效的TFEB激活剂，所述激活剂增强神经细胞和非神经细胞中的自噬和溶酶体生物合成。与目前已知的TFEB激活剂相比，本发明的优势是：1)本发明的化合物是具有良好的BBB穿透性和强效的TFEB激活作用以用于治疗神经退行性疾病的小脂质分子；2)本发明的化合物的化学结构简单，并且可以容易地大规模合成以用于临床前研究和临床研究；3)本发明的化合物激活TFEB而不抑制MTOR途径，从而消除临床试验中可能的MTOR相关并发症。因此，本发明在治疗溶酶体贮积病症和常见的神经退行性疾病中具有广泛的应用领域。
本发明提供了一种用于增强细胞中的自噬的方法，所述方法包括提供具有下式的姜黄素的单羰基类似物：
Figure BDA0003030770380000121
其中R独立地选自CF3、OH以及OCH3。
在本发明的第一个实施方案中，所述姜黄素的单羰基类似物具有A2的化学式：
Figure BDA0003030770380000122
1,5-双(3-(三氟甲基)苯基)戊-1,4-二烯-3-酮。
在本发明的第二个实施方案中，所述姜黄素的单羰基类似物具有B3的化学式：
Figure BDA0003030770380000123
1,5-双(4-羟基苯基)戊-1,4-二烯-3-酮。
在本发明的第三个实施方案中，所述姜黄素的单羰基类似物具有C1的化学式：
Figure BDA0003030770380000124
1,5-双(2-甲氧基苯基)戊-1,4-二烯-3-酮。
在本发明的第二个方面，提供了一种用于增强细胞中的溶酶体生物发生的方法，所述方法包括提供具有下式的姜黄素的单羰基类似物：
Figure BDA0003030770380000125
其中R是OCH3。
在本发明的第二个方面的第一个实施方案中，提供了一种用于增强细胞中的溶酶体生物合成的方法，所述方法包括提供具有C1的化学式的姜黄素的单羰基类似物：
Figure BDA0003030770380000131
1,5-双(2-甲氧基苯基)戊-1,4-二烯-3-酮。
在本发明的第二个方面的第二个实施方案中，所述单羰基类似物结合并且激活细胞中的TFEB。
在本发明的又另一个实施方案中，所述细胞是非神经细胞或神经细胞。
在本发明的第三个方面，提供了一种通过向需要其的受试者施用包含式I的单羰基类似物的组合物来治疗神经退行性疾病的方法，其中R独立地选自CF3、OH以及OCH3。
在本发明的第三个方面的第一个实施方案中，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及克雅二氏病。
在本发明的第三个方面的第二个实施方案中，所述组合物包含1.62mg/kg至28.38mg/kg的C1。
在本发明的第三个方面的第三个实施方案中，经由口服施用、静脉内注射或这两者来施用所述组合物。
技术方案
1.一种用于增强细胞中的自噬的方法，所述方法包括提供具有下式的姜黄素的单羰基类似物：
Figure BDA0003030770380000132
其中R独立地选自由CF3、OH以及OCH3组成的组。
2.如技术方案1所述的方法，其中所述R是CF3并且所述姜黄素的单羰基类似物具有式A2：
Figure BDA0003030770380000141
3.如技术方案1所述的方法，其中所述R是OH并且所述姜黄素的单羰基类似物具有式B3：
Figure BDA0003030770380000142
4.如技术方案1所述的方法，其中所述R是OCH3并且所述姜黄素的单羰基类似物具有式C1：
Figure BDA0003030770380000143
5.一种治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用包含具有下式的姜黄素的单羰基类似物的组合物：
Figure BDA0003030770380000144
其中R选自由CF3、OH以及OCH3组成的组。
6.如技术方案5所述的方法，其中所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及克雅二氏病。
7.如技术方案5所述的方法，其中所述单羰基类似物是
Figure BDA0003030770380000145
所述单羰基类似物以每千克所述需要其的受试者的体重1.62mg至28.38mg被施用。
8.如技术方案5所述的方法，其中所述组合物通过口服施用、静脉内注射或这两者被施用至所述需要其的受试者。
9.如技术方案5所述的方法，其中所述R是CF3并且所述姜黄素的单羰基类似物包含式A2：
Figure BDA0003030770380000151
10.如技术方案5所述的方法，其中所述R是OH并且所述姜黄素的单羰基类似物包含式B3：
Figure BDA0003030770380000152
11.如技术方案5所述的方法，其中所述R是OCH3并且所述姜黄素的单羰基类似物包含式C1：
Figure BDA0003030770380000153
12.一种增强细胞中的溶酶体生物合成的方法，所述方法包括提供具有下式的姜黄素的单羰基类似物：
Figure BDA0003030770380000154
其中R是OCH3。
13.如技术方案12所述的方法，其中所述姜黄素的单羰基类似物包含式C1：
Figure BDA0003030770380000155
14.如技术方案12所述的方法，其中所述细胞是神经细胞。
15.如技术方案12所述的方法，其中所述细胞是非神经细胞。
本发明的实施方案进一步通过以下工作实施例来说明，所述工作实施例不应当被视为构成进一步限制。
实施例
在以下实施例中，使用以下材料；提供了所述材料的各种商业来源。各种方案的细节还阐述于下文中：
试剂和抗体
