CN113388635A - 一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113388635A
CN113388635A CN202110770783.1A CN202110770783A CN113388635A CN 113388635 A CN113388635 A CN 113388635A CN 202110770783 A CN202110770783 A CN 202110770783A CN 113388635 A CN113388635 A CN 113388635A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vector
cas9
sgrna
pbi121
mcs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110770783.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113388635B (zh
Inventor
熊兴鹏
程文翰
胡玉婷
高莹莹
余小林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jingmen Chenlong Ecological Agriculture Technology Co ltd
Original Assignee
Jingchu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jingchu University of Technology filed Critical Jingchu University of Technology
Priority to CN202110770783.1A priority Critical patent/CN113388635B/zh
Publication of CN113388635A publication Critical patent/CN113388635A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113388635B publication Critical patent/CN113388635B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，首先得到串联两个sgRNA表达框的中间载体；然后得到pBI121‑MCS‑Cas9；再设计包含两条sgRNA的引物，以所述中间载体为模板进行PCR；最后通过同源重组把PCR产物连入pBI121‑MCS‑Cas9中。通过上述制备方法可制备得到所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体，以pBI121载体为骨架载体，依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2和Cas9表达框。本发明的方法提高了双靶点CRISPR/Cas9载体构建的效率，获得所述中间载体和所述pBI121‑MCS‑Cas9载体后，仅需设计一对引物进行一步PCR和一步同源重组即可成功构建双靶点CRISPR/Cas9载体，方便快捷。另外，本发明一次反应仅需20元，只需合成带接头的一对引物，不需额外的引物及其他试剂，显著降低了成本。

