CN113388677A - 包括ifi44的干燥症诊断标志物组合 - Google Patents

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Abstract

本课题组提供了可以高效准确诊断干燥症的标志物组合，所述标志物组合中包含IFI44；优选地，所述标志物组合还包括RSAD2和/或IFI44L。同时提供了检测所述标志物组合的试剂组合、试剂盒及其应用；所述试剂组合、试剂盒中包括检测前述标志物组合中任一标志物的表达量的试剂中的一种或多种。

Description

包括IFI44的干燥症诊断标志物组合
技术领域
本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及包括IFI44的干燥症诊断标志物组合。
背景技术
干燥综合征(SS，干燥症)是一个主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病，又名自身免疫性外分泌腺体上皮细胞炎或自身免疫性外分泌病。主要表现为干燥性角膜、结膜炎、口腔干燥症或伴发类风湿性关节炎等其它风湿性疾病，它可累及其他系统如呼吸系、消化系、泌尿系、血液系、神经系以及肌肉、关节等造成多系统、多器官受损它可累及其他系统如呼吸系、消化系、泌尿系、神经系以及肌肉、关节等造成多系统、多器官受损。其血清中则有多种自身抗体和高免疫球蛋白血症。本病分为原发性和继发性两类。
原发性干燥综合征属全球性疾病，在我国人群的患病率为0.3％～0.7％，在老年人群中患病率为3％～4％。本病女性多见，男女比为1：9～20。发病年龄多在40岁～50岁。也见于儿童。
发明内容
本课题组通过对数据集数据的筛选验证，提供了可以高效准确诊断干燥症的标志物组合。同时提供了检测干燥症的试剂组合、试剂盒及其应用。
标志物组合
一方面本发明提供了一种诊断干燥症的标志物组合，所述标志物组合中包含IFI44。
优选地，所述标志物组合还包括RSAD2和/或IFI44L。
优选地，所述干燥症是原发性干燥症。
优选地，所述IFI44在患者中高表达。
优选地，所述RSAD2在患者中高表达。
优选地，所述IFI44L在患者中高表达。
优选地，所述标志物组合还包括其他基因。
优选地，所述IFI44的基因序列是人第1号染色体的第78648943-78664078位。
优选地，所述RSAD2的基因序列是人第2号染色体的第6865733-6898239位。
优选地，所述IFI44L的基因序列是人第1染色体的第78620412-78646145位。
优选地，所述高表达指所述基因的表达水平大于健康对照群体该基因的表达水平，相对于对照表达水平高至少1.1倍，例如至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多。
检测表达量的试剂组合
另一方面，本发明提供了检测前述标志物组合表达量的试剂组合，所述试剂组合包括检测前述标志物组合中任一标志物的表达量的试剂中的一种或多种。
优选地，所述检测前述标志物组合中任一标志物的表达量的试剂包括检测mRNA表达量和/或蛋白表达量的试剂。
优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的定量检测方法、Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台。
优选地，所述基于PCR的定量检测方法包括将mRNA逆转录为cDNA的步骤和/或测量cDNA的含量的步骤。
优选地，所述测量cDNA的含量的方法包括但不限于PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM。
优选地，所述基于PCR的定量检测方法包括探针法和染料法。
优选地，所述基于PCR的定量检测方法所使用的试剂包括特异性引物和/或探针。
优选地，所述探针包括杂交型探针和水解型探针(Taqman探针)。
优选地，所述探针上连接有可检测标记物。
优选地，所述可检测标记物包括但不限于荧光染料(荧光分子，荧光基团)、化学发光标记物、磷光分子、生物素、放射性同位素、在UV光谱中进行吸收的分子、在近红外辐射中能够进行吸收的分子或远红外辐射中能够进行吸收的分子中。
优选地，所述的荧光染料(荧光分子，荧光基团)包括但不限于FAM(羧基荧光素，Carboxy fluorescein，绿色荧光)、FITC(异硫氰酸荧光素，Fluoresceinisothiocyanate)、TET(四氯-6-羧基荧光素，Tetrachloro fluorescein)、HEX(六氯-6-甲基荧光素，Hexachloro fluorescein)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、罗丹明类(Rhodamine染料如R110，TAMRA、Texas Red等)、ROX、AlexaFluor染料、ATTO染料、DyLight染料、cyanine染料(如Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy3b，Cy5，Cy5.5，Cy7，Cy7.5)、FluoProbes染料、SulfoCy染料、Seta染料、IRIS染料、SeTau染料、SRfluor染料、Square染料。
优选地，所述化学发光标记物包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精(Lucigenin)、过氧草酸酯(Peroxyoxalate)等。
优选地，所述鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、4-氨基己基-N-乙基异鲁米诺等，鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的化学发光。
优选地，所述光泽精(N，N-二甲基二吖啶硝酸盐，Lucigenin)自身在碱性环境中产生微弱的化学发光，加入过氧化氢时化学发光强度会大大增加，被氧化而发出420-500nm的光，具有较高的发光效率。
优选地，所述过氧草酸酯(peroxalate)的化学发光反应涉及过氧化氢与芳基草酸酯之间的反应。
优选地，所述荧光素酶包括但不限于长腹水蚤(Gaussia)荧光素酶、海肾(Renilla)荧光素酶、腰鞭毛虫荧光素酶、萤火虫荧光素酶、真菌荧光素酶、细菌荧光素酶和弯喉萤(vargula)荧光素酶。
优选地，所述探针上还可以连接有淬灭基团。