姜黄素的单羰基类似物的试验样品是由周波博士(中国的兰州大学(LanzhouUniversity,China))友情提供的。化合物C1((1E,4E)-1,5-双(2-甲氧基-苯基)戊-1,4-二烯-3-酮)是在单步反应中由2-甲氧基苯甲醛合成的。通过1H NMR和HPLC确认化合物的结构和纯度。姜黄素(08511)、氯喹(C6628)、强力霉素(D9891)、抗Flag M2抗体(F1804)购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。Torin 1(2273-5)购自BioVision公司。抗磷酸化AKT(ser473)抗体(9271)、抗AKT抗体(9272)、抗磷酸化MTOR(Ser2448)抗体(2971)、抗MTOR抗体(2983)、抗磷酸化P70S6K/RPS6KB1(Thr389)抗体(9234)以及抗P70S6K/RPS6KB1抗体(9202)、泛-14-3-3/YWHA抗体(8312)购自细胞信号转导技术公司(Cell SignalingTechnology)。抗α-syn/SNCA抗体(610786)购自碧迪转导实验室公司(BDTransductionLaboratories)。HRP缀合的山羊抗小鼠二抗(115-035-003)和山羊抗兔二抗(111-035-003)购自杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)。抗α-肌动蛋白/ACTB抗体(sc-47778)购自圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)。抗ATG5抗体(NB110-53818)和抗LC3抗体(NB100-2220)购自诺伟司生物制剂公司(NovusBiologicals)。抗TFEB抗体(13372-1-AP)购自Proteintech公司。小鼠Atg5 siRNA(L-064838-00-0005)和非靶siRNA、人类TFEB siRNA(M-009798-02-0005)和非靶siRNA购自Dharmacon公司。DMEM(11965-126)、FBS(10270-106)、Opti-MEM I(31985-070)、马血清(16050-122)、潮霉素B(10687-010)、G418(10131-035)、Alexa
Figure BDA0003030770380000161
488山羊抗小鼠IgG(A-11001)以及Alexa
Figure BDA0003030770380000162
594山羊抗兔IgG(A-11012)购自生命科技公司(LifeTechnologies)。
细胞培养和药物处理
将N2a细胞、Hela细胞以及稳定表达3×Flag-TFEB的Hela细胞培养在添加有10％FBS的DMEM中。将SH-SY5Y细胞培养在添加有10％FBS的DMEM/F12中。对于药物处理，将完全培养基置换为新鲜的Opti-MEM I，然后将化合物(溶解于0.1％DMSO中)添加到细胞中并且孵育12小时。将过表达SNCA(WT和A53T)的诱导型PC12细胞(来自剑桥大学(CambridgeUniversity)的David C.Rubinsztein教授的惠赠)在37℃、10％CO2下培养在添加有10％马血清、5％FBS、50μg/ml G418以及150μg/ml潮霉素B的DMEM中。将细胞用2μg/ml的强力霉素(Dox)处理24小时以诱导SNCA表达。将完全培养基更换为含有测试化合物的Opti-MEM I，再持续48小时。
LDH测定
通过使用LDH试剂盒(11644793001，罗氏公司(Roche))，根据制造商的方案测量来自受损的细胞的LDH释放来测定细胞毒性。
siRNA基因敲低
将小鼠Atg5 siRNA(25nM)或人类TFEB(100nM)siRNA以及非靶siRNA用脂染胺RNAiMAX(13778030，英杰公司(Invitrogen))转染并且在37℃孵育72小时。
动物和处理
所有的动物护理和程序均由香港浸会大学关于在教学和研究中使用人类和动物受试者的委员会(Hong Kong Baptist University Committee on the Use of Human andAnimal Subjects inTeaching and Research)批准。将体重为350g-400g的成年雄性斯普拉格-多雷(Sprague-Dawley，SD)大鼠在不限量采食和饮水的情况下以12小时光/暗周期维持在受控环境中。对于短期处理，通过灌胃向大鼠(每组n＝6)经口施用C1(每天10mg/kg和25mg/kg)或媒介物(1％羰甲基纤维素钠(CMC-Na))，持续24小时。对于长期处理，通过灌胃给予大鼠以C1(每天10mg/kg)，持续21天。在每一种处理结束时，在将大鼠处死前6小时内给予额外剂量的C1。将解剖的肝脏和主要脑区域在液氮中速冻。
定量实时PCR
使用RNeasy Plus小型试剂盒(74134，快而精公司(Qiagen))从细胞和组织中提取总RNA。使用大容量cDNA逆转录试剂盒(4368814，生命科技公司)进行逆转录。自噬和溶酶体基因引物是由生命科技公司合成的并且寡核苷酸序列列于表1中。使用ViiATM 7实时PCR系统(生命科技公司)用快速SYBRR绿色主混合物(4385612，生命科技公司)进行实时PCR。使用ΔΔCT法计算倍数变化，并且将结果相对于内参(GAPDH或ACTB)归一化。
表1：用于实时PCR分析的引物序列。
Figure BDA0003030770380000181
Figure BDA0003030770380000191
蛋白质印迹法和免疫沉淀