Description

一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
背景技术
CRISPR/Cas9已经成为目前最常用的基因编辑系统，CRISPR/Cas9包括2部分：Cas9核酸内切酶和sgRNA(single guide RNA)，sgRNA由天然的tracrRNA(transactivatingcrRNA)和crRNA(CRISPR RNA)融合而来。
sgRNA的5’端包括20nt的protospacer序列，该序列和靶向DNA序列互补以实现双链切割；其3’端则为固定的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffoldsequence)，该序列和Cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex,RNP)。
目前植物中双靶点CRISPR/Cas9载体构建的方法主要有以下几种：
(1)酶切连接-同源重组联用
以白菜中双靶点CRISPR/Cas9载体构建流程为例，如图1所示，通常先设计带接头的sgRNA31和sgRNA32，分别退火生成双链；再用Bbs I酶切sgRNA表达框，通过T4 DNA连接酶把sgRNA31和sgRNA32连入其表达框(psgR-Cas9-At)；然后设计新的引物克隆sgRNA32表达框，用同源重组的方法把两个sgRNA表达框串联起来；再用Hind III和EcoR I酶切中间载体psgR-Cas9-At和目标载体pBI121，最后通过T4 DNA连接酶把两条sgRNA和Cas9表达框连入目标载体，从而成功获得目标重组分子。
(2)Golden Gate组装法
该方法的酶切连接，可以在同一反应体系中进行，不需要分步骤进行。首先，利用限制性核酸内切酶将DNA的序列切割开来；同时，使用DNA连接酶，将DNA片段按既定的顺序连接起来，该DNA片段不含有酶切位点。此方法通过边切边连、重叠延伸PCR，制备出了sgRNA表达盒(2个两端带有酶切位点)，随后将sgRNA表达盒组装到CRISPR/Cas9载体上，从而使目标载体构建成功。
如图2所示，以PJG090为模板，在扩增中使用了含有用于Golden Gate克隆的接头(OJH307和OJH308)的引物。推荐的试剂如下：1μL PCR产物，50ng PJG112、1μL CutsmartBuffer(NEB)，0.4μL T4连接酶缓冲液(NEB)，5U Bsa I(NEB)，20U T4DNA连接酶(NEB)，并将ddH2O补齐至10μL。将反应孵育20～25个循环(37℃2min，20℃5min)，然后分别在50℃和80℃孵育5min。随后，将1μL产物引入到Trans T1感受态细胞中。阳性克隆通过克隆PCR鉴定并测序。
(3)Gibson组装法
这项技术需要通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为15～40bp，同时要求这部分对应的退火温度高于48℃。首先需要设计引物扩增出这两个DNA片段，同时这个两个DNA片段有各有一部分是同源的，便于它们之间进行连接；同时这两个DNA片段与载体上各有一部分是同源的，便于它们与载体进行连接。然后，两个DNA片段进行克隆之后，需要进行DNA纯化。最后将线性化的载体片段，这两个DNA片段和Gibsonassembly master mix孵育1h后直接转化感受态细胞。该方法成功率非常高，一般不需要筛选很多克隆就可以拿到正确的克隆。Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性末端形成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，成功率会大受影响。
(4)Gateway组装法
Gateway技术是基于λ噬菌体位点的特异重组系统(attB×attP→attL×attR)。包括BP和LR两个反应。首先，利用BP反应，创建一个入门克隆，利用attB DNA片段或表达克隆和attP供体载体之间的重组反应，在22℃下反应30min，得到入门克隆；再进行LR反应，得到一个或更多个目的载体，此步骤是通过attL入门克隆和attR目的载体之间的重组反应，在22℃下反应3h，使平行的反应中的目的序列转移；最后，质粒酶切体系，37℃反应3h，来检测是否构建成功。
(5)同源重组法
利用在线工具设计合成sgRNA(加上接头)，再用Bbs I酶切sgRNA表达框，通过T4DNA连接酶把sgRNA连入其表达框(pMD18T-Cas9)；进行PCR扩增，通过与目标片段(pBI121)的同源序列片段交换，使外源性DNA片段取代原位点的基因，达到构建目标载体的目的。从而避免了因随机插入得不到调控和表达，以及激活或失活插入位点附近的基因等麻烦问题。
最终的gRNA表达盒的示意图显示在顶部面板中。使用一组四个通用引物(p1F，p2F，g1R和g2R)和四个靶标特异性引物(用于原型间隔物靶标1的g1F和p1R，以及用于原型间隔物靶标2的g2F和p2R)，四个片段，A，B，C和在第1轮PCR中，使用pEn-Chimera-ccdB质粒对D进行PCR扩增。在第2轮PCR中，使用引物p1F和g1R将片段A和B融合，得到片段AB，使用引物p2F和g2R将片段C和D融合，得到片段CD。在第3步中，使用
Figure BDA0003152874470000031
HD克隆系统将片段AB和CD克隆到pDe-Cas9-D10A或pUC57GW中，流程如图3所示。
