CN113388874B - 一种具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜及其制备方法与应用。所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜是指在基材表面原位生长的纳米管状的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，包括TiO₂纳米管和均匀负载于TiO₂纳米管表面并与TiO₂纳米管之间形成纳米异质结构的纳米CeO_2‑x颗粒，其中0.12≤x≤0.50，优选0.15~0.36。

Description

一种具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜及其 制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种适用于氧化应激环境的生物抗氧化薄膜及其制备与应用，具体来说，涉及一种具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜及其制备方法与应用，属于生物医用技术领域。

背景技术

随着人口老龄化进程加速，以及交通事故、疾病等造成的骨损伤事故的频发，骨科植入材料的需求量日益增加。以金属钛或其合金为主要材质的骨科植入体，临床上可满足普通患者的基本修复需求。然而，对于患有代谢性疾病(糖尿病、雌激素缺乏、骨质疏松症等)的骨缺损患者而言，机体内活性氧水平较高，容易在骨科植入体周围引发组织的氧化应激损伤，抑制成骨细胞活性，严重影响术后植入体的使用效果。因此，开发具有良好生物抗氧化性能的骨科植入材料，对于促进氧化应激下骨修复具有重要意义。

纳米CeO_2-x颗粒因具有多种生物酶模拟活性被广泛用于生物催化、生物医药和生物支架等领域。铈离子混合价态共存(Ce³⁺/Ce⁴⁺)赋予其生物抗氧化性，使其能够催化分解生物体内过量的活性氧，对多种氧化应激状态下的细胞、组织和器官表现出抗氧化和抵御损伤的作用。CeO_2-x纳米颗粒的多种酶模拟活性与Ce³⁺含量有关。由于二氧化铈的氧化速度远高于其还原速度，要形成较为稳定的氧空位或者形成稳定的非化学计量的CeO_2-x，二氧化铈需要经历严苛的高温还原过程。若不能获得稳定的Ce³⁺和氧空位，在实际运用中，二氧化铈的抗氧化保护性能将大幅降低。

发明内容

本发明为了解决现有技术中所存在的缺陷，提供一种具备良好生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜及其制备方法与应用。

第一方面，本发明提供一种具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜是指在基材表面原位生长的纳米管状的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，包括TiO₂纳米管和均匀负载于TiO₂纳米管表面并与TiO₂纳米管之间形成纳米异质结构的纳米CeO_2-x颗粒，0.12≤x≤0.50，优选0.15～0.36。

本发明的氧化铈/氧化钛异质结薄膜中，Ti 2p与Ce 4f发生轨道能级杂化,可降低Ce 4f轨道电子的离域势能，因此，金属钛离子掺杂有利于纳米CeO_2-x颗粒形成稳定的氧空位和Ce³⁺从而赋予其稳定持续的生物抗氧化性，且具有良好的生物相容性，能有效降低骨细胞的氧化应激损伤，并促进氧化应激环境下骨组织的修复。

较佳地，所述纳米CeO_2-x颗粒中Ce³⁺和Ce⁴⁺共存，对异质结薄膜的光电子能谱(XPS)Ce 3d轨道的精细谱图进行价态拟合分析可知，其中Ce³⁺/(Ce³⁺+Ce⁴⁺)的比例范围为25～75％，优选30～50％。

较佳地，所述TiO₂纳米管为锐钛矿相TiO₂纳米管。由于Ti-O键的极性较大，超氧根阴离子和H₂O₂吸附在材料表面容易发生解离分别形成Ti-OOH和Ti-OH，锐钛矿相TiO₂与金红石相TiO₂相比，Ti-O的极性更大，因而，锐钛矿相TiO₂更有利于提高异质结薄膜的生物抗氧化性。

较佳地，所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜中，所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜中，Ce原子的占比为5～10％，Ti原子的占比为25～30％，O氧原子的占比为30～60％；优选地，(Ce+Ti):O的原子比大于1:2，优选为1：1.5～1：1.8。