将细胞在冰上在含有完全蛋白酶抑制剂混合物(04693124001，罗氏应用科学公司(Roche Applied Science))的1×裂解缓冲液(9803，生命科技公司)中裂解。将动物组织在9倍体积的添加有蛋白酶抑制剂的冰冷PBS中匀浆。使用与先前所述的方案类似的方案分离胞质部分和胞核部分。将抗Flag抗体或抗TFEB抗体添加到全细胞裂解物中并且使用
Figure BDA0003030770380000201
蛋白G(10003D，生命科技公司)进行免疫沉淀。将蛋白质通过10％-15％SDS-PAGE分离，转移，并且用所述的抗体呈现印迹。然后将印迹与二抗或Clean-Blot IP检测试剂(21230，赛默科技公司(Thermo Scientific))一起在室温孵育1小时。将蛋白质信号通过ECL试剂盒(32106，皮尔斯公司(Pierce))检测并且使用ImageJ软件定量。
免疫细胞化学
将细胞接种到被放置在24孔板中的盖玻片上。在药物处理后，将玻片用3.7％多聚甲醛固定，在0.2％Triton X-100中透化并且用5％BSA封闭。在封闭后，将玻片用抗TFEB抗体(1:200)或抗Flag抗体(1:500)在4℃染色过夜。在室温添加Alexa
Figure BDA0003030770380000202
488(绿色)或Alexa
Figure BDA0003030770380000203
594(红色)二抗(1:500)，持续1小时。在用DAPI进行核染色后，将玻片用FluorSave试剂(345789，Calbiochem公司)封片。使用Eclipse 80i荧光显微镜(尼康仪器公司(Nikon Instruments Inc.))使细胞可视化。
统计分析
将每一个实验进行至少3次，并且结果被表示为平均值±SD。使用SigmaPlot 11.0软件包进行单因素方差分析(ANOVA)，继而进行斯图登-纽曼-柯尔斯检验(Student-Newman-Keuls test)。P<0.05的概率值被认为具有统计显著性。
实施例I
从姜黄素的单羰基类似物中鉴定的新型自噬增强剂。
首先，本申请的发明人通过LDH测定(图1B)测试了测试化合物(如图1A中所示)在1μM和10μM在24小时内的细胞毒性并且随后使用1μM的浓度。与媒介物对照(0.1％DMSO)相比，姜黄素(10μM)以及类似物A2、B3和C1(1μM)使N2a细胞中微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)-II的水平显著提高(图2A)。在溶酶体抑制剂氯喹(CQ)存在下，与单独的CQ处理相比，这些类似物进一步提高了LC3-II的水平(图2B)。此外，在通过siRNA干扰自噬相关基因5(Atg5)的表达时，这些化合物不能提高LC3-II的水平(图2C)。所述数据表明姜黄素类似物A2、B3以及C1增强了自噬，而不是阻止溶酶体降解。
实施例II
姜黄素类似物对MTOR途径的作用
由于姜黄素经由抑制MTOR途径来增强自噬，因此确认本发明的三种新鉴定的自噬增强剂对MTOR途径的作用。类似于姜黄素，A2和B3抑制RPS6KB1/p70S6K、MTOR以及AKT的磷酸化(图3A和图3B)。Torin1(一种强效的MTOR抑制剂)用作阳性对照。C1显著地促进RPS6KB1、MTOR以及AKT的磷酸化(图3A和图3B)。
实施例III
姜黄素类似物C1激活细胞培养物中的TFEB
TFEB已经被鉴定为MTOR的靶标。药理学抑制MTORC1会激活TFEB，这是通过促进它的核转运而实现的。然而，还没有研究抑制MTOR途径的姜黄素和它的类似物对TFEB的作用。首先测定在经过姜黄素和它的类似物处理的N2a细胞中内源性TFEB的表达和分布。将N2a细胞用姜黄素(Cur，10μM)、A2、B3以及C1(1μM)处理12小时。化合物C1提高TFEB总的水平并且促进它的核转运(图4A-D)。姜黄素、A2以及B3没有显示出对TFEB的表达或分布的作用(图4A-D)。其次，通过免疫染色和蛋白质印迹确定姜黄素和它的类似物对稳定表达Flag-TFEB的Hela细胞中TFEB的分布的作用。类似于Torin 1处理，化合物C1显著地促进Flag-TFEB的核转运，而姜黄素、A2以及B3没有显示出作用(图4E-H)。这些数据表明姜黄素类似物C1代表了一种新的TFEB激活剂，该激活剂影响它的表达和转运这两者。
实施例IV
姜黄素类似物C1与TFEB结合并且抑制MTOR-TFEB-YWHA相互作用
将稳定表达3×Flag-TFEB的Hela细胞用C1(1μM)处理12小时。使内源性MTOR(A)和YWHA(B)与Flag-TFEB共同免疫沉淀。将免疫沉淀的MTOR和YWHA的水平相对于它们在全细胞裂解物(WCL)中的相应水平归一化。在稳定表达Flag-TFEB的Hela细胞中，C1处理对内源性MTOR(图5A)和YWHA(图5B)的水平没有影响。然而，在C1处理后当使MTOR和YWHA与Flag-TFEB共同免疫沉淀时，与对照相比，MTOR和YWHA与TFEB的相互作用减少。这表明C1抑制MTOR-TFEB-YWHA相互作用。此外，将纯化的His-TFEB(TP760282，傲锐东源公司(ORIGENE))在RIPA缓冲液中稀释并且将17μmol姜黄素(6.3mg)或C1(5mg)粉末添加到TFEB溶液中并且在4℃在振荡下孵育2小时。在离心后弃去上清液。将沉淀物(化合物和结合的蛋白质)在RIPA缓冲液中洗涤4次并且通过添加2％SDS上样缓冲液将结合的蛋白质洗脱。将结合的蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并且通过TFEB抗体(Proteintech公司)检测。证实了C1可以直接与纯化的TFEB结合，但是姜黄素不能(图6)。如在图6中所看到，在用化合物C1处理的情况下仅观测到TFEB的55kDa条带。