现有文献报道的植物中双靶点CRISPR/Cas9载体构建过程复杂、实验周期长、成本高，所以亟需一种构建过程简单、实验周期短、成本低的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法及载体。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，为了简化构建植物双靶点CRISPR/Cas9载体的步骤，提高构建载体的效率并降低构建载体的成本，本发明公开了一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，首先克隆sgRNA表达框，通过同源重组把sgRNA表达框插入psgR-Cas9-At载体，得到串联两个sgRNA表达框的中间载体；然后通过酶切连接把sgRNA表达框和Cas9表达框插入pBI121载体，得到pBI121-Cas9；随后把sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点，得到pBI121-MCS-Cas9；再设计包含两条sgRNA的引物，以串联两个sgRNA表达框的中间载体为模板进行PCR；最后通过同源重组把上一步的产物连入pBI121-MCS-Cas9中。通过上述制备方法可制备得到所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体，以pBI121载体为骨架载体，依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2和Cas9表达框。
本发明提供一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括如下步骤：
S1：克隆sgRNA表达框，所述sgRNA表达框依次连接有启动子和sgRNA支架，通过同源重组的方法把所述sgRNA表达框插入psgR-Cas9-At骨架载体，所述psgR-Cas9-At骨架载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、Cas9表达框，所述启动子为U6-26或U3，所述U6-26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，此步得到串联两个所述sgRNA表达框的中间载体；
S2：通过酶切连接的方法把所述sgRNA表达框和所述Cas9表达框插入pBI121骨架载体，得到pBI121-Cas9；
S3：把步骤S2产物中所述sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点，得到pBI121-MCS-Cas9，所述MCS为多克隆位点；
S4：根据靶基因的DNA序列，设计2条sgRNA序列，分别为sgRNA1和sgRNA2，根据酶切位点的侧翼序列在所述sgRNA序列上加上接头作为PCR引物，所述PCR引物以步骤S1获得的所述中间载体为模板进行PCR扩增；
S5：通过同源重组的方法把步骤S4的PCR产物连入步骤S3的所述pBI121-MCS-Cas9中，获得所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体。
进一步的，所述步骤S1中克隆sgRNA表达框使用的2对引物为：
2*U6-26-HR-F1：ACGACGGCCAGTGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；
2*U6-26-HR-R1：CAAAAACTCCGAATGAAAAAAGCACCGACTCGGTG；
2*U6-26-HR-F2：CCGAGTCGGTGCTTTTTTCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；
2*U6-26-HR-R2：CAATTTGTGAAATATAAAAAAGCACCGACTCGGTG；
所述psgR-Cas9-At骨架载体使用Sma I进行单酶切线性化。
进一步的，所述步骤S2中分别用Hind III和EcoR I双酶切所述psgR-Cas9-At骨架载体和所述pBI121骨架载体，酶切产物分别电泳后切胶回收，再用T4 DNA连接酶连接，得到所述pBI121-Cas9。
进一步的，所述步骤S3中设计两对引物，以所述psgR-Cas9-At骨架载体为模板，分别克隆所述U6-26启动子和所述sgRNA支架；Hind III和Sma I双酶切所述pBI121-Cas9骨架载体，所述U6-26启动子和所述sgRNA支架以及双酶切后的pBI121-Cas9骨架载体同源重组，得到所述pBI121-MCS-Cas9；
步骤S3中使用的2对引物为：
Bpi-MCS-121HR-F1：CATGATTACGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；
Bpi-MCS-MR1：CTAAAACAAGCTTGTCGACCTCGAGCAATCACTACTTCGA
CTCTAGCTGTATATAA；
Bpi-MCS-MF2：GTGATTGCTCGAGGTCGACAAGCTTGTTTTAGAGCTAGAA
ATAGCAAGTTAAAATA；
Bpi-MCS-121HR-R2：CAATTTGTGAAATATAAAAAAGCACCGACTCGGTG。
进一步的，所述步骤S3中所述多克隆位点为Xho I-Sal I-Hind III。
进一步的，所述步骤S5中使用Xho I和Hind III双酶切或者Xho I、Sal I、HindIII中任意一种单酶切所述pBI121-MCS-Cas9使之线性化。