第二方面，本发明提供上述具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的制备方法，包括以下步骤：

通过阳极氧化法在钛基材表面原位形成TiO₂纳米管；

采用电化学沉积法在TiO₂纳米管表面负载纳米CeO_2-x颗粒以制备异质结薄膜。

上述生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的制备方法还包括退火处理步骤。在负载纳米CeO_2-x颗粒前后进行退火处理均可。一些实施方式中，在负载纳米CeO_2-x颗粒之前，先对形成有TiO₂纳米管的钛基材进行退火处理以使至少部分TiO₂纳米管为锐钛矿相。优选地，对表面负载纳米CeO_2-x颗粒的TiO₂纳米管进行退火处理以使至少部分TiO₂纳米管为锐钛矿相。锐钛矿相TiO₂中Ti-O的极性更大，因而更有利于活性氧簇在材料表面解离，进而提高异质结薄膜的生物抗氧化性能。

较佳地，所述退火的气氛为空气气氛或氧气气氛，温度可为350～500℃，时间可为20～120分钟。

较佳地，以金属铂片作为阴极，以钛或钛合金作为阳极，以氟化铵溶液和丙三醇组成的混合溶液作为电解质溶液进行所述阳极氧化，所述阳极氧化的电压为10～30V，氧化时间为15～60分钟。

较佳地，所述电化学沉积法中，以导电金属铂片作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以表面原位生长有二氧化钛纳米管的钛或钛合金作为工作电极，硝酸铈溶液作为电解液，采用计时电流法制备异质结薄膜。优选地，采用的电流密度为0.05～0.08mA/cm²，电化学沉积时间为15～60分钟。

本发明的制备方法具有成本低、操作简单、可重复性好、适合规模化生产等优点。

第三方面，本发明提供上述具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜在制备硬组织修复与替换生物材料中的应用。

附图说明

图1为TiO₂纳米管、高Ce³⁺与低Ce³⁺两种不同Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的XRD图谱；图1中的插图为TiO₂纳米管、高Ce³⁺与低Ce³⁺两种不同Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜在衍射角20～35°范围的XRD图谱；

图2为高Ce³⁺与低Ce³⁺两种不同Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的XPS全谱图(A)以及Ce 3d轨道的精细谱图和价态拟合分析(B)；

图3中的A1、A2为TiO₂纳米管在不同标尺下的SEM图，B1、B2为高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜在不同标尺下的SEM图，C1、C2为低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜在不同标尺下的SEM图；

图4为高Ce³⁺与低Ce³⁺两种不同Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜表面的产生和消除超氧自由基ESR图谱；

图5为高Ce³⁺与低Ce³⁺两种不同Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜分解H₂O₂并释放氧气的紫外-可见光吸收曲线(A)以及溶液中溶解氧含量随时间变化曲线(B)；

图6为在正常和H₂O₂模拟的氧化应激环境下，高Ce³⁺与低Ce³⁺两种不同Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜表面成骨细胞黏附(A)、成骨细胞荧光骨架(B)、和成骨细胞分化图(C)；

上述高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜标记为CeO_2-x/TiO₂-III，上述低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜标记为CeO_2-x/TiO₂-IV。

具体实施方式

以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。在本发明未作特殊说明的情况下，原子比为各元素之间的物质的量之比。

本发明所述具有良好生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，是指在钛基材表面原位生长的纳米管状的氧化铈/氧化钛异质结薄膜。所述钛基材包括但不限于医用金属钛或钛合金。一些实施方式中，所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜的厚度为100～1000nm。薄膜厚度在上述范围内，可以增大异质结薄膜的比表面积，提高异质结薄膜的生物抗氧化性。TiO₂纳米管对超氧根离子和H₂O₂特殊的吸附和解离作用，可以提高CeO_2-x纳米颗粒的抗氧化保护效率，同时，异质界面的存在有利于形成稳定的Ce³⁺和氧空位，提高CeO_2-x纳米颗粒的可逆转换活性，从而使其保持较高的催化活性。

具体来说，所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜包括TiO₂纳米管和均匀负载于TiO₂纳米管表面的纳米CeO_2-x颗粒。其中，0.12≤x≤0.50，优选0.15～0.36。

TiO₂纳米管作为负载CeO_2-x纳米颗粒的基体，制备方法简单，纳米颗粒分散均匀，形貌可控，且适用于各种钛基材料的表面改性，可以通过调节Ce³⁺含量，使其发挥不同的纳米酶模拟活性，应用于多种活性氧簇引起的氧化应激。