实施例V
姜黄素类似物C1激活细胞培养物中TFEB介导的自噬和溶酶体生物合成
在非神经性Hela细胞系和神经性SH-SY5Y细胞系中，显示出TFEB基因和参与自噬和溶酶体生物合成的一系列基因在Hela细胞(图7A)和SH-SY5Y细胞(图7B)中通过C1处理而得到上调。C1处理使基因表达发生的变化在Hela细胞中比在SH-SY5Y细胞中更敏感。随后，通过蛋白质印迹测定TFEB、自噬标志物(LC3B)以及溶酶体标志物(LAMP1和CTSD)的表达(图7C)。蔗糖(一种TFEB激活剂)用作阳性对照。如所预期，不同浓度的C1在Hela细胞(图7D)和SH-SY5Y细胞(图7E)中提高了TFEB的蛋白质水平并且激活了自噬/溶酶体生物合成。在经过TFEB siRNA转染的Hela细胞中，C1处理所引起的LC3-II水平的提高被阻止，这表明C1的自噬增强作用具有TFEB依赖性(图7F)。
实施例VI
姜黄素类似物C1促进SNCA的降解。
将诱导型PC12细胞用强力霉素(Dox，2μg/ml)处理24小时以诱导HA标记的野生型(WT)或A53T突变型SNCA的表达，然后在存在或不存在氯喹(CQ，20μM)和渥曼青霉素(WM，1μM)(B、D)的情况下再用姜黄素(10μM)、A2、B3以及C1(1μM)处理48小时(A、C)。HA-SNCA的表达是通过蛋白质印迹来测定的并且通过三次独立实验来定量。柯诺辛碱B(Cory B，25μM)用作阳性对照。在过表达SNCAWT或SNCAA53T的诱导型PC12细胞中，发现姜黄素(10μM)促进SNCAA53T降解，但是对SNCAWT没有影响。然而，姜黄素类似物A2、B3以及C1(1μM)显著地降解SNCAWT或SNCAA53T这两者(图8A和图8C)。值得注意的是，C1在SNCA清除方面显示出最好的作用。柯诺辛碱B(Cory B)用作阳性对照。此外，C1降解SNCA的活性被自噬抑制剂渥曼青霉素(WM)或溶酶体抑制剂CQ显著阻断(图8B和图8D)，这表明C1经由自噬-溶酶体途径促进SNCA的清除。
实施例VII
口服姜黄素类似物C1激活大鼠脑中的TFEB和自噬。
测定在单次剂量静脉内(IV)尾静脉注射的情况下C1在大鼠中的急性毒性以及C1的半数致死剂量(LD50)值是175mg/kg。C1(10mg/kg和25mg/kg)的短期口服剂量依赖性地提高了肝脏、脑的额叶皮层和纹状体中LC3-II和TFEB的表达(图9A-D)。然而，C1的短期施用对脑中内源性SQSTM1/p62或SNCA的水平没有影响(图9A-D)。此外，C1处理剂量依赖性地提高了脑中LAMP1的表达。对脑裂解物进行的实时PCR分析证实C1上调了脑中的TFEB和若干自噬/溶酶体基因(图9E)。这表明C1可以穿过血脑屏障(BBB)。口服C1(10mg/kg)6小时后C1在脑组织中的平均浓度经HPLC测定为0.26±0.063μg/g。这些数据证实了C1的短期治疗可以激活大鼠脑中的TFEB和自噬，而不足以降解自噬底物SQSTM1/p62和SNCA。
结果显示口服C1后大鼠的额叶皮层中的MTOR途径和TFEB转运。与体外观测结果相一致，C1处理(25mg/kg)显著地提高了MTOR和RPS6KB1的磷酸化(图10A)，从而确认C1促进MTOR活性。蛋白质印迹结果(图10B)显示施用C1剂量依赖性地促进脑中TFEB的核转运。内源性TFEB与MTOR之间的相互作用在经过施用C1(25mg/kg)的大鼠的额叶皮层中受到显著抑制(图10C)。
实施例VIII
姜黄素类似物C1的长期施用促进内源性SNCA的降解。
大鼠接受口服C1(10mg/kg)持续21天。在6小时内给予另一次剂量的C1，C1在脑组织中的平均浓度是0.849±0.302μg/g。然后，分析肝脏和脑中的自噬标志物。长期C1处理提高了肝脏中LC3-II的水平(图11A和B)。在脑的额叶皮层和纹状体中，C1处理显著地提高了TFEB和LC3-II的水平(图11A、C以及D)。值得注意的是，内源性SQSTM1/p62和SNCA的水平在经过C1处理21天的大鼠脑中显著降低(图11A、C以及D)，这表明C1的长期施用足以促进脑中蛋白质聚集体的由自噬介导的降解。在处理程序期间，没有观测到体重的变化或行为异常。对主要器官(肝脏、肺、肾、以及胰腺)进行的组织学评价没有揭示任何形态异常。
将动物剂量换算成人类剂量。
所发明的姜黄素单羰基类似物C1的有效剂量在每天10mg/kg(体重)至175mg/kg(体重)的范围。根据剂量换算公式(Reagan-Shaw S1等,Dose translation from animalto human studies revisited(重新审视从动物研究到人类研究的剂量换算),FASEBJ.2008；22(3):659-61.)，本发明的姜黄素单羰基类似物C1换算的有效人类剂量在每天1.62mg/kg(体重)至28.38mg/kg(体重)的范围。
工业适用性
本发明公开了新型组合物，所述组合物包含自噬增强化合物。具体来说，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含能够通过激活基因TFEB来增强自噬和溶酶体生物发生的小分子，所述小分子可以阻止毒性蛋白质聚集体的积聚以治疗神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病以及亨廷顿病。
如果需要的话，本文所论述的不同功能可以按不同的顺序和/或彼此同时执行。此外，如果需要的话，上述功能中的一种或多种可以是任选的或可以组合。