本发明还提供一种用于构建植物双靶点CRISPR/Cas9载体的载体组合，所述载体组合由中间载体和pBI121-MCS-Cas9组成；所述中间载体以psgR-Cas9-At为骨架载体，所述psgR-Cas9-At骨架载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、Cas9表达框，所述中间载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、启动子、sgRNA支架、Cas9表达框；所述pBI121-MCS-Cas9以pBI121为骨架载体，所述pBI121-MCS-Cas9上依次连接有启动子、多克隆位点、sgRNA支架、Cas9表达框；所述多克隆位点为Xho I-Sal I-Hind III，所述启动子为U6-26或U3，所述U6-26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体以pBI121载体为骨架载体，在所述pBI121骨架载体上依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2、Cas9表达框，所述sgRNA表达框1依次连接有启动子、sgRNA1、sgRNA支架，所述sgRNA表达框2依次连接有启动子、sgRNA2、sgRNA支架，所述启动子同时为U6-26或同时为U3，所述U6-26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体的使用方法，将所述双靶点CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，再通过浸花法或愈伤组织转化植物，对得到的T1代种子进行筛选，提取阳性苗的DNA进行PCR检测，用特异引物扩增两条sgRNA的侧翼序列，并进行电泳检测，把电泳条带有多态性的PCR产物进行测序，根据测序结果判断靶基因两条sgRNA处是否发生了基因编辑。
本发明还提供所述的植物双靶点CRISPR/Cas9载体的构建方法在植物基因编辑中的应用，所述植物选自拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱中的任意一种。拟南芥选用U6-26启动子，水稻、小麦、玉米、高粱选用U3启动子。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)提高了效率：本发明构建了包含2个串联sgRNA表达框的中间载体，设计引物之后可直接一步PCR反应得到“sgRNA1-sgRNA支架-启动子-sgRNA2”片段，不需要经过多轮PCR或者重叠PCR等步骤，有效减少实验步骤；以上PCR产物和线性化的pBI121-MCS-Cas9载体经一步同源重组即可得到最终载体，大大提高了构建双靶点CRISPR/Cas9载体的效率。
(2)降低了成本：现有技术采用Golden Gate克隆(50元/次)、Gibson组装(150元/次)、Gateway克隆(125元/次)、In-Fusion克隆(100元/次)等方法构建双靶点CRISPR/Cas9载体所用的中间载体或者其他试剂都比较贵，本发明的构建方法把sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成了多克隆位点(Xho I-Sal I-Hind III)，得到pBI121-MCS-Cas9，Xho I、Sal I和Hind III都比Bpi I酶便宜很多；本发明所用的试剂ClonExpress II One StepCloning Kit一次反应仅需20元。另外，本发明在载体组合构建成功后只需合成带接头的一对引物，不需额外的引物及其他试剂，也节约了不少成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为酶切连接-同源重组联用构建单靶点和双靶点CRISPR/Cas9载体流程。
图2为Golden Gate组装构建双靶点CRISPR/Cas9载体流程。
图3为In-Fusion法构建双靶点CRISPR/Cas9载体流程。
图4为本发明构建双靶点CRISPR/Cas9载体流程图。
图5为本发明的psgR-Cas9-At骨架载体图。
图6为本发明的pBI121骨架载体图。
图7为拟南芥At4g14730基因双靶点编辑结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明的植物双靶点CRISPR/Cas9载体的构建方法如下，流程如图4所示：
S1：克隆sgRNA表达框，通过同源重组的方法把sgRNA表达框插入psgR-Cas9-At骨架载体，得到串联两个sgRNA表达框的中间载体，所述psgR-Cas9-At骨架载体的载体图如图5所示；
S2：通过酶切连接的方法把sgRNA和Cas9表达框插入pBI121骨架载体，得到pBI121-Cas9，所述pBI121骨架载体的载体图如图6所示；
S3：把sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点，得到pBI121-MCS-Cas9；所述MCS为多克隆位点；
S4：设计包含两条sgRNA的引物，以串联两个sgRNA表达框的中间载体为模板进行PCR；
S5：通过同源重组的方法把S4的产物连入pBI121-MCS-Cas9中。
本发明的S1和S3的CRISPR/Cas9载体构建完成后，在之后应用过程中，只需设计一对包含两条sgRNA及接头的引物，以串联两个sgRNA表达框的中间载体为模板进行PCR，产物与酶切线性化的pBI121-MCS-Cas9直接进行一步同源重组，即可得到双靶点CRISPR/Cas9载体。