从SEM图可以看出，所述TiO₂纳米管呈现定向的阵列分布，其直径可为30～150nm，长度为100～1000nm。为避免异质结薄膜的生物抗氧化性除受铈离子价态影响之外无其他干扰因素，所述异质结薄膜的TiO₂纳米管管径基本一致。又，所述TiO₂纳米管的晶相均为锐钛矿相。一些实施方式中，所述TiO₂纳米管通过在钛或钛合金表面经阳极氧化并结合退火处理得到。

另外，将氧化铈纳米颗粒(即纳米CeO_2-x颗粒)原位沉积在生长有二氧化钛纳米管的基材表面形成所述异质结薄膜，这样可以提高基材的生物抗氧化性能。

一些实施方式中，所述沉积方法可为电化学方法。电化学沉积过程中，H₂O分子首先在TiO₂纳米管表面得电子生成OH^-，随后OH^-与电解液中的Ce³⁺反应生成Ce(OH)₃，Ce(OH)₃在TiO₂纳米管表面分解生成Ce₂O₃和H₂O。由于Ce₂O₃无法稳定存在，且电解液中溶解氧的含量较低，因此Ce₂O₃在氧化结晶生长为CeO₂纳米颗粒过程中与TiO₂纳米管发生固相反应，夺氧并伴随着氧空位的生成，得到Ce³⁺含量较高的CeO_2-x纳米颗粒。其电化学沉积过程中发生的固相反应过程为：Ce⁴⁺+O^2-+Ti⁴⁺→Ti³⁺+Ce³⁺+1/2O₂+O_v。

所述基材包括但不限钛或钛合金沉积。从SEM图可以看出，纳米CeO_2-x颗粒的粒径可为5～50nm。又，所述纳米CeO_2-x颗粒均呈立方萤石相结构。

本发明的氧化铈/氧化钛异质结薄膜中，通过控制退火时机对CeO_2-x纳米颗粒中的Ce³⁺含量进行调控，Ce原子和Ti原子的原子比优选为0.15-0.21。

本发明的氧化铈/氧化钛异质结薄膜中，Ti 2p与Ce 4f发生轨道能级杂化,可降低Ce 4f轨道能级电子的离域势能，因此,金属钛离子掺杂有利于其形成稳定的氧空位和Ce³⁺。另外，TiO₂作为纳米CeO_2-x的载体能提高CeO_2-x的稳定性以及Ce³⁺与Ce⁴⁺之间的可逆转换能力，因此，钛植入体表面构建CeO_2-x与TiO₂的异质结构有望获得生理环境下更稳定的抗氧化性能。

本发明具有良好生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，可以实现氧化铈纳米颗粒中三价铈离子含量的可控调节。阳极氧化所得TiO₂纳米管均为非晶相，TiO₂由非晶相向锐钛矿相转变的温度区间约在350～500℃之间，因此，退火温度应该控制在相应温度区间之内。当退火温度高于500℃时，TiO₂由锐钛矿相变为金红石相。为确保TiO₂纳米管完全转变为锐钛矿相，同时又无金红石相生成，退火时间不得少于20min,长于120min易导致锐钛矿相向金红石相转变。本发明中，为避免退火温度和时间造成的TiO₂纳米管相组成变化会对铈离子价态造成影响，通过控制退火时机对CeO_2-x纳米颗粒中Ce³⁺含量进行调控，高Ce^{3 +}含量的异质结薄膜采用经退火处理转为锐钛矿相的TiO₂纳米管进行电化学沉积制备，低Ce³⁺含量的异质结薄膜电化学沉积则采用阳极氧化后的非晶态TiO₂纳米管，然后经退火TiO₂纳米管转为锐钛矿相。

本发明所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜的相组成均相同，仅在铈离子的价态组成方面存在区别。

另外，所述纳米CeO_2-x颗粒中Ce³⁺和Ce⁴⁺共存，三价铈离子占三价和四价铈离子总含量的范围为25～75％，优选30～50％。若三价铈离子超出上述范围，则主要发挥超氧化物歧化酶模拟活性，反应终产物为过氧化氢。此外，过氧化氢可与三价铈离子发生类芬顿反应，生成对细胞损伤严重的羟基自由基，反而不利于其发挥抗氧化保护作用。