虽然已关于各种实施方案和实施例对上述本发明加以描述，但是应当了解的是，其它实施方案落入如在以下权利要求和它们的等同方案中所表示的本发明的范围内。此外，上述具体实施例仅应当被视作是说明性的，而不会以任何方式限制本公开的其余部分。在没有进一步详细描述的情况下，认为本领域技术人员能够基于本文的说明将本发明利用到它的最大程度。本文所叙述的所有出版物在此以引用的方式整体并入本文。
序列表
<110> 香港浸会大学
<120> 用于自噬增强的非MTOR依赖性TFEB激活剂和其用途
<130> P7599PC00
<150> US61/949,233
<151> 2014-03-06
<150> US14/608,438
<151> 2015-01-30
<160> 80
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATG9B反向引物人
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<220>
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<220>
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gagcgttacc agaacctgtc tc 22
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<220>
<223> MAPK14反向引物人
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SQSTM1正向引物人
<400> 19
tgtgtagcgt ctgcgaggga aa 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SQSTM1反向引物人
<400> 20
agtgtccgtg tttcaccttc cg 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VPS11正向引物人
<400> 21
gctataccaa gctcaaggac agc 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VPS11反向引物人
<400> 22
atggttctcc gccagataca gg 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VPS18正向引物人
<400> 23
acttgggcaa ggcaaatgag cc 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VPS18反向引物人
<400> 24
ccttctgtcc atttcggttc acg 23
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WIPI1正向引物人
<400> 25
cttcaagctg gaacaggtca cc 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WIPI1反向引物人
<400> 26
cggagaagtt caagcgtgca gt 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLCN7正向引物人
<400> 27
cacagttgcc ttcgtgctga tc 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLCN7反向引物人
<400> 28
tggagttgta ctcgccatct gc 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP6V0E1正向引物人
<400> 29
ggtgacctgt tcagtttgct gc 22
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP6V0E1反向引物人
<400> 30
gagcatgtct tcttcctcaa ggc 23
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP6V1H正向引物人
<400> 31
cgggtcaatg agtaccgctt tg 22
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP6V1H反向引物人
<400> 32
gatactggag ctgaaagcca cac 23
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSA正向引物人
<400> 33
gcttcgtgaa ggagttctcc ca 22
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSA反向引物人
<400> 34
ctgtggtcat cagtatggct gc 22
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSB正向引物人
<400> 35
gcttcgatgc acgggaacaa tg 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSB反向引物人
<400> 36