本发明的启动子可以选用U6-26或者U3，U6-26适用于拟南芥等双子叶植物，U3适用于水稻、小麦、玉米、高粱等单子叶植物，均可实现本发明的双靶点CRISPR/Cas9载体构建。以下实施例以U6-26为例说明本发明的构建方法。
实施例1
(1)构建包含2×(pAtU6-26-2×Bpi I-sgRNA支架)片段的中间载体；
利用CE Design V1.04软件(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，设计两对引物以psgR-Cas9-At为模板，分别克隆psgR-Cas9-At载体上的sgRNA表达框的启动子和sgRNA支架，Sma I(ThermoFisher)单酶切线性化psgR-Cas9-At载体，同源重组上述两个片段和载体，得到包含2×(pAtU6-26-2×Bpi I-sgRNA支架)的中间载体。所用两对引物序列如下所示：
Figure BDA0003152874470000071
Figure BDA0003152874470000081
(2)通过酶切连接的方法把sgRNA和Cas9表达框插入pBI121载体；
用Hind III(ThermoFisher)和EcoR I(ThermoFisher)双酶切psgR-Cas9-At载体及pBI121载体，酶切产物分别电泳后切胶回收，再用T4 DNA连接酶连接，得到pBI121-Cas9。
(3)把sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点，得到pBI121-MCS-Cas9；
设计两对引物(下表)，以psgR-Cas9-At为模板，分别克隆pAtU6-26和sgRNA支架；Hind III和Sma I双酶切pBI121-Cas9载体，以上两个片段和pBI121-Cas9线性化的载体同源重组，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒，得到pBI121-MCS-Cas9。
Figure BDA0003152874470000082
(4)设计包含两条sgRNA的引物，以(1)中得到的中间载体为模板进行PCR，PCR体系：2×phanta Max Buffer，25μL；dNTP Mix，1μL；Bpi-MCS-121HR-F1，2μL；Bpi-MCS-MR1，2μL；(1)中间载体，1μL；phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，1μL；ddH2O，18μL。PCR程序：94℃，3min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，90s，35个循环；72℃，5min。
根据靶基因的DNA序列，设计2条sgRNA，根据酶切位点的侧翼序列在sgRNA序列上加接头，加上接头的引物以(1)中得到的中间载体为模板进行PCR，得到“接头-sgRNA1-sgRNA支架-pAtU6-26-sgRNA2-接头”片段。
(5)通过同源重组的方法把上一步的产物连入pBI121-MCS-Cas9中。
Xho I和Hind III双酶切(或者Xho I、Sal I、Hind III单酶切)pBI121-MCS-Cas9使之线性化，线性化载体和(4)中片段进行同源重组，使用ClonExpress II One StepCloning Kit试剂盒，即可得到双靶点载体“pBI121-pAtU6-26-sgRNA1-sgRNA支架-pAtU6-26-sgRNA2-sgRNA支架-Cas9”。
实施例2
针对拟南芥At4g14730基因，利用本发明的技术构建了双靶点CRISPR/Cas9载体，并对哥伦比亚野生型拟南芥进行了遗传转化，最后得到了编辑植株，说明本发明的方法切实可行。首先针对At4g14730设计了两条sgRNA，即At4g14730-sg1：GGTGGTAACGAGCTGTATCC和At4g14730-sg2：TCTTTTTCGTCATCCTCCTC。设计并合成含有接头的引物，其中加粗的部分为sgRNA1的序列和sgRNA2的反向互补序列：
14730-sg1-F：TCGAAGTAGTGATTgGGTGGTAACGAGCTGTATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
14730-sg2-R：TAGCTCTAAAACGAGGAGGATGACGAAAAAGAAATCACTACTTCGACTCTAGCTGT
采用本发明中的(4)和(5)两步，成功构建双靶点CRISPR/Cas9载体，将构建得到的CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，通过浸花法转化拟南芥(水稻等单子叶植物可通过愈伤组织转化)，对得到的T1代种子进行筛选，提取阳性苗的DNA进行PCR检测，用特异引物14730SG-FP：GACGGAACAGTAACACCAGC和14730SG-RP：GCCACAACACTACAACACAC扩增两条sgRNA的侧翼序列，并进行电泳检测，发现电泳条带有多态性的，取PCR产物进行测序，结果表明靶基因两条sgRNA均处发生了编辑，如图7所示，sgRNA1附近的切割位点是45～46bp之间，sgRNA2附近的切割位点是209～210bp之间，造成了164bp的大片段缺失。