以下具体说明上述具有良好生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的制备方法。

首先，二氧化钛纳米管可采用阳极氧化法制得。优选地，阳极氧化的电压为10～30V，氧化时间为15～60min。在上述阳极氧化参数范围内，可以通过控制阳极氧化的电压和氧化时间调控TiO₂纳米管的管径大小；当电压越大，管径越大；当阳极氧化时间越长，纳米管越长。若阳极氧化的电压小于优选电压，会造成纳米管管径太小，不利于CeO_2-x颗粒与TiO₂纳米管充分接触杂化，易在管口结晶生长纳米颗粒团聚。若阳极氧化的电压大于优选电压，会导致TiO₂纳米管无法保持完整的形貌。而氧化时间短于优选氧化时间，会造成TiO₂纳米管的管长较短，比表面积较小；氧化时间长于优选时间，会导致纳米管无法保持管状阵列。

在本发明一可选的实施方式中，以医用钛及钛合金作为阳极，铂片电极作为对电极，以氟化铵水溶液和丙三醇的混合溶液作为电解质溶液。其中，上述混合溶液中，氟化铵的质量分数可为0.005～0.015％；丙三醇与水的体积比可约为1:1。

然后，将阳极氧化法制得的二氧化钛纳米管退火。退火可在空气气氛下进行。一些实施方式中，退火温度为350～500℃，退火时间为20～120min。一些实施方式中，还可以通过控制退火时间和/或退火温度控制锐钛矿相的比例进而控制最终所得氧化铈/氧化钛中稳定的三价铈的含量。CeO_2-x纳米颗粒中的Ce³⁺含量较高，高温氧化反应可以进一步氧化Ce^{3 +},O₂进入CeO_2-x晶格，氧空位消失。高温退火过程中：Ce³⁺+O_v+1/2O₂+Ti³⁺＝Ti⁴⁺+Ce⁴⁺+O^2-。在一些实施方式中，可以通过控制退火温度和退火时间可以进一步调控纳米CeO_2-x颗粒中Ce³⁺的含量。

最后，在二氧化钛纳米管表面沉积纳米氧化铈颗粒，制得上述具有良好生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜。可采用计时电流法在二氧化钛纳米管表面沉积纳米氧化铈颗粒。在可选的实施方式中，以表面有氧化钛纳米管的钛或钛合金为工作电极，硝酸铈溶液作为电解液。硝酸铈浓度可为0.05～0.15mmol/L。一些实施方式中，电流密度可为0.05～0.08mA/cm²，电化学沉积时间可为15～60min。电化学沉积过程中，硝酸铈的浓度大于优选浓度范围或者电流大于优选密度范围以及沉积时间过长，均容易造成CeO_2-x纳米颗粒无法均匀分散在TiO₂纳米管管壁表面，相反地，在管口团聚成球。

本发明采用操作简单、可规模化生产的电化学法，在基材表面通过制备氧化铈/氧化钛异质结薄膜，获得了具有良好的生物抗氧化功能的骨植入材料。

本发明的制备方法中，相较于溶剂热或者其他的制备方法，使用阳极氧化和退火制备TiO₂纳米管可通过调控阳极氧化的参数精确调控TiO₂纳米管的管径和管长，进而调控比表面积的大小，有利于大规模的生产及应用。使用电化学法沉积反应更加迅速，同时可以大幅度提高CeO_2-x纳米颗粒沉积的分散度和稳定性，有利于大规模的生产及应用，且适用于形状结构复杂的医疗器械。

实施例1高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜(CeO_2-x/TiO₂-III)

A.高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的制备

首先，采用双电极模式，导电金属铂作为阴极、医用金属钛片作为阳极，电解质溶液为包含氟化铵水溶液和丙三醇的混合溶液，氟化铵的质量分数约为0.015％，丙三醇与水的体积比约为1:1。采用恒电压模式，20V电压下阳极氧化20min,空气气氛下，450℃退火120min,在医用金属钛片表面得到原位生长的TiO₂纳米管。然后，选用三电极模式，金属铂电极作为对电极、表面有TiO₂纳米管的医用金属钛片作为工作电极，采用计时电流法控制电化学反应的发生，电解质为硝酸铈的水溶液，硝酸铈的浓度为0.05mmol/L，电流密度为0.05mA/cm²，计时沉积30min,得到高Ce³⁺含量(Ce³⁺含量为72.07％)的氧化铈/氧化钛异质结薄膜。