cattggtgtg gatgcagatc cg 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSD正向引物人
<400> 37
gcaaactgct ggacatcgct tg 22
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSD反向引物人
<400> 38
gccatagtgg atgtcaaacg agg 23
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSS正向引物人
<400> 39
tggatcacca ctggcatctc tg 22
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTSS反向引物人
<400> 40
gctccaggtt gtgaagcatc ac 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GALNS正向引物人
<400> 41
agcagaccac gtttgaagga gg 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GALNS反向引物人
<400> 42
gtggtgaaga ggtccatgat gc 22
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GBA正向引物人
<400> 43
tgctgctctc aacatccttg cc 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GBA反向引物人
<400> 44
taggtgcgga tggagaagtc ac 22
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GLA正向引物人
<400> 45
gcaaccttga ctgccaggaa ga 22
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GLA反向引物人
<400> 46
ctcataacct gcatccttcc agc 23
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GNS正向引物人
<400> 47
tccactgttg gttcgaggac ct 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GNS反向引物人
<400> 48
taggtcgtag ccagcaatgt cc 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HEXA正向引物人
<400> 49
ggaggtcatt gaatacgcac gg 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HEXA反向引物人
<400> 50
ggattcactg gtccaaaggt gc 22
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP1正向引物人
<400> 51
cgtgtcacga aggcgttttc ag 22
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP1反向引物人
<400> 52
ctgttctcgt ccagcagaca ct 22
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCOLN1正向引物人
<400> 53
cggactgcta taccttcagc gt 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCOLN1反向引物人
<400> 54
ggtgcttaca ctcctggatg tg 22
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PSAP正向引物人
<400> 55
gcctccaaga atgtcatccc tg 22
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PSAP反向引物人
<400> 56
caatcagctt ggtcacctcc ttc 23
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCPEP1正向引物人
<400> 57
cattcagcga gggaccatca ag 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCPEP1反向引物人
<400> 58
cctctgccag acctttgtct tc 22
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SGSH正向引物人
<400> 59
aatgccttca cctcggtcag ca 22
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SGSH反向引物人
<400> 60
tgtcgaagga gttgaagtgg tgc 23
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFEB正向引物人
<400> 61