优选地，所述淬灭基团包括但不限于3'-BBQ-650(Black Berry Quencher 650)、BHQ-0(Black Hole Quencher 0，3')、BHQ-1(Black Hole Quencher 1，3')、BHQ-2(BlackHole Quencher 2，3')、BHQ-3(Black Hole Quencher 3，3')、BHQ-1(Black HoleQuencher-1，5')、BHQ-2(Black Hole Quencher-2，5')、BHQ-3(Black Hole Quencher-3，5')、Atto 540Q、Atto 575Q、Atto 612Q、BBQ-650NHS(Black Berry Quencher 650NHS)、BBQ-650-dT(Black Berry Quencher650dT)、BHQ-1-NHS(Black Hole Quencher 1NHS)、BHQ-1-dT(Black Hole Quencher 1dT)、BHQ-2-dT(Black Hole Quencher 2dT)、DabcylQuencher deoxythymidine dT、Dabcyl Quencher-3'、Dabcyl-5'、MGB 3'CDPI3、MGB-5'CDPI3、Tamra NHS、TAMRA-3'(Carboxytetramethylrhodamine)、Tamra-dT(Carboxytetramethylrhodamine-dT)。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹(Western Blot法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括前述标志物组合中任一标志物的抗体或其片段，所述抗体或其片段能特异性的与所述标志物所表达的蛋白结合。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂还包括二抗，所述二抗能与前述标志物组合中任一标志物的抗体或其片段结合并且显色。
优选地，所述显色通过可检测标记物体现，所述可检测标记物与前述一致。
优选地，所述试剂组合中还包括处理样品的试剂。
优选地，所述样品包括：组织、血液尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。
优选地，所述血液包括：血清、血浆、全血。
优选地，所述血液是全血。
试剂盒
另一方面，本发明提供了检测前述标志物组合表达量的试剂盒，所述试剂盒中包括但不限于前述试剂组合、mRNA表达量辅助检测试剂、蛋白表达量辅助检测试剂、mRNA表达量辅助检测仪器、蛋白表达量辅助检测仪器。
优选地，所述mRNA表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂，RNA提取试剂，逆转录试剂，cDNA扩增试剂，制备标准曲线所用的标准品，阳性对照品，阴性对照品。
优选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液，抗体稀释液，洗涤缓冲液，显色终止液，制备标准曲线的标准品。
诊断疾病的应用
另一方面，本发明提供了前述检测标志物组合表达量的试剂在制备诊断受试者是否患有干燥症的产品中的应用。
诊断疾病的方法
另一方面本发明提供了诊断干燥症的方法，所述方法包括检测检测前述标志物组合的表达量。
附图说明
图1为IFI27在两个数据库中差异表达结果图，A是在GSE84844数据集中的结果，B是在GSE66795数据集中的结果。
图2为IFI44L在两个数据库中差异表达结果图，A是在GSE84844数据集中的结果，B是在GSE66795数据集中的结果。
图3为RSAD2在两个数据库中差异表达结果图，A是在GSE84844数据集中的结果，B是在GSE66795数据集中的结果。
图4为IFI44在两个数据库中差异表达结果图，A是在GSE84844数据集中的结果，B是在GSE66795数据集中的结果。
图5为IFIT1在两个数据库中差异表达结果图，A是在GSE84844数据集中的结果，B是在GSE66795数据集中的结果。
图6为IFI27和IFI44联合检测时的AUC曲线图。
图7为IFIT1和IFI44联合检测时的AUC曲线图。
图8为RSAD2和IFI44联合检测时的AUC曲线图。
图9为IFI44L和IFI44联合检测时的AUC曲线图。
图10为IFI44L、RSAD2和IFI44联合检测时的AUC曲线图。
图11为IFI44L、RSAD2、IFI44和IFI27联合检测时的AUC曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、筛选差异表达基因并验证其诊断效果
为进一步研究干燥综合征的分子机制，并为干燥综合征致病的诊断提供更高效准确的标志物，我们在GEO数据库中检索原发性干燥综合征的转录组数据，检索关键词：(Sjogren’s syndrome)AND"Homo sapiens"[porgn:__txid9606]，得到2个相关数据集，数据集信息如下表1所示：
表1.干燥症的数据集信息
Figure BDA0003120405260000061
筛选在两个数据集中都差异表达的基因，得到IFI27、IFI44L、RSAD2、IFI44、IFIT1，其在两个数据库中差异表达结果图依次如图1-5所示。为进一步提高诊断效果，对筛选到的基因进行组合，在GSE84844数据库中筛选在诊断时AUC最高的标志物组合，AUC的统计信息如下表2所示，其中最后一列为附图序号：
表2.诊断干燥症时的AUC统计
行数 标志物 AUC 附图
1 IFI27 0.821111111
2 IFI44 0.895555556
3 IFI44L 0.847777778
4 IFIT1 0.878888889
5 RSAD2 0.86
6 IFI44+IFI27 0.891111 6
7 IFI44+IFIT1 0.893333 7
8 IFI44+RSAD2 0.945556 8
9 IFI44+IFI44L 0.952222 9
10 IFI44L+RSAD2+IFI44 0.964444 10
11 IFI44L+RSAD2+IFI44+IFI27 0.964444 11
结果如表2所示，当选择差异表达基因与IFI44结合时，只有RSAD2和IFI44L会使诊断AUC进一步提高，阴性对照基因(IFI27基因和IFIT1基因)则不能使IFI44的诊断效果进一步提高。
当IFI44、RSAD2和IFI44L三个基因组合时，AUC值会相较于两个基因的组合进一步提高，但是增加更多的基因不能使AUC继续升高。