由图1可知，较高Ce³⁺含量的纳米管状氧化铈/氧化钛异质结薄膜中TiO₂纳米管为锐钛矿相，纳米CeO_2-x颗粒为立方萤石相结构。

由图2中XPS的全谱可知，样品主要含有Ce、Ti和O三种元素组成。由Ce 3d轨道的精细谱图及对铈离子的价态进行拟合分析可知，实施例1成功制备得到了较高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，其中高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜中Ce³⁺的含量约为72.07％。

由图3的SEM图观察可知，高Ce³⁺含量的纳米CeO_2-x纳米颗粒均匀分布于TiO₂纳米管表面，与TiO₂纳米管之间形成纳米异质结构。

B.高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜超氧化物歧化酶模拟活性检测

将样品裁成10×10×0.5mm尺寸，浸没于300μM的过氧化氢溶液中，所用过氧化氢溶液的体积为10mL，加入自由基捕捉剂BMPO，紫外灯辐照材料表面，在材料表面产生超氧根阴离子，BMPO会与超氧根自由基生成加合产物，通过ESR监测溶液中超氧根阴离子特征谱线的产生和消除情况。

由图4可知，光生电子和空穴可以在材料表面氧化H₂O₂产生大量的超氧根自由基，与光照瞬间相比，TiO₂纳米管表面超氧根自由基的含量没有发生明显的减少，而高Ce³⁺含量的纳米CeO_2-x颗粒的存在可以有效消除材料表面过多的超氧根自由基，表现为优异的超氧化物歧化酶模拟活性。

C.高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜过氧化氢酶模拟活性检测

(1)采用KMnO₄吸光度变化来检测溶液中H₂O₂的浓度变化。

KMnO₄与H₂O₂在酸性条件下能定量发生如下反应：2KMnO₄+5H₂O₂+3H₂SO₄＝K₂SO₄+2MnSO₄+8H₂O+5O₂。

其基本原理是：525nm处的吸光度(A_KMnO4)与反应后KMnO₄的浓度(c_KMnO4)呈正比，而反应后的KMnO₄的浓度＝反应前总的KMnO₄浓度-0.4×H₂O₂的浓度。因此，H₂O₂的浓度与反应中消耗的KMnO₄的浓度成正比，即与体系吸光度的变化值呈正比。将样品(尺寸10×10×0.5mm)浸没于300μM的过氧化氢溶液中2h，所用溶液体积为4mL，取上清液1mL,加入1mLH₂SO₄(9.0mol/L)和1mL KMnO₄(3.2mmol/L)，加去离子水定容到4mL，溶液吸光度的变化值和H₂O₂浓度的变化值正相关。

(2)将样品(尺寸10×10×0.5mm)浸没于300μM的过氧化氢溶液中，所用溶液体积为4mL，采用溶氧测定仪实时监测溶液中氧气的浓度。溶液中氧气的相对浓度越高，说明样品催化分解过氧化氢的能力越强。

由如图5中(A)和图5中的(B)所示的溶液中H₂O₂浓度变化以及溶液中溶解氧的浓度随时间变化可知，相对于医用金属钛和TiO₂纳米管表面，高Ce³⁺含量的CeO_2-x/TiO₂异质结薄膜能明显催化分解过氧化氢并伴随氧气的释放，表现为过氧化氢酶模拟活性。

D.H₂O₂模拟的氧化应激条件下，高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜表面成骨细胞黏附形态观察及荧光骨架观察

将MC3T3-E1细胞按1×10⁴/孔的密度接种于放置有各组样品的24孔板内，培养24h。到时间点后，弃培养液，PBS清洗两遍。使用2％戊二醛4℃下处理样品过夜，然后PBS冲洗两遍。分别以30％、50％、70％、90％、100％、100％的酒精梯度脱水，每个浓度脱水10min。喷金处理后，使用扫描电子显微镜观察细胞形貌。