综合以上实施例，为了简化构建植物双靶点CRISPR/Cas9载体的步骤，提高构建载体的效率并降低构建载体的成本，本发明公开了一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，首先克隆sgRNA表达框，通过同源重组把sgRNA表达框插入psgR-Cas9-At载体，得到串联两个sgRNA表达框的中间载体；然后通过酶切连接把sgRNA表达框和Cas9表达框插入pBI121载体，得到pBI121-Cas9；随后把sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点，得到pBI121-MCS-Cas9；再设计包含两条sgRNA的引物，以串联两个sgRNA表达框的中间载体为模板进行PCR；最后通过同源重组把上一步的产物连入pBI121-MCS-Cas9中。通过上述制备方法可制备得到所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体，以pBI121载体为骨架载体，依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2和Cas9表达框。本发明构建了包含2个串联sgRNA表达框的中间载体，可为后续PCR反应直接提供“sgRNA1-sgRNA支架-启动子-sgRNA2”片段，减少实验步骤；把sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成了多克隆位点(Xho I-Sal I-Hind III)，得到pBI121-MCS-Cas9，Xho I、Sal I和Hind III都比Bpi I酶便宜很多；改造后可用单酶切线性化载体，也可用双酶切线性化载体，后者酶切更彻底，利于下一步同源重组反应；获得了中间载体和pBI121-MCS-Cas9载体后，仅需设计一对引物，进行一步PCR和一步同源重组即可成功构建双靶点CRISPR/Cas9载体，方便快捷。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1
CATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGG
SEQ ID NO.2
AAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGATGTGAAGAAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGC
SEQ ID NO.3
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
SEQ ID NO.4
GACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGAC
SEQUENCE LISTING
<110> 荆楚理工学院
<120> 一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
<130> 20210701
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 295
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
cattcggagt ttttgtatct tgtttcatag tttgtcccag gattagaatg attaggcatc 60
gaaccttcaa gaatttgatt gaataaaaca tcttcattct taagatatga agataatctt 120
caaaaggccc ctgggaatct gaaagaagag aagcaggccc atttatatgg gaaagaacaa 180
tagtatttct tatataggcc catttaagtt gaaaacaatc ttcaaaagtc ccacatcgct 240
tagataagaa aacgaagctg agtttatata cagctagagt cgaagtagtg attgg 295
<210> 2
<211> 380
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
aaggaatctt taaacatacg aacagatcac ttaaagttct tctgaagcaa cttaaagtta 60
tcaggcatgc atggatcttg gaggaatcag atgtgcagtc agggaccata gcacaagaca 120
ggcgtcttct actggtgcta ccagcaaatg ctggaagccg ggaacactgg gtacgttgga 180
aaccacgtga tgtgaagaag taagataaac tgtaggagaa aagcatttcg tagtgggcca 240
tgaagccttt caggacatgt attgcagtat gggccggccc attacgcaat tggacgacaa 300
caaagactag tattagtacc acctcggcta tccacataga tcaaagctga tttaaaagag 360
ttgtgcagat gatccgtggc 380
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgc 76
<210> 4
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 720
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080
ctgtctcagc tgggaggcga c 4101