Claims (10)

1.一种诊断干燥症的标志物组合，所述标志物组合中包含IFI44；
优选地，所述标志物组合还包括RSAD2和/或IFI44L；
优选地，所述干燥症是原发性干燥症。
2.如权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述IFI44在患者中高表达；
优选地，所述RSAD2在患者中高表达；
优选地，所述IFI44L在患者中高表达。
3.如权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述的IFI44的基因序列是人第1号染色体的第78648943-78664078位。
4.如权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述的RSAD2的基因序列是人第2号染色体的第6865733-6898239位。
5.如权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述的IFI44L的基因序列是人第1染色体的第78620412-78646145位。
6.一种检测权利要求1所述的标志物组合表达量的试剂组合，其特征在于，所述的试剂组合包括检测权利要求1所述的标志物组合中任一标志物的表达量的试剂中的一种或多种；
优选地，所述表达量包括mRNA表达量和/或蛋白表达量。
7.如权利要求6所述的试剂组合，其特征在于，所述检测mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的定量检测方法、Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台；
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片。
8.如权利要求7所述的试剂组合，所述试剂组合中还包括处理样品的试剂；
优选地，所述样品包括：组织、血液尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液；
优选地，所述血液包括：血清、血浆、全血；
优选地，所述血液是全血。
9.一种检测权利要求1所述的标志物组合的试剂盒，所述试剂盒中包括权利要求6所述的试剂组合、mRNA表达量辅助检测试剂、蛋白表达量辅助检测试剂中的一种或多种；
优选地，所述mRNA表达量辅助检测试剂包括但不限于：RNA提取试剂，制备标准曲线所用的标准品，阳性对照品，阴性对照品；
优选地，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液，洗涤缓冲液，显色终止液，制备标准曲线所用的标准品。
10.权利要求6所述的试剂组合和权利要求9所述的试剂盒在制备诊断受试者是否患有干燥症的产品中的应用。
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CN116287183A (zh) * 2022-11-18 2023-06-23 中国医学科学院北京协和医院 一组用于诊断干燥综合征的分子标志物组合
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