将MC3T3-E1细胞以1×10⁴/孔的密度接种于放置有各组样品的24孔板内，培养24h。到时间点后，操作如下：弃培养基，用PBS清洗两遍，然后使用4％多聚甲醛在室温下固定15-20min，PBS清洗三遍。使用0.1％的Triton X-100(PBS溶液中)室温破膜10min，再用1％BSA封闭液(In PBS)在37℃下处理1h。PBS清洗两遍后，使用vinculin一抗(CST)在4℃下处理过夜。PBS清洗三遍，使用actin二抗(CST)在37℃下处理1h。加入按说明书要求稀释后的鬼笔环肽(Molecular Probes)，室温避光40min-45min，PBS洗三遍，每次5min。使用4’,6-二脒基-2苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，Sigma)染色剂室温避光孵育3-5min，PBS洗三遍，每次5min。最后使用激光共聚焦显微镜对细胞进行观察。

由图6中(A)和(B)可知，H₂O₂模拟的氧化应激会抑制成骨细胞在材料表面的黏附和铺展，而成骨细胞在实施例1制备高Ce³⁺含量的的纳米管状的氧化铈/氧化钛异质结薄膜表面，与Ti和TiO₂纳米管表面相比，呈现出更加良好的铺展形貌。

E.H₂O₂模拟的氧化应激条件下，高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜促成骨分化能力检测

采用蒸汽灭菌器(121℃，30min)对样品进行灭菌消毒，将各组无菌材料小心置于48孔细胞培养板中。收集生长状态良好的MC3T3-E1细胞，消化并调整细胞悬液浓度。取1mL细胞悬液(50000个细胞/mL)种植在样品表面，氧化应激组为过氧化氢终浓度为300μM的培养基。在37℃、5％CO₂细胞培养箱中分别培养7和14天后，弃去培养液。每孔分别加入300μL0.1％Triton X-100(PBS稀释)。用枪头反复吸取吹打样品表面后，将孔内液体和泡沫一起吸取至EP管内离心(10000转，5min)。配制显色底物溶液和标准品工作液(0.5mM)，参考表1使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μL。借助摇床(50rpm/min)混匀液体后，37℃孵育10min。每孔加入100μL终止液，利用酶标仪在405nm处测定吸光度。将总蛋白浓度归一化后，得到ALP定量结果。

表1空白对照孔、标准品孔和样品孔的设置说明

	空白对照	标准品	样品
				检测缓冲液	50μL	100-x	-
显色底物	50μL	-	50
				样品	-	-	50
标准品工作液	-	x	-

由图6中(C)可知，H₂O₂模拟的氧化应激会抑制早期成骨分化标志ALP的表达，高Ce^{3 +}含量的纳米CeO_2-x颗粒的存在有利于促进成骨细胞的早期分化，这与其具有多种酶模拟活性而具抗氧化保护能力有关。

实施例2低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜(CeO_2-x/TiO₂-IV)

A.低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的制备

首先，采用双电极模式，导电金属铂作为阴极、医用金属钛片作为阳极，电解质溶液为包含氟化铵水溶液和丙三醇的混合溶液，氟化铵的质量分数约为0.015％，丙三醇与水的体积比约为1:1，采用恒电压模式，20V电压下阳极氧化20min,在医用金属钛片表面得到原位生长的非晶态的TiO₂纳米管；然后，选用三电极模式，金属铂电极作为对电极、表面有TiO₂纳米管的医用金属钛片作为工作电极，采用计时电流法控制电化学反应的发生，电解质为硝酸铈的水溶液，硝酸铈的浓度为0.05mmol/L，电流密度为0.05mA/cm²，计时沉积30min，得到高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，在空气中450℃，退火120min，得到Ce^{3 +}含量较低(Ce³⁺的含量约为29.62％)的氧化铈/氧化钛异质结薄膜。

由图1可知，低Ce³⁺含量的纳米管状氧化铈/氧化钛异质结薄膜与高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的相组成相同。