cctggagatg accaacaagc ag 22
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TFEB反向引物人
<400> 62
taggcagctc ctgcttcacc ac 22
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP1正向引物人
<400> 63
ggtggcttca gcaatgtgtt cc 22
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP1反向引物人
<400> 64
gaagtaactg gatggtggca gg 22
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TMEM55B正向引物人
<400> 65
cagagttcac agaccgcact ttg 23
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TMEM55B反向引物人
<400> 66
ggcagtgact gccaaaagca ag 22
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH正向引物人
<400> 67
gtctcctctg acttcaacag cg 22
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH反向引物人
<400> 68
accaccctgt tgctgtagcc aa 22
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Map1lc3a正向引物大鼠
<400> 69
aacaggagaa ggatgaagac gg 22
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Map1lc3a反向引物大鼠
<400> 70
ttgactcaga agccgaaggt tt 22
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lamp1正向引物大鼠
<400> 71
gcacctccaa ctattccctg aa 22
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lamp1反向引物大鼠
<400> 72
acagacccaa acctgtcact tt 22
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tfeb正向引物大鼠
<400> 73
aatgggagca accgtactta gg 22
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tfeb反向引物大鼠
<400> 74
gagggaagac aggtccatga ag 22
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Atp6v1h正向引物大鼠
<400> 75
ctcagtatgt gcagtgtgtt gc 22
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Atp6v1h反向引物大鼠
<400> 76
tacagttcac cccatctgct tc 22
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Vps18正向引物大鼠
<400> 77
gctgatgatt cgctccattg ac 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Vps18反向引物大鼠
<400> 78
agtctggtag ctgtatccct gt 22
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Actb正向引物大鼠
<400> 79
ctgtgtggat tggtggctct at 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Actb反向引物大鼠
<400> 80
gtaacagtcc gcctagaagc at 22

Claims (5)

1.姜黄素的单羰基类似物在制备用于治疗帕金森病、亨廷顿病和克雅二氏病的药物中的应用，所述姜黄素的单羰基类似物具有下式C1结构：
Figure FDA0003030770370000011
2.姜黄素的单羰基类似物在制备用于治疗帕金森病的药物中的应用，所述姜黄素的单羰基类似物具有下式C1结构：
Figure FDA0003030770370000012
3.权利要求1或2所述的应用，其中所述具有C1结构的姜黄素的单羰基类似物通过非MTOR依赖性方式激活TFEB介导的自噬的途径治疗所述疾病。
4.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述单羰基类似物以每千克所述需要其的受试者的体重1.62mg至28.38mg被施用。
5.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述药物为经口服、静脉内注射或这两者施用至受试者的药物。
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