Claims (10)

1.一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：克隆sgRNA表达框，所述sgRNA表达框依次连接有启动子和sgRNA支架，通过同源重组的方法把所述sgRNA表达框插入psgR-Cas9-At骨架载体，所述psgR-Cas9-At骨架载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、Cas9表达框，所述启动子为U6-26或U3，所述U6-26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，此步得到串联两个所述sgRNA表达框的中间载体；
S2：通过酶切连接的方法把所述sgRNA表达框和所述Cas9表达框插入pBI121骨架载体，得到pBI121-Cas9；
S3：把步骤S2产物中所述sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点，得到pBI121-MCS-Cas9，所述MCS为多克隆位点；
S4：根据靶基因的DNA序列，设计2条sgRNA序列，分别为sgRNA1和sgRNA2，根据酶切位点的侧翼序列在所述sgRNA序列上加上接头作为PCR引物，所述PCR引物以步骤S1获得的所述中间载体为模板进行PCR扩增；
S5：通过同源重组的方法把步骤S4的PCR产物连入步骤S3的所述pBI121-MCS-Cas9中，获得所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中克隆sgRNA表达框使用的2对引物为：
2*U6-26-HR-F1：ACGACGGCCAGTGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；
2*U6-26-HR-R1：CAAAAACTCCGAATGAAAAAAGCACCGACTCGGTG；
2*U6-26-HR-F2：CCGAGTCGGTGCTTTTTTCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；
2*U6-26-HR-R2：CAATTTGTGAAATATAAAAAAGCACCGACTCGGTG；
所述psgR-Cas9-At骨架载体使用Sma I进行单酶切线性化。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中分别用Hind III和EcoRI双酶切所述psgR-Cas9-At骨架载体和所述pBI121骨架载体，酶切产物分别电泳后切胶回收，再用T4 DNA连接酶连接，得到所述pBI121-Cas9。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中设计两对引物，以所述psgR-Cas9-At骨架载体为模板，分别克隆所述U6-26启动子和所述sgRNA支架；Hind III和Sma I双酶切所述pBI121-Cas9骨架载体，所述U6-26启动子和所述sgRNA支架以及双酶切后的pBI121-Cas9骨架载体同源重组，得到所述pBI121-MCS-Cas9；
步骤S3中使用的2对引物为：
Bpi-MCS-121HR-F1：CATGATTACGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；
Bpi-MCS-MR1：CTAAAACAAGCTTGTCGACCTCGAGCAATCACTACTTCGA
CTCTAGCTGTATATAA；
Bpi-MCS-MF2：GTGATTGCTCGAGGTCGACAAGCTTGTTTTAGAGCTAGAA
ATAGCAAGTTAAAATA；
Bpi-MCS-121HR-R2：CAATTTGTGAAATATAAAAAAGCACCGACTCGGTG。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中所述多克隆位点为XhoI-Sal I-Hind III。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S5中使用Xho I和Hind III双酶切或者Xho I、Sal I、Hind III中任意一种单酶切所述pBI121-MCS-Cas9使之线性化。
7.一种用于构建植物双靶点CRISPR/Cas9载体的载体组合，其特征在于，所述载体组合由中间载体和pBI121-MCS-Cas9组成；所述中间载体以psgR-Cas9-At为骨架载体，所述psgR-Cas9-At骨架载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、Cas9表达框，所述中间载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、启动子、sgRNA支架、Cas9表达框；所述pBI121-MCS-Cas9以pBI121为骨架载体，所述pBI121-MCS-Cas9上依次连接有启动子、多克隆位点、sgRNA支架、Cas9表达框；所述多克隆位点为Xho I-Sal I-Hind III，所述启动子为U6-26或U3，所述U6-26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体以pBI121载体为骨架载体，在所述pBI121骨架载体上依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2、Cas9表达框，所述sgRNA表达框1依次连接有启动子、sgRNA1、sgRNA支架，所述sgRNA表达框2依次连接有启动子、sgRNA2、sgRNA支架，所述启动子同时为U6-26或同时为U3，所述U6-26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
9.一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体的使用方法，所述CRISPR/Cas9载体为权利要求8的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，将所述双靶点CRISPR/Cas9载体转化农杆菌，再通过浸花法或愈伤组织转化植物，对得到的T1代种子进行筛选，提取阳性苗的DNA进行PCR检测，用特异引物扩增两条sgRNA的侧翼序列，并进行电泳检测，把电泳条带有多态性的PCR产物进行测序，根据测序结果判断靶基因两条sgRNA处是否发生了基因编辑。
10.权利要求1所述的植物双靶点CRISPR/Cas9载体的构建方法在植物基因编辑中的应用，所述植物选自拟南芥、水稻、小麦、玉米、高粱中的任意一种。
CN202110770783.1A 2021-07-07 2021-07-07 一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 Active CN113388635B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110770783.1A CN113388635B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110770783.1A CN113388635B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113388635A true CN113388635A (zh) 2021-09-14
CN113388635B CN113388635B (zh) 2022-08-19