由图2中XPS的全谱以及Ce 3d轨道的精细谱图可知，实施例2成功实现了对铈离子价态的调控，低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜中Ce³⁺的含量约为29.62％。

由图3的SEM图观察可知，低Ce³⁺含量的纳米CeO_2-x纳米颗粒均匀分布于TiO₂纳米管表面，与TiO₂纳米管之间形成纳米异质结构。

B.低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜超氧化物歧化酶模拟活性检测

将样品裁成10×10×0.5mm尺寸，浸没于300μM的过氧化氢溶液中，所用溶液体积为10mL，加入自由基捕捉剂BMPO，紫外灯辐照材料表面在材料表面产生超氧根阴离子，BMPO会与超氧根自由基生成加合产物，通过ESR监测溶液中超氧根阴离子特征谱线的产生和消除情况。

由图4可知，低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的超氧化物歧化酶模拟活性低于高Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的超氧化物歧化酶模拟活性。

C.低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜过氧化氢酶模拟活性检测

(1)采用KMnO₄吸光度变化来检测溶液中H₂O₂的浓度变化。

KMnO₄与H₂O₂在酸性条件下能定量发生如下反应：2KMnO₄+5H₂O₂+3H₂SO₄＝K₂SO₄+2MnSO₄+8H₂O+5O₂。

其基本原理是：525nm处的吸光度(A_KMnO4)与反应后KMnO₄的浓度(c_KMnO4)呈正比，而反应后的KMnO₄的浓度＝反应前总的KMnO₄浓度-0.4×H₂O₂的浓度。因此，H₂O₂的浓度与反应中消耗的KMnO₄的浓度成正比，即与体系吸光度的变化值呈正比。将样品(10×10×0.5mm)浸没于300μM的过氧化氢溶液中2h，所用溶液体积为4mL，取上清液1mL,加入1mL H₂SO₄(9.0mol/L)和1mL KMnO₄(3.2mmol/L)，加去离子水定容到4mL，溶液吸光度的变化值和H₂O₂浓度的变化值正相关。

(2)将样品(尺寸10×10×0.5mm)浸没于300μM的过氧化氢溶液中，所用溶液体积为4mL，采用溶氧测定仪实时监测溶液中氧气的浓度。溶液中氧气的相对浓度越高，说明样品催化分解过氧化氢的能力越强。

由如图5中(A)和(B)所示溶液中H₂O₂的浓度变化和氧气的含量随时间变化可知，低Ce³⁺含量的薄膜表面H₂O₂的浓度最低，溶解氧的浓度最高，因此低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜同样具有过氧化氢酶模拟活性，且其过氧化氢酶模拟活性较高Ce³⁺含量的异质结薄膜更为优异。

D.低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜表面成骨细胞黏附形态观察及荧光骨架观察

将MC3T3-E1细胞按1×10⁴/孔的密度接种于置放有各组样品的24孔板内，培养24h。到时间点后，弃培养液，PBS清洗两遍。使用2％戊二醛4℃下处理样品过夜，然后PBS冲洗两遍。分别以30％、50％、70％、90％、100％、100％的酒精梯度脱水，每个浓度脱水10min。喷金处理后，使用扫描电子显微镜观察细胞形貌。

将MC3T3-E1细胞以1×10⁴/孔的密度接种于置放有各组样品的24孔板内，培养24h。到时间点后，操作如下：弃培养基，用PBS清洗两遍，然后使用4％多聚甲醛在室温下固定15-20min，PBS清洗三遍。使用0.1％的Triton X-100(PBS溶液中)室温破膜10min，再用1％BSA封闭液(In PBS)在37℃下处理1h。PBS清洗两遍后，使用vinculin一抗(CST)在4℃下处理过夜。PBS清洗三遍，使用actin二抗(CST)在37℃下处理1h。加入按说明书要求稀释后的鬼笔环肽(Molecular Probes)，室温避光40min-45min，PBS洗三遍，每次5min。使用4’,6-二脒基-2苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，Sigma)染色剂室温避光孵育3-5min，PBS洗三遍，每次5min。最后使用激光共聚焦显微镜对细胞进行观察。

由图6中(A)和(B)可知，成骨细胞在实施例2制备的低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜表面，与高Ce³⁺含量的异质结薄膜相比，低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜表面成骨细胞的黏附、铺展以及分化情况最优。

E.低Ce³⁺含量的氧化铈/氧化钛异质结薄膜促成骨分化能力检测

采用蒸汽灭菌器(121℃，30min)对样品进行灭菌消毒，将各组无菌材料小心置于48孔细胞培养板中。收集生长状态良好的MC3T3-E1细胞，消化并调整细胞悬液浓度。取1mL细胞悬液(50000个细胞/mL)种植在样品表面，氧化应激组为过氧化氢终浓度为300μM的培养基。在37℃、5％CO₂细胞培养箱中分别培养7和14天后，弃去培养液。每孔分别加入300μL0.1％Triton X-100(PBS稀释)。用枪头反复吸取吹打样品表面后，将孔内液体和泡沫一起吸取至EP管内离心(10000转，5min)。配制显色底物溶液和标准品工作液(0.5mM)，参考表1使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40μL。借助摇床(50rpm/min)混匀液体后，37℃孵育10min。每孔加入100μL终止液，利用酶标仪在405nm处测定吸光度。将总蛋白浓度归一化后，得到ALP定量结果。

表2空白对照孔、标准品孔和样品孔的设置说明

	空白对照	标准品	样品
				检测缓冲液	50μL	100-x	-
显色底物	50μL	-	50
				样品	-	-	50
标准品工作液	-	x	-

由图6中(C)可知，低Ce³⁺含量的CeO_2-x/TiO₂异质结薄膜较高Ce³⁺含量的异质结薄膜的过氧化氢酶模拟活性更加优异，因此在H₂O₂模拟的氧化应激环境下，具有更优异的抗氧化保护和促进成骨细胞分化的能力，更加有利于ALP活性的提高。

Claims (13)

1.一种具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，其特征在于，所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜是指在基材表面原位生长的纳米管状的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，包括TiO₂纳米管和均匀负载于TiO₂纳米管表面并与TiO₂纳米管之间形成纳米异质结构的纳米CeO_2-x颗粒，其中0.12≤x≤0.50。

2.根据权利要求1所述的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，其特征在于，0.15≤x≤0.36。

3.根据权利要求1所述的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，其特征在于，所述纳米CeO_2-x颗粒中Ce³⁺和Ce⁴⁺共存，其中Ce³⁺/（Ce³⁺+ Ce⁴⁺）的比例为25~75%。

4.根据权利要求3所述的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，其特征在于，Ce³⁺/（Ce³⁺+ Ce⁴⁺）的比例为30~50%。

5.根据权利要求1所述的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，其特征在于，所述TiO₂纳米管为锐钛矿相TiO₂纳米管。

6.根据权利要求1所述的氧化铈/氧化钛异质结薄膜，其特征在于，所述氧化铈/氧化钛异质结薄膜中，Ce原子的占比为10%，Ti原子的占比为30%，O原子的占比为60%。

7.制备权利要求1至6中任一项所述的具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过阳极氧化法在钛基材表面原位形成TiO₂纳米管；

采用电化学沉积法在TiO₂纳米管表面负载纳米CeO_2-x颗粒以制备异质结薄膜。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对表面负载纳米CeO_2-x颗粒的TiO₂纳米管进行退火处理以使至少部分TiO₂纳米管为锐钛矿相。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述退火的气氛为空气气氛或氧气气氛，温度为350~500℃，时间为20~120分钟。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以金属铂片作为阴极，以钛或钛合金作为阳极，以氟化铵溶液和丙三醇组成的混合溶液作为电解质溶液进行所述阳极氧化，所述阳极氧化的电压为10 ~ 30V，氧化时间为15 ~ 60 分钟。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述电化学沉积法为：以导电金属铂片作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以表面原位生长有二氧化钛纳米管的钛或钛合金作为工作电极，硝酸铈溶液作为电解液，采用计时电流法制备异质结薄膜。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，采用的电流密度为0.05 ~ 0.08 mA/cm²，电化学沉积时间为15 ~ 60 分钟。

13.权利要求1至6中任一项所述的具备生物抗氧化功能的氧化铈/氧化钛异质结薄膜在制备硬组织修复与替换生物材料中的应用。

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