Family

ID=77625458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110770783.1A Active CN113388635B (zh) 2021-07-07 2021-07-07 一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113388635B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112435A (zh) * 2015-08-09 2015-12-02 中国水稻研究所 植物多基因敲除载体的构建及应用
WO2019075159A1 (en) * 2017-10-13 2019-04-18 Intrexon Corporation EDITION OF EVOLVED GENOME
WO2020071528A1 (ja) * 2018-10-04 2020-04-09 株式会社カネカ 植物のゲノム編集に用いられるｄｎａ構築物
CN113073110A (zh) * 2021-03-10 2021-07-06 中国农业科学院作物科学研究所 用于缩短水稻抽穗期的蛋白质及其编码基因与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112435A (zh) * 2015-08-09 2015-12-02 中国水稻研究所 植物多基因敲除载体的构建及应用
WO2019075159A1 (en) * 2017-10-13 2019-04-18 Intrexon Corporation EDITION OF EVOLVED GENOME
WO2020071528A1 (ja) * 2018-10-04 2020-04-09 株式会社カネカ 植物のゲノム編集に用いられるｄｎａ構築物
CN113073110A (zh) * 2021-03-10 2021-07-06 中国农业科学院作物科学研究所 用于缩短水稻抽穗期的蛋白质及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XINGPENG XIONG等: "Efficient genome editing of Brassica campestris based on the CRISPR/Cas9 system", 《MOLECULAR GENETICS AND GENOMICS》 *
杨锋等: "梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立", 《园艺学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113388635B (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Development of plant prime-editing systems for precise genome editing
CN105132451B (zh) 一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用
Zhang et al. CRISPR/Cas9-based genome editing in plants
CN110157726B (zh) 植物基因组定点替换的方法
CN110607320B (zh) 一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体及其应用
CN110747187B (zh) 识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法
WO2018098935A1 (zh) 一种用于植物基因组定点碱基替换的载体
Hsu et al. Application of Cas12a and nCas9-activation-induced cytidine deaminase for genome editing and as a non-sexual strategy to generate homozygous/multiplex edited plants in the allotetraploid genome of tobacco
CN113717960A (zh) 一种新Cas9蛋白、CRISPR-Cas9基因组定向编辑载体及基因组编辑方法
CN116063549A (zh) 一种碱基编辑系统及其应用
Char et al. CRISPR/Cas9 for mutagenesis in rice
CN113564197B (zh) 一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用
CN113846075A (zh) Mad7-nls融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物及其应用
US20220315938A1 (en) AUGMENTED sgRNAS AND METHODS FOR THEIR USE TO ENHANCE SOMATIC AND GERMLINE PLANT GENOME ENGINEERING
CN113388635B (zh) 一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
EP3802833A1 (en) Gene targeting
WO2018082611A1 (zh) 在植物细胞内表达外源基因的核酸构建物及其应用
Venkatesh et al. Heat stress induced potato virus X-mediated CRISPR/Cas9 genome editing in Nicotiana benthamiana
CN115927447A (zh) 一种无转基因残留基因编辑载体、构建方法及应用
Ren et al. Targeted genome editing in grape using multiple CRISPR-guided editing systems
CN117286178B (zh) 一种双组份病毒载体的简化构建方法及其相关应用
WO2023227050A1 (zh) 一种在基因组中定点插入外源序列的方法
US20220162625A1 (en) Methods to improve site-directed integration frequency
CN116478993A (zh) 一种植物cgbe碱基编辑系统及其应用
CN115896158A (zh) 一种植物基因编辑中的重组载体以及利用其筛除假阳性愈伤组织的方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210914

Assignee: Feile New Material Technology (Shandong) Co.,Ltd.

Assignor: JINGCHU University OF TECHNOLOGY

Contract record no.: X2023420000094

Denomination of invention: A Plant Double Target CRISPR/Cas9 Vector and Its Construction Method and Application

Granted publication date: 20220819

License type: Common License

Record date: 20230506

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EC01 Cancellation of recordation of patent licensing contract

Assignee: Feile New Material Technology (Shandong) Co.,Ltd.

Assignor: JINGCHU University OF TECHNOLOGY

Contract record no.: X2023420000094

Date of cancellation: 20230807

EC01 Cancellation of recordation of patent licensing contract
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230828

Address after: 448000 Room 201, 2nd Floor, Village Committee Office, Lailong Village, Pailou Town, Dongbao District, Jingmen City, Hubei Province

Patentee after: Jingmen Chenlong Ecological Agriculture Technology Co.,Ltd.

Address before: 448000 No. 33 Xiangshan Avenue, Dongbao District, Jingmen City, Hubei Province

Patentee before: JINGCHU University OF TECHNOLOGY

TR01 Transfer of patent right